Abstract

Στο σώμα μας, τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε φυσικές δυνάμεις που μπορούν να ρυθμίζουν διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό των κυττάρων, της διαφοροποίησης και του θανάτου. Σε αυτή την εργασία, χρησιμοποιήσαμε δύο διαφορετικές στρατηγικές σε μηχανικώς καρκίνο του στρες των κυττάρων. Ο καρκίνος και κυτταρικούς πληθυσμούς υγιών υποβλήθηκαν σε θεραπεία είτε με μηχανική πίεση που παραδίδονται από μικροαντλίας (κατασκευάζεται από βαθιές nanolithography ακτίνες Χ) ή με ερεθίσματα κύμα υπερήχων. Μια ειδική προς τα κάτω ρύθμιση Κύριο Σύμπλοκο Ιστοσυμβατότητας (MHC) τάξης Ι μόρια έκφραση στο καρκινικό κύτταρο μεμβράνη σε σύγκριση με τα διαφορετικά είδη των υγιών κυττάρων (ινοβλάστες, μακροφάγα, δενδριτικά και των λεμφοκυττάρων κυττάρων) παρατηρήθηκε, διεγείροντας τα κύτταρα με δυνάμεις στην περιοχή των νανο -newton, και πιέσεις μεταξύ 1 και 10 bar (1 bar = 100.000 Pascal), ανάλογα με τις συσκευές που χρησιμοποιούνται. Επιπλέον, η ανάλυση φασματοσκοπία Raman, μετά από μηχανική κατεργασία, στην περιοχή μεταξύ 700-1800 cm

-1, έδειξε μια σχετική διακύμανση συγκέντρωση του MHC τάξης Ι ανάλυση PCA πραγματοποιήθηκε επίσης να διακρίνει τον έλεγχο και τόνισε κύτταρα μέσα σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Αυτές οι μηχανικές μεταβολές που προκαλούνται φαινοτυπική αυξάνουν την ανοσογονικότητα του όγκου, όπως προέκυψε από τη σχετική αυξημένη ευαισθησία σε Natural Killer (NK) κυττάρων κυτταροτοξική αναγνώριση

Παράθεση:. La Rocca R, Tallerico R, Talib Χασάν Α, Das G, Tadepally L, Matteucci Μ, et al. (2014) μηχανική καταπόνηση ρυθμίζει προς τα κάτω MHC Τάξης Ι έκφρασης σε ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές μεμβράνες. PLoS ONE 9 (12): e111758. doi: 10.1371 /journal.pone.0111758

Επιμέλεια: Laurent Kreplak, Πανεπιστήμιο Dalhousie του Καναδά

Ελήφθη: 17 Απριλίου, 2014? Αποδεκτές: 30 Σεπτεμβρίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 26 Δεκ 2014

Copyright: © 2014 La Rocca κ.ά.. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. Εργασίες Ennio Carbone έχει υποστηριχθεί από μια UICC International Technology Καρκίνου Μεταφορά υποτροφία, να χορηγούν AIRC-IG 10189, και να χορηγήσει AIRC 15521. Rossana Tallerico είναι μια δημοσίευση Doc απονέμεται από τριετείς υποτροφίες «Luciana Selce» FIRC. Giovanni Cuda έχει υποστηριχθεί από PON01_02834 Prometeo (Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας) και PONa3_00435 Biomedpark @ UMG (Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στη φύση, τα κύτταρα συνεχώς εκτεθειμένες σε φυσικές, χημικές και βιολογικές καταπονήσεις. Στο παρελθόν, ελήφθησαν φυσικές αλλαγές που συμβαίνουν σε παθολογικούς ιστούς υπόψη από τους γιατρούς ως πολύτιμο διαγνωστικό δείκτες. Φυσική στρες ενέχεται στην παθοφυσιολογία πολλών ασθενειών του ανθρώπου, όπως η φλεγμονή και ο καρκίνος. Σε αμφότερες τις συνθήκες, η μεταβολή στην εξωκυτταρική μήτρα (ECM) περιβάλλον φυσικοχημικά σχετίζεται με την παθογένεση αυτών των ασθενειών. Επιπλέον, φυσικές δυνάμεις διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη μεταστατική εξέλιξη. Τα τελευταία χρόνια, τα νέα εργαλεία, όπως μικροσκοπία ατομικών δυνάμεων, έχουν αναπτυχθεί για να αναλύσει τις αλλαγές στα κύτταρα που σχετίζονται με την ελαστικότητα φυσικές αλλαγές στο θάλαμο εξωκυτταρική μήτρα [1]. Επιπλέον, για να καθορίσει πόσο ένα κύτταρο μπορεί να παραμορφωθεί, μια συσκευή που ονομάζεται «οπτική φορείο» αναπτύχθηκε [2]. Σε αντίθεση με άλλα εργαλεία, η οπτική φορείο βασίζεται σε ένα διπλό πορείας οπτική παγίδα [3], [4], στην οποία δύο αντίπαλο και πανομοιότυπες ακτίνες λέιζερ παγίδα σε ένα κελί στη μέση. Αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση των ελαστικών και συσταλτικές ιδιότητες πολλών κυττάρων, όπως είναι γνωστό ότι η ικανότητα του κυττάρου να συρρικνωθεί είναι πολύ σημαντική για τη μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό [5]. Επιπλέον, την ελαστικότητα και τη συσταλτικότητα των διαφόρων κυττάρων όγκου μπορεί να αλλάξει με την εξέλιξη της νόσου, με αυξημένη ελαστικότητα του καρκινικού σύγκριση με τους υγιείς [6] κύτταρα. Μια σχέση μεταξύ της ECM και ακαμψία του όγκου μετασχηματισμός έχει περιγραφεί [7]. Έχει δειχθεί ότι οι ECM μεσολαβούμενης ισομετρική δυνάμεις αισθητό από ιντεγκρίνες, οι οποίες ρυθμίζουν τη φωσφορυλίωση των κινασών μηχανο-αισθητήριο, όπως ERK και Rho [8]. Έχει επίσης αποδειχθεί ότι η αύξηση του εξωγενούς δυνάμεων να οδηγήσει σε αυξημένο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων και επάγει όγκους όπως φαινοτυπικές αλλαγές. Τέλος, φλεγμονώδης καρκίνος του μαστού είναι γνωστό ότι ασκεί μια μηχανική φόρτιση λόγω των αλλαγών ECM, που οδηγούν δυνητικά σε ένα υψηλότερο μεταστατικό δυναμικό [9].

Σε αυτή τη βάση, υποθέσαμε ότι η μηχανική καταπόνηση θα μπορούσε είτε να επηρεάσει την έκφραση της αντιγόνα των κυττάρων ή να επάγει την έκφραση του άγχους που επάγεται από τα μόρια, όπως συνδετήρες υποδοχέα NKG2D [10] σε θέση να προνομιακή κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων τελεστή λειτουργίες των κυττάρων.

τα τελευταία χρόνια, η ανακάλυψη των ανοσοϋποδοχείς αναγνωρίζοντας επαγώγιμων πρωτεΐνες του στρες έχουν διευρύνει τις γνώσεις μας για το πώς το ανοσοποιητικό σύστημα είναι γεμάτοι [11], [12]. Αυτές οι παρατηρήσεις έχουν καλλιεργήσει το ενδιαφέρον μας σε ελεγχόμενες συσκευές χορήγησης άγχος που θα μπορούσε να προκαλέσει έναν όγκο ανοσογονικό φαινότυπο σε θέση να προκαλέσουν μια ανοσολογική απόκριση, ειδικά όταν ο όγκος έχει ήδη επεξεργαστεί από κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων [13].

Κυττάρων

Φυσικό Killer είναι ισχυρός κυτταροτοξικών λεμφοκυττάρων σε θέση να αναγνωρίσει προσφάτως εκφυτευτεί καρκινικών κυττάρων [14] – [16] και να λύουν αυθόρμητα ορισμένων όγκων-στόχων [17] – [19]. Αυτές διέπονται από μια λεπτή ισορροπία μεταξύ ανασταλτικών υποδοχέων, αναγνωρίζοντας τα μόρια αυτο MHC τάξης Ι, και ενεργοποιώντας τους υποδοχείς για το στρες που επάγεται από τα μόρια [20]. ΝΚ κύτταρα έχουν την ικανότητα να εντοπίζουν και να σκοτώσει ιικώς μολυσμένα και κακοήθη κύτταρα ενώ διαφυλάσσει τα φυσιολογικά κύτταρα. Ο κανονισμός ΝΚ κυττάρων ήταν ελάχιστα κατανοητή, μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του 1980, όταν το «λείπει αυτο» υπόθεση προτάθηκε [21]. Σύμφωνα με αυτή την υπόθεση, προς τα κάτω ρύθμιση των μορίων MHC τάξης Ι κατά τη διάρκεια ιογενή λοίμωξη ή κακοήθη μετασχηματισμό πυροδοτεί την ενεργοποίηση ΝΚ.

Εδώ ρωτάμε αν η θεραπεία του καρκίνου ΝΚ κύτταρα ανθεκτικά από μηχανική καταπόνηση θα μπορούσε να ανατρέψει την ισορροπία μεταξύ των ανασταλτικών και μορίων ενεργοποίησης όγκου που εκφράζουν υπέρ του τελευταίου, που οδηγεί σε ενεργοποίηση των κυττάρων ΝΚ. Στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικές διαδικασίες σε μηχανικώς καρκίνο του στρες και φυσιολογικά κύτταρα κάτω από ελεγχόμενες συνθήκες. Συγκρίναμε τις βιολογικές επιδράσεις του μηχανικά ερεθίσματα που παραδίδεται είτε με μια συσκευή μηχανικής μικροαντλίας ρητώς για το σκοπό αυτό [22], με αυτές που παρέχονται από έναν εξοπλισμό παλμό κρουστικών κυμάτων. Η μεταβολή των μορίων MHC τάξης Ι πριν και μετά από μηχανική καταπόνηση παρακολουθήθηκε τόσο με φασματοσκοπία Raman (σε συνδυασμό με ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA)) και με τη βοήθεια των κυτταροτοξικών μετρήσεων. Ο απώτερος στόχος της μελέτης μας ήταν να καταλάβουμε αν οι εφαρμοζόμενες μηχανικές δυνάμεις θα μπορούσε να προκαλέσει ή /και διαμορφώνει σχετικές βιολογικές λειτουργίες των κυττάρων, όπως η ανοσογονικότητα τους. Επιπλέον, θα διερευνηθεί η δυνατότητα χρήσης υιοθεσίας μηχανική χειρισμούς toswitch ένα ανθεκτικό φαινότυπο όγκου ΝΚ κυττάρων σε έναν ευαίσθητο ένα.

Υλικά και Μέθοδοι

συσκευή

Micropump

Για να παραδώσει μηχανική καταπόνηση να κυττάρου όγκου πληθυσμούς, χρησιμοποιήσαμε ένα περιγράφηκε προηγουμένως μικροαντλία [22] (S1A Σχ.) κατασκευάζονται με τη βοήθεια ofdeep λιθογραφία ακτίνων-Χ τεχνική (DXRL) για την αντιμετώπιση ειδικά ευκαρυωτικά κύτταρα χωρίς την καταστροφή τους. Τρία εκατομμύρια κύτταρα /ml μηχανικά τόνισε, για 1 ώρα στους 48 κύκλους και η δύναμη της μέγιστης πίεσης που εφαρμόστηκε ήταν περίπου 10 bars. Αυτό αξιολογήθηκε με τη μέτρηση της επικράτησης της αντλίας με τη χρήση νερού ως ρευστού. Στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωλήνες των 15 ml και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και φασματοσκοπία Raman μικρο.

Η συσκευή κρουστικών κυμάτων

Τα κύματα κλονισμού εφαρμόζεται στην ορθοπεδική και είναι ουσιαστικά ακουστικά κύματα με ένα μηχανικό αποτέλεσμα. Όταν τα κρουστικά κύματα περνούν μέσα από ένα ρευστό, δημιουργούν διαφορές στην πίεση υπεύθυνη για το σχηματισμό των φυσαλίδων αερίου (σπηλαίωση) που επηρεάζονται από μεταγενέστερες κρουστικά κύματα και παραμορφώνονται μέχρι την κατάρρευση. Ασύμμετρη κατάρρευση της φούσκας προκαλεί το σχηματισμό ενός πίδακα νερού «ρεύμα jet». Αυτό το φαινόμενο περαιτέρω ενισχύει την μηχανική επίδραση του κρουστικού κύματος που προκαλεί μικρο-αλλοιώσεις των οποίων το μέγεθος είναι συνάρτηση του αριθμού των παλμών και της ροής της ενέργειας. Για τη θεραπεία των καρκινικών κυτταρικών σειρών χρησιμοποιήθηκε το

ελβετική Dolorclast συσκευή

(Electro Medical System-EMS, Ιταλία) με ένα χέρι-κομμάτι υψηλής ενέργειας (S1B Εικ.).

Τα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε τρυβλία Petri και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με κρουστικά κύματα (500 βολές) εφαρμόζοντας μία ροή ενέργειας από 1 bar. Μετά την επεξεργασία τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν και τα δεδομένα που ελήφθησαν συγκρίθηκαν με τα αντίστοιχα δείγματα αναφοράς.

Cells την απομόνωση και καλλιέργεια

Για μηχανικά πειράματα στρες χρησιμοποιήσαμε διάφορα είδη κυτταρικών σειρών. Πρωτογενή κύτταρα Mel 59c, Mel 42α, 42β Mel, Mel 66β, Mel 137α και 103β Mel ελήφθησαν από μεταστατικά κύτταρα πρόσφατα εκφυτευτεί δέρματος μελάνωμα με λίγες in vitro περάσματα, αντίστοιχα, από τους ασθενείς 59, 42, 66, 137 και 103. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και την Επιτροπή Δεοντολογίας II του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης (0198,3 /2002). Υγιείς δότες PBL και συναφή καθαρισμένα κύτταρα ΝΚ παρήχθησαν αναλόγως με την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Magna Graecia Καταντζάρο (49/2003). Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή UMG Δεοντολογίας (49/2003). Ανθρώπινη κυτταρική γραμμή καρκινώματος νεφρών (293Τ), ανθρώπινη Β λεμφοβλαστοειδή κυτταρική γραμμή (ΙΜ9) και ινοβλαστών κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC). Λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (PBLs) ελήφθησαν από υγιείς δότες με Ficoll-Paque (Biochrom AG, Βερολίνο, Γερμανία) φυγοκέντρηση κλίσης πυκνότητας τα ανθρώπινα δείγματα συλλέχθηκαν ανάλογα με την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Magna Graecia Καταντζάρο (49/2003). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 και σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) (Sigma Aldrich, St. Louis) και πενικιλλίνη (100 IU /ml) και στρεπτομυκίνη (100 mg /mL ) (SIGMA Aldrich, St. Louis) και διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα. Τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα (DC) ελήφθησαν από μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος. Τα μακροφάγα δημιουργήθηκαν από μονοκύτταρα προσκολλημένα πάνω στην πλάκα. Τα δενδριτικά κύτταρα (DC) δημιουργήθηκαν από μονοκύτταρα συμπληρώνονται για 7 ημέρες με 50 ng //μακροφάγων παράγοντα διέγερσης αποικίας ml κοκκιοκυττάρων (GM-CSF) (Santa Cruz Biotechnology, Texas, USA) και 1.000 U /ml IL-4 [23] .

Natural Killer καθαρισμό κύτταρο

ΝΚ κύτταρα ελήφθησαν όπως περιγράφεται [24]. Εν συντομία, ανθρώπινα ΝΚ λεμφοκύτταρα καθαρίστηκαν από μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC), που ελήφθη από υγιείς δότες με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll-Paque, χρησιμοποιώντας το κιτ κελί απομόνωσης ΝΚ και Vario MACS για την εξάντληση των κυττάρων μη-ΝΚ (Miltenyi Biotec). Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 3% ανθρώπινο ορό, πενικιλίνη (100 IU /ml), και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml) και χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασία κυτταροτοξικότητας. καθαρότητα των κυττάρων ΝΚ ήταν τουλάχιστον 95%.

Φασματοσκοπία Raman

Microprobe Raman φάσματα ενθουσιασμένοι από κοντά λέιζερ IR με τη γραμμή λέιζερ 830 nm σε θερμοκρασία δωματίου (RT) σε γεωμετρία οπισθοσκέδασης μέσα από μια αντικειμενική 100X (

NA

= 0,95) της Leica μικροσκόπιο (Model – DMLM). Όλα τα δεδομένα συλλέχθηκαν με ισχύ λέιζερ 70-130 mW. Η ισχύς λέιζερ ήταν πάντα επιλεγεί με τέτοιο τρόπο για να αποφευχθεί οποιαδήποτε βλάβη του κυττάρου. Αυτή η ισχύς του λέιζερ δεν αναμένεται να προκαλέσει οποιαδήποτε σημαντική αύξηση της θερμοκρασίας του δείγματος λόγω του συντελεστή εξαιρετικά χαμηλή απορρόφηση των κυττάρων στα 830 nm. Επιπλέον, οι συνθήκες κυτταρικής επαληθεύτηκαν μέσω οπτικής εικόνας πριν και μετά τις μετρήσεις. Αρκετά κύτταρα της κάθε κυτταρικής σειράς ανιχνεύθηκαν στην περιοχή από 700-1800 cm

-1 από μετρήσεις χαρτογράφηση σημείο, το οποίο συλλέγει διάφορα φάσματα σε διαφορετική θέση καλύπτουν ολόκληρη την επιφάνεια του κυττάρου. Για κάθε κυτταρική γραμμή 5 κύτταρα επελέγησαν τυχαία για το σημείο χαρτογράφησης. Raman φάσματα διαφορετικών κυττάρων του κάθε κυτταρικές γραμμές στη συνέχεια συλλέχθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για στατιστική ανάλυση (Spectra δεν δείχνουν σημαντική διαφορετικά το ένα στο άλλο [25], [26]). Η στατιστική ανάλυση (με τυπική απόκλιση σφάλμα) εκτελέστηκε επί 10 φάσματα Raman για κάθε κυτταρική γραμμή. Είναι αξιοσημείωτο να επισημάνει ότι οι μετρήσεις για τον έλεγχο και τόνισε κύτταρα της κάθε κυτταρικής σειράς διεξήχθησαν την ίδια ημέρα προς αποφυγή κάθε μεταβολής σε απόκριση των οργάνων. Φασματική εξομάλυνση εκτελέστηκε για όλα τα επιμέρους φάσματα Raman χρησιμοποιώντας το λογισμικό PS9 σύρμα 2.0 που παρέχεται με το φασματόμετρο Raman Renishaw. Η καμπύλη τοποθέτηση των φασμάτων διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας συνδυασμό Gaussian και Lorentzian λειτουργία.

Principal Component Analysis

Κατά την τελευταία δεκαετία πολυμεταβλητή τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως για την ανάλυση μεγάλων συνόλων δεδομένων Raman [27] , [28]. Μεταξύ αυτών των τεχνικών, ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) έχει αποδειχθεί ότι είναι μία από τις πιο ισχυρές και αξιόπιστες μεθόδους [29], [30]. Όταν PCA εφαρμόζεται σε φάσματα Raman, κάθε συχνότητας Raman θεωρείται ως μια μεταβλητή της οποίας η τιμή αλλαγές σε όλη την ηχογραφημένη φάσματα, έτσι ώστε ολόκληρη η δέσμη στοιχείων συνιστά

Ν

διάστατο χώρο όπου

Ν

είναι ο αριθμός των μετρούμενων συχνοτήτων (

Ν

είναι συνήθως πολύ μεγάλο). Ο κύριος στόχος της PCA είναι διάστασης μείωσης χωρίς απώλεια πληροφοριών. Αυτό επιτυγχάνεται μέσω της διαγωνοποίηση του πίνακα συνδιακύμανσης των φασμάτων: τα ιδιοδιανύσματα ορίζουν μονοδιάστατο (1D) άξονες στο

Ν

-Χώρος και οι αντίστοιχες ιδιοτιμές εκφράζουν το ποσό της συνολικής διακύμανσης εξηγείται από κάθε ιδιοδιάνυσμα. Τα ιδιοδιανύσματα είναι οι λεγόμενες κύριες συνιστώσες (PC), ενώ οι ιδιοτιμές που ονομάζεται λανθάνοντα δακτυλικά αποτυπώματα. Η πρώτη κύρια συνιστώσα είναι 1D άξονα κατά μήκος του οποίου λαμβάνεται η μεγαλύτερη ποσότητα της διακύμανσης υπόψη (δηλαδή ο άξονας με τη μεγαλύτερη λανθάνουσα αξία)? η δεύτερη κύρια συνιστώσα είναι ο άξονας (ορθογώνιο προς την πρώτη), η οποία αντιπροσωπεύει το μεγαλύτερο υπολειμματική διακύμανση (δηλαδή ο άξονας με τη δεύτερη μεγαλύτερη λανθάνουσα), και ούτω καθεξής για τα ακόλουθα συστατικά. Με αυτόν τον τρόπο, από ένα

Ν

-variables σύνολο δεδομένων που ανάγονται σε ένα σύνολο δεδομένων λίγες μεταβλητές, χωρίς να χάσει το σημαντικό μέρος των πληροφοριών. ανάλυση PCA πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό που αναπτύχθηκε από τον Ρ Candeloro et al. [31].

ανοσοφθορισμού δοκιμασία

Μετά από κάθε θεραπεία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωλήνες και επωάστηκαν με ανθρώπινο ορό για 15 λεπτά σε RT. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές σε PBS 1Χ και στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά σε σκοτάδι στους 4 ° C, με τις ακόλουθες mAbs: W6 /32 (αντι-ΜΗΟ τάξης Ι, IgG2a? BioLegend, San Diego, CA)? κλώνος BAM 195 (αντι-MICA, IgG 1) και mAb 6D4 (αντι-MICA /Β, IgG 1), είχαν την καλοσύνη να παρέχονται από Veronika Groh (Έρευνας Καρκίνου Fred Hutchinson κέντρο, Seattle, WA)? M295 (αντι-ULBP1, IgG 1), M310 (αντι-ULBP2, IgG 1), M550 (αντι-ULBP3, IgG3) και M478 (αντι-ULBP4, IgG 1) είχαν την καλοσύνη να προικισμένος από τον Δ Cosman, (Amgen Inc. Seattle, WA )? mAb L95 (αντι-PVR, IgG 1) και mAb L14 (αντι-nectin-2, IgG2a) ευγενώς από τον Α Moretta (Πανεπιστήμιο της Γένοβας, Γένοβα, Ιταλία). Μετά από πλύση δύο φορές, τα κύτταρα βάφτηκαν με το δευτερεύον mAbs FITC κατσίκας αντι-ποντικού IgG (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) για 30 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Στη συνέχεια, τα κύτταρα και πάλι πλύθηκαν δύο φορές και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA, USA). Για ενδοκυτταρική χρώση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε Cytofix και διαπερατά από Cytoperm (BD Biosciences). Τα κύτταρα βάφτηκαν με τα ειδικά mAbs ακολουθούμενο από FITC συζευγμένα αντισώματα IgG αντι-ποντικού (Jackson Immuno Research, Baltimore, USA) και αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση εκδοχή Cell Quest (BD Biosciences) ή FlowJo λογισμικό 9.3.1.

κυτταροτοξικότητας

δοκιμασία

Για τους προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας ο όγκος ή υγιή κύτταρα ως στόχου και των ΝΚ λεμφοκυττάρων ως τελεστές κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν. Μετά τη μηχανική κατεργασία στρες, τα κύτταρα στόχοι επωάστηκαν με το φθορίζον CFDA (διοξικής καρβοξυφλουορεσκεΐνης, Life Technologies, ΝΥ, USA) για 30 λεπτά στους 37 ° C, μετά πλύθηκαν δύο φορές και επωάζονται με κύτταρα ΝΚ επί τρεις ώρες σε επωαστήρα στους 37 ° C και 5% CO

2. Οι λεπτομέρειες του πρωτοκόλλου περιγράφονται από McGinnes et al. [32] Η κυτταρομετρίας ροής χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δειγμάτων.

Real Time

Το συνολικό κυτταρικό RNA που από τέσσερις διαφορετικές μελανώματος πρωτογενή κύτταρα και δύο υγιή κύτταρα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Life Technologies).

Εν συντομία, 1 μg ολικού RNA μεταγράφηκαν ανάστροφα χρησιμοποιώντας το Superscript III αντίστροφη Μεταγραφή Kit (Life Technologies) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή? τα cDNA ενισχύθηκαν χρησιμοποιώντας iTaq καθολική Syber Πράσινη Supermix (BioRad, Segrate (MI), Ιταλία) με την παρουσία ειδικών εκκινητών όπως περιγράφηκε προηγουμένως [33]. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: MHC-I- FW, 5′- CCTTGTGTGGGACTGAGAGG -3? MHC-Ι-RV, 5′-CAGAGATGGAGACACCTCAGC -3 ‘. Η έκφραση του γονιδίου housekeeping αφυδρογονάσης 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης (GAPDH) χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα δείγματα, και η σχετική ποσοτικοποίηση των HLA τάξης Ι πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας την 2

-ΔΔCt μέθοδο [34]. Οι ακόλουθοι εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν: GAPDH-FW, 5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3 ‘, GAPDH-RV 5′-TCACGCCACAGTTTCCCGGA -3’

Western Blotting

Η έκκριση των μορίων MHC τάξης Ι. εντός του ρυθμισμένου μέσου επιβεβαιώθηκε με ανάλυση στυπώματος Western. Για στύπωμα Western, κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 100 πιάτα cm πλύθηκαν με 0,1 Μ αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (ρΗ 7.4) (Life Technologies) και, στη συνέχεια, προστέθηκαν 2 mL RPMI χωρίς ορό. Μετά τη θεραπεία του στρες, το μέσο συλλέχθηκε. Κύτταρα μέσον συγκέντρωση πρωτεϊνών για κάθε τόνισε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν χρησιμοποιώντας τη χρωστική δέσμευσης πρωτεΐνης (Bio-Rad) με αλβουμίνη ανθρώπινου ορού (Life Technologies) ως πρότυπη καμπύλη.

Για κάθε πειραματικό σημείο, 50 μg του κυτταρικού ΠΑΡΑΔΟΣΗΣ μέσον πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε αποστειρωμένα φιαλίδια που περιέχουν ψυχρή ακετόνη (20%, w /v) και καταβυθίστηκε επί 30 λεπτά επί πάγου που ακολουθείται από φυγοκέντρηση στις 15.000 rpm για 15 λεπτά στους 4 ° C.

Το υπερκείμενο ήταν αποχύνεται, και το δισκίο πλένεται με ψυχρή ακετόνη που ακολουθείται από απομάκρυνση όλων των ακετόνης. Το σφαιρίδιο στη συνέχεια διαλυτοποιήθηκε σε LB [31,25 mmol /L Tris-HCl (ρΗ 6,8), 1,25% SDS, 6,25% γλυκερόλη, 0,06% κυανό βρωμοφαινόλης, και 5% h-μερκαπτοαιθανόλης], επιλύονται με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης.

Μετά την προσθήκη του μίγματος φραγμού [5% (w /v) γάλα σε PBS (ρΗ 7,4) και 0,05% Tween 20], η μεμβράνη επωάστηκε με μία αραίωση 1:100 αντι ποντικού -HLA αντίσωμα, κλώνος W6 /32 (BioLegend,). Το σήμα ανιχνεύθηκε με δευτερογενές αντίσωμα χρένο αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση (1:5000? Santa Cruz Biotechnology). Η μεμβράνη αναπτύχθηκε από ενισχυμένη αντιδραστήρια ανίχνευσης στύπωσης χημειοφωταύγειας-Western σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Santa Cruz Biotechnology).

Η μεμβράνη επωάστηκε με το κόκκινο διάλυμα χρώσης Ponceau S (Sigma-Aldrich) για να διασφαλιστεί η ομοιόμορφη φόρτωση γέλη. Ένας εσωτερικός έλεγχος δεν χρησιμοποιήθηκε επειδή είναι ουσιαστικά αδύνατο να βρεθεί μια πρωτεΐνη «νοικοκυριό» στα κύτταρα μέσο ελεύθερο ορού που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως σταθερή αναφορά. Ponceau S μπορεί να χρησιμοποιηθεί επωφελώς πάνω ακτίνη ανίχνευσης για την ποιότητα ή ίση έλεγχος φόρτωσης σε κηλίδωση Western? Επιπλέον, έχει ένα πρόσθετο πλεονέκτημα, δηλαδή ότι δεν βασίζεται σε ένα μόνο πρωτεΐνη για ομαλοποίηση ή έλεγχος φόρτωσης. Αυτό παρακάμπτει την πιθανότητα ότι οι πρωτεΐνες «housekeeping» που χρησιμοποιούνται για το σκοπό αυτό μπορεί πράγματι να ποικίλει σε ορισμένες συνθήκες ή ότι είναι κορεσμένα στα επίπεδα φόρτωσης αναγκαία για την ανίχνευση των προϊόντων χαμηλής έκφρασης ή ότι δεν είναι ανιχνεύσιμα όπως στο παράδειγμα μας [35 ].

ATM /ΑΤΚ καταρράκτη σηματοδότησης ανάλυση

η ετοποσίδη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) διαλύθηκε σε DMSO και προστέθηκε σε τελική συγκέντρωση 5 μΜ για 1 ώρα. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν από προσφάτως συλλεγέντα κύτταρα με τη χρήση ενός ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως (20 mM Tris-HCI ρΗ 7.5, 10 mM EDTA, 0,5% Nonidet Ρ-40, 400 mM NaCl) συμπληρωμένου με μίγμα αναστολέα πρωτεάσης (Calbiochem, Merck Darmstadt , Γερμανία), 0,5 mM PMSF και 2 mM ορθοβαναδικό νάτριο. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν σε πάγο για 15 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στα 13.000 rpm για 10 λεπτά. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης από υπερκείμενα προσδιορίσθηκε με Biorad δοκιμασίας (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Για ανοσοστυπώματα, τα δείγματα φορτώθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli, στις 6% ή 10% Τπδ-γλυκίνης πηκτώματα SDS /PAGE, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης και υβριδοποιήθηκαν με κατάλληλα αντισώματα σε 1:1000 αραίωση. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Germany). Αντισώματα: αντι-phosphoAtm (Ser 1981) κουνελιού αντι-phosphoChk1 (Ser 345), κουνελιού αντι-phosphoChk2 (Thr 387), αντι-φωσφο JNK κουνελιού (Thr183 /Tyr185) (Cell Signaling, New York, ΝΥ, USA), κουνέλι αντι -ρ53 και αντι-MCM7 (Santa Cruz).

η στατιστική ανάλυση

Όλα τα αποτελέσματα αναφέρθηκαν ως μέσος όρος ± SEM. επίπεδο σημαντικότητας καθορίστηκε με Mann – Whitney test. Μια τιμή * p ≤ 0,05, ** p≤0,001 και **** p≤0,0001 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Τα δεδομένα εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με τον μάρτυρα, που όπως 1.

Αποτελέσματα

Για να κατανοήσουμε τις πιθανές επιπτώσεις της μηχανική καταπόνηση στην κυτταρική ανοσογονικότητα, καρκίνο και υγιή κύτταρα μηχανικά τόνισε με μικροαντλία συσκευής και των κρουστικών κυμάτων.

Οι αλλαγές που προκαλούνται από τη μικρο-αντλία-διατυπώθηκε στρες αναλύθηκαν με φασματοσκοπία Raman. Raman μετρήσεις έγιναν για τα αντίστοιχα κύτταρα (Mel 59C, Mel 42α, Mel 103α και 293 Τ κυτταρική γραμμή) σε διάλυμα PBS στη φασματική περιοχή μεταξύ 700 έως 1.800 cm

-1. Φάσματα Raman με τυπική μπαρ σφάλμα απόκλισης για (χωρίς ένταση) κύτταρα ελέγχου και μηχανικά τόνισε κύτταρα σε ρυθμιστικό διάλυμα PBS φαίνονται στο Σχ. 1. Raman φάσματα αυτών των κυττάρων είναι παρόμοια με χαρακτηριστικά φάσματα Raman των περισσότερων ζωντανών κυττάρων. Όλα τα φάσματα δείχνουν διαφορετικές κορυφές σε περίπου 780, 850, 1003, 1125, 1445, και 1660 εκατοστά

-1. Τυπικές ζώνες σε αυτά τα φάσματα (Σχ. 1), συνδέονται με το νουκλεοτίδιο διαμόρφωση (600-800 cm

-1), μοριακή γεωμετρία σκελετού και δονήσεις φωσφορικό σχετίζονται (800-1200 cm

-1), νουκλεοτίδια ( 1200-1600 cm

-1), και CC και CH

x τρόπους λόγω πρωτεΐνες και τα λιπίδια [36]. Οι δονήσεις αμίδιο, όπως αμίδιο Ι-band (λόγω C = O τέντωμα, 1650-1700 cm

-1) και η ζώνη αμιδίου III (λόγω τέντωμα CN, και ΝΗ κάμψη, περίπου 1250 cm

– 1) σε πρωτεΐνες είναι εύκολα διακριτές [37]. Το αμίδιο μπάντες που στην περιοχή μεταξύ 1650-1700 cm

-1 δώσει, επίσης, πολύ σημαντικές πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση επιβεβαίωση της δευτερογενούς δομής (α-έλικα, β-φύλλο και τυχαία δομή σπείρας) των πρωτεϊνών. Διαφορετικά αμινοξέα μπορούν να αναγνωριστούν ρητά σε περίπου 1003, 1011 και 1032 εκατοστά

-1 στα φάσματα Raman [37].

φάσματα Raman για τον έλεγχο και τόνισε καρκινικές κυτταρικές σειρές (Mel 59c (Α), Mel 42α (Β), Mel 103β (C) και 293Τ (D)) με το πρότυπο μπαρ σφάλμα απόκλισης. Τα φάσματα πραγματοποιήθηκαν πριν και μετά από μηχανική καταπόνηση με μικροαντλίας.

Η

Η μεταβολή της σχετικής συγκέντρωση της πρωτεΐνης σε διαφορετικά κύτταρα υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας καμπύλη προσαρμογής αυτών των δύο περιοχών της πρωτεΐνης σε ζώνες περίπου 1440 και 1650 cm

-1. Σύκο. 2 δείχνει, για διάφορους κυτταρικούς τύπους, η διακύμανση στην σχετική ένταση της κυτταρικής μεμβράνης πρωτεΐνης /λιπιδίων (1440 cm

-1) και α-έλικας (1650 cm

-1) μπάντα πριν και μετά την εφαρμογή της μηχανικής τάσης . Μια σαφής μείωση ποσότητας πρωτεΐνης και α-έλικα του δευτερογενούς δομής παρατηρήθηκε μετά από μηχανική κατεργασία των κυττάρων στρες.

Κανονικοποιημένη περιοχή της ζώνης με κέντρο γύρω στα 1440 (κορυφή) και 1670 cm

-1 (κάτω) για όλες οι κυτταρικές σειρές, που δείχνει την μεταβολή της συγκέντρωσης πρωτεΐνης και σχετική περιεκτικότητα α-έλικας πάνω στην επιφάνεια του κυττάρου.

η

Μια πολύ σαφής εικόνα μπορεί να αποκαλυφθεί από την παραλλαγή της δευτερογενούς δομής μετά απασχολούν μηχανική καταπόνηση. Δείχνει την αναγωγή του α-έλικα δευτερεύουσα δομή του Ι μπάντα αμιδίου για όλα τα κύτταρα με μηχανική καταπόνηση. Η τάση αυτή δεν παρατηρείται σαφώς στο Mel 42α κύτταρα για τα οποία το φάσμα είναι πολύ θορυβώδες (Εικ. 1Β). Επιπλέον, σε βαθιά ανάλυση, έχει βρεθεί ότι το 59C Mel και 293 Τ κύτταρα συμπεριφέρονται με παρόμοιο τρόπο. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διερευνήθηκαν δείχνουν μια μείωση δευτερογενή δομή σε μηχανική καταπόνηση. Απόσβεση της δομής α-έλικας και ένα εξάρτημα του υποβάθρου φθορισμού, καθώς μπορεί να παρατηρηθεί σαφώς. Αυτές οι αλλαγές στα φάσματα Raman είναι συνεπείς με μας έχουν αναφερθεί στο παρελθόν πορίσματα σχετικά με την ανίχνευση MHC τάξης Ι με φασματοσκοπία Raman [38].

Επιπλέον, Ανάλυση Στοιχείο Principal (PCA) εκτελείται για να διακρίνουν το τόνισε για τον έλεγχο των κυττάρων του Κάθε κύτταρο γραμμές. PCA, μια στατιστική ανάλυση, μειώνει την διάσταση των πολυδιάστατων σύνολο δεδομένων, διατηρώντας την χαρακτηριστική όλων των φασμάτων [31]. Οι μειωμένες σημεία διάσταση του κάθε φάσματος περιγράφεται από ένα περιορισμένο αριθμό μεταβλητών, που ονομάζεται κύρια συστατικά (PCs). Οι υπολογιστές αυτοί ενσωματώνουν τις περισσότερες φασματικές πληροφορίες. Σύκο. 3 παριστά την ανάλυση PCA (PC1 έναντι PC2, PC3 PC2 εναντίον και εναντίον PC1 PC3) όλων των κυτταρικών γραμμών στην περιοχή από 700-1800 cm

-1. Τα γεμάτα τετράγωνα είναι για τα κύτταρα ελέγχου, ενώ τα κενά μπλοκ που συνδέονται να τονίσω κύτταρα. Τα κύτταρα στρες μπορεί να είναι καλά διακρίνονται από τα κύτταρα ελέγχου και Περαιτέρω κάθε κυτταρικές γραμμές μπορούν να βρεθούν σε-ομαδοποιούνται καθαρά στο Σχήμα. Τα αποτελέσματα αυτά αποκαλύπτουν μια ενδιαφέρουσα και σημαντικός τρόπος για να γίνει διάκριση μεταξύ των κυττάρων και επίσης αν τα κύτταρα έχουν ενόχλησή εξωτερικά

ανάλυση PCA σε κύτταρα ελέγχου και το άγχος για διάφορες κυτταρικές σειρές.? Mel 42α, Mel 59c, Mel 103β και 293Τ. α) PC1 έναντι PC2, β) PC2 εναντίον PC3 και γ) PC1 εναντίον PC3.

Η

Για να επιβεβαιώσετε ότι η μηχανική καταπόνηση προκαλεί ρύθμιση προς τα κάτω της τάξης MHC Ι στην επιφάνεια των κυττάρων , εκτελέσαμε μία δοκιμασία ανοσοφαινότυπο για όλους τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων.

Μετά από θεραπεία ισχύος 1 bar, παρατηρήθηκε από μικροαντλίας και κρουστικών κυμάτων, μια σαφής μείωση του MHC τάξης Ι επίπεδα επί της μεμβράνης κυττάρων όγκου (Σχ. 4Α), ενώ δεν παρατηρήθηκαν αλλαγές όταν τα υγιή κύτταρα, ινοβλάστες, μακροφάγα, δενδριτικά και τα λεμφοκύτταρα κύτταρα, τόνισε (Εικ. 4Β). Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα όγκου (μελάνωμα και ΙΜ9 κυτταρικές γραμμές, εικ. 4C) και υγιή κύτταρα (ινοβλάστες, μακροφάγα, δενδριτικά κύτταρα και λεμφοκύτταρα, εικ. 4D).

Πίνακας Α δείχνει τη μείωση του MHC τάξης Ι μόρια έκφραση σε καρκινικά κύτταρα (5 μελανώματος και ένα λεμφοβλαστοειδείς κυτταρικές γραμμές) μετά από μηχανική κατεργασία στρες μέσω της μικροαντλίας (άνω μέρος) και τα κρουστικά κύματα (κάτω μέρος) συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Πίνακας Β αναφέρει την επίδραση της μηχανικής τάσης σε ορισμένα υγιή κύτταρα (ινοβλάστες και μακροφάγα) της τάξης MHC Ι με τις δύο αναφερθείσες αγωγές. Η σχετίζονται με ισοτοπική ελέγχου των ΝΧΙ έδωσε το ίδιο σήμα επικάλυψη για όλες τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται, ως εκ τούτου, έχουν παραλειφθεί. Πάνελ C αντιπροσωπεύει τις στατιστικές τιμές των φορές μείωση του ΜΗΟΙ πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα μελανώματος (η = 4 ξεχωριστά πειράματα με μικροαντλίας και η = 4 ξεχωριστά πειράματα με κρουστικά κύματα? Ρ & lt? 0,05) και ΙΜ9 κυττάρων (η = 10 ξεχωριστό πείραμα με κρουστικά κύματα? p & lt? 0,0001). Το φορές μείωση του ΜΗΟΙ προήλθε από την ένταση Μέσος φθορισμού (MFI) των μορίων MHC-I πριν και μετά τη θεραπεία των κυτταρικών σειρών μελανώματος και ΙΜ9. Ο πίνακας D δείχνει τις στατιστικές τιμές που λαμβάνονται από διαφορετικό πείραμα (η = 3) για κάθε τύπο των υγιών κυττάρων. Οι ινοβλάστες και τα ΡΒΙ_ τονίστηκαν με μικροαντλίας ενώ, τα μακροφάγα και τα δενδριτικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με κρουστικά κύματα. Η τιμή που αναφέρεται στον πίνακα Α δεν είναι στατιστικά σημαντική.

Η

Τα άλλα ανοσογόνα μόρια αναλύονται, όπως μίκα, MICB, ULBPs, PVR και nectin-2, δεν παρουσιάζουν σημαντικές αλλαγές μεταξύ του ελέγχου και τόνισε κύτταρα με κρουστικά κύματα (S2 Εικ.). Για να καταλάβουμε την επίδραση της μειωμένης έκφρασης MHC τάξης Ι επί μηχανικά τονίσει καρκινικά κύτταρα ανοσογονικότητα, λειτουργικές δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση των δύο κυμάτων συσκευές, μικροαντλίας και σοκ. Στο παρόν, η NK κύτταρα ευαισθησία μηχανικά τόνισε κυττάρων στόχων όγκου σε σύγκριση με την χωρίς ένταση των ελέγχων τους από το κλασικό δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας. Μια σαφής και αναπαραγώγιμη αύξηση στον ευαισθησία ΝΚ παρατηρήθηκε μετά τη μηχανική κατεργασία στρες. Το εύρος της αύξησης ποσοστιαία λύση ΝΚ σε κύτταρα όγκου ήταν μεταξύ 30-70% (Σχ. 5Α-Ε), ενώ τα υγιή κύτταρα, δηλαδή ινοβλαστών (Εικ. 5F), δεν ανταποκρίνονται σε μηχανική επεξεργασία στρες. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η μηχανική καταπόνηση βελτιώνει την αναγνώριση NK για όγκο με στατιστική σημασία (Σχ. 5G-H), αλλά όχι για τα υγιή κύτταρα. Μηχανική καταπόνηση αλλάζει τον φαινότυπο όγκου από το να είναι ΝΚ ανθεκτική σε NK ευαίσθητα. Αυτή η αλλαγή στην ευαισθησία NK συσχετίζεται με συγκεκριμένο όγκο απώλεια MHC τάξης Ι. Τα μόρια MHC τάξης Ι είναι οι πιο ισχυρές ανασταλτικές συνδέτες για υποδοχείς ΝΚ. Το MHC τάξης Ι κάτω ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν την απάντηση ΝΚ ανάλογα με το «Missing αυτο υπόθεση» [21]. Τα δεδομένα που συλλέγονται εδώ δείχνουν ότι η αποβολή του ΜΗΟΙ συμβαίνει μετά από μηχανική καταπόνηση επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, αυτό δεν είναι η περίπτωση για υγιή κύτταρα. Το εύρημά μας υποδηλώνει μια ανοσολογικά σχετική επίδραση της μηχανική καταπόνηση για την ευαισθησία του όγκου σε κυτταροτοξικά επίθεση

αναγνώριση των ΝΚ κυττάρων των διαφόρων στόχων καρκινικών κυττάρων σε διαφορετικές E /T (δράστου /στόχου) αναλογία:. 59c, 42α, 66β ( μελανώματος κυτταρικές γραμμές), 293Τ (καρκίνωμα νεφρών) και ΙΜ9 (γραμμές lymphoblastoidcell) πριν (γκρι) και μετά (μαύρο) μηχανική καταπόνηση. Η Mel 42α, 66b Mel, ινοβλάστες κύτταρα (πάνελ Β, Ε και F) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με μικροαντλίας, το 59C Mel, ΙΜ9, 293 κύτταρα Τ (πάνελ Α, C και D) τόνισε με τα κρουστικά κύματα. Όπως υγιή κύτταρα-στόχους, σε αυτή την περίπτωση οι ινοβλάστες φαίνονται. Αντιπροσωπευτικά πειράματα που αναφέρονται για κάθε κυτταρικό τύπο. Πάνελ G και Η δείχνουν τα στατιστικά στοιχεία που προέρχονται από τρεις διαφορετικές λειτουργικές δοκιμασίες, χρησιμοποιώντας ΝΚ λεμφοκύτταρα ως τελεστές κύτταρα (Ε) και τα κύτταρα ΙΜ9 και μελάνωμα ως στόχοι (Τ). Τα κύτταρα στόχοι ΙΜ9 υποβλήθηκαν σε αγωγή με τα κύματα σοκ (πίνακας G: n = 3, ρ = 0,0325), ενώ οι κύτταρα στόχου μελανώματος τονίστηκαν με μικροαντλίας (πάνελ H, η = 3, ρ = 0.0186). E αναλογία /Τ 12/1, σ & lt?. 0.05

Η

Η αυξημένη κυτταροτοξικότητα των κυττάρων που παρατηρείται στην κλασική δοκιμασίες κυτταροτοξικότητα ΝΚ δεν οφειλόταν σε παθητικό θάνατο του κυττάρου-στόχου που προκαλούνται από μηχανικές κατεργασίες του στρες, αλλά μάλλον από την ενεργό NK κύτταρα cytolitic πρόγραμμα, όπως αποδεικνύεται από τη μείωση της μηχανικής κυττάρων-στόχων άγχος σκοτώνει μετά την ενεργοποίηση αποκλεισμό των υποδοχέων ΝΚ κυττάρων.

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε το μηχανισμό με τον οποίο η μηχανική καταπόνηση, που προκαλείται είτε με την μικροαντλία ότι με κρουστικά κύματα, μπορεί να να οδηγήσει σε MHC τάξης Ι κάτω ρύθμιση.

Εικ.