Αφηρημένο

Ανοσοποιητικό διαφυγής και μετάσταση είναι τα κύρια χαρακτηριστικά των διαφόρων τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου της ουροδόχου κύστης Καρκίνος. Ένας από τους μηχανισμούς που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες έχει συνδεθεί με 2,3-διοξυγενάσης ινδολαμίνης (IDO). Παρά το γεγονός ότι IDO κλασικά αναγνωρίζεται για ανοσοτροποποιητικά περιουσία του, έχει παρουσιάσει nonimmunological αποτελέσματα σε ορισμένους όγκους. ΤΟΡ-β1 πιστεύεται ότι συνεισφέρει στην ανάπτυξη του καρκινώματος με ρύθμιση ανοσοκατασταλτική μόρια, περιλαμβανομένων IDO. Επιπλέον, ΤΟΡ-β1 επάγει την επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), το οποίο είναι ένα κρίσιμο βήμα στην εισβολή όγκου και η μετάσταση. Ερευνήσαμε το ρόλο των ΜΤ και IDO διαμόρφωση στην επαγωγή ΕΜΤ από τον TGF-β1 σε κύτταρα καρκινώματος κύστεως ανθρώπου Τ24. Όταν τα κύτταρα Τ24 επωάστηκαν με τον αναστολέα IDO (ΜΤ, 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη), με ΤΟΡ-β1, και με ΜΤ + ΤΟΡ-β1, παρατηρήθηκε μία σημαντική μείωση της έκφρασης IDO και δραστηριότητας. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση της Ε-καδερίνης και προς τα πάνω ρύθμιση του Ν-καντερίνης και παράγοντες μεταγραφής ΕΜΤ προκλήθηκαν από τις θεραπείες, επιβεβαιώνοντας την επαγωγή της EMT. siRNA μεσολάβηση knockdown του IDO μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης, αλλά δεν είχε καμία επίδραση επί μεταγραφικών παραγόντων EMT. Στην δοκιμασία γρατσουνιά-τραύματος, η αυξημένη διαδικασία μετανάστευση εντάθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με ΜΤ + ΤΟΡ-β1. Αυτές οι επιδράσεις που σχετίζονται με μια ισχυρή αναστολή της ενεργοποίησης Akt. Μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων T24 κάτω από την κάψουλα του νεφρού του Balb /c γυμνούς, τα κύτταρα ήταν θετικά για IDO στο κέντρο του κυττάρου διηθήματος, είναι αρνητική στην περιφέρεια, όπου ΕΜΤ είναι υψηλή. Εν κατακλείδι, η αναστολή της IDO με ΤΟΡ-β1 και ΜΤ συνδέεται με EMT σε κύτταρα καρκινώματος κύστεως ανθρώπου Τ24. MT έχει ενισχυτικά αποτελέσματα σε ΤΟΡ-β1 επαγόμενη EMT, ανεξάρτητα από IDO. Αυτό nonimmunological επίδραση της ΜΤ θα πρέπει να εξετάζεται αν IDO είναι ο στόχος να αποφευχθεί το ανοσοποιητικό διαφυγής στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Brito RBO, Μάλτα CS, Souza DM, Matheus LHG, Matos YST, Silva CS, et al. (2015) 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη ενισχύει ΤΟΡ-β-Induced μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος σε κύτταρα Τ24 Human καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 10 (8): e0134858. doi: 10.1371 /journal.pone.0134858

Επιμέλεια: Μιχαήλ Platten, Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Χαϊδελβέργης, Γερμανία

Ελήφθη: 28η Ιανουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 14, Ιούλη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 12 Αυγούστου 2015

Copyright: © 2015 Brito et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα Ερευνών του Σάο Πάολο (FAPESP), να χορηγούν 2012 /04423-0, https://www.fapesp.br/.

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο της ουροδόχου κύστεως είναι η πιο συχνή κακοήθεια του ουροποιητικού συστήματος [1]. Αν και η πιο κοινή μορφή ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι μη-μυϊκό επεμβατική (70% έως 80%), 30% έως 50% αυτών των περιπτώσεων προόδου σε ένα μυ-επεμβατική μορφή μετά από επανειλημμένες εκτομές, η οποία τελικά οδηγεί σε ειδική για τον καρκίνο θάνατο και μετάσταση [2].

έχουν εμπλακεί στην διεισδυτικότητα όγκου και τη μετάσταση πολλαπλών μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της επιθηλιακής-μεσεγχυματικής μετάβασης (ΕΜΤ). Σε αυτή τη διαδικασία, ένα πολωμένο επιθηλιακών κυττάρων προϋποθέτει ένα φαινότυπο μεσεγχυματικών, η οποία οδηγεί σε απώλεια της κυτταρικής προσκόλλησης στην μεμβράνη, η ενεργοποίηση της κινητικότητας και διεισδυτικότητα, και παραγωγή ενζύμων εξωκυττάριας μήτρας αποικοδόμησης [3]. Αρκετά μόρια που ασχολούνται με την έναρξη της ΕΜΤ, συμπεριλαμβανομένων των ΤΟΡ-β υπεροικογένειας πρωτεϊνών. ΤΟΡ-β1 είναι ένας σημαντικός επαγωγέας της ΕΜΤ σε αρκετούς διαφορετικούς τύπους όγκων [4], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης [5]. Ορισμένες γενετικές παραλλαγές και αυξημένα επίπεδα του ΤΟΡ-β στο πλάσμα είναι ισχυροί παράγοντες πρόβλεψης του κινδύνου καρκίνου της ουροδόχου κύστης [6,7].

2,3-διοξυγενάση ινδολαμίνης (IDO) είναι ένα ένζυμο που καταλύει την αποικοδόμηση του αμινοξέος τρυπτοφάνη, η οποία οδηγεί σε συσσώρευση της τρυπτοφάνης μεταβολιτών, όπως κυνουρενίνης. Όπως περιγράφεται από Μυηη et al., IDO έχει ένα ρόλο στη διεπαφή και τις λειτουργίες μητέρα στο έμβρυο για την προστασία των εμβρύων κατά του μητρικού ανοσοποιητικού συστήματος [8]. Στη συνέχεια, IDO έχει διερευνηθεί για χρήση ως ένα αποτελεσματικό μόριο ανοσορυθμιστική. Επειδή IDO παράγεται από πολλούς τύπους κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος, συμπεριλαμβανομένων των δενδριτικών κυττάρων, μακροφάγων, και ρυθμιστικά Τ κύτταρα, IDO έχει εμπλακεί σε μεσολάβηση του ανοσιακού συστήματος διαταραχών, όπως απόρριψη αλλομοσχεύματος [9], αυτοάνοσες ασθένειες [10] και να ξεφύγουν από αντικαρκινική ανοσία στον καρκίνο [11]. Αναφορικά με τον καρκίνο, η δραστηριότητα IDO είναι παρούσα σε πολλούς ανθρώπινους τύπους όγκων, καθώς και όγκων λεμφαδένες παροχέτευσης [11]? Ωστόσο, ο ρόλος του IDO στην ανάπτυξη του όγκου είναι ακόμη πλήρως κατανοητό. Ενώ η έκφραση IDO συσχετίζεται με μία λιγότερο ευνοϊκή πρόγνωση για πολλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του ορθοκολικού [12], της μήτρας του τραχήλου της μήτρας [13], του ενδομητρίου [14], του μαστού [15], το μελάνωμα [16], των ωοθηκών [17], και τον καρκίνο του πνεύμονα [18], η έκφραση IDO συνδέεται επίσης με επιβίωση χωρίς υποτροπή του ηπατοκυτταρικού ασθενών [19] και την μακροπρόθεσμη επιβίωση των ασθενών με νεφρικό καρκίνωμα [20]. Αν και υπάρχει μια διαμάχη για το ρόλο του IDO στον καρκίνο, μόρια που μπορούν να διαμορφώσουν IDO μεσολάβηση οδοί έχουν παρατηρηθεί ως πολλά υποσχόμενη για τη θεραπεία του καρκίνου. Στο πλαίσιο αυτό, 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη, ένας ανταγωνιστικός αναστολέας της IDO, έχει εντατικά μελετηθεί ως αντικαρκινικός παράγοντας. Επί του παρόντος, η ένωση 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη (ΜΤ) με docetaxel χρησιμοποιήθηκε σε μία κλινική δοκιμή Φάσης Ι με ασθενείς με μεταστατικό στερεούς όγκους [21]. Ωστόσο, αυτό το μόριο μπορεί να δρα ανεξάρτητα από δραστηριότητα IDO [22], καθώς επίσης και σαν τρυπτοφάνη να ρυθμίζουν μονοπάτι mTOR [23].

έκφραση IDO έχει βρεθεί όχι μόνο σε κύτταρα του ανοσοποιητικού διηθημένων από όγκο και όγκο-αποστράγγιση λεμφαδένες αλλά και σε νεοπλασματικά κύτταρα. Στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, ο Τ24 ανθρώπινο καρκίνωμα μεταβατικού κυττάρου γραμμή παράγει IDO ιδιοσυστατικά σε καλλιέργεια [24], ακόμη και χωρίς τη συμμετοχή του ανοσοποιητικού συστήματος, οδηγώντας στην υπόθεση ότι IDO μπορούν να έχουν ένα ρόλο στην μη-άνοση διεργασίες. Λεβήνα et al., Έδειξαν ότι προς τα πάνω ρύθμιση του IDO σε καρκινικά κύτταρα του μαστού αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μειωμένη απόπτωση με έναν τρόπο που ήταν ανεξάρτητη από τις ανοσολογικές επιδράσεις του IDO [25].

Είναι ενδιαφέρον ότι, ο ΤΟΡ-β επάγει μια ανεκτικογόνο φαινότυπο σε ανοσογονικές δενδριτικά κύτταρα, και αυτό το αποτέλεσμα διαμεσολαβείται από IDO μέσω της ενεργοποίησης του μονοπατιού ΡΙ3Κ /Akt [26]. Επειδή ΤΟΡ-β επάγει την ΕΜΤ σε κύτταρα καρκινώματος ουροδόχου κύστεως Τ24 [27, 28], υποθέσαμε ότι η διαμόρφωση του IDO μπορεί να συνδέεται με τον ΤΟΡ-β στην επαγωγή ΕΜΤ σε κύτταρα καρκινώματος Τ24. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε την επίδραση της ΜΤ και το siRNA μεσολάβηση knockdown του IDO στο ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT σε κύτταρα καρκινώματος της ουροδόχου κύστης Τ24.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Ανθρώπινα κύστης καρκινικά κύτταρα Τ24 (ΗΤΒ-4? American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA) αποκτήθηκαν από την τράπεζα κυττάρων του ομοσπονδιακού Πανεπιστημίου του Ρίο ντε Τζανέιρο. κύτταρα Τ24 καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α Medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) των βοοειδών και διατηρείται στους 37 ° C με 5% CO

2.

για να αναλυθεί η επίδραση του ΤΟΡ-β1 επί της έκφρασης IDO, κύτταρα Τ24 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (1X10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο). Τα κύτταρα επωάστηκαν με 1 ng /ml, 5 ng /ml ή 10 ng /ml ΤΟΡ-β1 (R &? D Systems Inc., Minneapolis, ΜΝ). Σε 5Α μέσο McCoy ελεύθερο ορού για 48 ώρες (εις τριπλούν)

Αφού καθοριστεί η βέλτιστη συγκέντρωση του ΤΟΡ-β1 (5 ng /ml), κύτταρα Τ24 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν μέχρι να φθάσει το 75% συρροή. Τα κύτταρα στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α ελεύθερο ορού για 48 ώρες κάτω από τις ακόλουθες τέσσερις συνθήκες εις τριπλούν: μόνο μέσο (έλεγχος)? μέσου που περιέχει 1 mM μεθυλ-τρυπτοφάνη (ΜΤ? 1-μεθυλ-D-τρυπτοφάνη, cat 452483, Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ)? μέσο που περιέχει ΤΟΡ-β1 (5 ng /ml)? και μέσο που περιέχει MT συν ΤΟΡ-β1. Στο τέλος της 48 ώρες, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν για μέτρηση κυνουρενίνης, και οι κυτταρικές μονοστοιβάδες σε επεξεργασία με θρυψίνη για την εκχύλιση RNA. Αυτό το πείραμα επαναλήφθηκε για την απομόνωση των πρωτεϊνών.

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) επιμόλυνση

Για να νοκ ντάουν ενδογενή IDO, κύτταρα Τ24 ήταν επιμολυσμένα με siRNA για IDO (σιλανσιέ Επιλέξτε απογραφεί 4.392.420, Ambion, Carlsbad, CA) ή με μη-στόχευσης siRNA ελέγχου για τον έλεγχο της επιμόλυνσης (σιλανσιέ Επιλέξτε Negative Control απογραφεί 4.390.843, Ambion, Carlsbad, CA), χρησιμοποιώντας Lipofectamine 3000 αντιδραστήριο (Invitrogen, Carlsbad, CA). Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6 φρεατίων και στη συνέχεια διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy άνευ ορού που περιέχει (ανά φρεάτιο) 1 μg siRNA, 5 μΐ αντιδραστηρίου P3000, και 5 μΐ Lipofectamine 3000 αντιδραστηρίου, κατά τη διάρκεια 24 h. Μετά την επιμόλυνση, το μέσο αφαιρέθηκε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες σε μέσο McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό στους 37 ° C με 5% CO

2. Μετά από αυτό το χρόνο αποκατάστασης, τα κύτταρα επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 (5 ng /ml, για 48 ώρες, σε μέσο McCoy ελεύθερο ορού), ακριβώς όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Οι ακόλουθες τέσσερις προϋποθέσεις εις τριπλούν διεξήχθησαν: κύτταρα Τ24 προηγουμένως επιμολυνθεί με έλεγχο siRNA (si-Control), χωρίς TGF-β 1? κύτταρα Τ24 προηγουμένως μορφομετατραπέντα με IDO siRNA επωάστηκαν χωρίς ΤΟΡ-β 1 (siIDO)? κύτταρα Τ24 προηγουμένως μορφομετατραπέντα με siRNA ελέγχου επωάστηκαν με ΤΟΡ-β 1 (ΤΟΡ-β)? και τα κύτταρα Τ24 προηγουμένως μορφομετατραπέντα με IDO siRNA επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 (siIDO + ΤΟΡ-β).

RT-qPCR

Το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας PureLink RNA Mini Kit (Ambion Inc, Carlsbad , CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και ο πρώτος κλώνος cDNA συντέθηκε από την M-MLV (Promega, Madison, WI) μετά τη θεραπεία ϋΝάσης (Promega, Madison, WI). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση δύναμης SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, CA). Ειδικοί εκκινητές για TBP (

ΤΑΤΑ δεσμευτική πρωτεΐνη

? Διαβιβάσει 5′-TTCGGAGAGTTCTGGGATTGTA-3 ‘και αντίστροφη 5′-TGGACTGTTCTTCACTCTTGGC-3’? Αριθμός ένταξης NM003194), IDO (προς τα εμπρός 5-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3 ‘και αντίστροφη 5’-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ‘? αριθμός ένταξης NM002164), E-CAD (προς τα εμπρός 5-GGTCATGGAGATGTCCGTAA-3′ και αντίστροφη 5’-ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA-3 ‘? αριθμός ένταξης Z18923), Ν-CAD (προς τα εμπρός 5-TGCCCGGTTTCATTTAGGGG -3 ‘και αντίστροφη 5′-TCCCTCAGGAACTGTCCCAT-3’? αριθμός ένταξης X57548), TWIST (προς τα εμπρός 5-AGAGATGCAACTAAGCCCTCT-3 ‘και αντίστροφη 5′-AAGCAGCTACTGACAGGCAC-3’? αριθμός ένταξης Y11177), σαλιγκάρι (προς τα εμπρός 5-ACCACTATGCCGCGCTCTT -3 ‘και αντίστροφη 5′-GGTCGTAGGGCTGCTGGAA-3’? αριθμός ένταξης NM005985), και γυμνοσάλιαγκα (προς τα εμπρός 5-TGTTGCAGTGAGGGCAAGAA-3 ‘και αντίστροφη 5′-GACCCTGGTTGCTTCAAGGA-3’? αριθμός ένταξης NM003068) χρησιμοποιήθηκαν. Τριπλά κάθε δείγματος θερμάνθηκαν στους 95 ° C για 5 λεπτά και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 15 δευτερόλεπτα, ανόπτηση στους 60 ° C για 60 sec και επέκταση στους 60 ° C για 60 sec. Αυτές οι αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA, USA). Μετά από PCR πραγματικού χρόνου, το κατώφλι κύκλου (C

t) προσδιορίσθηκε για το γονίδιο καθαριότητα (ΤΒΡ), καθώς και γονίδια-στόχους χρησιμοποιώντας τις συνθήκες αυτόματη έναρξη και κατώφλι auto. Κανονικοποιημένα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης, χρησιμοποιώντας ΔΔC

t (ΔΟ

t reference- ΔΟ

t-στόχο) και ο τύπος 2

-ΔΔCt, χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

κηλίδος Western

ανάλυση κηλίδος Western διεξήχθη για να αναλυθεί έκφραση IDO και Akt /pAkt σηματοδότησης ενεργοποίηση μονοπατιού. Εν συντομία, η συνολική πρωτεΐνη εκχυλίζεται από τα κύτταρα Τ24 με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM Tris-Base, 1 mM EDTA, 0.5 μΜ PMSF, 0,001% Triton Χ-100, 0.1 mM AEBSF, 0,08 μΜ απροτινίνη, 4 μΜ βεστατίνη, 1.4 μΜ Ε- 64, 2.0 μΜ λευπεπτίνη και 1.5 μΜ πεπστατίνη). Εκατό μικρογραμμάρια συνολικής πρωτεΐνης μετουσιώθηκαν και φορτώθηκαν σε ένα 12% δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS) -πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση γέλης και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με ημίξηρη ηλεκτροστύπωσης (Trans-Blot SD ημίξηρης μεταφοράς κυττάρων? Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Μετά από αποκλεισμό με άπαχο γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν με 1: αντι-ανθρώπινο IDO 250 ποντικού (MAB5412? Merck Millipore, Billerica, ΜΑ) ή 1: αντι-ανθρώπινο φωσφο-Ακί (ΜΑΒ 2965 1000 κουνέλι? Cell Signaling Technology Inc ., Danvers, ΜΑ). Μετά την ανίχνευση με (ECL σύστημα ανίχνευσης? Amersham Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) ενισχυμένης χημειοφωταύγειας, τα αντι-IDO και αντι-φωσφο-Ακί μεμβράνες απογυμνώθηκαν με ρυθμιστικό απογύμνωσης (62.5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 0 , 1 Μ 2-μερκαπτοαιθανόλη), και επωάζονται με 1: αντι-ανθρώπινο β-ακτίνης 5000 ποντικού (A1978? Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και 1: Akt (ΜΑΒ 4685 1000 κουνελιού αντι-ανθρώπου? Cell Signaling Technology Inc., Danvers, ΜΑ), αντίστοιχα. Για την ανίχνευση, 1: συζευγμένο με HRP (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) IgG αντι-κουνελιού και 1 5000 κατσίκα: 5000 κατσίκα αντι-ποντικού IgG συζευγμένο με HRP (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν.

κυνουρενίνης μέτρηση

HPLC πραγματοποιήθηκε για τη μέτρηση της κυνουρενίνης στα υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας. Τα δείγματα αφαιρέθηκαν οι πρωτεΐνες με φυγοκέντρηση στα 5000 g (15 λεπτά στους 4 ° C) με 10% τριχλωροξικό οξύ (1: 1, ν /ν). Παράλληλα, ένα πρότυπο καμπύλη κατασκευάστηκε με τις ακόλουθες συγκεντρώσεις: 0.5 μΜ, 1.0 μΜ, 2.0 μΜ, 4.0 μΜ, 8.0 μΜ, και 16.0 μΜ. Μετά την φυγοκέντρηση, τα υπερκείμενα και τα πρότυπα διηθούνται μέσω ενός φίλτρου σύριγγας φορτωμένο 0,22 μm και επιλυθεί με μία κινητή φάση ακετονιτριλίου συν ρυθμιστικού διαλύματος οξικού νατρίου (4:96, ν /ν), ρΗ 4.7. Χρησιμοποιήθηκαν? Μια προ-στήλη του 12.5X4.6 mm και μια στήλη 250×4.6 mm (Agilent Hypesil ODS, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA 5 μm). Η κορυφή που αντιπροσωπεύει κυνουρενίνης ανιχνεύθηκε με το λογισμικό Chemstation Agilent (G2170AA, Agilent Technologies, Santa Clara, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής).

Scratch-πληγή της μετανάστευσης και φρεατίων προσδιορισμούς εισβολής

Για προσδιορισμούς μηδέν-πληγή, T24 τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων (5X10

4 ανά φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν μέχρι να φθάσει το 80% συρροή (24-30 ώρες). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α ελεύθερο ορού για 24 ώρες και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τον ακόλουθο (τριπλούν): MT (1 mM), ΤΟΡ-β1 (5 ng /ml), και ΤΟΡ-β1 + ΜΤ. Τα κύτταρα διατηρούνται σε μέσο άνευ ορού που παριστάνεται με τον έλεγχο. Μετά από 24 ώρες επώαση με την αγωγή, τα υπερκείμενα απομακρύνθηκαν και προστέθηκε νωπό μέσο (10% FBS). Ένα μηδέν ανά φρεάτιο διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ και τέσσερις εικόνες ανά φρεάτιο ελήφθησαν σε 40Χ μεγέθυνση κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Ti-S? Nikon Corp., Tokyo, Japan). Μετά από τρεις ώρες, πρόσθετες εικόνες αποκτήθηκαν. Κάθε περιοχή μηδέν-τραύματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ImageProPlus 6.0 (Media Cybernetics Inc., Bethesda, MD).

Δοκιμασίες εισβολή

Transwell πραγματοποιήθηκαν επίσης. Transwells προσαρμόστηκαν με μεμβράνες (διάμετρος 6,5 mm, που 8,0 μm μέγεθος πόρου, Corning Inc., ΝΥ), επικαλυμμένα με Matrigel BD Υπόγειο Membrane Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA) σε συγκέντρωση 3 mg /ml, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται για την δοκιμασία γρατσουνιά-τραύματος, και στη συνέχεια εμβολιάζονται πάνω από την επίστρωση Matrigel με μέσο χωρίς ορό (εις τριπλούν). Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 6 ώρες και 24 ώρες προς ένα θάλαμο που περιέχει μέσο McCoy συμπληρωμένο με 20% ορό εμβρύου μόσχου. Μετά την επώαση, οι μεμβράνες στερεώθηκαν σε μεθανόλη και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Ο αριθμός των μετανάστευσαν κυττάρων προσδιορίστηκε υπό μεγέθυνση μικροσκόπιο (400Χ).

Ζωικό μοντέλο για την ανάλυση εισβολή

Όλες οι διαδικασίες ζώων εγκρίθηκαν από τη Φροντίδα των Ζώων και Χρήση Επιτροπή Nove de Julho Πανεπιστήμιο Θεσμική.

χρησιμοποιήθηκαν τρεις αρσενικούς BALB /c γυμνά ποντίκια (ηλικίας 5-6 εβδομάδων). Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σε χωριστά αεριζόμενα κλουβιά σύμφωνα με φιλτραρισμένο αέρα (Alesco, Capivari, Σάο Πάολο, Βραζιλία) με ελεύθερη πρόσβαση σε νερό και τρόφιμα. Ενδοπεριτοναϊκή έγχυση κεταμίνης (100 mg /Kg? Κεταμίνη-S, Σάο Πάολο, Βραζιλία) και ξυλαζίνης (10 mg /Kg? Rompun, Bayer, Leverkusen, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί γενική αναισθησία. 10 mm οσφυϊκή τομή εκτελέστηκε για πρόσβαση στο αριστερό νεφρό. κύτταρα Τ24 (1X10

6) επαναιωρήθηκαν σε 10 μικρολίτρα PBS και εμβολιάστηκαν κάτω από την κάψα του νεφρού χρησιμοποιώντας μια 21G βελόνα συνδέεται με ένα 100 μl-Hamilton σύριγγα (Hamilton Company, Reno, Νεβάδα). Μετά από προσεκτική εμβολιασμό, η τομή της κάψας στη συνέχεια καυτηριασμό. Οι ποντικοί παρακολουθήθηκαν καθημερινά για 28 ημέρες. Στις 28

ης ημέρας, οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη /ξυλαζίνη, ακολουθούμενη από λαπαροτομία και θωρακοτομή για την επαλήθευση της μετάστασης. Για κάθε ποντίκι, ένα midcoronal τμήμα του αριστερού νεφρού μονιμοποιήθηκε σε διάλυμα Ντούμποσκ-Βραζιλία για 60 λεπτά που ακολουθείται από μετα-καθήλωση σε ρυθμισμένο διάλυμα φορμαλδεΰδης 10% μέχρι εμβάπτιση σε παραφίνη. Τμήματα (3 μm πάχους) βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για ανοσοϊστοχημεία. Η ιστολογική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε για να επαληθευθεί η παρουσία των κυττάρων T24 στο υποκαψικό χώρο και νεφρικό παρέγχυμα.

Ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης υποβλήθηκαν σε ακτινοβολία μικροκυμάτων σε κιτρικό ρυθμιστικό για να ενισχύσει ανάκτηση αντιγόνου. Βιοτίνη Blocking System (X0590, Dako Co, Denmark) και μη λιπαρά μπλοκάρισμα γάλακτος είχαν χρησιμοποιηθεί πριν πρωτογενές επώαση αντισώματος. Ποντικού αντι-ανθρώπινης IDO (MAB5412? Merck Millipore, Billerica, ΜΑ) (1:25) χρησιμοποιήθηκε ως το πρωτογενές αντίσωμα για την ανάλυση της έκφρασης IDO. Για να ολοκληρωθεί το σάντουιτς, οι τομές επωάστηκαν με αντιδραστήρια LSAB + System-HRP (K0690? Dako Co, Denmark). Τέλος, DAB υπόστρωμα-χρωμογόνου χρησιμοποιήθηκε για να ολοκληρωθεί η αντίδραση (K346811? Dako Co, Denmark)

Στατιστική Ανάλυση

Δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM.. Για παραμετρικά στοιχεία, μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης με συγκρίσεις κατά ζεύγη διεξήχθη σύμφωνα με την τυποποίηση Newman-Keuls. Για μη-παραμετρικά στοιχεία, εφαρμόστηκε Kruskal-Wallis ή Wilcoxon. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

TGF-β1 και MT αναστέλλουν την έκφραση IDO

Η επώαση των κυττάρων Τ24 με TGF-β1 μειώθηκαν σημαντικά την έκφραση IDO (Σχήμα 1), για όλες τις δοκιμαζόμενες συγκεντρώσεις. Όπως απεικονίζεται στο σχήμα 2Α, η θεραπεία με ΜΤ και ΜΤ + ΤΟΡ-β1 σημαντικά μειωμένη έκφραση του IDO σε κύτταρα Τ24 (σχετική έκφραση 0,16 ± 0,18 έναντι 1,00 ± 0,01). Αυτή η επίδραση παρατηρήθηκε επίσης στα αποτελέσματα της κηλίδωσης Western για την πρωτεΐνη IDO (Σχήμα 2Β). Να εκτιμηθεί η δραστικότητα IDO, κυνουρενίνης μετρήθηκε στο υπερκείμενο των κυττάρων Τ24 χρησιμοποιώντας HPLC. Η συγκέντρωση της κυνουρενίνης αξιοσημείωτα μειωμένη μετά από επώαση με ΜΤ, TGF-β1, και ΜΤ + ΤΟΡ-β1 (0.59 ± 0.12 μΜ, 0.29 ± 0.02 μΜ, και 0,38 ± 0,06 μΜ, αντίστοιχα, έναντι 3,45 ± 0,16 μΜ στο μάρτυρα ? p & lt?. 0.0001) (Σχήμα 2C)

έκφραση IDO ρυθμίζεται προς τα κάτω από τον TGF-β σε κύτταρα Τ24

η

(Α) IDO έκφραση με πραγματικού χρόνου PCR, (Β. ) κηλίδωση Western για IDO, και (δραστηριότητα Γ) IDO αξιολογείται με μέτρηση κυνουρενίνης στο υπερκείμενο.

η

MT ενισχύει τη γονιδιακή έκφραση EMT

Μια σημαντική μείωση παρατηρήθηκε στην έκφραση ECAD με MT και θεραπείες TGF-β1 (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, η έκφραση Ncad αυξήθηκε σημαντικά με θεραπεία ΤΟΡ-β1 (Σχήμα 3Β), ένα αποτέλεσμα που ενισχύεται από το συνδυασμό του ΤΟΡ-β1 με ΜΤ (πάνω από 8 φορές έναντι του ΤΟΡ-β1 μόνο). Επιπλέον, η έκφραση του ΕΜΤ-σχετιζόμενων παραγόντων μεταγραφής (Twist, σαλιγκάρι και Slug) αυξήθηκε κατά TGF-β1, και θεραπεία με ΤΟΡ-β1 σε συνδυασμό με ΜΤ ενταθεί αυτό το αποτέλεσμα (Σχήμα 3C, 3D και 3Ε).

Σχετικά επίπεδα mRNA του (Α) Ε-καντερίνη (επιθηλιακά δείκτη), (Β) Ν-καντερίνη (μεσεγχυματικά δείκτη), και (CE) EMT που σχετίζονται με παράγοντες της μεταγραφής (Twist, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκας). Σύλλογος MT και TGF-β1 ενισχύεται EMT στα κύτταρα Τ24, μειώνοντας την έκφραση Ε-καδερίνης και προς τα πάνω ρύθμιση γονιδίων πηνίο της EMT. * P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου?

# p & lt? 0,05 έναντι ΜΤ?

† p & lt? 0,05 έναντι του ΤΟΡ-β

Η

siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της IDO και την έκφραση των δεικτών EMT

Η χρήση των siRNA ήταν αποτελεσματικότητας στην αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης IDO. . Όπως καταδεικνύεται στο σχήμα 4, siIDO μείωσε σημαντικά την έκφραση του IDO σε κύτταρα Τ24. Μια σημαντική μείωση της έκφρασης IDO παρατηρήθηκε μετά ερέθισμα με ΤΟΡ-β1, επίδραση που εντάθηκε όταν συνδέεται με siIDO (Σχήμα 4). Όσον αφορά τους δείκτες EMT, siIDO μείωσε σημαντικά την έκφραση ECAD, και η ένωσή του με ΤΟΡ-β1 ενισχύει αυτό το αποτέλεσμα, ωστόσο, δεν στατιστική σημαντικότητα βρέθηκε (Σχήμα 5Α). Αν και η siIDO έδειξε επίδραση στην έκφραση ECAD, siIDO δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση της Ν-cadherin και παράγοντες μεταγραφής EMT (Twist, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκας) (Σχήμα 5).

Ένα αρνητικό μάρτυρα-siRNA ήταν χρησιμοποιείται για si-Control και συνθήκες ΤΟΡ-β. Μια σημαντική μείωση της έκφρασης IDO παρατηρήθηκε σε κύτταρα siIDO, και σε κύτταρα ΤΟΡ-β που διεγείρεται. Η ένωση των siIDO και ΤΟΡ-β προκάλεσαν μια πιο έντονη μείωση της έκφρασης IDO.

Η

Σχετικά επίπεδα mRNA του (Α) Ε-καδερίνης (επιθηλιακό δείκτης), (Β) Ν-καδερίνης (μεσεγχυματικά δείκτη), και (CE) EMT που σχετίζονται με παράγοντες της μεταγραφής (Twist, σαλιγκάρι και γυμνοσάλιαγκας). siRNA μεσολάβηση knockdown του IDO ήταν αποτελεσματική στη μείωση της έκφρασης Ε-cad, και η ένωσή του με ΤΟΡ-β ενίσχυσε αυτό το αποτέλεσμα. Ωστόσο, knockdown του IDO μόνη δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση Ν-CAD, καθώς και στην έκφραση των παραγόντων ΕΜΤ-μεταγραφής. Μόνο ΤΟΡ-β έδρασε επάγει την έκφραση του Ν-CAD και παράγοντες ΕΜΤ-μεταγραφής, και η ένωσή του με siIDO δεν άλλαξε αυτό το αποτέλεσμα. * P & lt? 0,05 έναντι ελέγχου?

# p & lt?. 0,05 έναντι ΜΤ

Η

Scratch-πληγή και φρεατίων προσδιορισμούς εισβολής

Στην δοκιμασία μηδέν-πληγή, η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων Τ24 αξιολογήθηκε από μετρώντας την περιοχή που καταλαμβάνεται από κύτταρα που μεταναστεύουν. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 6, 3 ώρες μετά την εισαγωγή του στις γρατσουνιές πληγή, ΜΤ και ΤΟΡ-β1 διήγειρε ταχύτερη μετανάστευση κυττάρων Τ24 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτή η αυξημένη διαδικασία μετάβασης εντάθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 συν ΜΤ (σχήμα 6Α και 6Β).

(Α) Οι εικόνες ελήφθησαν σε 40Χ μεγέθυνση κάτω από ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο, τρεις ώρες μετά το σχηματισμό μηδέν. (Β) Το κλείσιμο της πληγής ήταν σημαντικά πιο γρήγορα σε ΜΤ + TGF-β σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Η

Τ24 κυτταρική εισβολή μελετήθηκε χρησιμοποιώντας ανασύσταση Matrigel σε επικοινωνούντα δοχεία. Μετά από 6 ώρες επώασης, αυξημένη δραστικότητα εισβολή παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα επωάστηκαν με ΤΟΡ-β1 συν MT, αν και το αποτέλεσμα δεν ήταν στατιστικά σημαντική (Σχήμα 7). Μετά από 24 ώρες επώασης, δεν παρατηρήθηκε διαφορά ανιχνεύθηκε μεταξύ των διαφόρων ομάδων (Σχήμα 7).

Αν και παρατηρήθηκε ένα υψηλότερο επίπεδο της διηθητικής ικανότητας σε κύτταρα Τ24 μετά από 6 ώρες του ΤΟΡ-β και ΜΤ + ΤΟΡ β αγωγή, δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική. Μετά από μια περίοδο μετάβασης από 24 ώρες, δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά.

Η

ενεργοποίηση Akt

Για να αναλύσουμε Akt μονοπατιού ενεργοποίησης, Western πειράματα αποτύπωση πραγματοποιήθηκαν. Όπως καταδεικνύεται στο Σχήμα 8, η επώαση των κυττάρων με T24 MT, ΤΟΡ-β1 ή ΜΤ + ΤΟΡ-β1 προωθείται ισχυρή αναστολή της ενεργοποίησης των Akt.

ΡΙ3Κ /ενεργοποίησης μονοπατιού Akt εκτιμήθηκε με κηλίδωση Western για Akt και φωσφο- Akt στα κυτταρολύματα Τ24. Μετά από 48 ώρες επώασης με MT, ΤΟΡ-β, και ΜΤ + ΤΟΡ-β, ένα μειωμένο επίπεδο φωσφο-Ακί παρατηρήθηκε. Η αναστολή του μονοπατιού PI3K /Akt συνδέεται με EMT στα κύτταρα Τ24.

Η

In vivo

ανάλυση

Για να αναλυθεί η έκφραση IDO

in vivo

, κύτταρα Τ24 εμβολιάσθηκαν κάτω από την κάψα του νεφρού γυμνών ποντικών. Τέσσερις εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό, εντοπίσαμε κύτταρα T24 κάτω από την κάψα του νεφρού. Επιπλέον, τα κύτταρα Τ24 βρέθηκαν διείσδυση του νεφρικού παρεγχύματος προς τη νεφρική μυελό (S1 Σχήμα). Ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης IDO αποκάλυψε ότι υποκάψιος και διηθητικά κύτταρα Τ24 ήταν θετικά για IDO. Ωστόσο, η έκφραση του IDO ήταν ειδικά εντοπισμένη στο κέντρο του κυττάρου διηθήματος (Σχήμα 9).

IDO-θετικά κύτταρα βρέθηκαν στο κέντρο διήθηση (βέλος), ενώ IDO-αρνητικά κύτταρα κυρίως βρέθηκαν σε η περιφέρεια του διηθήματος (κεφαλή βέλους). IDO ανοσοχρώση δεν παρατηρήθηκε στο νεφρικό παρέγχυμα (αστερίσκο).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η μη ανοσολογική ρόλο των ΜΤ και IDO στην εξέλιξη και διάδοση του καρκίνου , ιδιαίτερα σε ΕΜΤ. Κυττάρων κύστης Τ24 καρκινώματος ιδιοσυστατικά εκφράζουν IDO, ακόμη και απουσία ενός ανοσοποιητικού συστήματος. Είχαμε τη δυνατότητα να επάγουν ΕΜΤ σε κύτταρα Τ24 με ΤΟΡ-β1, και αυτό το αποτέλεσμα συσχετίζεται με προς τα κάτω ρύθμιση του IDO. Όταν χρησιμοποιούμε ΜΤ ή IDO siRNA, η EMT είχε ενισχυθεί, ιδίως με την MT.

EMT είναι μια διαδικασία κατά την οποία τα επιθηλιακά κύτταρα αποκτούν μια επεμβατική φαινότυπο, που οδηγεί σε συστηματική εξάπλωση των κακοηθών κυττάρων. Κατά τη διάρκεια της EMT, τα συγκεκριμένα γονίδια εκφράζονται ότι τελικά λειτουργούν για την απελευθέρωση ενδοκυτταρικών βιοχημικές οδούς, πράγμα που συμβάλλει στη δημιουργία ενός κακοήθους φαινοτύπου. Στη μελέτη μας, αξιολογήσαμε τη διαδικασία μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης που ακολουθείται από αυξημένη έκφραση Ν-καδερίνης, μια διαδικασία που ονομάζεται «μεταγωγή cadherin,» να χαρακτηρίσει ΕΜΤ σε κύτταρα Τ24 [29]. EMT διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όπου κινητικότητα, εισβολή, και οι μηχανισμοί αντι-αποπτωτική απαιτείται για μετάσταση [30].

ΤΟΡ-β1 είναι ένας ισχυρός επαγωγέας της ΕΜΤ σε ορισμένους τύπους ιστού, συμπεριλαμβανομένης της ουροδόχου κύστης Καρκίνος. κύτταρα Τ24 εκφράζουν ΤΟΡ-β υποδοχέα 1, και siRNA που βασίζεται αναστολή του υποδοχέα ΤΟΡ-β 1 καταστέλλει την κινητικότητα και διεισδυτικότητα των κυττάρων αυτών [27]. Στη μελέτη μας, τα κύτταρα Τ24 αποκτήσει χαρακτηριστικά μεσεγχυματικά, όπως έκφραση μεσεγχυματικών δείκτη και την κινητικότητα, μετά από TGF-β1 ερέθισμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, η κατεργασία του ΤΟΡ-β1 επαγόμενη EMT και ανέστειλε την έκφραση IDO σε κύτταρα Τ24. Επιπλέον, MT, που περιόριζε επίσης έκφραση IDO, εντείνει την ΤΟΡ-β με γνώμονα EMT.

Το siRNA μεσολάβηση knockdown του IDO μείωσε σημαντικά την έκφραση Ε-καδερίνης, αλλά οι δείκτες μεσεγχυματικά δεν μεταβλήθηκαν. Επειδή ΜΤ αύξησε σημαντικά την έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι IDO μονοπάτι συμμετέχει ενδεχομένως στο ΕΜΤ των κυττάρων Τ24, αλλά MT έχει ένα ενισχυτικό αποτέλεσμα ΤΟΡ-β1 επαγόμενη EMT ανεξάρτητα από IDO. Metz et al απέδειξαν ότι η MT έχει επίδραση στα δενδριτικά κύτταρα, ανεξάρτητα από IDO επάγουν το μονοπάτι mTOR (Μετς). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι mTOR συνδέεται στενά με EMT στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [31]. Είναι πιθανό ότι η MT μεσολαβεί mTOR μονοπάτι στα κύτταρα Τ24, αλλά ο μηχανισμός αυτός δεν αξιολογήθηκε στη μελέτη μας.

Η μελέτη μας είναι η πρώτη που εξετάζει τη σχέση μεταξύ TGF-β1 και IDO στα κύτταρα Τ24. Ωστόσο, υπάρχουν μελέτες που αποδεικνύουν ότι ο TGF-β1 μπορεί να ρυθμίζουν την έκφραση IDO σε ορισμένους τύπους κυττάρων. Yuan et al. έδειξαν ότι ενώ η έκφραση IDO μπορεί να προκληθεί σε ανθρώπινους ινοβλάστες μετά από διέγερση με ΙΝΡ-γάμα, ΤΟΡ-β1 καταργεί αυτό το αποτέλεσμα χωρίς να επηρεάζει την έκφραση INF-γ [32]. Σε αντίθεση, ο ΤΟΡ-β1 επαγόμενη έκφραση IDO σε δενδριτικά κύτταρα μέσω των Akt και noncanonical οδούς ΡΙ3Κ /NFK-β, οδηγώντας σε ανεκτικογόνο φαινότυπο [26]. Οι μηχανισμοί που συνδέουν ΤΟΡ-β και IDO δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί, αλλά μια πιο αληθοφανή μηχανισμός έχει περιγραφεί από Pallotta και Grohmann [33]. Οι μελέτες τους υποστηρίζουν τη θεωρία ότι ο TGF-β παρέχει κανονιστικό επιπτώσεις στην σύνθεση IDO. Επιπλέον, IDO μπορεί να ασκήσει τα αποτελέσματά της μέσω ενός μηχανισμού που είναι ανεξάρτητη δράση των ενζύμων του [33].

Στη μελέτη μας, αξιολογήσαμε την ενεργοποίηση μονοπατιού PI3K /Akt χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western για Akt /φωσφο-Akt. Η θεραπεία με ΜΤ και ΤΟΡ-β1 μειώθηκαν σημαντικά φωσφο-Ακί επίπεδα, υποδεικνύοντας ότι ο ΤΟΡ-β με γνώμονα ΕΜΤ σε κύτταρα Τ24 συνδέεται με την αρνητική ρύθμιση αυτής της οδού. Σε πολλούς τύπους κυττάρων, ο ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT σχετίζεται με ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι προς τα πάνω ρύθμιση? Ωστόσο, σε κύτταρα Τ24 παραμένει ασαφές. Al-Azayzih et al. αναλύθηκαν φωσφο-Akt σε κύτταρα Τ24 μετά από επώαση με ΤΟΡ-β1 (όπως χρησιμοποιήθηκε στα πειράματά μας, 5 ng /ml), και ήταν σε θέση να προσδιορίσει τη διαφορά στις φωσφο-Ακί επίπεδα [34]. Η απουσία αποτελέσματος επί φωσφο-Ακί επίπεδα μπορεί να οφείλεται στην διάρκεια της θεραπείας ΤΟΡ-β1. Ενώ χρησιμοποιείται μία περίοδο επώασης 24 ωρών, χρησιμοποιήσαμε 48 ώρες. Επιπλέον, Ηλιόπουλος et al. μεταχειρισμένων Akt – /- κύτταρα για να δείξει ότι Akt1 knockdown προωθείται ΤΟΡ-β επαγόμενη EMT σε κύτταρα ΜΟΡ10Α. Αυτή η επίδραση φαίνεται ότι εξαρτάται από την έκφραση ειδικών microRNAs [35]. Σε αυτό το πλαίσιο, ο ρόλος της Akt στην EMT μπορεί να διαφέρουν ανάλογα με το σύστημα μοντέλο.

Εκτός από καντερίνη μεταγωγής και σημαντικά αυξημένη έκφραση του EMT που σχετίζονται με παράγοντες μεταγραφής (Twist, σαλιγκάρι, και Slug), T24 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με TGF-β συν MT κατέδειξε αυξημένο μεταναστευτικές ικανότητα και εισβολής. Εκτός από την

in vitro

πειράματα, τα κύτταρα Τ24 εμβολιάσθηκαν στο χώρο subcapsular νεφρό ποντικών Balb /c γυμνών ποντικών. Μετά από 4 εβδομάδες, τα κύτταρα Τ24 παρατηρήθηκαν σε νεφρικού παρεγχύματος προς το μυελό. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι T24 κύτταρα στο κέντρο του διηθήματος ήταν θετικά για IDO, ενώ περιφερικά κύτταρα ήταν IDO-αρνητικά. Είναι πιθανό ότι τα περιφερειακά κύτταρα του διηθήματος χάσει έκφραση IDO να αποκτήσει μια επεμβατική φαινότυπο. Περαιτέρω μελέτες είναι απαραίτητες για να διευκρινιστεί αυτό το μηχανισμό.

Εν κατακλείδι, MT και αρνητική ρύθμιση της IDO σχετίζονται με EMT σε κύτταρα Τ24 ανθρώπινο καρκίνωμα ουροδόχου κύστης, και αυτό το αποτέλεσμα μπορεί να προκληθεί από TGF-β1. Αν και η αναστολή IDO είναι ελκυστική ως θεραπεία κατά του καρκίνου επειδή IDO προωθεί ανοχή σε όγκους, οι nonimmunological αποτελέσματα που προκαλούνται από ΜΤ και άλλους ρυθμιστές IDO αξίζει να εξεταστούν σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Όπως προοπτική, αναστολείς της IDO πρέπει να συνδυαστεί με άλλες κατηγορίες φαρμάκων σε αντικαρκινική θεραπεία για την ελαχιστοποίηση των πιθανών δυσμενών επιπτώσεων που προκαλούνται από αυτούς τους παράγοντες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 Εικ. Ιστολογία του νεφρικού ιστού μετά subcapsular εμβολιασμό των κυττάρων Τ24.

Να αναλύσει Τ24 κυτταρική εισβολή

in vivo

, θα εμβολιάζονται 1X10

6 κύτταρα κάτω από την κάψα του νεφρού. Ιστολογία (αιματοξυλίνη και ηωσίνη) εκτιμήθηκε 28 ημέρες μετά τον εμβολιασμό. (Α) κυττάρων T24 υπό την κάψουλα του νεφρού (κεφαλή βέλους), και (Β) Τ24 κύτταρα διηθούν το νεφρικό παρέγχυμα προς το νεφρικό μυελό (βέλος). Νεφρικό παρέγχυμα υποδεικνύεται με αστερίσκο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0134858.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε ειλικρινά ευγνώμονες για την Angela Μπατίστα Gomes dos Santos και Σαμαρά για την τεχνική βοήθεια τους.