Αφηρημένο

ανωμαλίες Σήματος στα ανθρώπινα κύτταρα συνήθως προκαλούν απρόβλεπτες συνέπειες για την ατομική υγεία. Έχουμε επικεντρωθεί σε αυτά τα είδη των εκδηλώσεων που εμπλέκονται σε οδούς σήματος JAK-STAT, ιδιαίτερα αυτές που προκαλούνται από παρεκκλίνουσα ενεργοποιημένα STAT3, μια ογκοπρωτεΐνη που συμμετέχει στο ουσιαστικό διεργασίες κυτταρικής επιβίωσης, της ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού σε πολλούς τύπους όγκων, όπως επίσης και ασθένειες του ανοσοποιητικού. Με την καθιέρωση ενός συστήματος διαλογής φαρμάκων με βάση το σήμα STAT3 υψηλής απόδοσης σε ανθρώπινο πνεύμονα κύτταρα καρκίνου του Α549, που έχουν προβληθεί μια βιβλιοθήκη από φυσικά προϊόντα που περιείχαν καθαρισμένο ενώσεων από φαρμακευτικά φυτά. Μία ένωση, που ονομάζεται Brevilin Α, παρουσίασαν τόσο ισχυρή αναστολή του σήματος STAT3 και STAT3 σηματοδοτούν εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων. Περαιτέρω έρευνες αποκάλυψαν ότι Brevilin Α αναστέλλει όχι μόνο σηματοδότηση STAT3 αλλά και STAT1 σηματοδότηση για κυτοκίνες επαγόμενη φωσφορυλίωση της STAT3 και STAT1, καθώς και την έκφραση των γονιδίων στόχων τους. Επιπλέον, βρήκαμε Brevilin Α θα μπορούσε να εξασθενήσει την δραστικότητα JAKs αναστέλλοντας τη περιοχή κινάσης τυροσίνης JAKs JH1. Τα επίπεδα των επαγόμενων κυτοκινών φωσφορυλίωση στατιστικά και άλλα υποστρώματα μειώνεται δραματικά με κατεργασία Brevilin Α Οι ρόλοι των Brevilin Α στόχευσης στο JAKs δραστηριότητα δείχνουν ότι Brevilin Α δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο ως αναστολέας STAT3 αλλά και μια ένωση αποκλεισμού άλλων JAK- STAT υπερενεργοποίηση. Έτσι, τα ευρήματα αυτά παρέχεται μια ισχυρή ώθηση για την ανάπτυξη των εκλεκτικών αναστολέων της JAK-STAT και θεραπευτικά φάρμακα, προκειμένου να βελτιώσει την επιβίωση των ασθενών με υπερενεργοποιημένη JAKs και τα στατιστικά

Παράθεση:. Chen X, Y Du, Nan J, Zhang X, Qin Χ, Υ Wang, et al. (2013) Brevilin Ένα, ένα μυθιστόρημα φυσικό προϊόν, Αναστέλλει Janus κινάση Δραστηριότητα και μπλοκ STAT3 Σηματοδοσίας σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 8 (5): e63697. doi: 10.1371 /journal.pone.0063697

Επιμέλεια: Mark Jackson, Πανεπιστήμιο Case Western Reserve, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Νοέμβρη, 2012? Αποδεκτές: πέμπτης Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις 1104FK CA123 από το Επιστημονικό και Τεχνολογικό Σχέδιο στήριξης της Gansu Providence να QW? 2009DFA30990 από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας, 0708WCGA149 από την Gansu Provincial Επιστήμης και Τεχνολογίας και 2009AA01A130 από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας στην Ι.Υ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το περίγραμμα της οδού σήματος JAK-STAT έχει ολοκληρωθεί σχεδόν πριν από 20 χρόνια [1]. Περισσότερες μελέτες στη συνέχεια συνεχίστηκε για λεπτομέρειες σήματος περιλαμβανομένων αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών, μετα-τροποποιήσεις, μεταγραφική κανονισμοί, και φυσιολογικά αποτελέσματα. Η οικογένεια Janus κινάση (JAK) περιέχει τέσσερα μέλη της τυροσινικής κινάσης, συμπεριλαμβανομένης της JAK1, JAK2, JAK3 και Tyk2, η οποία μετάγει σήματα κυτοκινών που προκαλείται μέσω σήματος Ανιχνευτές και ενεργοποιητές μεταγραφής (stats). Συνήθως, JAKs που σχετίζονται με υποδοχείς ενεργοποιήθηκαν κατόπιν διμερισμό υποδοχέα παρουσία κυτοκινών. Εν τω μεταξύ δΤΑΤδ στο κυτταρόπλασμα προσλήφθηκαν με τους υποδοχείς και φωσφορυλιώνεται από JAKs. Φωσφορυλιωμένη τυροσίνη δΤΑΤδ σχηματίζεται ομο- ή ετερο μέσω αλληλεπιδράσεων φωσφοτυροσίνης-SH2, και μετατοπίζεται στον πυρήνα για να ξεκινήσει μεταγραφές των στοχευμένων γονιδίων [2]. Ανώμαλη δραστηριότητα των σημάτων JAK-STAT έχει θεωρηθεί ότι είναι σύνδεσμος σε πολλές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένων των καρκίνων και ανοσολογικές διαταραχές. Εκτραπέντος STATs δραστηριότητα συνήθως συσχετίζεται με διάφορους τύπους της ανάπτυξης του όγκου, και την εξέλιξη των διαφόρων κακοηθειών καρκίνου, τόσο σε απόκριση σε κυτοκίνες και από μεταλλαγμένα κινάσες τυροσίνης πρωτεΐνης. Από τα μέλη της οικογένειας επτά STAT (STAT1-STAT6, με δύο ανεξάρτητα γονίδια που κωδικοποιούνται STAT5A και STAT5b), STAT3, καθώς και STAT5 σε κάποιο βαθμό, οι πιο συχνά ενεργοποιούνται σε πάρα πολλά ανθρώπινους στερεούς όγκους και λευχαιμίες [3] – [5 ].

Σε πολλές STAT3 συστατική ενεργοποιημένα τα καρκινικά κύτταρα, είτε καλλιεργημένα κύτταρα ανθρώπινου όγκου ή δημιουργούνται μοντέλα ποντικών, εμποδίζοντας σηματοδότηση STAT3 θα αναστέλλει την κυτταρική ανάπτυξη, επάγουν απόπτωση και να μειώσει τη μετάσταση των κυττάρων. Σε γλοιώματος ή κύτταρα γλοιοβλαστώματος [6], [7], κύτταρα καρκινώματος μαστού [8], καρκίνους του παχέος εντέρου [9], πλακωδών προέρχονται κύτταρο όγκους [10], κύτταρα καρκίνου του προστάτη [11] – [13] και μελανωμάτων [14], [15], η στόχευση διαταραχή της δραστηριότητας STAT3 με παρεμβαλλόμενα RNA, που εκφράζουν τις κυρίαρχες μορφές αρνητικό STAT3 ή εφαρμόζοντας ειδικούς αναστολείς σηματοδότησης θα αξιοσημείωτα ρυθμίζουν προς τα κάτω STAT3 επάγεται γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων CyclinD1, Bcl-XL, c-myc, Survivin και άλλα γονίδια που ρυθμίζουν κυτταρικών κύκλων και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και στη συνέχεια να μειώσει την ανάπτυξη των κυττάρων και την ενίσχυση της κυτταρικής απόπτωσης [16], [17]. Η μετάσταση είναι η κύρια αιτία της κακής πρόγνωσης και των θανάτων που σχετίζονται με Caner σε σύγκριση με γένεση όγκου και της ανάπτυξης νεοπλάσματος. STAT3 έχει πλέον θεωρείται ως ένα από τα κρίσιμα ογκοπρωτεϊνών μεσολαβούν ρύθμιση της κυτταρικής εισβολής και μικροπεριβάλλον του όγκου. Στην ανθρώπινη παχέος εντέρου, STAT3 ενεργοποιήθηκε σε εκείνους που πήραν φτωχή πρόγνωση [18]. Πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων, όπως μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας (. ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-10,

κλπ

) και Twist, ρυθμίζονταν από ενεργοποίηση STAT3 [19] – [21] . Μία επαγόμενη IL-6 σηματοδότηση /STAT3 JAK ήταν απαραίτητη για διείσδυση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων. Που προέρχονται από όγκους IL-6 βοηθά στην κυκλοφορία καρκινώματος μαστού και μελάνωμα να αποκατασταθεί

in situ

ή σε απομακρυσμένες περιοχές μετάσταση [22]. Πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι ενεργοποιούνται διαρκώς STAT3 διατηρείται δραστικότητα του ΝΡ-κΒ μέσω της ρ300 μεσολάβηση οδών. δραστικότητα ΝΡ-κΒ μειώθηκε δραματικά με STAT3 RNAi σε πολλές STAT3 συστατική ενεργοποιημένα κύτταρα καρκίνου [23], υποδηλώνοντας ότι οι αναστολείς της STAT3 μπορεί επίσης να παίζουν ρόλους δυναμικό στο μπλοκάρισμα δραστικότητα ΝΡ-κΒ και την ενίσχυση της αναστολής της ανάπτυξης σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα.

Εξερευνώντας αναστολείς σήματος JAK-STAT ιδιαίτερα STAT3 αναστολέων με υψηλής απόδοσης διαλογής φαρμάκων (HTS) είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για την ανακάλυψη πιθανών συγκεκριμένων φαρμάκων που στοχεύουν στην STAT3 ή ανάντη JAK κινασών.

Ν μου Chau

και συνεργάτες ανέπτυξαν μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη η οποία περιείχε ένα ρεπόρτερ STAT3 κατασκεύασμα για διαλογή υψηλής απόδοσης ενεργοποιητών και αναστολέων STAT3 [24]. Εδώ έχουμε καθιερώσει ένα παρόμοιο σύστημα ελέγχου που βασίζεται σηματοδότησης STAT3 αναφοράς λουσιφεράσης σε άνθρωπο Α549 πνεύμονα κυτταρική σειρά καρκίνου, η οποία δείχνει συστατική ενεργοποιούνται δραστηριότητα STAT3 και θα μπορούσε να προκληθεί περαιτέρω από κυτοκίνες όπως η IL-6, EGF, και HGF [25]. Με διαλογή, Brevilin Α, ένα νέο φυσικό προϊόν, έδειξε σημαντική αναστολή της σηματοδότησης JAK-STAT χωρίς τοξικότητα άμεσης άμεση κυττάρων από 1.400 περισσότερες ενώσεις οι οποίες είχαν αρχικά απομονωθεί από φυτά, τα περισσότερα από τα οποία ήταν γνωστά ως βότανα. Brevilin Α έχει προτιμώμενο αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης των DU145 και MDA-MB-468, οι εν λόγω αυξήσεις εξαρτώνται από STAT3 σηματοδότηση [17], [26]. Περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε ότι Brevilin Μια μπλοκάρει δραστηριότητα του τομέα Janus τυροσινικής κινάσης κινάσης JH1, και στη συνέχεια μειώνεται η φωσφορυλίωση του κατάντη δράστες. Brevilin Α μπορεί να λειτουργήσει ως μια πιθανή φαρμάκων που στοχεύουν σε ασθένειες που προκαλούνται από ανωμαλίες JAK-STAT.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Τα αντισώματα έναντι STAT3, JAK2, pTyr705- STAT3, pTyr701-STAT1, pSer473-ΑΚΤ, pSer9-GSK-3β, c-myc, CyclinD1, PARP, pTyr1007 /1008-JAK2, pTyr1054 /1055-ΤΥΚ2, pSer536-p65 και p65 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology? Αντισώματα έναντι του c-Src, ρΤγΓ (ΡΥ99), GAPDH και His-tag λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology, Inc .; διάνυσμα pGL4.20 και υπόστρωμα λουσιφεράσης Steady Glo ελήφθησαν από την Promega? M-MLV πρώτου κλώνου κιτ σύνθεσης cDNA ελήφθησαν από την Invitrogen, Life Technologies Corporation? PD180970, AG490, σταυροσπορίνη, δοξορουβικίνη, ΑΤΡ και EZview Red αντι-ΡΕΑΟ Μ2 συγγένειας σφαιρίδια αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich? Η ιντερλευκίνη-6 (IL-6), ιντερφερόνη α (ΙΡΝα) και γ ιντερφερόνη (ΙΡΝγ) ήταν από την PeproTech. Ni

+ χάντρες χρωματογραφία συγγένειας ελήφθησαν από την GE Healthcare Επιστημών Ζωής. 10 × PK ρυθμιστικό κινάσης ελήφθησαν από την New England Biolabs (ΝΕΒ).

πλασμίδια και γραμμές κυττάρων

Μια ακολουθία που περιέχει 16 × ΣΗΕ plus με ένα ΤΑΤΑ εισήχθη στο pGL4.20 μεταξύ Κρη και HindIII. Το κατασκεύασμα SIE-Luc-puro μορφομετατράπηκε εντός Α549 κυτταρική γραμμή. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα επελέγησαν με 5 μg /ml πουρομυκίνη για 2 εβδομάδες, στη συνέχεια 2,5 μg /ml για άλλες 2 εβδομάδες. Κλώνοι και αναλύονται χωριστά. Οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν ανθρώπινο τομέα JAK1-JH1, τον τομέα JAK2-JH1, τον τομέα JAK3-JH1, Tyk2-JH1 τομέα και c-Src κλωνοποιήθηκαν σε PLV-SV40-puro lentivirus φορέα έκφρασης χωριστά. Επιπρόσθετες αλληλουχίες Flag-His διπλής ετικέτες συντήχθηκαν στο Ο-τερματικό του κάθε τομέα JAKs-JH1. c-Src συντήχθηκαν με μία ετικέτα FLAG στο Ο-τερματικό. Κάθε ένα από τα κατασκευάσματα ανωτέρω διαμολύνθηκε σε ΗΕΚ293Τ συνδυασμό με PMD-2.G και pCMV-dr8.74 βοηθός φορείς για τη συσκευασία του ιού. Το υπερκείμενο μέσο συλλέχθηκε μετά από 48 ώρες και χρησιμοποιήθηκαν για να μολύνουν ΗΕΚ293Τ όλη τη νύκτα, στη συνέχεια αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο για άλλες 24 ώρες. Σταθερές δεξαμενές κυττάρων επιλέχθηκαν με την παρουσία πουρομυκίνης (2.5 μg /mL) για 7 ημέρες.

Cell Culture

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου ( FBS), πενικιλλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml).

ναρκωτικές ουσίες

Φυσικά προϊόντα για τον έλεγχο των ναρκωτικών ήταν από την Εθνική Ένωση Resource Center (τον αρχικό προμηθευτή βιβλιοθήκη για αυτό το ινστιτούτο ήταν BioBioPha Co., Ltd.). Ενώσεις από φυσικά προϊόντα (10 mM) αραιώθηκαν με ϋΜΕΜ (10% FBS) και 100 μΜ (αραιωμένες ενώσεις). A549R κύτταρα για τη διαλογή φαρμάκων απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 (100 μl /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 10% FBS). Δώδεκα ώρες αργότερα, 25 μΐ αραιωμένων ενώσεων με 75 μΙ φρέσκο ​​DMEM (10% FBS) προστέθηκαν σε κάθε διαχωρίζονται καλά για άλλες 24 ώρες για την

st γύρο κοσκινίσματος 1 σε συγκέντρωση 25 μΜ. 12.5 μΙ αραιωμένων ενώσεων με 87.5 μΙ φρέσκο ​​DMEM προστέθηκαν για την 2

ος γύρος διαλογής σε συγκέντρωση 12,5 μΜ. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως όχημα (0,25% σε 1

ου γύρο διαλογής και 0,125% σε 2

ος γύρος screening). IL-6 (250 ng /ml) και PD-180970 (250 ηΜ) χρησιμοποιήθηκαν όπως είναι γνωστό διεγερτικό και αναστολέα να ελέγξει απόκριση του συστήματος για κάθε κύκλο διαλογής σε ένα μόνο πλάκα. Η απόκριση του συστήματος θα μπορούσε να θεωρηθεί φυσιολογική, όταν η IL-6 προκαλεί περισσότερο από 2,5 φορές φθορισμού και PD-180970 δείχνει το 40% -50% αναστολή φθορισμού σε κάθε γύρο διαλογής. Χρησιμοποιήσαμε μια αντίθετη εικόνα με την παραδοχή ότι ο γνωστός αναστολέας PD-180970 έχει σημαντική αναστολή του σήματος, και πιθανοί αναστολείς θα έχουν πάντα καλύτερες επιδόσεις από ό, τι PD-180970. Δεδομένου ότι το θετικό μάρτυρα PD-180970 (250 nm) έδειξε πάντα μια αναλογία φθορισμού περίπου στο 50% και θα μπορούσε να αναστείλει την φωσφορυλίωση STAT3 σημαντικά όταν κρίνεται από την ανάλυση Western-Blot, εμείς επιλέξαμε το 50% ως «κόψει» την αξία, τότε οποιαδήποτε ένωση η οποία παρουσιάζει μια αναλογία φθορισμού των κυττάρων ελέγχου ≤50% (

δηλαδή

φθορισμού αναστολή ≥50%) θα πρέπει να διαλέξει. Οι λεπτομέρειες συνοψίζονται ως εξής: Στάδιο 1, 1

st γύρο διαλογής, ένα πηγάδι-One ένωση, 25 μΜ, δοκιμασία λουσιφεράσης μόνο. Οι ενώσεις διάλεξε όποτε FR (φθορισμού Ratio) είναι ≤50%. Μετά από αυτό το στάδιο, οι ενώσεις θα μπορούσαν να συλλέγονται περιλαμβάνουν ορισμένα υπερβολικά τοξικά. Για να αποκλειστεί η αναστολή φθορισμού που προκαλούνται από κυτταροτοξικότητα, εφαρμόστηκε Βήμα 2. Βήμα 2, 2

ος γύρος διαλογής, 12,5 μΜ της κάθε ένωσης από το Βήμα 1, και δύο επαναλήψεις για προσδιορισμούς λουσιφεράσης και ΜΤΤ εφαρμόστηκαν. Αν FR% είναι ≤50% & amp? Δ (CV% – FR%) είναι ≥30%, οι ενώσεις θα πρέπει να διαλέξει για περαιτέρω αναλύσεις. Οι υπερβολικά τοξικές ενώσεις αποκλείστηκαν από αυτό το βήμα. Η απόκλιση «30%» είναι μια τιμή εμπειρική που ήταν σε θέση να διακρίνουν υπερβολικά τοξικές ενώσεις και ειδικών ενώσεων. Εδώ, FR, φθορισμού Ratio = τιμή φθορισμού των επεξεργασμένων και διαιρείται δια φθορισμού αξία του ελέγχου καλά? CV, Cell Βιωσιμότητα = αξία επιβίωση των κυττάρων των επεξεργασμένων και διαιρείται με την αξία επιβίωση των κυττάρων του ελέγχου καλά? Λουσιφεράσης δοκιμασία διεξήχθη για Fluorescence Value? δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη για Επιβίωση κυττάρων Value. (Ποσοστό αναστολής φθορισμού = 100% – FR%? Ποσοστό αναστολής ανάπτυξης κυττάρων = 100% – CV%).

Για την δοκιμασία λουσιφεράσης, προστέθηκαν

50 μΙ υποστρώματος λουσιφεράσης Steady Glo (50 μl /φρεάτιο) . Μετά από 10 λεπτά επώασης, ο φθορισμός μετρήθηκε με Vector3 πολυεπίπεδη αντίθετη πλάκα (Perkin Elmer). Για τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ, 20 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκε για 4 ώρες επώασης. Οι προκύπτοντες κρύσταλλοι διαλύθηκαν σε 100 μΐ DMSO και η ένταση απορρόφηση μετρήθηκε με Vector3 σε μήκος κύματος 490 nm.

Western Blot-, Ανοσοκαταβύθιση and Cell Χρώση

Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS για τρεις φορές και λύθηκαν με RIPA ρυθμιστικού διαλύματος λύσεως επί 30 λεπτά στους 4 ° C (150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS, 50 mM Tris, ρΗ 7,5, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA , 1 × αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Roche), 1 × αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Roche)). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών, προσδιορίστηκε με τη μέθοδο BCA (Pierce, Θέρμο), στη συνέχεια διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Merck). Πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα.

κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκφράζουν Flag ετικέτα Src προκατεργάστηκαν με DMSO, PD180970 (500 ηΜ) και Brevilin Α (15 μΜ) για 4 ώρες ξεχωριστά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS τρεις φορές και λύθηκαν με 500 μΙ ρυθμιστικού λύσης (50 mM Tris HCI, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton Χ-100 ρΗ 7.4) με την παρουσία του κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και φωσφατάσης αναστολέας κοκτέιλ. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 12,000 χ rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Ίσες ποσότητες των πρωτεϊνών με μεθόδους BCA, στη συνέχεια επωάστηκαν με σφαιρίδια αντι-ΡΙβα Μ2 συγγένεια για 8 ώρες στους 4 ° C. δείγματα πρωτεΐνης Src εκλούστηκαν με 0.1 Μ γλυκίνη-ΗΟΙ, ρΗ 3,5 και εξουδετερώθηκε με Τρις-ΗΟΙ (0,5 Μ ρΗ 7,4).

Για την δοκιμασία απόπτωσης, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Δώδεκα ώρες αργότερα, μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με την παρουσία 10 μΜ Brevilin Α για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβάλλεται σε μια διαδικασία διπλής χρώσης αννεξίνης-ν-ΡΙ όπως στο πρωτόκολλο του αννεξίνης V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beyotime Institute of Biotechnology).

Καθαρισμός Πρωτεϊνών και Δοκιμασία Κινάσης

Ο-τερματικό Ηίδ-σημασμένη hSTAT3 ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη εκφράστηκε σε

E.coli

,

Rosetta

και καθαρίστηκε με Ni

χρωματογραφία + συγγένειας.

hSTAT3

CDS κλωνοποιήθηκε σε pET28b, και επάγεται από 0,5 mM ισοπροπυλοθειο-β-γαλακτοσίδη στους 37 ° C για 6 ώρες. έγκλειστα φυγοκεντρήθηκαν σε 12,000 χ rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C μετά τη θεραπεία με υπερήχους σε ολόκληρα

E.coli

κύτταρα. Στη συνέχεια, τα σώματα εγκλεισμού λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (0.5 Μ NaCl, 20 mM φωσφορικό νάτριο, 20 mM ιμιδαζόλη, 8 Μ ουρία, ρΗ 7.5). Ni

χρωματογραφία συγγένειας + σφαιρίδια στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τη σύνδεση εκτυλίχθηκε His-tagged hSTAT3. On-στήλη Αναδίπλωση επιλέχθηκε και, τέλος, η αναδιπλωμένη πρωτεΐνη STAT3 εκλούστηκε με ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης (0.5 Μ NaCl, 20 mM φωσφορικό νάτριο, 250 mM ιμιδαζόλη, ρΗ 7,5). Μετά από μια διαδικασία ανταλλαγής ιόντων, το καθαρισμένο hSTAT3 πρωτεΐνη σε PBS (10% γλυκερόλη) καταψύχθηκε για περαιτέρω ανάλυση.

Κατά προσέγγιση 5 × 10

8 κύτταρα ΗΕΚ293Τ εκφράζουν Flag-His Tyk2-JH1 συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (0.5 Μ NaCl, 20 mM φωσφορικό νάτριο, 20 mM ιμιδαζόλη, ρΗ 7,5). Ni

χρωματογραφία συγγένειας + σφαιρίδια στη συνέχεια χρησιμοποιείται για τη σύνδεση Flag-His-tagged Tyk2-JH1. Η πρωτεΐνη εκλούστηκε με 250 mM ιμιδαζόλης και αραιώνεται με ρυθμιστικό σύνδεσης σφαιρίδια αντι-ΡΕΑΟ Μ2 Affinity και επωάζονται με σφαιρίδια M2 Affinity για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Tyk2-JH1 πρωτεΐνη τελικά εκλούστηκε με PBS που περιείχε 3 × πεπτίδιο FLAG (500 ng /ml, 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου) για περαιτέρω ανάλυση κινάσης.

Κατά προσέγγιση 150 ng hSTAT3 πρωτεΐνη και 20 ng Tyk2-JH1 κινάση ήταν προ-επωάστηκαν με 1 × ρυθμιστικό κινάσης, παρουσία της σειράς συγκέντρωσης στα 10, 20, 40, και 80 μΜ, για 10 λεπτά. ΑΤΡ προστέθηκε στην αντίδραση σε συγκέντρωση 200 μΜ σε 50 μΙ τελικά όγκο. Η αντίδραση κινάσης στη συνέχεια συνεχίστηκε στους 37 ° C για 2 ώρες, και διακόπηκε με 5 πρωτεΐνη × ρυθμιστικό φόρτωσης δείγματος (95 ° C, 5 λεπτά). 20 μΐ από κάθε δείγμα φορτώθηκε για SDS-PAGE και Western Blot-ανάλυση.

RT-PCR και ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Σύνολο mRNA εκχυλίστηκε από καλλιεργημένα κύτταρα με κιτ καθαρισμού TianGen DNA . Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε με την M-MLV kit αντίστροφης μεταγραφής (Invitrogen, Life Technologies Corporation). Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου τελείωσε με κιτ μείγμα Roche Cyber ​​Πράσινη PCR σε Biorad C1000 Thermal Cycler. Τα ζεύγη εκκινητών για RT-PCR ήταν ως ακολούθως:

GAPDH

εμπρός 5′-TGGCAAATTCCATGGCAC-3 ‘, αντίστροφος 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3’?

socs3

μπροστά 5′-CCATGGTGGTGAAGACGC-3 ‘, αντίστροφη 5′-CCTGTCCAGCCCAATACCTGA-3’ [27]?

IRF-1

forward5′-CGATACAAAGCAGGGGAAAA-3 ‘, αντίστροφη 5′-TAGCTGCTGTGGTCATCAGG-3’ [28].

Ανάλυση Δεδομένων και Στατιστικές Μέθοδοι

Κάθε ανάλυση επαναλήφθηκε όπως υποδεικνύεται. Σχετική βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως ποσοστό (%) σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου. Οι ράβδοι σφάλματος εκπροσωπείται τυπική απόκλιση (± SD). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη μέθοδο ANOVA για κάθε τεστ σύγκρισης δύο ομάδων. Κηλίδα και η ένταση του σήματος εικόνας προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ2X. P-STAT3 και p-p65 αλλαγές φορές ομαλοποιήθηκαν σε συνολικό STAT3 και p65, αντίστοιχα, ενώ η π-ΑΚΤ και p-GSK-3β αλλαγές κανονικοποιούνται σε GAPDH.

socs3

και

IRF-1

μεταβολές της στάθμης του mRNA ομαλοποιήθηκαν με το σύνολο των

GAPDH

mRNA. Οι αριθμοί ποσοτικοποίηση εκπροσωπούνται στο κάτω μέρος των κηλίδων. Fold αλλαγές φθορισμού αννεξίνης-ν ομαλοποιήθηκαν με απαρίθμηση κυττάρων. IC

50 (GI

50) υπολογίστηκε από το λογισμικό SPSS19 (παλινδρόμηση-probit μέθοδος). Ιστογράμματα και διαγράμματα συντάχθηκαν με Προέλευσης 8 λογισμικού.

Αποτελέσματα

Ίδρυση της STAT3 σηματοδότηση με βάση υψηλής απόδοσης του συστήματος ελέγχου των ναρκωτικών.

κύτταρα Α549 ήταν επιμολυσμένα με φορέα αναφοράς λουσιφεράσης, ΣΗΕ-Luc-puro, που περιέχει επαναλαμβανόμενες στοιχεία απόκρισης STAT3 (16 × SIE, sis επαγόμενο element,5′-TTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAAGCTCGCTAGCATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGTTTCCCGTAAATTCCTGTAAGCTCGAGGATATCAAGATCTAGACACTAGAGGGTATATAATGGAAGCTCGACTTCCAGCTT-3′) (Εικ. S1). Σταθερές κυτταρικές γραμμή A549R από έναν κλώνο επιλέχθηκε τότε. Αυτός ο κλώνος ήταν σε θέση να απάντηση στις δύο κυτοκίνες και αναστολείς που εμπλέκονται στην σηματοδότηση STAT3 (Εικ. 1Α). IL-6 που προκαλείται από περίπου 5 × φθορισμού φορές, και PD-180970 θεραπεία έδειξε περίπου 50% αναστολή της δραστηριότητας της λουσιφεράσης. οι συγκεντρώσεις των IL-6 και PD-180970 για θεραπείες δεν επηρεάζεται σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων (Εικ. 1Β). PD180970, ο γνωστός αναστολέας κινάσης Src, ήταν ικανή να αναστείλει δραστηριότητα STAT3 εν μέρει σε Α549 κυτταρική γραμμή, όπως αναφέρθηκε [25] (Σχ. 1 C).

λουσιφεράσης (Α) και ΜΤΤ (Β) δοκιμασίες των κυττάρων A549R σε επεξεργασία με PD-180970 (250 ηΜ) και IL-6 (250 ng /ml) αντίστοιχα. A549R κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 (100 μl /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 10% FBS). Δώδεκα ώρες αργότερα, μέσα απομακρύνθηκαν και αντικαταστάθηκαν . με φρέσκο ​​μέσο με την παρουσία της IL-6 ή PD-180970 Bars δείχνουν την τυπική απόκλιση (± SD) (τρεις ανεξάρτητες επαναλήψεις, η = 5 σε κάθε επανάληψη) *** ρ & lt?. 0.001, ** ρ & lt? 0,01, * ρ & lt? 0,05, σημαντική σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος. NS, όχι στατιστικά σημαντική. (C) PD-180970 αναστέλλει τη δράση STAT3 στα κύτταρα A549R. A549R κύτταρα επιστρώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία των 100 mm σε 70% συρροή. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PD-180970 (250 ηΜ) για 24 ώρες. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

Ταυτοποίηση Brevilin Α ως STAT3 Σηματοδότησης Αναστολέα

Ενώσεις (1440 συνολικά) από φυσικά προϊόντα (Πίνακας S1) υποβλήθηκαν σε διαλογή όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Στο γύρο διαλογής 1

st, θεωρείται επίσης ως ένα τραχύ διαλογής, χρησιμοποιήθηκε μία ένωση-όνη στρατηγική καλά σε συγκέντρωση 25 μΜ. Εννέα ενώσεις έδειξαν% αναστολή περισσότερο από 50 φθορισμού (Πίνακας S2, τιμές σε κόκκινο). Στο 2

ος γύρος διαλογής, 12,5 μΜ ενώσεις επιλέχθηκαν για περαιτέρω λουσιφεράσης δοκιμασίας, καθώς επίσης και για επιπλέον δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας ΜΤΤ. Μόνο μία ένωση, που ονομάζεται Brevilin Α (Σχ. 2Α, ένα pseudoguaiane σεσκιτερπένιο από

Litsea glutinosa

, πληροφορίες που παρέχονται από τον αρχικό προμηθευτή) έδειξε ακόμα περισσότερο από το 50% αναστολή φθορισμού, ενώ παρουσίασαν απόκλιση (πάνω από 30% ) μεταξύ της βιωσιμότητας των κυττάρων (CV) και η αναλογία φθορισμού (FR). Θεωρούμε ότι οι ειδικοί αναστολείς του σήματος θα πρέπει να παρουσιάζει μεγαλύτερη αναστολή του σήματος από την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων μέσα σε 24 ώρες, και στο 2

ου γύρο διαλογής, αν FR% είναι ≤50% andΔ (CV% – FR%) είναι ≥30%, οι ενώσεις θα πρέπει να διαλέξει για περαιτέρω αναλύσεις (Πίνακας S3). Από τις 9 ενώσεις από 1 γύρο διαλογής

ου, μόνο Brevilin Μια πληρούνται τα κριτήρια αυτά (Εικ. S2). Φαινόταν ότι θα μπορούσαμε να πάρουμε τα ίδια αποτελέσματα με την αξιολόγηση βαθμολογίες Z στο 1

ος γύρος διαλογής (Πίνακας S4). Western Blot-απέδειξε περαιτέρω ότι Brevilin Α μπλοκάρει STAT3 τυροσίνης 705 φωσφορυλίωση σε μια συγκέντρωση που αναφέρεται 12.5 και 25 μΜ για 24 ώρες θεραπείας σε κύτταρα A549R (Εικ. 2Β). αναστολή σήματος και η βιωσιμότητα των κυττάρων στη συνέχεια αναλύθηκαν με λουσιφεράση και ανάλυση ΜΤΤ σε σειριακές συγκεντρώσεις Brevilin Μια θεραπεία μετά από 24 ώρες (Σχ. 2C). Brevilin Α επέδειξε καλύτερη STAT3 αναστολή σηματοδότησης σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο (IC

50 = 10,6 μΜ) σε σχέση με την αναστολή κυτταρικής βιωσιμότητας μέσα σε 24 ώρες (GI

50 & gt? 20 μΜ), υποδεικνύοντας ότι αυτό είναι ένα σήμα ειδικός αναστολέας περισσότερο από ένα ένωση που σκοτώνει άμεσα καλλιεργημένα κύτταρα με βάση την τοξικότητα των κυττάρων. Στη συνέχεια επέλεξε συγκεντρώσεις περίπου 10 μΜ για περαιτέρω αναλύσεις.

(Α) Διάρθρωση Brevilin Α (Β) Brevilin Α αναστέλλει τη φωσφορυλίωση STAT3 στα κύτταρα A549R. κύτταρα A549R απλώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 100 mm σε 70% συρροή. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με Brevilin Α (12.5 μΜ και 25 μΜ) για 24 ώρες. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. (Γ) σηματοδότηση STAT3 αναστάλθηκε από Brevilin Α σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο. A549R κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 1 × 10

4 (100 μl /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 10% FBS). Δώδεκα ώρες αργότερα, μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με την παρουσία Brevilin Α σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για άλλες 24 ώρες (20 μΜ, 17,5 μΜ, 15 μΜ, 12,5 μΜ, 10 μΜ, 7,5 μΜ, 5 μΜ, 2,5 μΜ και 1 μΜ). προσδιορισμοί λουσιφεράσης και ΜΤΤ Διεξήχθησαν στη συνέχεια. Μπαρ δείχνουν την τυπική απόκλιση (± SD) (3 ανεξάρτητες επαναλήψεις, n = 5 σε κάθε επανάληψη).

Η

Brevilin Α αναστέλλει μόνιμα ενεργοποιημένη-STAT3 Driven DU145 και MDA-MB-468 κύτταρα

Ανθρώπινο καρκίνωμα προστάτη κυτταρικές γραμμές DU145 και καρκίνου του μαστού MDA-MB-468 έδειξε συστατική δραστικότητα STAT3. Τότε θα ρωτήσω αν Brevilin Α θα μπορούσε να αναστείλει δραστηριότητα STAT3 σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Σχήμα 3Α και Β έδειξαν ότι Brevilin Α αναστέλλει σηματοδότηση STAT3 σε δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο τόσο DU145 (Εικ. 3Α) και MDA-MB-468 (Σχ. 3Β). Για να ελέγξετε το σήμα ειδική αναστολή, αναλύθηκαν τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της p65-Ser536, ΑΚΤ-Ser473 και GSK-3β-Ser9. Είναι ενδιαφέρον, Brevilin Α δεν παρουσιάζουν αντίστοιχες επιδράσεις στην φωσφορυλίωση των πρωτεϊνών αυτών (Σχ. 3Α, 3Β και 3C), υποδεικνύοντας ότι Brevilin Α δεν μπορεί να επηρεάσει ή να έχει λιγότερο αποτελέσματα επί άλλων σημάτων κυττάρων. Η αναστολή της δραστικότητας STAT3 συνήθως οδηγεί σε προς τα κάτω ρύθμιση των γονιδίων στόχων,

π.χ.

, C-Myc και CyclinD1 [17]. Εδώ, μετά από κατεργασία με Brevilin Α για 24 ώρες και 48 ώρες, τόσο c-Myc και CyclinD1 έκφραση μειώνεται σε DU145 και MDA-MB-468 κύτταρα (Σχ. 3D). Αυξημένη διασπασμένη PARP παρατηρήθηκε επίσης (Σχ. 3Ε), υποδεικνύοντας ότι Brevilin Α επάγεται DU145 και MDA-MB-468 απόπτωσης μετά από 24 ώρες θεραπείας [29]. Είναι σύμφωνο με τις αναφορές ότι ο αποκλεισμός της δραστικότητας STAT3 οδήγησε σε αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε DU145 [30] και MDA-MB-468 κύτταρα [31]. Στη συνέχεια, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε για DU145 και MDA-MB-468 κύτταρα, όπως επίσης και ανθρώπινα μη-μετασχηματισμένα τελομεράσης-αθανατοποιημένων ινοβλαστών κυττάρων BJ (hTERT-BJ, ένα κανονικό κύτταρο αθανατοποιημένη γραμμή). κύτταρα hTERT-BJ είχαν χαμηλότερη δραστικότητα STAT3 (Σχ. 4Α) και συνεπώς χρησιμοποιήθηκαν ως κύτταρα αρνητικού ελέγχου. Μετά από επεξεργασία με Brevilin Α για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, Brevilin Α έδειξε περισσότερο σημαντική αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης σε DU145 και MDA-MB-468 από hTERT-BJ τόσο σε 5 μΜ και 10 μΜ συγκέντρωση (Σχ. 4Β, αριστερά και Μέσης). Αρκετές άλλες ενώσεις, οι μηχανισμοί των οποίων ήταν γνωστές στη βιωσιμότητα των κυττάρων, επιλέχθηκαν ως έλεγχοι. AG490, ένας αναστολέας JAK, θα μπορούσε να αναστείλει JAK-STAT σηματοδότησης αύξηση εξαρτώμενη κυτταρική (

π.χ.

, DU145 και MDA-MB-468.)? Σταυροσπορίνη, η οποία είναι ένας γνωστός αναστολέας της κινάσης τυροσίνης παν-[32], αναστέλλει πολλά κυτταρικές διαδικασίες και συνήθως δεν εμφανίζει ειδικότητα τύπου κυττάρου? Η δοξορουβικίνη, μία άγρια ​​χρησιμοποιείται ένωση, είναι σε θέση να επάγει κυτταρική απόπτωση και ανάπτυξη μπλοκ κυττάρου [33]. Με τη σύγκριση των αποτελεσμάτων επί της βιωσιμότητας των κυττάρων μεταξύ των DU145, MDA-MB-468 και hTERT-BJ κυττάρων μετά από 24 ώρες φαρμακευτική αγωγή (Σχ. 4Β, η σωστή ιστόγραμμα), AG490 δείχνει παρόμοια αποτελέσματα (με Brevilin Α) σε αυτά τα κύτταρα, ενώ δοξορουβικίνη και σταυροσπορίνη είχε καμία εξειδίκευση στην κυτταρική βιωσιμότητα ή ανάπτυξη μεταξύ αυτών των κυττάρων. Περαιτέρω έρευνα με χρώση Annexin-V αποκάλυψε ότι Brevilin Α επέδειξε μια ισχυρότερη επαγωγή της απόπτωσης για DU145 και MDA-MB-468 (περίπου 2,2 και 4,4 φορές, αντίστοιχα) από ότι hTERT-BJ (~ 1,3 φορές) μετά από 24 ώρες θεραπείας (Σχ. 4C).

STAT3 τυροσίνης 705 φωσφορυλίωση αναστάλθηκε από Brevilin Α σε δόση (5 μΜ, 10 μΜ και 15 μΜ για 2 ώρες) και την ώρα (10 μΜ για 30 λεπτά, 60 λεπτά και 120 λεπτά) εξαρτώμενη ήθη τόσο DU145 (Α) και MDA-MB-468 (Β) κύτταρα, ενώ η φωσφορυλίωση του ρ65-Ser536 (Α και Β), η ΑΚΤ Ser473 και GSK-3β-Ser9 (C) δεν επηρεάστηκε αντίστοιχα (10 μΜ, 2 h). (D) c-Myc και CyclinD1 μειώθηκε μετά από 24 ώρες και 48 ώρες αγωγή με Brevilin Α (10 μΜ). Τα κύτταρα επιστρώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 100 mm για 12 ώρες, στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε θεραπεία με Brevilin Α όπως περιγράφεται. (Ε) διασπασμένη PARP αυξήθηκε σε DU145 και MDA-MB-468 κυττάρων με Brevilin Α (10 μΜ) αγωγή για 24 ώρες. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Η

(Α) STAT3 τυροσίνη 705 φωσφορυλίωση ανιχνεύθηκε σε hTERT-BJ, DU145 και MDA-MB-468 κύτταρα. (Β) Αριστερά και μεσαία διαγράμματα, hTERT-BJ, DU145 και MDA-MB-468 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 8 × 10

3 (100 μl /φρεάτιο σε ϋΜΕΜ με 10% FBS) . Δώδεκα ώρες αργότερα, μέσα απομακρύνθηκαν και αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα με την παρουσία Brevilin Α (5 μΜ και 10 μΜ) για 24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Δεξιά ιστόγραμμα, 12 ώρες αργότερα τα κύτταρα τοποθετήθηκαν, μέσα απομακρύνθηκαν και αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα με την παρουσία Brevilin Α (10 μΜ), AG490 (100 μΜ), δοξορουβικίνη (1 μΜ) και σταυροσπορίνη (100 ηΜ και 500 ηΜ) για 24 h. Dox, δοξορουβικίνη. Sta, σταυροσπορίνη. Μπαρ δείχνουν την τυπική απόκλιση (± SD) (3 ανεξάρτητες επαναλήψεις, η = 3 σε κάθε επανάληψη). *** P & lt? 0.001, ** p & lt? 0,01, * ρ & lt? 0,05. NS, όχι στατιστικά σημαντική. (C) Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Δώδεκα ώρες αργότερα, μέσο απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο με την παρουσία 10 μΜ Brevilin Α για 24 ώρες. DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα κύτταρα στη συνέχεια υποβάλλεται σε μια διαδικασία διπλής χρώσης αννεξίνης-ν-ΡΙ. Ίδιο πρόγραμμα έκθεσης χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε μήκος κύματος.

Η

Brevilin Ένα μπλοκ κυτοκίνης Induced δΤΑΤδ Σηματοδοσίας

Οι κυτοκίνες, όπως ιντερλευκίνες και ιντερφερόνες, συνήθως επάγει την ενεργοποίηση STAT3 μέσω της κανονικής οδού JAK-STAT. Έχει αναφερθεί ότι STAT3 ενεργοποιήθηκε σε DU145 και MDA-MB-468 έως IL-6 αυτοκρινείς βρόχους [34], [35]. Εδώ, με την παρουσία πρόσθετων IL-6 θεραπεία, βρήκαμε ότι Brevilin Α θα μπορούσε να αναστείλει την ενεργοποίηση STAT3 σε απόκριση στην IL-6 επαγωγή σε ΗΕΚ293Τ, κύτταρα HeLa και HepG2 (εικ. 5Α). Για να ελεγχθεί αν αυτή η αναστολή από Brevilin Α είχε εμπλακεί σε άλλες κυτοκίνες που προκαλείται ενεργοποίηση STAT3, ΙΡΝγ και ΙΡΝα χρησιμοποιήθηκαν. Εν συντομία, IL-6 που προκαλείται από ενεργοποίηση STAT3 μέσω της οδού IL6R-gp130-JAK [36], ενώ ΙΡΝγ και ΙΡΝα που επάγεται από την ενεργοποίηση Τύπος ΙΙ και τύπου ιντερφερόνη Ι- υποδοχέα JAK μονοπάτι αντίστοιχα [37]. Μετά την προεπεξεργασία των Hela με Brevilin Α, φωσφορυλίωση Tyr705 της STAT3 ανεστάλη σημαντικά όπως αναμενόταν (Εικ. 5Β). Η μεταγραφή του

socs3

(κατασταλτικά κυτοκίνης σηματοδότησης 3 πρωτείνη) γονιδίου ρυθμίζεται από ενεργοποίηση STAT3 απευθείας σε απόκριση σε κυτοκίνες όπως η IL-6 [38], έτσι ώστε το επίπεδο του mRNA της

socs3

συνήθως αντανακλά η μεταγραφική δραστηριότητα της STAT3. Μετρήσαμε τα επίπεδα του mRNA της

socs3

σε απόκριση στην IL-6 με ή χωρίς μία προεπεξεργασία Brevilin με RT-PCR σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ, HeLa και HepG2. Brevilin Μια ανέστειλε STAT3 με τη μεσολάβηση

socs3

μεταγραφή σε όλα αυτά τα κύτταρα δραματικά (Εικ. 5C). Real-time PCR αποτελέσματα έδειξαν κατά προσέγγιση 70% μείωση του

socs3

mRNA μετά επεξεργάστηκε με Brevilin Α παρουσία της IL-6 σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (Σχ. 5D).

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 100 mm για 12 ώρες, στη συνέχεια μέσα απομακρύνθηκαν και αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα χωρίς ορό για άλλες 12 ώρες. Brevilin Α (10 μΜ) προστέθηκε για 30 λεπτά προκατεργασία, τότε τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-6 (250 ng /ml), ΙΡΝα (5000 U /ml) και ΙΡΝγ (1500 U /ml) για 2 ώρες. φωσφορυλίωση STAT3 στη συνέχεια αναλύθηκαν με Western Blot-(Α και Β). (C) Τα κύτταρα επιστρώθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 100 mm για 12 ώρες, στη συνέχεια τα μέσα απομακρύνθηκαν και αντικαταστάθηκαν με φρέσκα μέσα χωρίς ορό για άλλες 12 ώρες. Brevilin Α προστέθηκε για 30 λεπτά προεπεξεργασίας (ΗΕΚ293Τ, 10 μΜ? Hela και HepG2, 15 μΜ), στη συνέχεια τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-6 (250 ng /ml), ΙΡΝα (5000 U /ml) και ΙΡΝγ (1500 U /ml) για 4 ώρες.

Socs3

mRNA αναλύθηκαν με RT-PCR. (D) σε πραγματικό χρόνο qPCR ανάλυση του

socs3

mRNA σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ που έλαβαν θεραπεία με Brevilin Α παρουσία της IL-6 (250 ng /ml). (Ε) Brevilin Α αναστέλλει προκαλούμενη Tyk2 και JAK2 φωσφορυλίωση ΙΡΝα και ΙΡΝγ αντίστοιχα, καθώς και φωσφορυλίωση τυροσίνης STAT1 σε κύτταρα HeLa ως επεξεργασία στο (Β). (F)

IRF

mRNA αναλύθηκαν με RT-PCR σε κύτταρα HeLa παρουσία ΙΡΝα όπως περιγράφηκε παραπάνω θεραπείες.

Η

Brevilin Α Blocks Janus Kinase Activity

από Brevilin Α θα μπορούσε να αναστείλει JAK2 και φωσφορυλίωση Tyk2 σε απάντηση ΙΡΝγ και ΙΡΝα (Σχ. 5Ε), που στη συνέχεια εξέτασαν τα αποτελέσματα της Brevilin Α στην σηματοδότηση STAT1. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η φωσφορυλίωση STAT1 και γονιδίου στόχου του

IRF1

μειώθηκαν παρουσία Brevilin Α μετά από επαγωγή κυτοκίνης (Σχ. 5Ε και 5F). Αυτά τα χαρακτηριστικά αποκαλύπτει ότι οι δυνητικοί άμεση ανασταλτική στόχους της Brevilin Α μπορεί να εντοπίσει ανάντη της STAT3 και STAT1 σηματοδότησης.