Αφηρημένο

ETV1

υπερεκφράζεται σε ένα υποσύνολο των κλινικών καρκίνων του προστάτη ως μεταγραφή σύντηξης με πολλούς διάφορους εταίρους. Ωστόσο,

ETV1

μπορεί επίσης να υπερεκφράζεται ως πλήρους μήκους μεταγραφή. λειτουργίες πλήρους μήκους ETV1 πρωτεΐνης διαφορετικά από περικομμένο ETV1 που παράγονται από τα γονίδια σύντηξης. Σε αυτή τη μελέτη περιγράφουμε την γενετικό υπόβαθρο του πλήρους μήκους

ETV1

υπερέκφραση και τις βιολογικές ιδιότητες των διαφόρων ισομορφών ETV1 πλήρους μήκους στον καρκίνο του προστάτη. Break-εκτός FISH έδειξαν σε πέντε από τα έξι δείγματα ασθενών με υπερέκφραση του πλήρους μήκους

ETV1

μια γονιδιακή αναδιάταξη του γονιδίου, δείχνοντας συχνή μετατόπιση. Είχαμε τη δυνατότητα να μελετήσουν τις αναδιατάξεις με περισσότερες λεπτομέρειες στα δύο όγκους. Στην πρώτη του όγκου 5′-RACE σε cDNA έδειξε σύνδεση η πλήρης

ETV1

μεταγραφή στο πρώτο εξόνιο ενός ειδικού προστατικού δύο εξόνιο ncRNA γονίδιο που χαρτογραφείται στο χρωμόσωμα 14 (

EST14

) . Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την έκφραση και των δύο full-length

ETV1

μεταγραφές και

EST14-ETV1

μεταγραφές σύντηξης. Σε επάλειψη χρωμόσωμα ενός ξενομοσχεύματος που προέρχεται από τη δεύτερη καρκίνο του προστάτη παρατηρήσαμε μια σύνθετη

ETV1

μετατόπιση συνεπάγεται χρωμόσωμα 7 θραύσμα που ελλιμενίζει

ETV1

και θραύσματα χρωμοσωμάτων 4 και 10. Περαιτέρω μελέτες αποκάλυψαν το υπερέκφραση πολλών διαφορετικών μεταγραφημάτων πλήρους μήκους, δημιουργώντας τέσσερα πρωτεΐνη ισομορφές με διαφορετικές περιοχές Ν-τερματικό. Ακόμη και η μικρότερη ισομορφή συντίθεται από πλήρους μήκους

ETV1

διεγείρονται

in vitro

αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη PNT2C2. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με την έλλειψη δραστηριότητας των ακόμη μικρότερη Ν-κολοβωμένη ETV1 παράγεται από μεταγραφές σύντηξης. Τα ευρήματά μας ότι στην κλινική υπερέκφραση του καρκίνου του προστάτη της πλήρους μήκους

ETV1

οφείλεται στη γονιδιωματική ανακατατάξεις που αφορούν διαφορετικά χρωμοσώματα και την ταυτοποίηση ενός συντομευμένη βιολογικά ενεργών ισομορφή ETV1 είναι ιδιαίτερα σημαντικές για την κατανόηση του μηχανισμού της λειτουργίας ETV1 στον καρκίνο του προστάτη .

Παράθεση: Γκάζι D, van der Korput ΗΑ, Douben HC, de Klein Α, de Ridder CM, van Weerden WM, et al. (2011) Η υπερέκφραση του πλήρους μήκους

ETV1

μεταγραφές στον Καρκίνο του Προστάτη Κλινική Λόγω Gene μετατόπισης. PLoS ONE 6 (1): e16332. doi: 10.1371 /journal.pone.0016332

Συντάκτης: Andrew Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Σεπτέμβρη 2010? Αποδεκτές: 10 Δεκ 2010? Δημοσιεύθηκε: 26 Γενάρη του 2011

Copyright: © 2011 Γκάζι et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση Μαρία Κιουρί (Cancure) που παρέχεται από την Ευρωπαϊκή Ένωση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

συγχωνεύσεις γονιδίων είναι σημαντικά στην ανάπτυξη πολλών αιματολογικών κακοηθειών και σαρκωμάτων, αλλά είναι σπάνιες σε περισσότερα άλλα είδη όγκων [1]. Ωστόσο, η συχνή συγχώνευση μεταξύ

TMPRSS2

και το γονίδιο ETS

ERG

έδειξε ότι το γονίδιο σύντηξης είναι μια ιδιαίτερα σημαντική εκδήλωση για τον καρκίνο του προστάτη [2], [3]. Η υπερέκφραση του

TMPRSS2-ERG

γονίδιο σύντηξης έχει αναφερθεί σε 40-70% των περιπτώσεων καρκίνου του προστάτη [2] – [5]. Συγχωνεύσεις των

,

ETV1

,

ETV4

και

ETV5

, τα οποία βρίσκονται σε διαφορετικά χρωμοσώματα, συμβαίνουν TMPRSS2

και άλλα τρία γονίδια που κωδικοποιούν μεταγραφικούς παράγοντες ETS σε χαμηλή συχνότητα στον καρκίνο του προστάτη [2], [6], [7]. Ωστόσο, για

ETV1

τουλάχιστον 10 διαφορετικών εταίρων σύντηξης έχουν περιγραφεί [8] – [10]. Τα περισσότερα από αυτά έχουν ως κοινό ότι, όπως

TMPRSS2

, είναι ειδικό για προστάτη και ανδρογόνα ρυθμίζονται εκφράζεται. Οι ιδιότητες των εταίρων σύντηξης είναι βασικά στοιχεία στην εξήγηση της ανδρογόνο-ρυθμίζεται η υπερέκφραση του ογκογονιδίου ETS στον καρκίνο του προστάτη. Ωστόσο, ένα μοναδικό χαρακτηριστικό του

ETV1

είναι ότι δεν μπορεί να υπερεκφράζεται μόνο στον καρκίνο του προστάτη ως ένα αντίγραφο της σύντηξης, αλλά και ως ένα πλήρους μήκους άγριου τύπου μεταγραφής.

Η μεγάλη οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων ETS αποτελείται από 27 μέλη [11] – [13]. Όλα τα μέλη έχουν κοινό ένα εξαιρετικά ομόλογη περιοχή πρόσδεσης DNA, την περιοχή ETS. Οι υπόλοιπες περιοχές της πλειονότητας των πρωτεϊνών ETS δείχνουν περιορισμένη δομική ομολογία. ETV1, ETV4 και ETV5 είναι τα μέλη μιας μικρής υπο-οικογένεια δομικά συγγενών πρωτεϊνών ETS. Αυτές οι πρωτεΐνες περιέχουν στην Ν-τερματική περιοχή συντηρημένη σύντομο όξινο τομέα διενεργοποίησης (ΣΕΔ), που είναι απούσα σε ERG. ETS πρωτεΐνες ρυθμίζουν πολλά γονίδια-στόχους που διαμορφώνουν βιολογικές διαδικασίες όπως η κυτταρική ανάπτυξη, αγγειογένεση, μετανάστευση, πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση. Ωστόσο, ποια από τις πολλές μοριακές και βιολογικές λειτουργίες των πρωτεϊνών ETS είναι πιο σημαντικό για τον καρκίνο του προστάτη δεν είναι γνωστή.

Μετά από

ERG, ETV1

είναι η πιο συχνά υπερεκφράζεται το γονίδιο ETS στον καρκίνο του προστάτη ( ~ 10% των όγκων) [10]. Η πρωτεΐνη που μεταφράζεται από ETV1 πιο μεταγραφές σύντηξης έχει περικοπεί, χωρίς τα 131 Ν-τερματικά αμινοξέα (dETV1). Περίπου. το ήμισυ των όγκων με

ETV1

υπερέκφραση εκφράζουν ένα αντίγραφο της σύντηξης, οι άλλοι δείχνουν ένα υψηλό επίπεδο πλήρους μήκους

ETV1

έκφρασης. Η

in vitro

βιολογικές και μοριακές ιδιότητες του dETV1 φαίνονται διαφορετικά από εκείνα της πρωτεΐνης οξύ 477 αμινοξέων πλήρους μήκους [10]. Η παρατήρηση αυτή υποδηλώνει ότι οι όγκοι με υπερέκφραση του πλήρους μήκους ETV1 είναι διαφορετικά από όγκους που εκφράζουν dETV1.

Λίγα είναι γνωστά σχετικά με το μηχανισμό της πλήρους μήκους

ETV1

υπερέκφραση και τη λειτουργία του στην κλινική του καρκίνου του προστάτη . παρόντα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η υπερέκφραση της πλήρους μήκους

ETV1

συσχετίζεται με αναδιάταξη του ETV1

χρωμοσωμική περιοχή. Επιπλέον, εντοπίσαμε ένα μυθιστόρημα, Ν-περικοπεί

ETV1

ισομορφή με την ίδια δραστηριότητα ως full-length

ETV1

.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Προηγουμένως , έχουμε αναφερθεί

ETV1

υπερέκφραση σε οκτώ από τα 84 δείγματα καρκίνου του προστάτη. Σε τέσσερις περιπτώσεις αυτό προκαλείται από ένα γονίδιο σύντηξης, στα άλλα τέσσερα πλήρους μήκους

ETV1

μεταγραφής υπερεκφράστηκε [10]. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η υπερέκφραση του

ETV1 από

αντίδραση μεταγραφάσης ποσοτική αντίστροφη (QPCR) σε μια νέα ομάδα από 66 καρκίνοι του προστάτη. Σε έξι RNAs

ETV1

ανιχνεύθηκε υπερέκφραση. Δείγματα G51, G59, G233, G270 και G268 προήλθαν από πρωτογενείς όγκους και G210 προήλθε από ένα επαναλαμβανόμενο όγκο. Τα έξι δείγματα μελετήθηκαν περαιτέρω με QPCR με ζεύγη εκκινητών στο 5′-άκρο του

ETV1

mRNA (εξόνιο 1F και εξόνιο 4R) και στο 3′-άκρο του mRNA (εξόνιο 11F και εξόνιο 12R) (Σχήμα 1Α). Ένα υψηλό εξόνιο 11-12 στο εξώνιο 1-4 αναλογία είναι ενδεικτική για ένα γονίδιο σύντηξης? μια αναλογία 1:01 έδειξε υπερέκφραση πλήρους μήκους

ETV1

mRNA. Με βάση αυτά τα κριτήρια, τους όγκους G51, G59, G233 και G270 εξέφρασε την πλήρη μήκους

ETV1

ενώ G210 και G268 εξέφρασε μια μεταγραφή σύντηξης (βλέπε επίσης τον έλεγχο PC374 που εκφράζει

TMPRSS2-ETV1

).

HNRPA2B1-ETV1

βρέθηκε ως η μεταγραφή σύντηξης σε G210 δείγμα (τα δεδομένα δεν φαίνονται)? η μεταγραφή σύντηξης σε G268 δεν έχει προσδιοριστεί ακόμη. Αυτά τα δύο δείγματα δεν διερευνήθηκαν περαιτέρω σε αυτή τη μελέτη.

(Α) QPCR σε RNA από κλινικά δείγματα που δείχνουν

ETV1

υπερέκφραση. Δύο ζευγών εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί

ETV1

έκφραση:

ETV1

εξόνιο 1 προς τα εμπρός και το εξώνιο 4 αντίστροφη, και το εξόνιο 11 προς τα εμπρός και το εξόνιο 12 αντίστροφο, αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες εκκινητών δίνονται στον συμπληρωματικό πίνακα S1. Τα ενισχυμένα προϊόντα προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε σχέση με την έκφραση της δεαμινάσης πορφοχοληγενής (

PBGD

) γονίδιο καθαριότητας. Δεδομένα κανονικοποιήθηκαν σε όλο το μήκος

ETV1

υπερεκφράζεται στην PC135 ξενομοσχεύματος. Ένα υψηλό εξόνιο 11/12 στο εξώνιο 1/4 αναλογία δείχνει μια

ETV1

περίπτωση συγχώνευσης, η αναλογία 1 προς 1 δείχνει υπερέκφραση ενός πλήρους μήκους

ETV1

μεταγραφή. PC374 είναι ένα ξενομόσχευμα ελέγχου που εκφράζει ένα

TMPRSS2-ETV1 γονίδιο

σύντηξης. Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από τα έξι δείγματα που δείχνουν

ETV1

υπερέκφραση απεικονίζεται. (Β) Μεσόφαση FISH για τα νωπά-κατεψυγμένα τμήματα του καρκίνου του προστατικού ιστού. Τα BAC χρησιμοποιείται υποδεικνύονται κάτω από την περιοχή του χρωμοσώματος 7 διερευνηθεί. BAC RP11-124L22 (κόκκινο) ανοίγματα

ETV1

και RP11-1149J13 (πράσινο) επικαλύπτει

DGKB

(αριστερό πάνελ). Οι θέσεις των γονιδίων από την κορυφή του χρωμοσώματος 7 αναφέρεται στην ΜΒΡ. Ένα σήμα διάσπαση αντιπροσωπεύει ETV1

μετατόπιση υποδεικνύεται με ένα βέλος. (Γ) Η μετατόπιση του

ETV1

στο χρωμόσωμα 14 σε G270 όγκου. τομές ιστών υβριδοποιήθηκαν με BAC RP11-460G19 (πράσινα) τα οποία επικαλύπτει

MIPOL1

και πλευρά

ETS14

και με το

ETV1

BAC RP11-124L22 (κόκκινο) (βλέπε Β για λεπτομέρειες). Στον αριστερό πίνακα η θέση του

MIPOL1

BAC στο χρωμόσωμα 14 ενδείκνυται. Στο δεξιό πίνακα ένα σήμα συγχώνευση (κίτρινο) δείχνει συν-εντοπισμό του

ETV1

και

MIPOL1

/

EST14

σε G270, όπως υποδεικνύεται από το βέλος.

στα επόμενα πειράματα που επικεντρώνονται στην αποσαφήνιση του μηχανισμού της υπερέκφραση πλήρους μήκους

ETV1

. Πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι σε δύο καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές που υπερεκφράζουν πλήρους μήκους

ETV1

, LNCaP και MDA PCa2b,

ETV1

μετατοπίζεται [8]. Εμείς απευθύνεται πλέον το ερώτημα αν σε κλινικά δείγματα μετατόπιση του πλήρους

θα μπορούσε να συμβεί ETV1

γονίδιο. Για την ανίχνευση γονιδιωματικής διαφάνειες αναδιατάξεων ιστό όλων των δειγμάτων καρκίνου του προστάτη τέσσερις με full-length

ETV1

υπερέκφραση αναλύθηκαν από διάλειμμα-εκτός ενδιάμεσης ψάρι με δύο σημασμένων ανιχνευτών BAC, ένα BAC αναγνωρίζεται

ETV1

και η δεύτερη η συνοδευτικά γονίδιο

DGKB

(Εικόνα 1Β). Η σειρά συμπληρώθηκε με δύο δείγματα που φιλοξενούν πλήρους μήκους

ETV1

υπερέκφραση από μας προηγούμενη μελέτη, G89 και G308 [10], για το οποίο κατεψυγμένοι ιστοί επαρκούς μορφολογικής ποιότητας ήταν διαθέσιμα. Το Σχήμα 1Β δείχνει τα αποτελέσματα των πειραμάτων FISH. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε διάσπαση σήματα σε όλα τα δείγματα εκτός από την G59, υποδεικνύοντας συχνές

ETV1

ανακατατάξεις σε καρκίνους του προστάτη που υπερεκφράζουν πλήρους μήκους

ETV1

. Απουσία διάσπαση σήματος στην G59 υποδηλώνει απουσία μετατόπιση, αν και δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ένα σημείο διακοπής έξω από την περιοχή έρευνας. παρατηρείται μεγάλη συχνότητα του δείχνει γονιδιωματική αναδιάταξη ως ένα σημαντικό μηχανισμό της πλήρους μήκους

ETV1

υπερέκφραση σε κλινικές του καρκίνου του προστάτη. Προφανώς, η χρωμοσωμική περιοχή στην οποία

ETV1

μετατοπίζεται μπορεί να συμβάλει στη διαλεύκανση του μηχανισμού του

ETV1

υπερέκφραση. Ήμασταν σε θέση να εντοπίσει περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τις ανακατατάξεις στα δείγματα G270 και G89.

Έχει αποδειχθεί σε LNCaP κύτταρα που

ETV1

μετατοπίζεται προς 14q13.3-q21.1. Η όλη γονίδιο είναι ενσωματωμένο στο τελευταίο ιντρόνιο του

MIPOL1

. Σε MDA PCa2b,

ETV1

μετατοπίζεται στην ίδια περιοχή, αν και η ακριβής θέση είναι άγνωστη [8]. Επιπλέον, περιγράψαμε προηγουμένως εισαγωγή περικοπεί

ETV1

στο ιντρόνιο ενός γονιδίου δύο εξόνιο που κωδικοποιεί μια ncRNA, συμβολίζεται

EST14

, δίνοντας αφορμή για ένα

EST14-ETV1

σύντηξης μεταγραφή που περιέχει

ETV1

εξόνιο 5-12 ακολουθίες (G342 δείγματος σε διαιτητή 10?. Εικόνα 2Α). Είναι σημαντικό ότι,

EST14

χάρτες σε άμεση γειτνίαση με

MIPOL1

στο 14q. Όπως και οι περισσότεροι

ETV1

εταίρους σύντηξης,

EST14

είναι ένα γονίδιο ειδικού προστατικού ανδρογόνων-ρυθμίζεται. Για να διερευνήσουν κατά πόσον η ίδια χρωμοσωμική περιοχή ενεπλάκη σε full-length

ETV1

μετατόπιση στο μυθιστόρημα ομάδα μας, ενδιάμεσης FISH έγινε με το

ETV1

BAC (Εικόνα 1Β) σε συνδυασμό με ένα

MIPOL1

BAC (Σχήμα 1C). Μία συγχώνευση κίτρινο σήμα ανιχνεύθηκε σε δείγμα G270 (Σχήμα 1C), αλλά σε κανένα από τα άλλα όγκων. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι αν και φαίνεται να υπάρχει μια προτίμηση για το χρωμόσωμα 14q13.3-21.1, άλλες περιοχές του γονιδιώματος θα συμβάλει επίσης στην αναδιοργάνωση και η υπερέκφραση του πλήρους μήκους

ETV1

.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του

ETV1

–

EST14

μεταγραφές σύντηξης σε όγκους του προστάτη G270 και G342 (G342 δείγμα είναι από διαιτητή. 10). Τα βέλη υποδεικνύουν τις θέσεις των εκκινητών που χρησιμοποιούνται στο πείραμα RT-PCR. Οι αλληλουχίες των εκκινητών φαίνεται στον συμπληρωματικό πίνακα S1. (Β) Ακολουθία του σημείου σύντηξης του

EST14

και

ETV1

στο δείγμα G270. Η θέση του σημείου σύντηξης στο G270 όγκου χαρτογραφήθηκε από μακράς εμβέλειας PCR σε γονιδιακό DNA με ένα πρόσθιο εκκινητή στο

EST14

ιντρόνιο και αντίστροφο εκκινητή ανοδικά του

ETV1

εξόνιο 1. Κατά την σημείο σύντηξης δύο υπολείμματα Τ χάθηκαν. Το σημείο διακοπής στο

EST14

στο G270 και G342 υποδεικνύονται από τα βέλη.

Η

Πρόσθετες πληροφορίες

ETV1

αναδιάταξη στο G270 ήρθε από 5′-RACE του cDNA όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι, δεν είχαμε μόνο να ανιχνεύσει όπως αναμενόταν το full-length

ETV1

μεταγραφή, αλλά και ένα αντίγραφο της σύντηξης (Εικόνα 2Α). Ένα τέτοιο αποτέλεσμα δεν βρέθηκε για οποιαδήποτε από τις άλλες όγκων που υπερεκφράζουν πλήρους μήκους

ETV1

. Ο προσδιορισμός αλληλουχίας έδειξε ότι η μεταγραφή σύντηξη σε G270 αποτελείται από

ETV1

εξόνιο 1-12 προηγείται το πρώτο εξόνιο του

EST14

(Εικόνα 2Α). Σάρωση η

EST14

ιντρόνιο και

ETV1

όμορη περιοχή με μεγάλης εμβέλειας PCR και αλληλούχιση χαρτογραφηθεί τα σημεία διακοπής στο G270 -1,9 Κορ ανάντη του

ETV1

εξόνιο 1 και ~ 5 Kbp κατάντη του

EST14

εξόνιο 1. το σημείο διακοπής στο

EST14

είναι μόνο 180 bp εκτός από το σημείο διακοπής στο G342 (Εικόνα 2Β και διαιτητή. 10).

Περαιτέρω πληροφορίες του

ETV1

αναδιάταξη επίσης συλλέγονται για G89 δείγματος. Προηγουμένως, ένα ξενομόσχευμα πολλαπλασιάστηκαν σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς είχαν δημιουργηθεί από αυτόν τον όγκο (PC135). Όπως G89 όγκου, PC135 υπερεκφράζεται πλήρους μήκους

ETV1

[3]. Η διαθεσιμότητα του ξένου μοσχεύματος επέτρεψε την προετοιμασία των spreads χρωμοσωμάτων μετάφασης. Σε πολύχρωμα FISH ένα σύνθετο πρότυπο χρωμοσωμική αναδιάταξη βρέθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεμονωμένα χρώματα χρωμοσώματος χρησιμοποιήθηκαν για την επικύρωση των δεδομένων πολύχρωμα FISH. Βαφή του χρωμοσώματος 7 έδειξε την παρουσία πολλαπλών 7 χρωμοσωμικά θραύσματα (Σχήμα 3). Ο υβριδισμός με ένα

ETV1

BAC εντόπισε την παρουσία τριών αντιγράφων του γονιδίου: δύο σε φαινομενικά φυσιολογικά χρωμοσώματα 7 και ένα, σε ένα συγκρότημα χρωμόσωμα δείκτη. Επακόλουθα πειράματα έδειξαν ότι το χρωμόσωμα δείκτη που περιέχεται θραύσματα χρωμοσωμάτων 4, 7 και 10, όπως υποδεικνύεται για πρώτη φορά από πολύχρωμες FISH (Σχήμα 3). Η

ETV1

BAC υβριδοποιήθηκαν στη διασταύρωση του χρωμοσώματος 7 και το χρωμόσωμα 4 θραύσμα, υποδηλώνοντας έντονα ότι η 4? 7 μετατόπιση έπαιξε σημαντικό ρόλο στην υπερέκφραση του

ETV1

. Οι ακριβείς θέσεις των σημείων διακοπής στο 4 και 7 μένει να καθοριστεί. Τα δεδομένα μας προβλέπουν ότι οι πολλαπλές χρωμοσωμικές περιοχές που εμπλέκονται στην υπερέκφραση της πλήρους μήκους

ETV1

. Τουλάχιστον μία από αυτές τις περιοχές είναι στο χρωμόσωμα 14 και μια δεύτερη στο χρωμόσωμα 4. Το χρωμόσωμα 14 περιοχή εμπλέκεται επίσης στην

ETV1

σύντηξη γονιδίων. τεχνολογία Deep αλληλουχίας θα μπορούσε να συμβάλει στην αναγνώριση των άλλων

ETV1

αναδιατάξεις.

Χρώματα των χρωμοσωμάτων 4, 7 και 10 είναι πράσινο και το

ETV1

BAC (Σχήμα 1β) είναι κόκκινος. Μαύρα βέλη δείχνουν την μετατοπίζεται

ETV1

. Στο κάτω πίνακα το σχετικό χρωμόσωμα δείκτης εγκλωβιστούμε σε κόκκινο.

Η

Λεπτομερής χαρακτηρισμός της πλήρους μήκους

ETV1

μεταγραφές στους διάφορους όγκους από 5′-RACE και αλληλουχίας έδειξε ότι όχι μόνο

ETV1

εξόνιο 1 εξόνιο 12 μεταγραφές ήταν παρόντες, αλλά και διάφορες άλλες full-length

ETV1

μεταγραφές, που προκύπτουν από εναλλακτική χρήση του υποκινητή. Αυτές οι μεταγραφές ήταν συμβολίζεται ως

ETV1

,

ETV1-1a

,

ETV1-1b

και

ETV1-1c.

Εικόνα 4Α και Συμπληρωματική Εικόνα S1 show οι θέσεις των διαφόρων πρώτων εξώνια στο γονίδιο και υποδεικνύει τα διάφορα κωδικόνια έναρξης ATG. Και των δύο

ETV1-1a

και

δύο ETV1-1b

παραλλαγές ματίσματος βρέθηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πειράματα QPCR χρησιμοποιώντας μεταγραφής-ειδικούς εκκινητές σε RNA από όλα τα έξι κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη που υπερεκφράζονται

ETV1

έδειξε ότι το επίπεδο της έκφρασης των διαφόρων μεταγραφημάτων ήταν μεταβλητή στις διάφορες όγκους (βλέπε σχήμα S2).

ETV1

ήταν δύσκολα εκφράζονται σε έλεγχο καλοήθη προστάτη G277 δείγμα υπερπλασία. Το Σχήμα 4Β παριστά σχηματικά την προβλεπόμενη σύνθεση των διαφόρων ETV1 πρωτεΐνη ισομορφές που θα παράγονται. Σημειώστε ότι ETV1-1c είναι μακράν η συντομότερη, στερείται τα Ν-τερματικά 60 αμινοξέα, συμπεριλαμβανομένης το μεγαλύτερο μέρος της διατηρημένης όξινων TAD. Σε dETV1 που εκφράζεται από τα περισσότερα γονίδια σύντηξης, τα Ν-termimal 131 αμινοξέα είναι απούσα. ETV1, ETV1-1b1 και -1Β2 ήταν παρόμοιου μεγέθους, όπως φαίνεται στη Δυτική κηλίδες λύματα από επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ κύτταρα (Εικόνα 4Β).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση της οργάνωσης του

ETV1

γονίδιο. Εναλλακτικές πρώτα εξώνια είναι 1α, 1, 1β και 1γ. Οι θέσεις των τεσσάρων διαφορετικών κωδικονίων ATG έναρξης υποδεικνύεται. Περισσότερες πληροφορίες δίνονται στη συμπληρωματική Εικόνα S1. (Β) Σχηματική αναπαράσταση της σύνθεσης των διαφορετικών πρωτεϊνών ETV1 και την έκφρασή τους σε επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Διαφορετικά χρώματα του Ν-τελικές περιοχές δείχνουν μία διαφορετική σύνθεση αμινοξέων. dETV1 είναι η κομμένη πρωτεΐνη ETV1 που παράγεται από τα γονίδια σύντηξης. Αυτή η πρωτεΐνη δεν είναι σε θέση να διεγείρει αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη. Στο δεξιό πάνελ ένα στύπωμα Western ETV1 ισομορφών παράγεται από παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα ΗΕΚ293Τ δείχνεται. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (C) Soft-άγαρ δοκιμασία δείχνει την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων PNT2C2 μολυνθεί με φακοϊούς εκφράζουν τα διάφορα ισόμορφα ETV1 ή ελέγχουν GFP. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο αριθμό των αποικιών ανά πεδίο μικροσκοπίου τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (± SD). Αντιπροσωπευτικά εικόνες των χρωματισμένων αποικιών φαίνεται παρακάτω σχήμα ράβδου.

Η

Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι ETV1 και dETV1 διέφεραν σε διέγερση του

in vitro

ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη [10] . κύτταρα μολυσμένα με PNT2C2 όλα τα νέα κατασκευάσματα ETV1 επαγόμενη από αγκύρωση ανάπτυξη ανεξάρτητη με παρόμοιο τρόπο όπως ETV1 (Σχήμα 4C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, ETV1-1c, παρόλο που εκφράζεται σε χαμηλότερο επίπεδο και πολύ μικρότερα, είναι τόσο ενεργό όσο τα πλέον ισομορφές ETV1. Έτσι, η πλήρης TAD Ν-τερματικό δεν ήταν απαραίτητη αλλά αμινοξέα 61-131 φαίνεται να είναι απαραίτητη για τη βιολογική δραστικότητα του ETV1 (Σχήμα 4Β, C).

Εν περιλήψει, τα δεδομένα που παρουσιάζονται αποκαλύπτουν δύο σημαντικές νέες πτυχές του ρόλος του ETV1 στον καρκίνο του προστάτη. Πρώτον, φαίνεται ότι στην κλινική καρκίνους του προστάτη μια υποομάδα ETV1 θετικούς ασθενείς δείχνουν πλήρους μήκους

ETV1

υπερέκφραση λόγω μεταθέσεις του συνόλου γονιδίων σε διαφορετικά χρωμοσώματα. Αυτή η νέα παρατήρηση συμπληρώνει την καλά-περιγράφονται μηχανισμός υπερέκφρασης κόλουρου ETV1 προκαλείται από συντήξεις γονιδίου όπου ρύθμιση έκφρασης προσδιορίζεται από τον προαγωγό και ενισχυτές των εταίρων σύντηξης. Δεύτερον, σε αντίθεση με dETV1 που παράγονται από συντήξεις γονιδίου, ένα σύντομο ισομορφή του πλήρους μήκους ETV1, ETV1-1c, λείπει το μεγαλύτερο μέρος του Ν-τερματικού TAD, είναι τόσο ενεργό όσο περισσότερο ισομορφές ETV1, περιέχει το πλήρες Ν-τερματικό όξινο TAD. Το εύρημα αυτό επισημαίνει την ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη σε μια μικρή περιοχή η οποία είναι απούσα σε κολοβωμένη ETV1 εκφράζονται από γονίδια σύντηξης.

Είναι ιδιαίτερα σημαντικό να αυξηθεί ο αριθμός των κλινικών δειγμάτων ώστε να είναι σε θέση να συγκρίνει την εξέλιξη του όγκου σε οι δύο υποομάδες των καρκίνων του προστάτη που δείχνει υπερέκφραση του κόλουρου εναντίον πλήρους μήκους ETV1, και για τον προσδιορισμό των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε διάφορες βιολογικές συμπεριφορά τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

η χρήση των δειγμάτων εγκρίθηκε από την υγειονομική επιτροπή Δεοντολογίας Erasmus MC, σύμφωνα με την ιατρική έρευνα σε ανθρώπους δράσουμε στο πρωτόκολλο MEC-2004-261, με τίτλο «η χρήση των ανθρώπινων φυσιολογικών και καρκινικών υπολειμματική ιστού από μια τράπεζα ιστών για το χαρακτηρισμό του DNA, RNA και πρωτεϊνών «.

τα ποντίκια στεγάστηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του Ιατρικού Κέντρου Erasmus, και οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σε συμμόρφωση με τα πρότυπα για τη χρήση των πειραματόζωων. Οι πειράματα σε ζώα που πραγματοποιήθηκαν σε αυτό το χειρόγραφο έχουν εγκριθεί από το ζώο πειραματική επιτροπή του Ιατρικού Κέντρου Erasmus (DEC-συμβουλευτείτε το Erasmus MC έργο 102-10-01).

δείγματα ιστών, RNA και την απομόνωση DNA

Snap-κατεψυγμένα καρκίνους του προστάτη ελήφθησαν από ριζική προστατεκτομή ή διουρηθρική εκτομή. Αιματοξυλίνη /ηωσίνη (ΗΕ) χρωματίστηκαν τομές ιστών ιστολογικά αξιολογήθηκαν από έναν παθολόγο (G. van Leenders). Όλα τα δείγματα περιείχαν τουλάχιστον 50 κύτταρα% του όγκου.

RNA από κλινικά δείγματα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNA Bee-(Campro Scientific, Βερολίνο, Γερμανία). DNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ DNA DNeasy Extraction (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA από κυτταρικές γραμμές απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy RNA Extraction (Qiagen).

Breakpoint χαρτογράφηση

Η θέση του σημείου σύντηξης σε όγκο 270 χαρτογραφήθηκε με μακράς εμβέλειας PCR σε γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας ένα προς τα εμπρός εκκινητή στο

EST14

ιντρόνιο και αντίστροφο εκκινητή ανοδικά του

ETV1

εξώνιο 1. PCR προϊόντα διαχωρίστηκαν επί πηκτής αγαρόζης 1% και η αλληλουχία σε ένα ΑΒΙ 3100 γενετικό αναλυτή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

Q-PCR

έκφραση του mRNA αναλύθηκε με QPCR. cDNA παρασκευάστηκε με MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) και ολιγο (dT) 12 εκκινητή. QPCR διεξήχθη σε υδραυλικό SYBR Green PCR Master Mix σε έναν ΑΒΙ Prism 7700 Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems). Τα ενισχυμένα προϊόντα προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε σχέση με πορφοχοληγενής δεαμινάση (

PBGD

) με την πρότυπη μέθοδο καμπύλη. Για εκκινητές βλέπε Πίνακα S1.

RNA λιγάση μεσολάβηση ταχεία ενίσχυση των άκρων cDNA

5′-RLM-RACE πραγματοποιήθηκε με χρήση του κιτ GeneRacer της Invitrogen. cDNA ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας την GeneRacer 5′-εκκινητή και μια αντίστροφη έναυσμα ειδικού γονιδίου (ETV1 εξόνιο 6). Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε μια γέλη αγαρόζης 1,5%, και ζώνες αποκόπηκαν, καθαρίστηκαν και αλληλουχήθηκαν.

φθορισμού

in situ υβριδισμού

FISH έγινε σε 5-μm τομές κατεψυγμένου ιστού σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα με μικρές τροποποιήσεις [14]. BAC κλώνοι RP11-124L22 (

ETV1

), RP11-460G19 (

MIPOL1

), RP11-1149J13 (

DGKB

) αγοράστηκαν από Bacpac Πόρων (bacpac.chori. org). BACs ήταν είτε διγοξιγενίνη-11-dUTP ή βιοτίνη-16-dUTP (Roche, Basel, Schweiz) επισημαίνονται και εμφανιζόμενα με αντι-διγοξιγενίνης FITC (Roche) ή στρεπταβιδίνης-Alexa 594 (Invitrogen). Τομές ιστού βάφτηκαν αντίθετα με DAPI. Εικόνες συλλέχθηκαν σε μικροσκόπιο επιφθορισμού (Leica DM, Wetzlar, Γερμανία) εξοπλισμένη με μια συσκευή συζευγμένου φορτίου ψύχεται κάμερα (Photometrics, Tuscon, AZ, USA).

Για την παρασκευή των spreads μετάφαση, ξενομόσχευμα PC135 διαδόθηκε σε αρσενικά γυμνά ποντίκια. Ενιαία κύτταρα συλλέχθηκαν με άλεσμα και διήθηση. Μεταφάσης προετοιμασία και υβριδοποίησης ήταν ουσιαστικά όπως περιγράφεται [14]. χρώματα χρωμόσωμα 4, 7 και 10 ήταν από την Euro-Diagnostica (Malmö, Σουηδία). Μεταφάσεις αναλύθηκαν με Αχίορίαπ 2 Imaging μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Oberkochen, Γερμανία) και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Ίσις (MetaSystems, Altiussheim, Γερμανία).

πλασμίδια έκφρασης

cDNAs των διαφορετικών ισομορφές ETV1 ενισχύθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκαν σε pGEM-TEasy (Promega). Εισάγει επαληθεύτηκαν ακολουθία και κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα έκφρασης pcDNA3 (Invitrogen) ή τον Lenti-ιικό φορέα pWPXLd (Didier Trono, Πανεπιστήμιο της Γενεύης).

Western ανάλυση κηλίδος

Για την ανάλυση στυπώματος Western, κύτταρα ΗΕΚ293Τ επιμολύνθηκαν με τις διαφορετικές έκφρασης pcDNA3-ETV1 κατασκευάσματα χρησιμοποιώντας την μέθοδο καθίζησης φωσφορικού ασβεστίου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών με αντίσωμα που κατευθύνεται προς την ETV1 Ο-άκρο (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA). Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με χημειοφωταύγεια (Pierce, Rockford, IL, USA).

λεντοϊών λοιμώξεις

ΗΕΚ293Τ κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης pWPXLd-ETV1, ή pWPXLd-GFP (έλεγχος), και pPAX2 και pMD2.G (Trono) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο καταβύθισης φωσφορικού ασβεστίου. Ιός συλλέχθηκε από το υπερκείμενο και χρησιμοποιήθηκε για τη μόλυνση των κυττάρων PNT2C2. Πισίνες των μολυσμένων κυττάρων πολλαπλασιάστηκαν.

μαλακό άγαρ

δοκιμασία

Ένα στρώμα 0.6% χαμηλής τήξης αγαρόζη σε πρότυπο μέσο καλλιέργειας παρασκευάστηκε σε πλάκες έξι φρεατίων. Στην κορυφή, ένα στρώμα 0,3% αγαρόζη που περιείχε 1 × 10

4 PNT2C2 κύτταρα μολυσμένα με διάφορους ιούς ETV1 που εκφράζουν ή κύτταρα ελέγχου PNT2C2-GFP απλώθηκαν. Την ημέρα 14, τα κύτταρα βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν οι αποικίες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

μέρος της γονιδιωματικής αλληλουχίας του

ETV1

. Τα διαφορετικά εξώνια επισημαίνονται με κίτρινο χρώμα. Τα κωδικόνια έναρξης μετάφρασης υπογράμμισε. Σημειώστε ότι η μεταγραφή ξεκινώντας από το εξόνιο 1a μπορεί ή δεν μπορεί να περιλαμβάνει το εξόνιο 1Α1 αλλά η έναρξη της μετάφρασης είναι η ίδια με εκείνη της μεταγραφής που ξεκινούν από το εξόνιο 1. Το τέλος του εξονίου 1Β1 υποδεικνύεται με κόκκινο χρώμα.

ETV1

μεταγραφές που ξεκινούν από εξώνια έλλειψη εξόνιο 1γ 1, 2 και 3, η οποία έχει ως αποτέλεσμα μια κολοβωμένη TAD στην μεταφρασμένης πρωτεΐνης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016332.s001

(DOC)

Εικόνα S2.

έκφραση των διαφόρων

ETV1

μεταγραφές προσδιορίστηκε από QPCR στο Fast σύστημα Real-Time PCR 7900HT από την Applied Biosystems, χρησιμοποιώντας τη δύναμη SYBR πράσινο κύριο μείγμα (Applied Biosystems). τα επίπεδα έκφρασης είναι σε σχέση με το γονίδιο της καθαριότητας

PBGD

.

ETV1

και

PBGD

εκκινητών παρατίθενται στον συμπληρωματικό πίνακα S1. Δείγμα G277 είναι μια καλοήθη υπερπλασία του προστάτη. Έχει πολύ χαμηλή ή καθόλου έκφραση όλων των διαφορετικών

ETV1

μεταγραφές. Δείγματα G51, G59, G89, G233, G270 και G308 όλα υπερεκφράζουν

ETV1

Οι διάφορες μεταγραφές εκφράζονται σε διάφορα επίπεδα

doi:.. 10.1371 /journal.pone.0016332.s002

(ΔΕΘ )

Πίνακας S1.

Primer ακολουθίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016332.s003

(ΔΕΘ)