Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρή, μη-κωδικοποίησης RNA που ρυθμίζουν ποικίλες κυτταρικές λειτουργίες καταστέλλοντας την έκφραση της πρωτεΐνης-στόχου. Υποθέσαμε ότι ένα σύνολο microRNA ρυθμίζουν αποκρίσεις όγκου στην υποξία με αναστολή συστατικά του μονοπατιού σηματοδότησης υποξία. Βρήκαμε ότι η έκφραση miR-22 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου είναι χαμηλότερο σε σχέση με φυσιολογικό ιστό κόλου. Βρήκαμε επίσης ότι miR-22 ελέγχει την υποξία διεγέρσιμο 1α παράγοντας (HIF-1α) έκφρασης στην κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116. Υπερ-έκφραση του miR-22 παρεμποδίζει την έκφραση του HIF-1α, καταστέλλοντας αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) παραγωγή κατά την υποξία. Αντιστρόφως, knockdown του ενδογενούς miR-22 ενισχύει την επαγόμενη από την υποξία έκφραση του HIF-1α και VEGF. Το προσαρμοσμένο μέσο από κύτταρα που υπερεκφράζουν miR-22 περιέχουν λιγότερη πρωτεΐνη VEGF από κύτταρα ελέγχου, και επίσης επάγουν λιγότερο αύξησης των ενδοθηλιακών κυττάρων και εισβολή, υποδηλώνοντας miR-22 σε γειτονικά κύτταρα επιρροές λειτουργία ενδοθηλιακών κυττάρων. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι το miR-22 μπορεί να έχει μια αντι-αγγειογενετική δράση στον καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Yamakuchi M, Yagi S, Ito Τ, Lowenstein CJ (2011) microRNA-22 Ρυθμίζει υποξία Σηματοδότηση στο Καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα. PLoS ONE 6 (5): e20291. doi: 10.1371 /journal.pone.0020291

Επιμέλεια: Costanza Emanueli, Πανεπιστήμιο του Μπρίστολ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 18η Ιανουαρίου του 2011? Αποδεκτές: 24η Απριλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: May 23, 2011

Copyright: © 2011 Yamakuchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση American Heart Association (0835446N) (μου) και επιχορήγηση ΝΙΗ (CJL). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρής μη-κωδικοποίησης RNAs (18-22 nt), τα οποία αναστέλλουν την έκφραση του γονιδίου. Ώριμη miRNAs παράγονται από την RNase III ένζυμα Drosha και Dicer, τότε ενσωματώσει στο RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC), και τελικά συνδέονται προς την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του γονιδίου στόχου mRNA τους, αναστέλλοντας τους έκφραση [1], [2]. Πιστεύεται ότι διαδοχικές ζευγαρώματος βάσης τουλάχιστον 7 νουκλεοτιδίων μεταξύ της αλληλουχίας miRNA (αλληλουχία σπόρος) και του στοιχείου miRNA αναγνώρισης (MRE) είναι αναγκαία για να καταστείλει την μετάφραση πρωτεΐνης [3], [4], [5], [6], [7]. Επιπλέον, ορισμένες μελέτες δείχνουν ότι η ατελής δεσμευτική, όπως ταλαντεύσεις ή εξογκώματα στην ακολουθία σπόρων αναστέλλει την πρωτεϊνική μετάφραση [8], [9].

miRNAs έχουν μια ποικιλία φυσιολογικών και παθολογικών λειτουργιών, συμπεριλαμβανομένου του ελέγχου της ογκογένεσης [ ,,,0],10], [11], [12]. Ο μεταγραφικός παράγοντας μεταλλαγμένο πιο συχνά στον καρκίνο, p53, ρυθμίζει μια σειρά από miRNAs. Η ενεργοποίηση της ρ53 αυξάνει την παραγωγή miR-34a, και η υπερ-έκφραση του miR-34a επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου, γήρανση και την απόπτωση. Ένας άλλος παράγοντας μεταγραφής που συνδέεται με τον καρκίνο, c-myc, ρυθμίζει ένα ξεχωριστό σύνολο των miRNA. C-myc μειώνει την έκφραση αρκετών miRNAs συμπεριλαμβανομένων miR-22 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου [13]. Πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι miR-22 στόχους αρκετές πρωτεΐνες, όπως τα οιστρογόνα υποδοχέα (ERA), c-Myc πρωτείνης πρόσδεσης (MYCBP), Myc σχετίζεται παράγοντας Χ (ΜΑΧ), και ΡΤΕΝ, υποδηλώνοντας ότι miR-22 μπορεί να εμπλέκεται στην ογκογένεση. Ωστόσο, η λειτουργία του miR-22 σε καρκινικά κύτταρα παραμένει άγνωστος.

υποξία διεγέρσιμο παράγοντα 1 (HIF-1) είναι ένας ετεροδιμερικός παράγοντας μεταγραφής που ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων όπως αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και βασικού ινοβλάστη αυξητικός παράγοντας (bFGF) [14], [15], [16]. HIF-1 είναι ένα ετεροδιμερές αποτελούμενο από δύο υπομονάδες, HIF-1α και HIF-1β (ARNT). Η υποξία ή υποξία μιμητικά σταθεροποίηση HIF-1α προλυλ με αναστολή υδροξυλίωση της. HIF-1 εμπλέκεται στην αγγειογένεση, εισβολή, μετάσταση, η πρόσληψη γλυκόζης και μεταβολισμού στα καρκινικά κύτταρα [17]. Η υποξία σε όγκους μπορεί να λειτουργήσει ως έναυσμα για την αγγειογένεση για να παραδώσει αυξημένη οξυγόνο στον καρκίνο. έκφραση του HIF-1α σχετίζεται με κακή πρόγνωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου και του καρκίνου του παγκρέατος [17], [18], [19].

Πρέπει τώρα προσδιορίσει HIF-1α σαν ένας στόχος για miR-22 σε ένα καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική σειρά. Θεωρούμε ότι τα επίπεδα miR-22 σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου είναι χαμηλότερο σε σχέση με φυσιολογικό ιστό κόλου. Από δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου με χαμηλότερο miR-22 δείχνουν υψηλότερη έκφραση του VEGF, υποθέτουμε ότι το miR-22 ρυθμίζει σηματοδότηση υποξία σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου.

Αποτελέσματα

Η έκφραση του miR-22 σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Χρησιμοποιήσαμε πρώτα κηλίδωση Northern για τη μέτρηση της miR-22 έκφραση σε ανθρώπινους ιστούς, και βρήκαν ότι miR-22 εκφράζεται στους περισσότερους ιστούς, αλλά σχετικά άφθονο στη καρδιά, λείων μυών, της ουροδόχου κύστης, και το λιπώδη ιστό (Σχ. 1Α). Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση του miR-22 σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου. Θα μπορούσε να ανιχνεύσει miR-22 σε τρία κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, HCT116, HCT116 ρ53 ΚΟ και ΗΤ29, καθώς επίσης και σε ένα επιθηλιακό καρκίνο κυτταρική γραμμή, HeLa (Σχ. 1Β). Να εξετάσει το επίπεδο του miR-22 στον καρκίνο του παχέος εντέρου, μετρήσαμε miR-22 έκφρασης με qPCR σε 9 ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου και 9 φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου από ασθενείς στο The Johns Hopkins Hospital. Η έκφραση του miR-22 είναι χαμηλότερη σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου (Ρ = 0,02) (Εικ. 1 C). Δεδομένου ότι μας ενδιαφέρει μελέτη πώς microRNA ρυθμίζουν την αγγειογένεση των όγκων, μετρήσαμε επίσης την έκφραση του mRNA του VEGF στα ίδια δείγματα και διαπίστωσε ότι η έκφραση του VEGF mRNA σε δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου είναι υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικά δείγματα κόλου (Ρ = 0,03) (Σχ.1 Γ) . Βρήκαμε επίσης ότι τα επίπεδα του RNA του miR-22 και VEGF συσχετίζονται αρνητικά (Ρ & lt? 0,05) (Σχ 1D.)

(Α) MiR-22 έκφραση σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς.. Μια εμπορική μεμβράνη που περιέχει RNA από φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς ανιχνεύθηκε για miR-22 χρησιμοποιώντας ανάλυση Northern. (Β) έκφραση MiR-22 σε κυτταρικές γραμμές. Κυτταρολύματα ανιχνεύτηκαν για miR-22 με κηλίδωση Northern. (C) MiR-22 και VEGF έκφραση σε φυσιολογικό ανθρώπινο ιστό του παχέος εντέρου και του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου. RNA εκχυλίστηκε από 9 φυσιολογικό ανθρώπινο δείγματα κόλου (λευκό) και από 9 δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου (μαύρο), και αναλύθηκαν με qPCR για miR-22 και VEGF έκφρασης (n = 9 ± S.D.). δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου περιέχουν λιγότερο miR-22 και περισσότερα VEGF από το κανονικό δείγματα του παχέος εντέρου. (Δ) Η ένωση του miR-22 και VEGF στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Φυσικό λογαριθμική μετατροπή του σχετική αναλογία του RNA για miR-22 και VEGF χρησιμοποιήθηκε για στατιστική ανάλυση (n = 30).

Η

HIF-1α είναι ο στόχος του miR-22

από HIF-1α είναι μέρος μιας μεγάλης πορείας αισθητήρα οξυγόνου, ψάξαμε για πιθανές miRNA που θα μπορούσαν να ελέγχουν τη μετάφραση του HIF-1α χρησιμοποιώντας υπολογιστική ανάλυση (Στόχοι του Ανθρώπου miRNA στο Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Υπολογιστική Βιολογία ιστοσελίδα http: //cbio. mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), και διαπίστωσε ότι η ακολουθία των σπόρων miR-22 ταιριάζει με το 3 ‘UTR του HIF-1α (7 νουκλεοτίδια αγώνες συμπεριλαμβανομένου ενός ταλάντευση αγώνα). Ερευνήσαμε πως miR-22 ρυθμίζει HIF-1 και υποξία σηματοδότηση χρησιμοποιώντας καρκινικά κύτταρα HCT116 του κόλου ως in vitro μοντέλο για το πώς τα καρκινικά κύτταρα ανταποκρίνονται σε υποξία. Να εξετάσει αν miR-22 ρυθμίζει την έκφραση της πρωτεΐνης του HIF-1α, μπορούμε επιμολυσμένα HCT116 κυττάρων με προ-miR-22 πάνω από την έκφραση του miR-22 και με αντι-αίσθηση-miR-22 για την εξουδετέρωση του miR-22. Η επιμόλυνση του προ-miR-22 σε HCT116 αυξημένη miR-22 επίπεδα πάνω από 10 φορές (Σχ. 2Α). Knockdown του miR-22 με επιμόλυνση με αντι-νόημα-miR-22 μειώθηκαν miR-22 επίπεδα κάτω του 40% (Εικ. 2Α). Η υποξία αυξημένη έκφραση του HIF-1α σε HCT116, όπως αναμενόταν (Εικ. 2Β). Ωστόσο, η υπερβολική έκφραση του miR-22 ανέστειλε την επαγόμενη από υποξία HIF-1α έκφραση σε HCT116 και ΗΤ29 (Σχ. 2Β-D). Σε αντίθεση, knockdown του miR-22 ενισχυμένη έκφραση του HIF-1α υπό υποξία (σχ. 2C-D). Υπερ-έκφραση του miR-22 δεν άλλαξε το επίπεδο του HIF-1β, ο εταίρος του διμερισμού HIF-1α (Εικόνα S1). Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι τα ενδογενή miR-22 αναστέλλει HIF-1α.

(Α) Τροποποίηση του miR-22 έκφρασης με επιμόλυνση. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με προ-miR-22 ή αντι-νόημα-miR-22 ή ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου, και τα επίπεδα του miR-22 μετρήθηκαν με qPCR. (Β) Η υπερέκφραση του miR-22 παρεμποδίζει την έκφραση του HIF-1α. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με ολιγονουκλεοτίδια ελέγχου ή προ-miR-22, και στη συνέχεια εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 16 ώρες. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για HIF-1α. Υποξία επάγει HIF-1α, αλλά miR-22 καταστέλλει HIF-1α. (Γ) Δύο κόλον καρκινικές κυτταρικές γραμμές, HCT116 (δύο άνω πίνακες) και ΗΤ29 (δύο κάτω πλαίσια), επιμολύνθηκαν με προ-miR-22 ή αντι-νόημα-miR-22, που εκτίθενται σε υποξία και κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για HIF-1α. (D) Ποσοτικός με πυκνομετρία των ανοσοκηλίδωση για HIF-1α σε κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν όπως παραπάνω (η = 3 ± S.D.).

Η

microRNA μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση με την καταστολή μετάφρασης. Η υπερέκφραση ή knockdown του miR-22 δεν μετέβαλε την έκφραση του mRNA HIF-1α, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-22 ρυθμίζει HIF-1α μετάφραση, αλλά όχι μεταγραφής (Σχ. 3Α). Ανθρώπινη HIF-1α 3 ‘UTR έχει μία πιθανή θέση πρόσδεσης για miR-22 (Σχ. 3Β). Για τη διερεύνηση του μηχανισμού με τον οποίο miR-22 ρυθμίζει HIF-1α, κάναμε ένα διάνυσμα αναφοράς λουσιφεράσης, το οποίο περιέχει ένα θραύσμα του 3 ‘UTR του HIF-1α (επέκταση μετά το κωδικόνιο στάση από 0 να 401 bp) που περιλαμβάνει ένα miR -22 θέση σύνδεσης. Είμαστε συν-επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 με αυτόν τον φορέα ρεπόρτερ και με προ-miR-22 ή τον έλεγχο. Υπερ-έκφραση του miR-22 μειώθηκαν λουσιφεράσης δραστικότητα (Σχ. 3C αριστερά). Ωστόσο, miR-22 δεν επηρεάζει την έκφραση της λουσιφεράσης με ένα μεταλλαγμένο miR-22 συνδετικά στοιχεία (Σχ. 3C δεξιά), υποδηλώνοντας ότι miR-22 παρεμποδίζει την έκφραση του HIF-1α μέσω αλληλεπίδρασης με το 3 ‘UTR του HIF-1α.

(Α) MiR-22 δεν επηρεάζει mRNA HIF-1α. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με Pre-miR-22 ή αντι-νόημα-miR-22 ή τον έλεγχο. Ολικό RNA συλλέχθηκε και αναλύθηκε για HIF 1α-mRNA με qPCR (η = 3 ± S.D.). (Β) Ανθρώπινη HIF-1α 3’UTR περιέχει μία θέση σύνδεσης για miR-22. (C) MiR-22 καταστέλλει διενεργοποίησης του HIF-1α 3’UTR. κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με ένα φορέα ανταποκριτή λουσιφεράσης (MiRreport) που περιέχει το 3 ‘UTR του HIF-1α (αριστερός πίνακας) ή μία μεταλλαγμένη 3’UTR του HIF-1α (δεξί πάνελ) και με προ-miR-22 ή προ-miR -έλεγχος. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μετρήθηκε η δραστικότητα της λουσιφεράσης (n = 3 ± SD).

Η

MiR-22 ελέγχους της έκφρασης του VEGF σε HCT116

Για να διερευνήσουν το ρόλο του miR-22 στην έκφραση του VEGF , έχουμε επιμολυσμένα HCT116 με προ-miR-22 ή αντι-νόημα-miR-22 ή ελέγχου, και στη συνέχεια να μετρηθεί η έκφραση του mRNA του VEGF με qPCR. Υποξία και η υποξία του μιμητική desferioxamine (DFX) αύξησε την έκφραση του VEGF mRNA (Σχ. 4Α, λευκές ράβδοι). Υπερ-έκφραση του miR-22 μειώθηκαν υποξία ή DFX επαγόμενη έκφραση του VEGF (Σχ. 4Α, μαύρες μπάρες). Αντιστρόφως, knockdown του miR-22 αυξήθηκε DFX επαγόμενη έκφραση του VEGF (Σχ. 4Β). Στη συνέχεια μετρήσαμε την συγκέντρωση του VEGF στα μέσα ενημέρωσης. DFX αύξησε την έκκριση του VEGF από κύτταρα HCT116. Υπερ-έκφραση του miR-22 κατέστειλε την έκκριση του VEGF. Σε αντίθεση, knockdown του miR-22 αυξημένης απελευθέρωσης του VEGF (Σχ. 4C-D). Επιπλέον, εξετάσαμε την επίδραση της miR-22 κατά την έκφραση του αγγειοποιητίνη 2 (ANGPT2) και παράγοντα αρχέγονων κυττάρων (SCF), επειδή ANGPT2 και SCF είναι αγγειογόνοι παράγοντες ανάπτυξης που ρυθμίζονται από HIF-1 [20]. Η υποξία επάγεται ANGPT2 και SCF, και η υπερ-έκφραση του miR-22 ανέστειλε την υποξία προκαλούμενη έκφραση του ANGPT2 και SCF (Σχήμα S2).

HCT116 διαμολύνθηκαν με προ-miR-22 ή αντι-νόημα-miR-22 ή ελέγχου, και στη συνέχεια εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 16 ώρες. Το μέσο αναλύθηκε για VEGF με ELISA και RNA από κυτταρολύματα αναλύθηκε για VEGF mRNA με qPCR (η = 3 ± S.D. * Ρ & lt? 0,05) (Α) Προ-miR-22 μειώνεται VEGF mRNA. (Β) Αντι-αίσθηση-miR-22 αυξάνει VEGF mRNA. (C) Προ-miR-22 μειώνει πρωτεΐνη VEGF. (D) Αντι-νόημα-miR-22 αυξάνει την πρωτεΐνη VEGF.

Η

MiR-22 σε HCT116 ρυθμίζει ενδοθηλιακών

κυτταρικής ανάπτυξης

Δεδομένου ότι η αγγειογένεση περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, εξετάσαμε την επίδραση της miR-22 κατά τον πολλαπλασιασμό των HUVEC. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 με προ-miR-22 ή έλεγχο, εκτίθενται τα κύτταρα σε φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία, και συλλέγονται τα μέσα ενημέρωσης. Προσθέσαμε αυτό το προσαρμοσμένο μέσο για ανθρώπινα πρωτογενή ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC), καλλιεργήθηκαν για άλλες 3 ημέρες, και στη συνέχεια μετράται ο πολλαπλασιασμός των HVUEC με δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU. Δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ των μέσων από κύτταρα επιμολυσμένα νορμοξία προ-miR-22 και των μέσων ενημέρωσης από νορμοξία κύτταρα επιμολυσμένα ελέγχου (Σχ. 5Α). Όπως ήταν αναμενόμενο, τα μέσα από υποξικά κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο αυξημένο πολλαπλασιασμό HUVEC. Ωστόσο, τα μέσα ενημέρωσης από υποξικά κύτταρα επιμολυσμένα προ-miR-22 μπλοκάρει αυτή την αύξηση στον πολλαπλασιασμό (Εικ. 5Α).

κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με προ-miR-22 ή ελέγχου, και τα μέσα ενημέρωσης συλλέχθηκαν. (Α) κύτταρα HUVEC αναπτύχθηκαν σε 12 φρεατίων, προστέθηκαν τα ρυθμισμένα μέσα, και ο HUVEC επωάστηκαν για 3 ημέρες. Ο πολλαπλασιασμός παρακολουθείται με δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU (η = 5 ± δ.ϋ. * Ρ & lt? 0,05). Προ-miR-22 μειώνει την ικανότητα των κυττάρων σε επεξεργασία υποξικά να παράγουν παράγοντες που διεγείρουν ενδοθηλιακά πολλαπλασιασμό. (Β) Κύτταρα HUVEC γδαρμένο, προστέθηκαν τα ρυθμισμένα μέσα, και φωτογραφήθηκαν σε 16 ώρες. (Γ) μέτρηση της απόστασης που καλύπτεται από κάθε τραύματος σε σχέση με τον έλεγχο εκτεθεί με φυσιολογική οξυγόνωση. (* P & lt? 0,05)

Η

Από την αγγειογένεση περιλαμβάνει επίσης την ενδοθηλιακή μετανάστευση, ελέγξαμε την επίδραση του miR-22 κατά HUVEC μετανάστευσης με την πληγή μηδέν δοκιμασία επούλωσης. Προσθέσαμε σε κύτταρα HUVEC Το προσαρμοσμένο μέσο από κύτταρα HCT116 που είχαν επιμολυνθεί με προ-miR-22 ή ελέγχου και είχαν στη συνέχεια εκτεθεί σε νορμοξία ή υποξία. Μετά από 16 ώρες μετρήθηκε μετανάστευση ενδοθηλιακών από την άκρη του τραύματος μηδέν. Μέσα από κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υποξία αυξημένη ενδοθηλιακή μετανάστευση (Εικ. 5Β-Γ). Υπερ-έκφραση του miR-22 σε HCT116 επιβραδύνθηκε HUVEC μετανάστευσης (Εικ. 5Β-Γ). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το miR-22 σε HCT116 επηρεάζει ενδοθηλιακή βιολογία, αυξάνοντας τον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση.

Συζήτηση

Το κύριο εύρημα της μελέτης αυτής είναι ότι το miR-22 αναστέλλει τη σηματοδότηση υποξία. MiR-22 εκφράζεται σε πολλά καρκινικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής σειράς καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116. Επιπλέον, miR-22 καταστέλλει την μετάφραση του HIF-1α. Τέλος, miR-22 αναστέλλει την έκφραση του VEGF με την καταστολή της έκφρασης HIF-1α. Επειδή άλλοι έχουν δείξει ότι τα όρια c-myc miR-22 έκφραση, οι όγκοι υπερεκφράζουν c-myc μπορεί να αναμένεται να έχουν χαμηλότερα επίπεδα miR-22, τα υψηλότερα επίπεδα του HIF-1α και VEGF. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι το miR-22 μπορεί να ρυθμίζει την αγγειογένεση των όγκων.

Στόχοι του miR-22

Ατομική miRNA μπορούν να διαμορφώσουν την έκφραση πολλών γονιδίων. Αρκετές αναφορές εντοπισμό πιθανών στόχων του miR-22 με τη χρήση αλγορίθμων του λογισμικού, όπως TargetScan, Miranda και PicTar, σε συνδυασμό με τις κυτταρικές μελέτες. MiR-22 στόχους υποδοχέα οιστρογόνου ένα (ERA) και καταστέλλει τα οιστρογόνα σηματοδότηση σε αρκετές καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές [21], [22]. MiR-22 καταστέλλεται επίσης c-Myc πρωτεΐνη δέσμευσης MYCBP [23], c-Myc εταίρο δέσμευσης MAX [24] και ογκοκατασταλτικό γονίδιο ΡΤΕΝ [25], [26], [27]. PPAR-άλφα και BMP7 είναι επίσης στόχοι του miR-22 [28]. Βρήκαμε ότι HIF-1α είναι ένας νέος στόχος του miR-22. Το 3 ‘UTR του HIF-1α περιλαμβάνει μία συμπληρωματική αλληλουχία για miR-22 που αποτελείται από 7 νουκλεοτίδια? αυτή η αλληλουχία σπόρος περιέχει μία ταλάντωση νουκλεοτίδιο πρόσδεσης (G-Α). βιοχημικά δεδομένα μας δείχνουν ότι το miR-22 ρυθμίζει άμεσα HIF-1α έκφραση αγοράσει την καταστολή της μετάφρασης του HIF-1α.

Ο ρόλος του miR-22 σε όγκο αγγειογένεση

MiR-22 έχει μοναδικό ρόλο στην ειδικούς τύπους κυττάρων. MiR-22 ρυθμίζει τη διαφοροποίηση ενός μονοκυττάρου κυτταρική γραμμή [24]. MiR-22 ρυθμίζει PPAR-άλφα και BMP7 μονοπάτια σηματοδότησης σε ανθρώπινα χονδροκύτταρα [28]. Στον καρκίνο, η λειτουργία του miR-22 είναι αμφιλεγόμενη. Το miR-22 γονίδιο ποντικού αντιστοιχίζεται σε μία γονιδιωματική περιοχή που σχετίζεται με καρκίνο, και το ανθρώπινο γονίδιο miR-22 κείται εντός απώλειας ετεροζυγωτίας περιοχής (LOH) σε αρκετά καρκινικά κύτταρα [23], [29], υποδηλώνοντας ότι miR-22 εμπλέκεται στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου. Η έκτοπη έκφραση του miR-22 ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό και την αποικία σχηματισμό MCF-7 κυττάρων [23]. Αυτή η δραστηριότητα καταστολέα όγκου του miR-22 περιλαμβάνει την καταστολή της MYCBP. Ωστόσο, άλλοι έχουν δείξει ότι η knockdown του miR-22 αυξάνει το ρυθμό απόπτωσης σε 16HBE-Τ κύτταρα [26]. Η φαινομενική αντίφαση μεταξύ αυτών των δύο μελετών μπορεί να οφείλονται σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές ή διαφορετικές μεθόδους για τη μεταβολή των επιπέδων miR-22. Βρήκαμε ότι miR-22 αναστέλλει την έκκριση VEGF, υποδηλώνοντας miR-22 μπορεί να δράσει σαν αντι-αγγειογένεσης παράγοντα σε καρκινικές κυτταρικές σειρές του κόλου. ανθρώπινα δεδομένα μας υποστηρίζουν την ιδέα αυτή: ανθρώπινα δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν χαμηλότερα επίπεδα miR-22 και υψηλότερα επίπεδα VEGF, συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό ανθρώπινου κόλου. Τα δεδομένα μας αποκαλύπτουν έναν άλλο μηχανισμό μέσω του οποίου miR-22 θα μπορούσε να δράσει ως καταστολέας όγκου:. απώλεια του miR-22 έκφραση όχι μόνο επιτρέπει την αύξηση MYCBP αλλά επίσης μια αύξηση στην HIF-1α

υποξία σηματοδότησης και miRNA

Τοπική ανάπτυξη του όγκου περιορίζεται από υποξία: ως ο όγκος επεκτείνεται, το κέντρο του γίνεται υποξικό, επαγωγή γονιδίων όπως ο VEGF που προκαλούν την αγγειογένεση [30], [31], [32]. Το ετεροδιμερές HIF-1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη σηματοδότηση υποξική σε όγκους [15], [33]. Εμείς και άλλοι έχουν προσδιορίσει miRNA που ελέγχουν σηματοδότηση υποξία. Έχουμε ήδη διαπιστώσει ότι το miR-107 αναστέλλει HIF-1β [34]. Άλλοι έχουν δείξει ότι miR-20b περιορίζει την έκφραση του HIF-1α σε κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και του καρκίνου του μαστού [35], [36], [37]. Το σύμπλεγμα miR-17-92 ρυθμίζει επίσης την ανάπτυξη του όγκου αναστέλλοντας την έκφραση του HIF-1α. τρέχουσα μελέτη μας προσθέτει miR-22 στον κατάλογο των miRNAs που ρυθμίζουν HIF-1 πρωτεΐνη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture, έκθεση υποξία και Επιμόλυνση

Ανθρώπινο ομφαλική φλέβα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) αγοράστηκαν από την Lonza (Walkersville, MD). HUVEC (δίοδος 2-5) καλλιεργήθηκαν σε ενδοθηλιακό βασικό μέσο (EBM2) συμπληρωμένο με αυξητικούς παράγοντες (Lonza). HeLa και ΗΕΚ293 (ATCC, Manassas, VA) καλλιεργήθηκαν σε μέσα DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). HCT116 (δώρο από τον Bert Vogelstein, Το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins School of Medicine) και ΗΤ29 (ATCC) καλλιεργήθηκαν σε μέσα McCoy 5Α συμπληρωμένο με 10% FBS. Η δεσφερριοξαμίνη (DFX) και άλλα αντιδραστήρια ελήφθησαν από τη Sigma (St Louis, ΜΟ). Να εκθέσει τα κύτταρα υποξίας, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Μπίλαπς-Rotenburg θάλαμο με 94% Ν2, 1% Ο2 και 5% CO2 σε 37 ° C για 24 ώρες.

Ανθρώπινο Δείγμα

Ανθρώπινο παχύ έντερο δείγματα καρκίνου (n = 9) και αντιστοιχισμένο μη-καρκινικές δείγμα φυσιολογικού κόλου (n = 9) ελήφθησαν από ασθενείς στο The Johns Hopkins Hospital, Βαλτιμόρη, MD, με τεκμηριωμένες ενημερωμένη συγκατάθεση σε κάθε περίπτωση. Η συλλογή και η ανάλυση του ανθρώπινου δείγματος καρκίνου του παχέος εντέρου έχουν εγκριθεί από το Johns Hopkins University School of Medicine Διοικητικού κριτική Θεσμική. Οι ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση για παχέος εντέρου παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για δωρεά ιστών για ανάλυση.

Η επιμόλυνση

Προδρόμου miRNAs και αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδια για miRNAs ήταν από την Applied Biosystems (Foster City, CA). Για την επιμόλυνση των προδρόμων miRNA, κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με siPORT NeoFX (Applied Biosystems) με πρόδρομο miRNA 0-20 ηΜ ή με αντι-νόημα miRNA 0-40 ηΜ και συλλέχθηκαν 48 ώρες αργότερα.

Northern blotting

Ολικά RNAs που εξάγονται από κύτταρα χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen). RNAs Ανθρώπινα ιστού ελήφθησαν από την Applied Biosystems. Κηλίδωση Northern για miR-22 πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, 10 μg κάθε RNA φορτώθηκαν σε 15% TBU-gel (Invitrogen), μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και υβριδοποιήθηκαν με

32Ρ-σημασμένο στο άκρο ανιχνευτές ειδικούς για miR-22 στους 42 ° C για 16 ώρες. Ο ανιχνευτής miR-22, 5′-TAAAGCTTGCCACTGAAGAACT-3 ‘συνετέθη από το Ολοκληρωμένο DNA Technologies? Όλα τα άλλα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Applied Biosystems.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

Για την ανάλυση της έκφρασης των miRNAs, αναλύσεις TaqMan microRNA χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των επιπέδων της ώριμης miRNAs μετά από τον κατασκευαστή οδηγίες. Εν συντομία cDNA συνετέθη από καθαρίστηκε μικρό RNA (10 ng) και εκτελείται Real-Time PCR χρησιμοποιώντας iCycler iQ (BioRad). Τα επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν προς U6. Οι εκκινητές για miRNA RT-PCR και η PCR μίγματος αγοράσθηκαν από την Applied Biosystems. Για την ανίχνευση της έκφρασης mRNA, cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση υψηλής χωρητικότητας κιτ σύνθεσης cDNA (Applied Biosystems). Οι εκκινητές για την ανθρώπινη VEGF και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Applied Biosystems.

λουσιφεράσης

Ένα θραύσμα του 3 ‘UTR του HIF-1α (ξεκινώντας μετά την TGA κωδικόνιο τερματισμού και εκτείνεται 401 bp) που περιέχει το στοιχείο απόκρισης miR-22 κλωνοποιήθηκε στον φορέα λουσιφεράσης pMIR-REPORT (Applied Biosystems). Μετάλλαξη του στοιχείου miR-22 απόκρισης (5’-GTTGACGG-3 ‘→ 5’ G

Μια

Τ

C

Ένα

G

GG -3 ‘) ήταν από QuikChange τοποκατευθυνόμενη kit μεταλλαξογένεση (Stratagene). κύτταρα HCT116 επιστρώθηκαν σε 5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων. Την επόμενη μέρα, pMIR-REPORT λουσιφεράσης φορείς συμπεριλαμβανομένων 3 ‘UTR του HIF-1α και πρόδρομο miR-22 ή ομελέτα ολιγονουκλεοτίδια επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, λουσιφεράση δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega).

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα λύθηκαν σε 0.4 ml ρυθμιστικού διαλύματος λύσης (50 mM Tris ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1% ΝΡ40, 20 mM NaF, 1 mM ορθοβαναδικό και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ). Τα προϊόντα λύσης διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση, στυπώθηκαν σε μεμβράνη και αντέδρασε με ειδικά αντισώματα. Αντίσωμα ποντικού HIF-1α ήταν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Όλα τα άλλα πρωτογενή αντισώματα και τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα ήταν από την Santa Cruz.

VEGF Συγκεντρώσεις

Μια ELISA χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση του VEGF που εκκρίνεται από κύτταρα HCT116 εντός του μέσου. κύτταρα HCT116 επωάστηκαν σε 1 ml μέσου με 1% FBS σε απουσία (μάρτυρες) ή παρουσία DFX ή υπό φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 24 ώρες στους 37 ° C. Τα υπερκείμενα προσδιορίστηκαν για παραγωγή VEGF χρησιμοποιώντας το κιτ Human VEGF ELISA σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (R &? D Systems).

BrdU δοκιμασία ενσωμάτωσης

HCT116 ή HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με προ-miR -22 ή προ-miR-ελέγχου και καλλιεργήθηκαν για 72 ώρες. BrdU προστέθηκαν σε κάθε φρεάτια και επωάζονται για 4 ώρες. Μετά τον καθορισμό των κυττάρων, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-BrdU αντίσωμα για 1 ώρα, στη συνέχεια με συζευγμένο με υπεροξειδάση κατσίκας αντι-Ποντικού IgG για 30 λεπτά. ΤΜΒ Υποστρώματος Υπεροξειδάσης προστέθηκε σε κάθε φρεάτια. Διαβάστε την πλάκα χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας φασματοφωτόμετρο ρυθμιστεί σε μήκος κύματος 450 nm.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

HUVECs σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες και αναπτύχθηκαν σε συρροή. Μια γρατσουνιά πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 1000 μl και την αλλαγή των μέσων ενημέρωσης για να ρυθμίσει τα μέσα από HCT116 επιμολυσμένα με Pre-miR-ελέγχου ή προ-miR-22. Οι εικόνες ελήφθησαν σε 16 ώρες και μετρήθηκαν οι αποστάσεις μεταξύ των κυττάρων.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Στατιστική συγκρίσεις έγιναν μεταξύ των δύο ομάδων με τη δοκιμασία t και μεταξύ πολλών ομάδων με ANOVA. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

HIF-1β δεν αποτελεί στόχο του miR-22. Περιγραφή: Κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με προ-miR-22 ή προ-miR-ελέγχου, και εκτέθηκαν σε νορμοξία ή υποξία για 16 ώρες. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για HIF-1α και HIF-1β. Υπερ-έκφραση του miR-22 αναστέλλει την έκφραση του HIF-1α, αλλά δεν HIF-1β

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020291.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

MiR-22 ρυθμίζει τις εκφράσεις των αγγειογενετικών παραγόντων. Περιγραφή: Κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με προ-miR-22 ή ελέγχου, και στη συνέχεια εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση ή υποξία για 8 ώρες. RNAs από κυτταρολύματα αναλύθηκαν για αγγειοποιητίνη 2 παράγοντας κυττάρων (ANGPT-2), στέλεχος (SCF), και COX-2 mRNA μέσω qPCR (η = 3 ± SD * Ρ & lt? 0,05) Υπερ-έκφραση του miR-22 μειώθηκαν τις εκφράσεις αγγειογενετικών παραγόντων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0020291.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε τον Δρ Σκοτ ​​Kern για την παροχή μας με ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου δείγματα.