Abstract

παράγοντες που αναστέλλουν STAT-3, ένα κυτοσολικό παράγοντα μεταγραφής εμπλέκεται στην ενεργοποίηση διαφόρων γονιδίων που εμπλέκονται στην πρόοδο του όγκου είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για χημειοπρόληψη του καρκίνου Αναγνώριση. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε η επίδραση των διαιτητικών ασταξανθίνης επί JAK-2 /STAT-3 σηματοδοσίας προς την 7,12-διμεθυλβενζ [α] ανθρακένιο (DMBA) επαγόμενη παρειάς χάμστερ θύλακα (ΗΒΡ) μοντέλο καρκινογένεσης εξετάζοντας το mRNA και πρωτεΐνη έκφραση της JAK /STAT-3 και γονιδίων-στόχων της. Ποσοτική RT-PCR, ανοσοκηλιδώσεως και ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα συμπληρώματα ασταξανθίνη αναστέλλει σημαντικά γεγονότα JAK σηματοδότηση /STAT ειδικά STAT-3 φωσφορυλιώσεως και μετέπειτα πυρηνική μετατόπιση του STAT-3. Επιπλέον, η ασταξανθίνη μειωτικά την έκφραση των γονιδίων STAT-3-στόχους που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και την αγγειογένεση, και μειωμένη πυκνότητα μικροαγγειακή, εμποδίζοντας έτσι την εξέλιξη του όγκου. ανάλυση μοριακής σύνδεσης επιβεβαίωσε ανασταλτικές επιδράσεις της ασταξανθίνη για STAT σηματοδότησης και της αγγειογένεσης. πειράματα κυτταρικής καλλιέργειας με την ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά ECV304 τεκμηριώνεται ο ρόλος των ασταξανθίνη στην καταστολή αγγειογένεσης. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας προβλέπουν ουσιαστικές αποδείξεις ότι οι διαιτητικές ασταξανθίνη αποτρέπει την ανάπτυξη και την εξέλιξη της ΗΒΡ καρκινωμάτων μέσω της αναστολής της JAK-2 /STAT-3 σηματοδότησης και καθοδικά συμβάντα της. Έτσι, ασταξανθίνη που λειτουργεί ως ισχυρός αναστολέας της ανάπτυξης και της εξέλιξης του όγκου με στόχευση σηματοδότησης JAK /STAT μπορεί να είναι ένας ιδανικός υποψήφιος για χημειοπροφύλαξη του καρκίνου

Παράθεση:. Kowshik J, Baba ΑΒ, Giri Η, Deepak Reddy G, Dixit M, Nagini S (2014) ασταξανθίνη Αναστέλλει JAK /STAT-3 Σηματοδότησης να καταργήσει κυτταρικού πολλαπλασιασμού, εισβολή και την αγγειογένεση σε ένα χάμστερ μοντέλο του καρκίνου του στόματος. PLoS ONE 9 (10): e109114. doi: 10.1371 /journal.pone.0109114

Επιμέλεια: Shree Ram Singh, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 17 Ιούνη του 2014? Αποδεκτές: 8 Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 Οκτ 2014

Copyright: © 2014 Kowshik et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Νέο Δελχί, Ινδία στο πλαίσιο του 7ου ΠΠ της κοινής Συνεργατικό έργο Ινδο-ΕΕ σχετικά με την «FUNCFOOD». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μορφοτροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 πρωτείνη (STAT3) είναι ένας λανθάνων κυτταροπλασματική παράγοντα μεταγραφής που μεταδίδει σήματα από την επιφάνεια του κυττάρου προς τον πυρήνα όταν ενεργοποιούνται από κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες [1]. Ειδικότερα, η ιντερλευκίνη-6 (IL-6) ή επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) διεγείρει τη φωσφορυλίωση της STAT3 πρωτεΐνης με Janus κινάση και ενεργοποιείται STAT3 σχηματίζει ένα ομοδιμερές που μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων κρίσιμων για την κανονική κυτταρικές διεργασίες όπως είναι η ανάπτυξη των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση, την αγγειογένεση, και την ανοσοποιητική λειτουργία [2] – [6].

ανώμαλη ενεργοποίηση της JAK σηματοδότησης /STAT3 έχει τεκμηριωθεί σε μία ευρεία ποικιλία ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένων των αιμοποιητικών κακοηθειών και στερεών όγκων όπως κεφαλής και λαιμού, του μαστού, του προστάτη και του καρκίνου [7], [8]. Συστατική ενεργοποίηση STAT3 συμβάλλει στον πολλαπλασιασμό και την ογκογένεση με ρύθμιση της έκφρασης μιας ποικιλίας γονιδίων που απαιτούνται για την επιβίωση των κυττάρων του όγκου, τον πολλαπλασιασμό, και την αγγειογένεση, όπως επίσης και εισβολή και η μετάσταση και κοινώς υποδηλώνει κακή πρόγνωση [9] – [11]. Έτσι, σηματοδότηση JAK /STAT3 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην ογκογένεση και θεωρείται ένας σημαντικός θεραπευτικός στόχος για νέα ανάπτυξη φαρμάκων.

ταυτοποίηση παραγόντων που στοχεύουν μόριο STAT3 είναι πιθανό να είναι ιδιαίτερης σημασίας σε χημειοπρόληψη του καρκίνου. Αρκετές διαιτητικά αντιοξειδωτικά που αναγνωρίζονται για να εμποδίσει την ανάπτυξη του όγκου με στόχευση του δικτύου σηματοδοσίας STAT3 [12] – [15]. Ασταξανθίνη, ένα μη-προβιταμίνης Α καροτινοειδών που βρέθηκαν κυρίως στην μικροφύκη, μύκητες, φυτά, θαλάσσια τρόφιμα και μερικά πουλιά όπως φλαμίνγκο και ορτύκια είναι ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό [16]. Η ασταξανθίνη βρέθηκε να παρουσιάζουν την υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση μεταξύ των καροτενοειδών και χρησιμοποιείται ευρέως για την πρόληψη και τη θεραπεία των διαφόρων ασθενειών [17]. AXT έχει επίσης καταδειχθεί ότι επιδεικνύουν αντι-φλεγμονώδεις και αντικαρκινικές ιδιότητες [18], [19].

Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι η διαιτητική συμπλήρωση του AXT επάγει ενδογενή απόπτωση μέσω αναστολής της ΡΙ3 /Akt, ΜΑΡΚ, NF-κΒ και Wnt /β-κατενίνης κυκλώματα στο 7,12-διμεθυλβενζ [α] μοντέλο καρκινογένεσης ανθρακενίου (DMBA) επαγόμενη χάμστερ στοματική κοιλότητα (HBP) [20] σηματοδότησης. Αυτά τα ευρήματα μας στον πειρασμό να υποθέσει ότι AXT που επάγει την απόπτωση μπορεί να μπλοκάρουν την αντίθετη διαδικασία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων εμποδίζοντας έτσι τη διαδοχική συσσώρευση μεταλλάξεων που ενδεχομένως να οδηγήσει σε εισβολή όγκου και την αγγειογένεση. Επιπλέον, AXT προκαλούμενη αδρανοποίηση των παραγόντων μεταγραφής ΝΡ-κΒ και β-κατενίνης, κεντρική κόμβους σε ογκογόνο σηματοδότηση θα μπορούσε επίσης να επηρεάσει την οδό /STAT3 JAK. Στην παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι οι διατροφικές AXT αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου με βάση την κατάργηση του μονοπατιού JAK /STAT3 και τους μεταγενέστερους στόχους κυκλίνης D1 του, ΜΜΡ-2, -9, και VEGF στο μοντέλο καρκινογένεσης HBP. Επιπλέον AXT μειωμένη πυκνότητα μικροαγγειακή, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου. πειράματα κυτταρικής καλλιέργειας με την ενδοθηλιακή κυτταρική σειρά ECV304 πραγματοποιήθηκαν επίσης να τεκμηριώσει το ρόλο της ασταξανθίνη στην καταστολή υποξία που προκαλείται από αγγειογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Το ακρυλαμίδιο, βοοειδών λευκωματίνη ορού (BSA), μπλε βρωμοφαινόλης, 7,12-διμεθυλβενζ [α] ανθρακένιο (DMBA), υδροξυουρία, 2-μερκαπτοαιθανόλη, δωδεκυλθειικό νάτριο (SDS) Ν, Ν, Ν ‘, Ν’ – τετραμεθυλενοδιαμίνη (ΤΕΜΕϋ) και ΤπζοΙ αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Company, St. Louis, ΜΟ, USA. Ασταξανθίνη είχε αγοραστεί από την Bio-Real, Σουηδία. μέσο DMEM-F12, αντιβιοτικό διάλυμα που αποτελείται από πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη και Alamar blue ήταν από HIMEDIA Labs, Mumbai, Ινδία. Εμβρυϊκό βόειο ορό της Νότιας Αμερικής προέλευσης ήταν από την GIBCO, Invitrogen, NY, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Ισχύς SYBR Green PCR μάστερ μιξ ελήφθη από την Applied Biosystems, Καλιφόρνια, ΗΠΑ. Αντισώματα για την IL-6, GAPDH, κυκλίνη D1, PCNA, ρ21, ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, ΤΙΜΡ-2, RECK, VEGF, VEGFR2, HIF1α, αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, USA. pJAK-2

tyr1007 /1008, JAK-2, pSTAT-3

tyr705,-3 STAT και ιστόνης (Η2Β) αντισώματα και BrdU, STAT-3

tyr705, συνολικής κυκλίνης D1 και pVEGFR2

κιτ tyr1175 ELISA ήταν από την Cell Signaling Technology, USA. CD-34 αντίσωμα αγοράσθηκε από Novocastra, Γερμανία. Matrigel ήταν από BD Biosciences, USA. Όλα τα άλλα αντιδραστήρια που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού.

Ζώα και ηθική δήλωση

Οκτώ έως δέκα εβδομάδων αρσενικών χάμστερ Συρίας βάρους μεταξύ 100-110 g χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τα ζώα που προέρχονται από την Κεντρική ζώων Σπίτι, Πανεπιστήμιο Annamalai, Ινδία. Τα ζώα στεγάστηκαν τέσσερις σε ένα κλουβί και εφοδιασμένο με τυπική δίαιτα σφαιρίδιο και νερό κατά βούληση. Η υγεία των ζώων παρακολουθήθηκε καθημερινά κατά τη διάρκεια της μελέτης. Τα πρωτόκολλα για τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Ηθικής, Πανεπιστήμιο Annamalai και διεξάγονται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από την επιτροπή για τον έλεγχο και την εποπτεία σε πειράματα σε ζώα (CPCSEA).

Θεραπεία χρονοδιάγραμμα

Τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν σε πειραματικές και ελέγχου ομάδες και διαιρέθηκαν σε 4 ομάδες των 5 ζώων η καθεμία. Στην ομάδα 1, η δεξιά παρειακή θύλακες των χάμστερ βάφτηκαν με 0,5% DMBA σε υγρή παραφίνη τρεις φορές την εβδομάδα 14 εβδομάδες [21]. Ομάδα 2 ζώα έλαβαν εκτός από DMBA, βασική δίαιτα που περιέχει 15 mg /kg σωματικού βάρους της ασταξανθίνης [20], [22]. Ομάδα 3 ζώα έλαβαν ασταξανθίνη (15 mg /kg σωματικού βάρους) μόνο για 14 εβδομάδες. Ομάδα 4 ζώα έλαβαν βασική δίαιτα μόνο και χρησίμευσε ως μάρτυρας χωρίς θεραπεία. Το πείραμα τερματίστηκε σε 14 εβδομάδες και όλα τα ζώα θυσιάστηκαν με εξάρθρωση του αυχένα μετά από ολονύκτια νηστεία. Τα παρειακά ιστοί θύλακα αμέσως υποδιαιρούνται και υφίστανται επεξεργασία για διανομή σε κάθε πείραμα.

Κυτταροκαλλιέργεια

ECV 304 κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ βασικό μέσο με 10% ορό εμβρύου μόσχου με αντιβιοτικά. ECV304 είναι μια γραμμή ενδοθηλιακών κυττάρων που προέρχονται από ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) μέσω αυθόρμητης μετασχηματισμού [23]. Σε σύγκριση με πρωτογενείς καλλιέργειες HUVEC, χρήση ECV304 κυττάρων έχει ένα πρακτικό πλεονέκτημα καθώς αυτά τα κύτταρα δεικνύουν αυξημένη ικανότητα και αναπαραγώγιμες για in vitro αγγειογένεσης έτσι είναι μια ιδανική επιλογή για δοκιμασίες που βασίζονται κυτταρική καλλιέργεια αγγειογένεση [24]. Συρρέουσες καλλιέργειες ECV304 κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν και διατηρήθηκαν σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C. Για τη δοκιμασία Matrigel, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ βασικό μέσο με 4% ορό εμβρύου μόσχου. Για υποξικά κατάσταση, τα κύτταρα επωάστηκαν σε θάλαμο υποξίας με 1% O

2.

εκχύλιση RNA και ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Ολικό RNA από τη στοματική ιστούς θύλακα εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε από την οπτική πυκνότητα σε μήκος κύματος 260 nm (χρησιμοποιώντας ένα OD260 μονάδα ισοδύναμη με 40 μg /ml του RNA). 5 μg του απομονωμένου ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA σε ένα μίγμα αντίδρασης που περιέχει 4 μΐ 5 χ ρυθμιστικού διαλύματος αντίδρασης, 2 μΐ μίγματος dNTP (10 mM), 20 μονάδες αναστολέα ΚΝάσης, 200 μονάδες του ιού της γρίπης-μυελοβλάστωσης (ΑΜν ) αντίστροφης μεταγραφάσης και 0,5 μg ολίγο (dT) εκκινητή (Promega, WI, USA) σε ένα συνολικό όγκο 20 μΙ. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 42 ° C για 60 λεπτά και η αντίδραση τερματίστηκε με θέρμανση στους 70 ° C για 10 λεπτά. Το cDNA φυλάχθηκε στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω χρήσης.

Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση ρεύματος SYBR Green κύριου μείγματος σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα θερμοκυκλωτή StepOne Plus (Applied Biosystems). Στο 1 χ PCR κύριο μείγμα, 2,5 μΙ εκάστου cDNA προστέθηκε σε τελικό όγκο 20 μΙ. Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 95 ° C για 5 λεπτά, 40 κύκλοι των 30 s στους 95 ° C, 30 s στους 52 έως 60 ° C (με βάση το στόχο), και 60 s στους 72 ° C. Σχετική ποσοτική αλλαγή φορές σε σύγκριση με τον έλεγχο υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τη συγκριτική μέθοδο Ct, όπου Ct είναι ο αριθμός του κύκλου στον οποίο ο φθορισμός πρώτα υπερβαίνει το όριο. Οι τιμές Ct από κάθε δείγμα ελήφθησαν αφαιρώντας τις τιμές για GAPDH Ct από την τιμή γονιδίου στόχου Ct. Η εξειδίκευση των προκυπτόντων PCR προϊόντων επιβεβαιώθηκε με καμπύλες τήξης.

κηλίδωση Western

Οι πρωτεΐνες εκχυλίζονται από δείγμα ιστού με τη χρήση ρυθμιστικού λύσης που περιέχει 62,5 mM Tris (ρΗ 6.8), 10% SDS, 5% 2-μερκαπτοαιθανόλη, 10% γλυκερόλη και μπλε βρωμοφαινόλης. Πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσματα διαχωρίζονται όπως περιγράφεται από Legrand-Πόελς et al. [26]. Ίση ποσότητα εκχυλισμάτων πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε SDS-PAGE και οι πρωτεΐνες επιλυθεί μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Τα στυπώματα στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες σε 1Χ PBS που περιείχε 5% άπαχο ξηρό γάλα. Οι μεμβράνες μετά ανιχνεύθηκαν με πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη αντιδραστήρια ανίχνευσης χημειοφωταύγειας (Sigma). Πυκνότητας πραγματοποιήθηκε σε IISP σαρωτή επίπεδης κλίνης και να ποσοτικοποιηθεί με την Total Lab 1.11 του λογισμικού.

ELISA

Τα επίπεδα της pSTAT

tyr705, συνολικής D1 κυκλίνης και pVEGFR2

tyr1175 προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας σάντουιτς ELISA kit (Cell Signaling Technology, Η.Π.Α.) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Ανοσοϊστοχημεία

τομές ιστού παραφίνης ενσωματωμένο είχαν αφαιρείται η παραφίνη, επανυδατώθηκαν και υποβάλλεται σε ανάκτηση αντιγόνου και ενδογενών κλείδωμα υπεροξειδάσης. Στη συνέχεια, οι τομές επωάστηκαν με pSTAT-3 μονοκλωνικό κουνέλι, PCNA, ΜΜΡ-2 και VEGF κουνελιού πολυκλωνικά αντισώματα σε θερμοκρασία δωματίου για 3 ώρες. Τα πλακίδια πλύθηκαν με TBS και κατόπιν επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με βιοτίνη που ακολουθείται από στρεπταβιδίνη-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Dako, Carprinteria, CA, USA) για 30 λεπτά κάθε φορά σε θερμοκρασία δωματίου. Το ανοσοΐζημα οπτικοποιήθηκε με κατεργασία με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη και αντικηλίδωση με αιματοξυλίνη. Οι ιστοί έπειτα φωτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φθορισμού (Leica Microsystem Vertrieb GmbH, Wetzler, Γερμανία) που συνδέεται με την ψηφιακή φωτογραφική μηχανή DFC295.

πυκνότητα μικροαγγειακή (MVD)

Η μικροαγγειακή πυκνότητα εκτιμήθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-CD34 αντίσωμα. Οι περιοχές με τις μεγαλύτερες νεοαγγείωση βρίσκονταν και οι εικόνες δεν σταματούν σε τουλάχιστον πέντε διαφορετικά πεδία. Μικροαγγείων μετρήθηκαν από δύο ανεξάρτητους ερευνητές και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αριθμός σκαφών /οπτικό πεδίο.

Μοριακή βάση σύνδεσης

Μοριακής docking έγινε με τη χρήση του Schrodinger σουίτα 2013. ασταξανθίνη ανακτήθηκε από PubChem (www .ncbi.nlm.nih.gov /pccompound) και πρωτεΐνες STAT-3 και VEGF ανακτήθηκε από την πρωτεΐνη τράπεζα δεδομένων με το ΠΣΠ ID: 3CWG και 3V2A αντίστοιχα. Υποδοχέα γενιά του δικτύου και σύνδεσης συνδέτη πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση αλγορίθμου σύνδεσης Glide Xp.

Alamar blue δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ανάλυση Alamar Blue [27]. Εν συντομία, Alamar Blue (άλας νατρίου ρεσαζουρίνη από HIMEDIA) διαλύθηκε σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό ρΗ 7,4 για να κάνει ένα απόθεμα των 5 mg /mL και τελική συγκέντρωση εργασίας 0.1 mg /ml σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας. Η ρεσαζουρίνη είναι ένα οξειδοαναγωγικό δείκτη, ο οποίος μετρά το αναγωγικό περιβάλλον του κυττάρου, μειώνοντας σε μεγάλο βαθμό φθορίζουσα ρεσορουφίνη. Η ασταξανθίνη σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (5, 10, 20, 50, 100, 200 και 400 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα και μετά από 24 ώρες, Alamar μπλε βαφή προστέθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ώρες. Η αλλαγή χρώματος παρακολουθήθηκε χρωματομετρικώς στα 595 nm και 570 nm για να αξιολογηθεί οξειδωμένη έναντι μειωμένη μορφές αντίστοιχα του αντιδραστηρίου με τη χρήση αναγνώστη πλάκας πολλαπλών-mode.

δοκιμασία BrdU

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων αναλύθηκε με μέτρηση τη σύνθεση του DNA με βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) κιτ (Cell Signaling Technology, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε μια μικροπλάκα 96-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς ασταξανθίνη (50 μΜ) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επισημάνθηκαν με BrdU για 6 ώρες. Μετά τη σταθεροποίηση, τα κύτταρα επωάστηκαν με 100 μΐ αντι-BrdU αντίσωμα για 60 λεπτά. Μετά την πλύση, 100 μΐ δευτερεύοντος αντισώματος προστέθηκαν και επωάστηκαν για 30 λεπτά, στη συνέχεια 100 μΐ υποστρώματος (τετραμεθυλοβενζιδίνη) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και οι πλάκες επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε με συσκευή ανάγνωσης ELISA.

Μετανάστευση

δοκιμασία

Συρρέουσες μονοστοιβάδες κυττάρων ECV 304 σε 24 φρεατίων πλάκες χαραχθεί με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ και επωάστηκαν σε νορμοξικές και υποξικές κατάσταση με και χωρίς 50 μΜ ασταξανθίνη. 5 mM υδροξυουρία προστέθηκε επίσης να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο σε μεγέθυνση 4χ σε 0 και 24 ωρών [28].

Matrigel του σχηματισμού σωλήνα

δοκιμασία

Pre-ψύχεται πλάκες 96 φρεατίων επικαλύφθηκαν με 80 μΙ Matrigel ( BD) και επωάστηκαν στους 37 ° C για μισή ώρα. Ίδιος αριθμός κυττάρων (20.000 /φρεάτιο) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο με και χωρίς υποξική κατάσταση και σε παρουσία και απουσία της ασταξανθίνης (50 μΜ) και επωάστηκαν σε CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C για 14 ώρες. Οι εικόνες ελήφθησαν σε ελάχιστο πέντε διαφορετικά πεδία και τα δεδομένα αντιπροσωπεύονται ως τελικά αριθμό σωλήνων /οπτικό πεδίο [29].

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια μη παραμετρική δοκιμή Mann-Whitney (Στατιστικά Direct, Ηνωμένο Βασίλειο) για

in vivo

και τεστ Tukey posthoc για

in vitro

πειράματα. Μια τιμή πιθανότητας μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε σημαντική.

Αποτελέσματα

όγκου συχνότητα

Η συχνότητα εμφάνισης όγκου έχει αναφερθεί σε προηγούμενη μελέτη [20]. Στο τέλος της πειραματικής περιόδου η συχνότητα εμφάνισης όγκου ήταν 100% με μέση φορτίο όγκου του 82,25 mm

3 σε χάμστερ βαμμένα με ΟΜΒΑ (ομάδα 1). Διαιτητικά συμπληρώματα ασταξανθίνης (15 mg /kg σωματικού βάρους) για να ϋΜΒΑ βαμμένο χάμστερ δεν επήγαγε οποιαδήποτε ακαθάριστο όγκους στο στοματικό θύλακα και ιστολογική εξέταση αποκάλυψε μόνο ήπια υπερπλασία. Σε χάμστερ τρέφονται ασταξανθίνη μεμονωμένα και σε ομάδες ελέγχου, το επιθήλιο ήταν κανονικό, άθικτο, και συνεχής.

ασταξανθίνη αναστέλλει σηματοδότησης JAK /STAT περιορίζοντας τη φωσφορυλίωση της STAT-3

Όπως STAT 3 είναι ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα σε ένα ευρύ φάσμα κακοηθειών, αναλύσαμε πρώτα την έκφραση του mRNA της JAK-2 και STAT-3 με ποσοτική ανάλυση RT-PCR. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι τα διαιτητικά συμπληρώματα της ασταξανθίνη μείωσε σημαντικά την έκφραση του mRNA των βασικών μορίων που εμπλέκονται στην σηματοδότησης JAK /STAT σε σύγκριση με τα ζώα DMBA ζωγραφισμένα (Εικόνα 1Α). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε ζώα που έλαβαν ασταξανθίνη μόνη σύγκριση με τον έλεγχο. Να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό με τον οποίο η ασταξανθίνη ρυθμίζει JAK σηματοδότησης /STAT, είμαστε δίπλα προσδιορίζεται η πρωτεΐνη έκφραση της IL-6, JAK-2, pJAK-2, STAT-3 και pSTAT-3 με western αποτύπωση. Βρήκαμε ότι η τοπική εφαρμογή του DMBA αύξησε σημαντικά τις εκφράσεις αυτών των γονιδίων σε σύγκριση με το μάρτυρα. Ταυτόχρονη χορήγηση διαιτητικών ασταξανθίνης ανέστειλε JAK σηματοδότηση /STAT με τη μείωση των επιπέδων της IL-6, JAK /STAT φωσφορυλιωμένες μορφές και μετέπειτα μετατόπιση προς τον πυρήνα (Εικόνα 1Β & amp? 1C). Αυτό επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με μειωμένο επίπεδο pSTAT

tyr705 (ELISA) σε κατεργασμένα AXT ομάδα (Σχήμα 1D). Ανοσοϊστοχημική χρώση επιβεβαίωσε επίσης ότι η συμπλήρωση ασταξανθίνη είχε ως αποτέλεσμα σημαντική μείωση στην έκφραση του pSTAT-3 σε σύγκριση με ϋΜΒΑ ζωγραφισμένα ζώα (Σχήμα 1 Ε)

(μέση ± SD? N = 3).. επίπεδο έκφρασης Α Αντίγραφο της JAK-2 και STAT-3 σε διάφορες πειραματικές ομάδες, όπως καθορίζεται από την κινητική PCR. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Β ανάλυση Εκπρόσωπος ανοσοαποτύπωσης. Δείγματα πρωτεΐνης (100 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE ανιχνεύθηκαν με αντίστοιχα αντισώματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κυτοσόλιο και πλήρους ιστού ομογενοποιήματα. Ιστονών Η2Β χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης των πυρηνικών πρωτεϊνών. Οι φωσφορυλιωμένες πρωτεΐνες κανονικοποιήθηκαν με μη φωσφορυλιωμένη μορφή τους. ανάλυση Γ πυκνομετρική. Η έκφραση πρωτεΐνης από κυτταρολύματα ελέγχου για τρία προσδιορισμούς ορίστηκε ως 100% στο γράφημα. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη έκφραση των τριών προσδιορισμών

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Δ Επίπεδα pSTAT

tyr705 (ELISA). Ε Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες ανοσοϊστοχημική χρώση των pSTAT-3 σε έλεγχο και σε πειραματόζωα (20Χ).

Η

ασταξανθίνη παρεμποδίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και την αγγειογένεση μέσω της αναστολής της JAK οδού /STAT

Όπως STAT-3 ενεργοποίησης ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εισβολή, και η αγγειογένεση, έχουμε την επόμενη διερευνήθηκε η επίδραση της ασταξανθίνης στους δείκτες του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Η διαιτητική συμπλήρωση της ασταξανθίνης μείωσε σημαντικά την έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης της κυκλίνης D1 και PCNA. Επιπλέον, AXT αυξημένη πυρηνική ρ21 έκφρασης σε σχέση με το κυτοσολικό κλάσμα. Επιπλέον, AXT συμπλήρωση μειωμένο συνολικό επίπεδο κυκλίνης D1 (ELISA) σε σύγκριση με την ομάδα DMBA (σχήμα 2). Ωστόσο, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των χάμστερ τροφοδοτείται ασταξανθίνη μόνη της και η ομάδα ελέγχου

(μέση τιμή ± SD? N = 3).. επίπεδο έκφρασης Α Αντίγραφο του p21, κυκλίνη D1 και PCNA σε διάφορες πειραματικές ομάδες, όπως καθορίζεται από την κινητική PCR. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Β ανάλυση Εκπρόσωπος ανοσοαποτύπωσης. Δείγματα πρωτεΐνης (100 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE ανιχνεύθηκαν με αντίστοιχα αντισώματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κυτοσόλιο και πλήρους ιστού ομογενοποιήματα. Ιστονών Η2Β χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης των πυρηνικών πρωτεϊνών. ανάλυση Γ πυκνομετρική. Η έκφραση πρωτεΐνης από κυτταρολύματα ελέγχου για τρία προσδιορισμούς ορίστηκε ως 100% στο γράφημα. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη έκφραση των τριών προσδιορισμών

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. p & lt? 0,05 έναντι DMBA. D. Τα επίπεδα της ολικής D1 κυκλίνης (ELISA). Ε Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες ανοσοϊστοχημική χρώση PCNA σε έλεγχο και σε πειραματόζωα (20Χ).

Η

Για να καθοριστεί εάν η αναστολή της JAK /STAT οδού από ασταξανθίνη εμποδίζει την εισβολή, είμαστε δίπλα ανέλυσε την έκφραση της ΜΜΡ-2 , ΜΜΡ-9 και των αναστολέων τους. Διαιτητικά χορήγηση της ασταξανθίνης διαμορφωμένου σημαντικά την έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης αυτών των μορίων σε σύγκριση με την ομάδα 1 ζώα. Για την επικύρωση περαιτέρω ότι η ασταξανθίνη ρυθμίζει μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας, εξετάσαμε επίσης πρωτεΐνη έκφραση της ΜΜΡ-2 με ανοσοϊστοχημική ανάλυση. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι η χορήγηση ασταξανθίνη μείωσε σημαντικά την έκφραση της ΜΜΡ-2 σε σύγκριση με την ομάδα 1 ζώα. . Από την άλλη πλευρά, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε ζώα που τρέφονται ασταξανθίνη μόνος σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 3)

(μέση ± SD? N = 3). επίπεδο έκφρασης Α Αντίγραφο του ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και ΤΙΜΡ-2 σε διάφορες πειραματικές ομάδες όπως προσδιορίζεται με κινητική PCR. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. B & amp? Γ Εκπρόσωπος ανοσοκηλιδώσεις και το μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη έκφραση της ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9, TIMP-2 και RECK για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Δ Αντιπροσωπευτικά φωτομικρογραφίες ανοσοϊστοχημικής χρώσης του ΜΜΡ-2 σε έλεγχο και σε πειραματόζωα (20Χ).

Η

Όπως νεοαγγείωση παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του όγκου και είναι ένα από τα σημαντικότερα καθοδικά συμβάντα που προκλήθηκε από την JAK /STAT οδού, διερευνήσαμε την επίδραση της ασταξανθίνης επί της αγγειογένεσης. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, διαιτητική συμπλήρωση της ασταξανθίνης διαμορφωμένου σημαντικά την έκφραση του VEGF, VEGFR2 και μειωμένη HIF-1α πυρηνική μετατόπιση σε σύγκριση με τα ζώα ϋΜΒΑ ζωγραφισμένα. Επιπλέον, AXT συμπλήρωση μείωσε το επίπεδο του pVEGFR2 (ELISA). Ανοσοϊστοχημική χρώση επιβεβαίωσε επίσης μειωμένη έκφραση του VEGF σε χάμστερ που τρέφονται ασταξανθίνη σύγκριση με τα ζώα ϋΜΒΑ ζωγραφισμένα. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές σε ζώα που υπέστησαν αγωγή με ασταξανθίνη μόνη σύγκριση με τον έλεγχο

(μέση ± SD? N = 3).. επίπεδο έκφρασης Α Αντίγραφο του HIF-1α, VEGF και VEGFR2 σε διάφορες πειραματικές ομάδες όπως προσδιορίζεται με κινητική PCR. Τα δεδομένα είναι η μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Β ανάλυση Εκπρόσωπος ανοσοαποτύπωσης. Δείγματα πρωτεΐνης (100 μg /λωρίδα) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE ανιχνεύθηκαν με αντίστοιχα αντισώματα. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για κυτοσόλιο και πλήρους ιστού ομογενοποιήματα. Ιστονών Η2Β χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης των πυρηνικών πρωτεϊνών. ανάλυση Γ πυκνομετρική. Η έκφραση πρωτεΐνης από κυτταρολύματα ελέγχου για τρία προσδιορισμούς ορίστηκε ως 100% στο γράφημα. Κάθε γραμμή αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη έκφραση των τριών προσδιορισμών

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Δ Επίπεδα pVEGFR2

tyr1175 (ELISA). Ε Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες ανοσοϊστοχημική χρώση του VEGF σε έλεγχο και σε πειραματόζωα (20Χ).

Η

Όπως AXT μειώθηκε HIF-1α και VEGF έκφραση, οι βασικοί παράγοντες που εμπλέκονται στη νεοαγγείωση, είμαστε δίπλα φρόντισε να διαπιστώσει αν αναστολή αυτών των μορίων με AXT έχει οποιαδήποτε επίδραση επί των αγγείων με τη μέτρηση της πυκνότητα μικροαγγείων. DMBA ζωγραφισμένα ζώα έδειξαν υψηλή αγγείωση με μία μέση MVD 185 σε σύγκριση με τα ζώα ελέγχου. Η διαιτητική συμπλήρωση του AXT μείωσε σημαντικά τον αριθμό των σκαφών σύγκριση με τα ζώα DMBA ζωγραφισμένα, υποδεικνύοντας την αντιαγγειογενετικές δυναμικό της ασταξανθίνης (σχήμα 5).

A. Εκπρόσωπος μικροφωτογραφίες της πυκνότητας μικροαγγειακή σε έλεγχο και σε πειραματόζωα (40Χ). Β Μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει τον αριθμό των σκαφών για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. * P & lt? 0,05 έναντι DMBA. Γ Μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει το μήκος του σκάφους για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

♣ p & lt?. 0,05 έναντι του ελέγχου. p & lt?. 0,05 έναντι DMBA

Η

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η αναστολή της STAT-3 σηματοδότησης και αγγειογένεση με ασταξανθίνη, πραγματοποιήθηκε μελέτη μοριακών σύνδεσης για ασταξανθίνη με STAT-3 και VEGF. AXT βρέθηκε να συνδέεται με STAT-3 και VEGF με σκορ σύνδεσης του -5.081 και -2,94 αντίστοιχα. AXT αλληλεπιδρά με τη θέση διμερισμού STAT-3 για να σχηματίσουν δεσμούς υδρογόνου με Met 1482, Glu 1523, Arg 1593 και Asn 539 και αλληλεπιδρά με VEGF μέσω δεσμού υδρογόνου με Asp 41 υπολειμμάτων (Σχήμα 6).

A. Αντιπροσωπεύει δεσμό υδρογόνου μορφή AXT με Met 1428, Glu 1523, Arg 1593 και Αδη 538 της STAT-3. Β Αντιπροσωπεύει δεσμός υδρογόνου μορφή AXT με ASP 41 του VEGF.

Η

Για να δοκιμαστεί η αντιαγγειογενετικές δυναμικό της ασταξανθίνη

in vitro

χρησιμοποιήσαμε ECV 304 κύτταρα. Η αγγειογένεση είναι μια πολύπλοκη διαδικασία που περιλαμβάνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη μετανάστευση, και το σχηματισμό σωλήνα. Πρώτον, προσδιορίσαμε την συγκέντρωση της ασταξανθίνης στο οποίο αναστέλλει την βιωσιμότητα των κυττάρων ECV κατά 50% (IC

50). Χρησιμοποιήσαμε διάφορες συγκεντρώσεις ασταξανθίνης από 5 έως 400 μm. Βρήκαμε ότι η ασταξανθίνη δεν μειώνει την βιωσιμότητα των κυττάρων ECV 304 σε 50% στις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν. Η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν 100% μέχρι και 50 μΜ της ασταξανθίνης όπως φαίνεται στο σχήμα 7? Ως εκ τούτου, ασταξανθίνη σε 50 μΜ συγκέντρωση χρησιμοποιήθηκε για περαιτέρω πειράματα. Για να ελεγχθεί αν η ασταξανθίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ενδοθηλιακών κυττάρων, εκτελέσαμε Alamar blue δοκιμασία και δοκιμασία BrdU. πολλαπλασιασμός κυττάρων που προκαλείται από υποξία δεν επηρεάστηκε από ασταξανθίνη όπως επιβεβαιώνεται τόσο από δοκιμασία BrdU καθώς Alamar blue δοκιμασίας (Σχήμα 7).

A. IC

50 αξία για ασταξανθίνη για ECV304 κύτταρα (ανάλυση Alamar Blue). B. Επίδραση ασταξανθίνης (50 μΜ) επί του πολλαπλασιασμού κυττάρου που διεγείρεται από υποξία (Alamar blue δοκιμασίας). * P & lt? 0,05 έναντι φυσιολογική οξυγόνωση. C. Επίδραση ασταξανθίνης (50 μΜ) επί του πολλαπλασιασμού κυττάρου που διεγείρεται από υποξία (δοκιμασία BrdU). * P & lt?. 0,05 έναντι νορμοξίας

Η

Η μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων είναι ένα από τα βασικά βήματα στην αγγειογένεση και μετάσταση? Ως εκ τούτου, έχουμε την επόμενη προσδιοριστεί η επίδραση της ασταξανθίνη για τη μετανάστευση. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι 50 μΜ ασταξανθίνη ανέστειλαν σημαντικά τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων. Όπως φαίνεται στο σχήμα 8, υποξικά κύτταρα ECV μετανάστευσαν περίπου 437 μm μετά από 24 ώρες? λαμβάνοντας υπόψη ότι η AXT επεξεργασμένα κύτταρα υποξικά μετανάστευσαν μόνο περίπου 192 μm, υποδεικνύοντας την πιθανή αντι-μετανάστευσης της ασταξανθίνη

& amp.? Β Αντιπροσωπευτικές μικροφωτογραφίες δοκιμασία μετανάστευσης σε κύτταρα ελέγχου και υποξικές ECV σε 0 h και 24 h (4Χ). Γ Μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει απόσταση μετανάστευσαν για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

♣ p & lt?. 0,05 έναντι φυσιολογική οξυγόνωση. p & lt?. 0,05 έναντι υποξία

Η

Το κύριο βήμα κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης είναι ο σχηματισμός και η συγχώνευση των σωλήνων που παράγεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα που σχηματίζουν ένα σύνθετο δίκτυο των πλοίων, ως εκ τούτου, είμαστε δίπλα προσδιοριστεί η επίδραση της AXT στο σχηματισμό σωλήνα εκτέλεση δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα matrigel. Υπό υποξικές συνθήκες, υπήρξε σημαντική αύξηση στον αριθμό των σωλήνων που σχηματίζονται, καθώς και το μήκος του σωλήνα σε σύγκριση με το νορμοξικό κατάσταση. θεραπεία ασταξανθίνη μείωσε σημαντικά τον αριθμό των σωλήνων και το μήκος του σωλήνα κάτω από υποξικές συνθήκες. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ασταξανθίνη υπό ορθοξικές κατάσταση (σχήμα 9).

Α. Αντιπροσωπευτικά φωτομικρογραφίες δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα Matrigel σε κύτταρα ελέγχου και υποξική ECV (4Χ). Β Μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει όχι. σωλήνων για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

♣ p & lt?. 0,05 έναντι φυσιολογική οξυγόνωση. * P & lt? 0,05 έναντι υποξία. Γ Μπαρ γράφημα που αντιπροσωπεύει το μήκος σωλήνα για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα

♣ p & lt?. 0,05 έναντι φυσιολογική οξυγόνωση. * Ρ & lt?. 0,05 έναντι υποξίας

Η

Για να γνωρίζουμε το μηχανισμό με τον οποίο AXT αναστέλλει τη μετανάστευση και σωλήνας σχηματισμό ενδοθηλιακών κυττάρων, αναλύσαμε την έκφραση της προ-αγγειογόνων μορίων σε νορμοξικά και 4 ώρες, 8 ώρες, και 16 ώρες υποξικά ECV κύτταρα. Ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση αποκάλυψε μια αύξηση στην έκφραση HIF1α από 4 ώρες που ήταν σταθερή έως και 8 ώρες υποξία. VEGF και της έκφρασης της ΜΜΡ-2 αυξήθηκαν από 8 ώρες μετά και συνεχίστηκε μέχρι 16 ώρες. Η θεραπεία με AXT μειωμένη υποξία προκαλούμενη από αύξηση στην έκφραση αυτών των μορίων (Σχήμα 10)

Α & amp.? Β Αντιπροσωπευτικές ανοσοκηλιδώσεις και ραβδόγραμμα που αντιπροσωπεύουν πρωτεΐνη έκφραση του HIF-1α, VEGF και ΜΜΡ-2 για τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. * P & lt?. 0,05 έναντι υποξία

Η

Συζήτηση

Αρκετές μελέτες έχουν τεκμηριώσει ότι η ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης STAT-3 συμβάλλει στην νεοπλασματικό μετασχηματισμό σε διάφορες κακοήθειες, και έχουν επικυρωθεί πού δηλώνουν 3 ως μια πολλά υποσχόμενη στόχος για τη θεραπεία του καρκίνου [11], [30], [31]. Η ανάπτυξη των παραγόντων που στοχεύουν STAT-3 με επαρκή ισχύ και εκλεκτικότητα όγκου έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα δύσκολο έργο. Μελέτες από τους άλλους και μας έχουν δείξει ότι οι φυτοχημικές ουσίες που εμπλέκονται στην χημειοπροφύλαξη του καρκίνου με τη διαμόρφωση των κυκλωμάτων σηματοδότησης παρεκκλίνουσα στον καρκίνο [32] – [35]. Στην παρούσα μελέτη, αποδεικνύει ότι η ασταξανθίνη αναστέλλει την /STAT-3 σηματοδοτικό μονοπάτι JAK, καθώς και γονίδια στόχους της στο μοντέλο καρκινώματος HBP.

Οι λειτουργίες της πρωτεΐνης STAT-3 εξαρτώνται κυρίως από φωσφορυλίωση και υποκυτταρικά της εντοπισμός. Σε μη διεγερμένα κύτταρα, οι πρωτεΐνες STAT-3 είναι παρόντα στην ανενεργό μορφή στο κυτταρόπλασμα. Η ενεργοποίηση του STAT-3 λαμβάνει χώρα μέσω φωσφορυλίωσης του υπολείμματος τυροσίνης της από σηματοδότηση υποδοχέα κυτοκίνης ή αυξητικού παράγοντα. Η φωσφορυλιωμένη STAT-3 στη συνέχεια διμερίζεται και μετατοπίζεται στον πυρήνα όπου δεσμεύεται με ΙΡΝ-γάμμα που ενεργοποιείται από το site (GAS) στο DNA και ενεργοποιεί τη μεταγραφή των γονιδίων στόχων [12]. STAT-3 έχει βρεθεί να είναι ουσιαστικά δραστική σε διάφορα καρκινώματα και αναστολή της STAT-3 ενεργοποίησης συσχετίζεται με την καταστολή κακοήθων κυττάρων τόσο

in vitro

και

in vivo

[36], [37] . Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης παρέχουν αποδείξεις ότι τα συμπληρώματα ασταξανθίνη καταργεί συστατική ενεργοποίηση του STAT-3 εμποδίζοντας φωσφορυλίωση του και μετέπειτα πυρηνική μετατόπιση. Επιπλέον, η αλληλεπίδραση του AXT με τη θέση διμερισμού του STAT-3 από μελέτες μοριακής σύνδεσης επικυρώνει επίσης την αναστολή της STAT-3 με AXT. Η ασταξανθίνη αποδείχθηκε ότι αναστέλλει ηπατοκυτταρικού καρκινώματος αρουραίου CBRH-7919 κύτταρα διαμορφώνοντας την JAK /STAT-3 σηματοδότηση [38].