Αφηρημένο

Η αναστολή της οδού DNA απάντηση ζημιά φαίνεται να είναι μία ελκυστική στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου. Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι σε κύτταρα τρωκτικών που εκτίθενται σε θερμική καταπόνηση, η κυτταρική ανάπτυξη προωθήθηκε από την δραστηριότητα του DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ), ενός ενζύμου που εμπλέκεται στο DNA μη ομόλογες άκρο σύνδεσης (NHEJ) που απαιτείται για διπλό σκέλος σπάσει επισκευή. Η απουσία μιας λειτουργικής ΟΝΑ-ΡΚ συνδέθηκε με ρύθμιση προς τα κάτω της πρωτεΐνης θερμικού σοκ 70 (HSP70). Ο στόχος της μελέτης αυτής είναι επομένως να διερευνηθεί ο ρόλος της αναστολής DNA-ΡΚ σε θερμότητα επαγόμενη απόπτωση σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Οι αναστολείς της φωσφορυλίωσης του DNA-PK καταλυτική υπομονάδα (DNA-PKcs) σε Ser2056, όπως NU7026 και NU7441, χρησιμοποιήθηκαν. Επιπλέον, γκρεμίζω του DNA-PKcs διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siDNA-PKcs). Για θερμική έκθεση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε υδατόλουτρο στους 44 ° C για 60 λεπτά. Η απόπτωση αξιολογήθηκε μετά από επώαση ροής 24 h cytometrically. Οι πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν μετά από 24 ώρες και αναλύθηκαν για έκφραση HSP70 και Hsp40 με κηλίδωση Western. Ολικό RNA εκχυλίστηκε 6 ώρες μετά την αγωγή και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα μικροσυστοιχιών GeneChip® να προσδιορίσει και να επιλέξει τις up-ρυθμιζόμενα γονίδια (≥1.5 φορές). Τα αποτελέσματα έδειξαν μία ενίσχυση στην θερμότητα επαγόμενη απόπτωση απουσία λειτουργικής DNA-PKcs. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα επίπεδα έκφρασης της HSP70 και Hsp40 ήταν αυξημένα σε απουσία DNA-PKcs υπό θερμικό στρες. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης γενετικού δικτύου έδειξε ότι HSPs και Ιούνιο γονίδια ήταν μέχρι ρυθμίζονται ανεξάρτητα από το DNA-PKcs σε εκτεθειμένα γονέα και νοκ άουτ κύτταρα. Με την παρουσία λειτουργικών DNA-PKcs, υπήρξε μια παρατηρήθηκε αυξητική ρύθμιση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως NR1D1, ενώ εν απουσία του DNA-PKcs τα προ-αποπτωτικά γονίδια, όπως EGR2, ήταν κατά προτίμηση πάνω ρυθμισμένα. Από τα ευρήματα αυτά, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι στα ανθρώπινα κύτταρα, η αδρανοποίηση του DNA-PKcs μπορεί να προωθήσει τη θερμότητα που προκαλείται απόπτωση ανεξαρτήτως των πρωτεϊνών θερμικού σοκ

Παράθεση:. Okazawa S, Furusawa Υ, Kariya Α, Χασάν ΜΑ, Arai Μ, Hayashi R, et al. (2013) Αδρανοποίηση του DNA κινάση πρωτεΐνης που εξαρτάται Προωθεί Heat απόπτωση που επάγεται Ανεξάρτητα από Heat Shock Protein-επαγωγής σε ανθρώπινα καρκινικά Κυτταρικές Γραμμές. PLoS ONE 8 (3): e58325. doi: 10.1371 /journal.pone.0058325

Επιμέλεια: Μιχαήλ Sherman, Boston University Medical School, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: πρώτης Φεβρουαρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαρτίου 2013

Copyright: © 2013 Okazawa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση γι ‘αυτό μελέτη που παρέχεται από μια Grant-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα (Β) (22.390.229), την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι κακοήθεις όγκοι είναι ένα σημαντικό πρόβλημα στον κόσμο ότι στην έρευνα στον τομέα της ιατρικής η ανάπτυξη αποτελεσματικών θεραπευτικών ήταν πάντα στην κορυφή των ερευνητικών ενδιαφερόντων για δεκαετίες. Ο στόχος αυτός συνεχίστηκε επί χρόνια, παρά τις πολυάριθμες διαθέσιμες θεραπευτικά εργαλεία (όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία, υπερθερμία [1], εστιασμένος υπέρηχος υψηλής έντασης (HIFU) [2], η ανοσοθεραπεία [3], κλπ), και της ποικιλίας των στρατηγικών συνδυασμών τους [1], [4], [5]. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι κανένα από αυτά τα εργαλεία λειτούργησε άψογα ή ασφάλεια στην εξάλειψη των καρκίνων. Ωστόσο, για να ρυθμίσετε επιστημονικούς λόγους για να τις ανακαλύψεις νέων προσεγγίσεων, σε βάθος κατανόηση της μοριακής βιολογίας του καρκίνου καθίσταται υποχρεωτική. Πρόσφατα, οι μελέτες για την αντιμετώπιση βλαβών του DNA (DDR) πορείες που παρέχονται σε αυτήν την περιοχή, όπως πολλά υποσχόμενη στη θεραπεία του καρκίνου. Ο συνδυασμός των παραγόντων που προκαλούν βλάβη του DNA με μοριακά φάρμακα που στοχεύουν εναντίον των παικτών εμπλέκονται σε οδούς επιδιόρθωσης DNA θα μπορούσε να οδηγήσει μια συνεργική επίδραση στην θανάτωση των καρκινικών κυττάρων [6]. Οι μελέτες σχετικά με DDR αποκάλυψαν μια πληθώρα μοριακών στόχων όπως η telangiectasia αταξία μεταλλαγμένο (ΑΤΜ), αταξία τηλαγγειεκτασία και Rad3 σχετίζονται (ATR), και DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση (ϋΝΑ-ΡΚ). Αυτές οι πρωτεΐνες είναι μέλη της φωσφοϊνοσιτόλης 3-κινάση που μοιάζει με κινάση (Pikk) οικογένεια λειτουργούν ως μετατροπείς σε DDR για την ενεργοποίηση πολλαπλών πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA [7] – [9].

Έχει αναφερθεί ότι το DNA-PK αλληλεπιδρά με τον παράγοντα μεταγραφής θερμικού σοκ (HSF1) [10]. Σε μία μελέτη, η DNA-PKcs αρνητικός ποντικός scva2 κυτταρική σειρά και μια συμφωνημένα DNA-PKcs sc θετική κυτταρική σειρά (8) -10 που προέρχεται από scva2 με την εισαγωγή ενός δομικού γονιδίου DNA-PKcs, εκτέθηκαν σε θερμική επεξεργασία και η έκταση της θερμότητας που προκαλείται από απόπτωση αξιολογήθηκε. Τα αρνητικά κύτταρα DNA-PKcs έδειξε κάπως καθυστερημένη HSP70 επαγωγής η οποία έφθασε σε χαμηλότερο επίπεδο σταθερής κατάστασης. Αυτή η παρατήρηση δικαιολογείται από HSF1 και DNA-PKcs αλληλεπίδρασης [11]. Ωστόσο, όπως DDR ενεργοποίηση από υπερθερμία δεν αναγνωρίστηκε εκείνη τη στιγμή, η συμμετοχή της ενεργοποίησης ΑΤΜ, φωσφορυλίωση p53 [12], και η επαγωγή της γH2AX [13] από τη θερμότητα στρες δεν αναφέρονται. Πρόσφατα, η φωσφορυλίωση του ρ53 σε Ser15 καθώς και η ενδοκυτταρική σηματοδότηση του μη ομόλογου άκρου σύνδεσης (NHEJ), έχει αποκαλυφθεί. Επιπλέον, αρκετές άλλες σενάρια εμπλοκής ΟΝΑ-ΡΚ σε απόκριση θερμική καταπόνηση, όπως ένα σήμα επιβίωσης των κυττάρων πάνω ρύθμιση με φωσφορυλίωση της Akt μέσω ΟΝΑ-ΡΚ [14] και την ενεργοποίηση του ΝΡκΒ ρ50 [15], έχουν επίσης αναφερθεί. Επιπλέον, η ομάδα μας έχει δείξει ότι η αναστολή της ΟΝΑ-ΡΚ από τους αναστολείς ϋΝΑ-ΡΚ και τεχνική RNAi προωθείται υπερήχους κυτταρικό θάνατο που επάγεται ανεξάρτητα από φαινότυπο ρ53 [16].

Σε αυτή τη μελέτη, θα ερευνήσουμε παρομοίως ο ρόλος του ϋΝΑ-ΡΚ σε θερμότητα επαγόμενη απόπτωση σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου του ανθρώπου. Υποθέτουμε ότι η αναστολή DNA-PKcs μπορούσε να ενισχύσει την υπερθερμία που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο. Οι λεπτομέρειες των υποκείμενων μηχανισμών θα μελετήσει επίσης.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η θερμότητα που προκαλείται απόπτωση Ενισχυμένη από το DNA-PK Αναστολείς

Έλεγχος και επεξεργασμένα κύτταρα αναλύθηκαν για η έκταση της χρωματίνης συμπύκνωσης ως δείκτης για την επαγωγή απόπτωσης με χρήση πυρηνικών ID ™ κιτ πράσινο συμπύκνωση της χρωματίνης μετριέται ροοκυττομετρικά. Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε 24 ώρες μετά την έκθεση σε θερμότητα απουσία ή παρουσία αναστολέων DNA-ΡΚ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α HSPA6, DNAJB1, DNAJA4 και JUN, προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας πραγματικού χρόνου qPCR (Σχήμα 4Α-D). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα επίπεδα του mRNA των γονιδίων αυτών αυξήθηκαν σημαντικά κατά θερμικό στρες.

Κύτταρα

HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία στους 44 ° C για 60 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C για 6 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του (α) DNAJB1 (Hsp40), (β) HSPA6 (HSP70), (γ) DNAJA4, (δ) JUN, (ε) NR1D1, (στ) AHR, (ζ) BIRC3, (h) Jund , (i) EGR2 και (ι) KLF4 κανονικοποιημένη σε επίπεδο έκφρασης GAPDH. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD (*, Ρ & lt? 0,05? **, Ρ & lt? 0,01? NS, μη-σημαντική)

Η

Στη συνέχεια, απεικονίζεται η πιθανή γενετική δίκτυο το οποίο θα περιλαμβάνει το. up-ρυθμιζόμενα γονίδια σε siLuc-επιμολυσμένα κύτταρα (ομάδα 2) (Σχήμα 5Α). Τα γονίδια που ταυτοποιούνται περιλαμβάνονται προ-αποπτωτικών γονιδίων που λειτουργούν μέσω οδών ΤΝΡα σχετίζονται όπως TLR4 [19], [20], και TNFRSF10B, επίσης γνωστή ως DR5, που μπορούν να ενεργοποιηθούν με νέκρωσης όγκου απόπτωση που επάγει πρόσδεμα παράγοντας που σχετίζονται με [21 RIPK2 ]. Οι παράγοντες που σχετίζονται με τον υποδοχέα του παράγοντα νέκρωσης όγκου, όπως TRAF2 και TRAF6, ανιχνεύθηκαν επίσης. TRAF2 μεσολαβήσει σηματοδότησης από υπεροικογένειας TNF-R για την ενεργοποίηση της JNK (c-Jun Ν-τελική κινάση) ή ΝΡκΒ [22]. TRAF6 συμμετέχει επίσης στο σηματοδοτικό μονοπάτι από τον TLR υπεροικογένεια και επάγει την απόπτωση μέσω μιας κασπάσης-εξαρτώμενο μονοπάτι και αυξάνει την ενεργοποίηση ΝΡκΒ [23]. TRAF3IPs αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες TRAF οικογένεια και είτε Ι-κΒ κινάσης ή ΜΑΡ κινάσης [24]. IRF1 γονίδιο προκαλεί κυτταρικό θάνατο με την παρουσία ΙΝΡγ και TNFa [25]. Από την άλλη πλευρά, εντοπίστηκαν επίσης μερικά γονίδια κυτταρικής επιβίωσης. Η προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων επιβίωσης επιβεβαιώθηκε και πάλι με τη δοκιμασία qPCR. Το Σχήμα 4Ε δείχνει ότι το επίπεδο του mRNA του NR1D1 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε siLuc-επιμολυσμένα κύτταρα ενώ κάτω-ρυθμίζονται σε DNA-PKcs knockdown κυττάρων. NR1D1 απεικονίζεται στο δίκτυο ως το γονίδιο που θα μπορούσε να επηρεάσει TLR4. NR1D1 αναφέρθηκε ότι είναι ένα γονίδιο στόχος LXR σε ανθρώπινα μακροφάγα και καταστέλλει LXR επαγόμενη-TLR-4 έκφραση [26]. Είναι ενδιαφέρον, NR1D1 είναι ένα από τα intranuclear υποδοχείς και θεωρείται ότι συμβάλλουν στην κιρκαδικό σύστημα, ωστόσο, το βιολογικό τρόπο δράσης της είναι άγνωστος. Μια πρόσφατη έκθεση προτείνει NR1D1 μπορεί να ενεργεί για το λίπος ένζυμο του μεταβολισμού δραστηριότητα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα του υποδοχέα 2 (ΕΚΒΒ2) καρκίνο του μαστού -θετικό, και να λειτουργήσουν στην επιβίωση των κυττάρων [27], [28]. Έτσι, θα μπορούσε να είναι ότι NR1D1 διεγείρεται υπό θερμικό στρες με ΟΝΑ-ΡΚ για την προώθηση του μεταβολισμού των κυττάρων για επιβίωση. Ομοίως, το Σχήμα 4F & amp? G δείχνουν την διαφορική έκφραση AHR και BIRC3 στις δύο παραλλαγές κύτταρο. AHR έχει πολλές λειτουργίες στο ΑΤΜ σηματοδότηση, τη διαφοροποίηση των οστών, Th17 διαφοροποίηση των λεμφοκυττάρων, της έκφρασης Ρ450, και τη ρύθμιση της οδού ΝΡκΒ [29], [30]. Επιπλέον, AHR ενισχύει την κυτταροπροστασία σχετίζονται γονίδιο SERPINE1 [31], η οποία αναγνωρίστηκε επίσης ως ένα up-ρυθμιζόμενο γονίδιο σε προηγούμενες μελέτες μας [32], [33]. BIRC3 (κυτταρική αναστολέας της απόπτωσης πρωτείνης 2? CIAP2) είναι ένας από τους αναστολείς της οικογενειακής απόπτωσης πρωτεϊνών. BIRC3 επάγεται από ΤΝΡα μέσω ΝΡκΒ μονοπάτι, και μπορεί να προκληθεί από άλλες οδούς, συμπεριλαμβανομένων ΡΙ3Κ [34]. Σε αυτό το σημείο, ήταν σημαντικό να επιβεβαιωθεί ο ρόλος αυτών των γονιδίων επιβίωσης σε διάσωση κυττάρων μετά από έκθεση θερμικό στρες. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε νοκ ντάουν πειράματα εναντίον NR1D1 και BIRC3 σε κύτταρα HeLa ακολουθούμενη από θερμική επεξεργασία. Η αποτελεσματικότητα της γκρεμίζω επαληθεύτηκε με ανάλυση qPCR 24 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα S4). Τα επιμολυσμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε θερμικό στρες 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι τα επίπεδα σχάση της κασπάσης-3 αυξήθηκαν ελαφρά σε siNR1D1- και siBIRC3 επιμολυσμένα κύτταρα 24 ώρες μετά την αγωγή (Σχήμα S5). Τα κύτταρα που στερούνται NR1D1 εμφανίζεται σημαντική αύξηση στην συμπύκνωση της χρωματίνης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siLuc, ενώ το knockdown του BIRC3 ελαφρώς, αλλά όχι σημαντικά, αύξησε το ποσοστό των κυττάρων με συμπυκνωμένη χρωματίνη μετά από θερμική επεξεργασία (Σχήμα S6).

( α) Up-ρυθμιζόμενα γονίδια του θερμικά εκτεθειμένα siLuc-επιμολυσμένα κύτταρα (Ομάδα 2 στο Σχ. 3Α). Αυτή η ομάδα αποτελείται από αντι-αποπτωτικών γονιδίων, όπως NFκB γονίδια που σχετίζονται με την οδό, AHR και NR1D1? (Β) Up-ρυθμιζόμενα γονίδια του θερμικά εκτεθειμένα siDNA-PKcs-επιμολυσμένα κύτταρα (Ομάδα 3 στο Σχ. 3Α). Αυτή η ομάδα αποτελείται από προ-αποπτωτικά γονίδια που κανονικά αναστέλλεται από δραστικότητα ϋΝΑ-ΡΚ όπως EGR2, KLF4 και ATF4.

Η

Σχήμα 5Β απεικονίζει την πιθανή γενετική δίκτυο το οποίο θα περιλαμβάνει τα πάνω ρυθμισμένα γονίδια σε siDNA -PKcs-επιμολυσμένα κύτταρα (ομάδα 3). Σχήμα 4Η-J παρέχουν τα αποτελέσματα qPCR για ορισμένα επιλεγμένα γονίδια, δηλαδή, Jund, ERG2 και KLF4. Μεταξύ των up-ρυθμιζόμενα γονίδια είναι Jund που συμπεριφέρεται παρόμοια με τις πρωτεΐνες Ιούνιο για να μετενεργοποιούν ένα ΑΡ-1 προαγωγός που αποκρίνεται σε συνδυασμό (Σχήμα 4Η). Jund εμφανίζει ένα κύτταρο-εξαρτώμενη ρόλο στην πρόληψη του κυτταρικού θανάτου σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες UV-τόνισε ποντικού [35], με παράλληλη ενίσχυση δραστικότητα υν-επαγόμενης κασπάσης-3 σε ανθρώπινο μυελοβλαστική λευχαιμία [36]. έκφραση SOCS1 προκαλείται από TLR διέγερση και αναστέλλει JAK /STAT σηματοδότηση [37] ως αρνητικό πρότυπο ανάδραση [38]. SOCS1, η οποία ρυθμίζεται από Jund σε Τ-κύτταρα [39], ρυθμίζει τη διάρκεια του ΝΡκΒ σηματοδότησης μειώνοντας την έκφραση των γονιδίων που εξαρτώνται από ΝΡκΒ [40]. PLAUR είναι ένα γονίδιο του υποδοχέα ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης. PLAUR ρυθμίζει επιβίωση των ενδοθηλιακών κυττάρων και είναι σημαντική για τον VEGF-επαγόμενη αντι-απόπτωση [41]. Η υπερβολική έκφραση του Jund οδηγεί στην προς τα κάτω ρύθμιση VEGFA mRNA [42].

Το γενετικό δίκτυο επιβεβαιώνει επίσης την προς τα άνω ρύθμιση αρκετών προ-αποπτωτικών γονιδίων η οποία πηγαίνει σε συντονισμό με την παρατηρούμενη αύξηση στην απόπτωση σε απουσία DNA-ΡΚ. EGR2 παίζει ένα ρόλο κλειδί στην αποπτωτική οδό ΡΤΕΝ επαγόμενη. ERG2 ήταν διαφορικά αυξήθηκε σε siDNA-PK γκρεμίζω κύτταρα (Σχήμα 4I). Η έκφραση πάνω από EGR2 επάγει απόπτωση σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων μέσω BNIP3L και ΒΑΚ [43]. CYCS (γ γονίδιο κυτοχρώματος η οποία επάγει την απόπτωση μέσω bcl-2 οδού μετά την απελευθέρωση του από τα μιτοχόνδρια στο κυτταρόπλασμα), παράγοντα ενεργοποίησης μεταγραφής 4 (ATF4) (ενισχύσεις στο πάνω ρύθμιση της προ-αποπτωτική πρωτεΐνη C /έκφραση πρωτεΐνης ΕΒΡ-ομόλογο [ ,,,0],44]), και ο μεταγραφικός παράγοντας δακτύλου ψευδαργύρου KLF4 (αναφερθεί ότι εμπλέκεται σε επαγωγή απόπτωσης σε Τ-κυττάρων λευχαιμίας [45]) έχουν όλες τις προσδιοριζόμενες ως up-ρυθμιζόμενα γονίδια. Η αύξηση του επιπέδου του mRNA του KLF4 ήταν κάτω από το επίπεδο σημαντικότητας (p = 0,078), όμως, η τάση ήταν ευδιάκριτη σε όλες τις επαναλήψεις (Σχήμα 4J). Αυτά τα προ-αποπτωτικών γονιδίων θα μπορούσε να ανασταλεί με δραστικότητα ϋΝΑ-ΡΚ και έτσι, σε απουσία ενός λειτουργικού DNA-ΡΚ, αυτά τα γονίδια μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση της θερμότητας που προκαλείται από απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

Ο εκλεκτικός αναστολέας DNA-ΡΚ NU7026 (2- (μορφολιν-4-υλ) -βενζο [h] chomen-4-όνη) αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich (St Louis, ΜΟ) και NU7441 (8- (4-διβενζοθειενυλ) -2- (4-μορφολινυλ) -4Η-1-βενζοπυραν-4-όνη) αγοράστηκε από Αχοη Medchem (Groningen, The Netherlands). Αυτά διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε τελική συγκέντρωση 10 mM. Στοκ διαλύματα αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C μέχρι τη χρήση.

Γραμμές κυττάρων και θεραπεία

ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος HeLa S3 κύτταρα (Riken, Tsukuba, Japan), ανθρώπινο κακόηθες γλοίωμα M059K και DNA- του PKcs ελαττωματικό παραλλαγή M059J (που παρέχεται από τον Α Takahashi, Πανεπιστήμιο Γκούνμα, Japan), ήταν όλα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% στρεπτομυκίνη αντιβιοτικό μίγμα πενικιλλίνη /. Και κύτταρο ωοθήκης Κινεζικού χάμστερ CHO-Κ1 και ελαττωματικά κύτταρα του DNA-PKcs παραλλαγή V3 [46] (Riken) έχουν όλα αναπτύχθηκαν σε ΜΕΜα συμπληρωμένο με 10% FBS και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη αντιβιοτικό μείγμα. Η θέρμανση πραγματοποιείται με τη βύθιση ενός parafilm σφραγισμένο πλάκα καλλιέργειας κυττάρων σε ένα λουτρό νερού στους 44 ° C για 60 λεπτά. Η θερμοκρασία παρακολουθήθηκε με ένα ψηφιακό θερμόμετρο (# 7563, Yokogawa, Tokyo, Japan). Σε πειράματα αναστολής, τα κύτταρα προ-επωάστηκαν με 10 μΜ NU7026 ή NU7441 για 30-60 λεπτά, ακολουθούμενο από έκθεση σε θερμότητα. Τα επεξεργασμένα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C μέχρι την ανάλυση χωρίς μέσο ανταλλαγής.

χρωματίνης Ανάλυση Συμπύκνωση

Έλεγχος και τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν 24 ώρες μετά τη θεραπεία και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Πυρηνικού-ID ™ πράσινο χρωματίνη κιτ ανίχνευσης συμπύκνωσης (Enzo Life Sciences, Farmingdale, ΝΥ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η έκταση της χρωματίνης συμπύκνωσης μετρήθηκε με τον υπολογισμό της έντασης φθορισμού της Πυρηνικής-ID ™ πράσινο σε σχέση με τον έλεγχο με κυτταρομετρία ροής (Έπη XL, Beckman Coulter, Miami, FL).

ανάλυση κηλίδωσης Western

τα κύτταρα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50 mM NaCl, 1% Nonidet Ρ-40 και 50 mM Tris-HCl, ρΗ 8.0) που περιέχει ορθοβαναδικό νάτριο και πρωτεάσες αναστολέα κοκτέιλ (NACALAI TESQUE, Kyoto, Japan). ηλεκτροφόρηση SDS-polyaclylamidegel και κηλίδωση Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται αλλού [47]. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα εξής: ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι-HSP70 αντίσωμα (MBL, Ναγκόγια, Ιαπωνία)? ένα αντι-Hsp40 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (MBL)? ένα αντι-κασπάσης 3 αντίσωμα κουνελιού πολυκλωνικό το οποίο αναγνωρίζει το πλήρες μήκος της κασπάσης-3 (35 kDa), καθώς και τα θραύσματα (19- και 17-kDa) του ενεργοποιημένου ενζύμου (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ)? ένα πολυκλωνικό κουνελιού αντι-φωσφο DNA-PKcs στο Ser2056 αντισώματος (Abcam, Cambridge, UK)? ένα μονοκλωνικό αντι-DNA-PKcs αντίσωμα (Epitomics, Burlingame, CA)? ένα αντίσωμα αντι-HSF1 πολυκλωνικό κουνελιού (Stressgen Bioreagents, Βικτόρια, Καναδάς)? και ένα μονοκλωνικό ποντικού αντι-γλυκεραλδεΰδης 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) αντίσωμα (Organon Teknika, Durham, NC). Ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια σύστημα ανίχνευσης (ECL) σε ένα φωτοβόλο αναλυτή εικόνας (ΣΕΝ-4000, Fujifilm, Tokyo, Japan).

πυκνότητες Band είχαν ποσοτικοποιηθεί από την εικόνα J (Rasband, WS, ImageJ, US National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012.) και τις σχετικές ποσότητες των πρωτεϊνών που σχετίζονται με κάθε συγκεκριμένο αντίσωμα κανονικοποιήθηκαν προς GADPH μπάντες.

Η επιμόλυνση με μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA)

Ο αρνητικός μάρτυρας siRNA λουσιφεράσης και DNA-PKcs στοχευμένες siRNA ελήφθησαν από την Nippon Gene Υλικού (Toyama, Ιαπωνία), και Thermo Fisher Scientific, Dharmacon Προϊόντα (Lafayette, CO), αντίστοιχα. Τα siRNAs που στοχεύουν NR1D1 (Rev-erbα) και BIRC3 (γ-IAP2) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnolgy, Santa Cruz, CA. Η επιμόλυνση διεξήχθη σε κύτταρα HeLa χρησιμοποιώντας RNAi Max (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα HeLa συνελέγησαν, πλύθηκαν και αιωρήθηκαν σε πλήρες μέσο ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 2,5 χ 10

πλάκες 4 κύτταρα /φρεάτιο σε 12 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Για την επιμόλυνση, 800 μΙ Ορίί-ΜΕΜ (Invitrogen) προστέθηκαν στα κύτταρα που ακολουθείται από 200 μΐ Opti-ΜΕΜ που περιέχει το RNAi Μέγιστη /σύμπλοκα siRNA παρασκευάζονται 20 λεπτά πριν την προσθήκη (Αντίστροφα πρωτόκολλο επιμόλυνση). Έξι ώρες αργότερα, το μέσο επιμόλυνσης αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​πλήρες μέσο χωρίς αντιβιοτικά. Στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω 42 ώρες. Τριάντα λεπτά πριν από τη θερμική επεξεργασία, το μέσο αλλάχθηκε με πλήρες μέσο με αντιβιοτικά.

Απομόνωση RNA

Ολικό RNA εξήχθη από κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ (Qiagen, Valencia, CA) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με DNase Ι (RNase-free κιτ DNase? Qiagen) για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να απομακρυνθεί το απομένον γονιδιωματικό DNA. ποιότητα RNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). δείγματα RNA που είχε αριθμό ακεραιότητα του RNA (RIN) τιμές πάνω από 9,5 θεωρήθηκαν αποδεκτές.

μικροσυστοιχιών και Υπολογιστική Gene Expression Αναλύσεις

Η γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ένα Array GeneChip® Human Gene 1.0 ST στίγματα με περίπου 28.869 σετ καθετήρα (Affymetrix, Santa Clara, CA). Δείγματα για υβριδισμό συστοιχίας παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται στο Expression Τεχνικό Εγχειρίδιο Affymetrix GeneChip®. Τα σαρωμένα συστοιχίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το GeneChip® Analysis Suite Software (Affymetrix). Τα ληφθέντα δεδομένα έντασης υβριδισμού αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης GeneSpring® ver 11.5 (Silicon Genetics, Redwood City, CA) για την εξαγωγή σημαντικών γονιδίων. Να εξετάσει το γονίδιο οντολογία, συμπεριλαμβανομένων των βιολογικών διεργασιών, κυτταρικά συστατικά, μοριακές λειτουργίες, και η γενετική δίκτυα, τα ληφθέντα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση των εργαλείων Ingenuity Pathways Ανάλυση (Ingenuity® Systems, Mountain View, CA, USA), ένα web-παραδοθεί αίτηση ότι επιτρέπει την ταυτοποίηση, απεικόνιση, και την εξερεύνηση των δικτύων μοριακής αλληλεπίδρασης σε δεδομένα γονιδιακής έκφρασης [48]. Πλήρεις κατάλογοι σετ καθετήρα από όλα τα δείγματα είναι διαθέσιμα στο Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE39063).

Ακίνητα -Ώρα Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR)

σε πραγματικό χρόνο ανάλυση qPCR διεξήχθη σε πραγματικό χρόνο σύστημα PCR Mx3000P® (Stratagene Ιαπωνία, Tokyo, Japan) χρησιμοποιώντας SYBR® πρόμιγμα Ex Taq (Takara Bio, Shiga , Japan) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Αντίστροφη αντίδραση μεταγραφάσης (Kit αντιδραστήριο PrimeScript®, Takara Bio) διεξήχθη με ϋΝάση ολικού RNA. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν με βάση τις ακόλουθες αλληλουχίες της βάσης δεδομένων: NM 006145, DnaJ (Hsp40) ομόλογο, υποοικογένεια Β, μέλος 1 (DNAJB1)? NM 002155, θερμικού σοκ 70 kDa πρωτεΐνη 6 (HSP70B ‘) (HSPA6)? NM 018602, DnaJ (Hsp40) ομόλογο, υποοικογένεια Α, μέλος 4 (DNAJA4)? NM 002 228, Ιούνιος πρωτο-ογκογονίδιο (Ιούνιος)? NM 021724, υποοικογένεια πυρηνικών υποδοχέων 1, ομάδα Δ, μέλος 1 (NR1D1)? NM 001621, υποδοχέα αρυλ υδρογονανθράκων (AHR)? NM 001165, βακιλλοϊική επανάληψη ΙΑΡ που περιέχει 3 (BIRC3)? NM 005 354, Ιούνιος D πρωτο-ογκογονίδιο (JunD)? NM 000399, έγκαιρης ανάπτυξης 2 (EGR2)? NM 004235, Kruppel-όπως παράγοντα 4 (KLF4)? NM 002046, αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (GAPDH). GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για ομαλοποίηση [49].

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο συνόλων δεδομένων προσδιορίστηκε με τη χρήση t-test Welch χρησιμοποιώντας το λογισμικό R (Το Ίδρυμα R για στατιστικούς υπολογισμούς, έκδοση 2.15.1, δωρεάν λογισμικό που διατίθεται σε https://www.R-project.org) με τιμές ρ & lt ? 0,05 θεωρηθεί σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1..

ανάλυση Western blot της έκφρασης HSP70 σε κύτταρα ωοθήκης κινέζικου χάμστερ (ΟΗΟ-Κ1). Ο αναστολέας DNA-ΡΚ, 10 μΜ NU7441 μείωσε την έκφραση της HSP70 σε κύτταρα CHO-K1 6 ώρες μετά την έκθεση σε θερμότητα στρες στους 44 ° C για 60 λεπτά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058325.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

ανάλυση Western blot της έκφρασης HSP70 σε κύτταρα τρωκτικών. Δύο παραλλαγές των κυττάρων ωοθήκης Κινεζικού χάμστερ, κύτταρα CHO-K1 με λειτουργικά κύτταρα ΟΝΑ-ΡΚ και V3 με ελαττωματικό DNA-PKcs εκτέθηκαν σε θερμικό στρες στους 44 ° C για 60 λεπτά και στη συνέχεια η έκταση της έκφρασης HSP70 αναλύθηκε 6 ώρες αργότερα. HSP70 ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε περίπτωση απουσίας των λειτουργικών DNA-PK στα κύτταρα V3

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058325.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης HSP70 και Hsp40 σε ανθρώπινο κακόηθες γλοίωμα κυτταρικές γραμμές. Σε δύο παραλλαγές των κακοήθων κυττάρων γλοιώματος, κύτταρα M059K με λειτουργούσα DNA-PK και την παραλλαγή ελαττωματικό M059J DNA-PKcs, την έκφραση της HSP70 και Hsp40 ήταν παρόμοια και στις δύο κύτταρα ανεξάρτητα από το καθεστώς του DNA-PK

doi:. 10.1371 /περιοδικό .pone.0058325.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Επαλήθευση των νοκ ντάουν αποτελεσματικότητα των NR1D1 και BIRC3 από πραγματικό χρόνο qPCR. Τα κύτταρα HeLa επιμολύνθηκαν με 50 ηΜ είτε siNR1D1 ή siBIRC3. Μορφομετατραπέντα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 24 ώρες. Τα επίπεδα έκφρασης του mRNA του (α) NR1D1 και (β) BIRC3 κανονικοποιημένη σε επίπεδο έκφρασης GAPDH. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SD (**, Ρ & lt? 0,01? N.S., μη-σημαντική)

DOI: 10.1371 /journal.pone.0058325.s004

(EPS)

Σχήμα S5..

ανάλυση στυπώματος Western της κασπάσης-3 σε siNR1D1 και siBIRC3 επιμολυσμένα κύτταρα μετά από θερμικό στρες. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η διασπασμένη κασπάση 3 ζώνες 24 ώρες μετά τη θεραπεία αυξήθηκε σε siNR1D1- και siBIRC3 επιμολυσμένα κύτταρα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0058325.s005

(TIF)

Σχήμα S6 . ανάλυση συμπύκνωση

χρωματίνης στην siNR1D1 και siBIRC3 επιμολυσμένα κύτταρα μετά από θερμική καταπόνηση. Κατά την έκθεση σε θερμότητα στρες, τα κύτταρα με κατήργησε NR1D1 εμφανίζεται σημαντική αύξηση στην συμπύκνωση της χρωματίνης σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με siLuc, ενώ κατάργηση του BIRC3 έτεινε να αυξήσει την έκταση της χρωματίνης συμπύκνωσης χωρίς να εμφανίσει στατιστική σημαντικότητα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD (*, Ρ & lt? 0,05? NS, μη σημαντικό)

doi: 10.1371 /journal.pone.0058325.s006

(EPS)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν με ευγνωμοσύνη Καθ Akihisa Takahashi, του Πανεπιστημίου Γκούνμα για το δώρο του κακοήθους γλοιώματος κυτταρικής σειράς M059K και M059J.