Αφηρημένο

Εξωσώματα πρωτεΐνες και microRNAs έχουν αποκτήσει μεγάλη προσοχή ως διαγνωστικά εργαλεία και τις δυνατότητες βιοδείκτη σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη (PCA). Ωστόσο, ο ρόλος του εξωσωμάτων και των υποδοχέων που συνδέονται με μεμβράνες, ιδιαίτερα υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) ως μεσολαβητές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής σε εξέλιξη PCa παραμένει ανεξερεύνητη. EGFR συχνά υπερεκφράζεται και έχει συσχετιστεί με επιθετικές μορφές προστάτη. Ενώ τα κύτταρα του προστάτη και των ιστών εκφράζουν EGFR, είναι άγνωστο αν εξωσώματα που προέρχεται από τα κύτταρα του προστάτη ή του προστάτη ορό του ασθενούς περιέχει EGFR. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να ανιχνεύσει και να χαρακτηρίσει EGFR σε εξωσώματα προέρχονται από κύτταρα PCa, LNCaP ξενομόσχευμα και PCa ορό του ασθενούς. Τα εξωσώματα απομονώθηκαν από ρυθμισμένα μέσα από διαφορετικές κυτταρικές σειρές προστάτη? LNCaP ορό ξενομόσχευμα καθώς ασθενής πλάσματος /ορού με διαφορική φυγοκέντρηση και υπερφυγοκέντρηση σε κλίση πυκνότητας σακχαρόζης. Εξωσώματα επιβεβαιώθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, έκφραση exosomal δεικτών και NanoSight

™ ανάλυση. έκφραση EGFR καθορίστηκε με ανάλυση western blot και ELISA. Αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι εξωσώματα μπορούν εύκολα να παραχθούν από κυτταρικές σειρές προστάτη, ορός ελήφθη από PCa ξενομόσχευμα φέρουν τα ποντίκια και κλινικά δείγματα που προέρχονται από ασθενείς PCa. Παρουσία exosomal EGFR σε εξωσώματα ασθενή προστάτη μπορεί να παρουσιάσει μια νέα προσέγγιση για τη μέτρηση της κατάστασης της νόσου. Το έργο μας θα σας επιτρέψει να οικοδομήσουμε αυτό το εύρημα για τη μελλοντική κατανόηση εξωσωμάτων προστάτη και του δυνητικού ρόλου τους στην εξέλιξη του προστάτη και η ελάχιστα επεμβατική βιοδείκτες για την PCA

Παράθεση:. Kharmate G, Hosseini-Beheshti Ε, Caradec J, Chin ΜΟΥ, Tomlinson Guns ES (2016) του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα στον καρκίνο του προστάτη Προέρχεται εξωσώματα. PLoS ONE 11 (5): e0154967. doi: 10.1371 /journal.pone.0154967

Επιμέλεια: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 9 Ιανουαρίου 2015? Αποδεκτές: 21 Απριλίου, 2016? Δημοσιεύθηκε: May 6, 2016

Copyright: © 2016 Kharmate et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

χρηματοδότηση:. EG λάβει χρηματοδότηση από Terry Fox Foundation. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των δυτικών άνδρες. Διατηρητέα δραστηριότητα του υποδοχέα ανδρογόνων είναι η βασική κινητήρια δύναμη για την PCA εξέλιξη και μετάσταση [1, 2]. Πρώιμο στάδιο PCA είναι ιάσιμη, ωστόσο, το ένα τρίτο των περιπτώσεων να εξελιχθεί σε μια πιο επιθετική ΣΕΣΣ με κακή επιβίωση [3] του ασθενούς. Παρά τη διαθεσιμότητα πολλών θεραπευτικών στρατηγικών, που στοχεύουν μεταστάσεις και τη διαχείριση υποτροπή της νόσου παραμένει μια πρόκληση. Ως εκ τούτου, η επιτυχής έγκαιρη ανίχνευση PCA είναι μεγάλης σημασίας. Εκτός από τα κοινώς χρησιμοποιούμενα διαγνωστικές διαδικασίες /εξετάσεις, όπως ειδικές δοκιμές (PSA) του προστάτη αντιγόνο και δακτυλική εξέταση [4], μια κρίσιμη παραμένει η ανάγκη για μας να ανακαλύψουν νέα βιοδεικτών και να αναπτύξει μια πιο ευαίσθητη ακόμα ελάχιστα επεμβατικές εξετάσεις για την καλύτερη και έγκαιρη διάγνωση του προστάτη.

υπάρχουν όλο και περισσότερες ενδείξεις υποδηλώνουν ότι τα καρκινικά κύτταρα απελευθερώνουν μικροκυστίδια 30-100 nm σε διάμετρο γνωστή ως «

εξωσώματα»

, και ότι οι εξωσώματα βρίσκονται εύκολα σε βιολογικά υγρά συμπεριλαμβανομένου του πλάσματος, ορού, κακοήθη ασκίτη, ούρα και το μητρικό γάλα [5, 6]. Τα εξωσώματα προέρχονται από αργά ενδοσώματα γνωστή ως πολυκυψελιδωτών σώματα (MVBs) και απελευθερώνονται κατά σύντηξη των MVBs με τη μεμβράνη του πλάσματος [7]. Τα εξωσώματα περιέχουν μοναδικές πρωτεΐνες και RNA φορτίο που απελευθερώνονται εντός του κυτταρικού μικροπεριβάλλοντος και ως εκ τούτου μπορεί να προωθήσει την επικοινωνία κυττάρου-κυττάρου εκτός από άλλους μηχανισμούς [8, 9]. Πρόσφατα, το εργαστήριο μας και άλλοι απέδειξαν ότι καλοήθεις καθώς και κύτταρα του προστάτη, με ή χωρίς ανδρογόνων εξωσώματα απελευθέρωση υποδοχέα (AR) [9, 10]. Επιπλέον, ένα ολοκληρωμένο λιπίδιο και πρωτεομική ανάλυση αποκάλυψε διακριτές διαφορές στα προφίλ πρωτεΐνη εξωσωμάτων που προέρχονται από καλοήθεις σε σύγκριση με κακοήθεις κυτταρικές σειρές προστάτη [9, 11, 12]. Μελέτες έχουν δείξει ότι εξωσώματα περιέχουν συνδεδεμένη με μεμβράνη πρωτεΐνες που δρουν ως μεσολαβητές της κυτταρικής ανάπτυξης και μπορεί να προσδώσει την κυτταρική φαινοτυπική μεταβολή μέσω επικοινωνίας κυττάρου-κυττάρου [13-15]. Ωστόσο, ο ρόλος του συστατικού υποδοχέων αυξητικού παράγοντα συνδεόμενες με μεμβράνη εξωσωμάτων ως μεσολαβητών του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της εισβολής παραμένει ανεξερεύνητη.

Εκτός από ανδρογόνα, ανάπτυξη του προστάτη και η λειτουργία εν μέρει ρυθμίζεται από διάφορους αυξητικούς παράγοντες και τους συγγενείς υποδοχείς, ένας εκ των οποίων είναι ο επιδερμικού αυξητικού παράγοντα και του υποδοχέα του (EGFR) [16, 17]. EGFR είναι μια πρωτο-ογκογονιδίου και διαμεμβρανικές υποδοχέα 170 kDa το οποίο είναι τυπικά υπερεκφράζεται σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένων προστάτη [18]. σύνδεση με EGFR Ligand επάγει διμερισμό, φωσφορυλίωση και εσωτερικοποίηση του EGFR που στη συνέχεια ενεργοποιούν ένα δίκτυο οδών ενδοκυτταρικής σηματοδότησης, με αποτέλεσμα τη σύνθεση του DNA, τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και προσκόλληση [18]. Έχει δειχθεί ότι σχεδόν το 30% των περιπτώσεων προστάτη υπερεκφράζουν EGFR και ότι η απορρύθμιση των οδών σηματοδότησης EGFR μεσολάβηση συνδέεται με κακή κλινική έκβαση [19, 20]. Αν και EGFR αναγνωρίζεται ως σημαντικός στόχος κατά του όγκου, θεραπείες κατά του EGFR χρησιμοποιώντας μικρές αναστολείς κινάσης τυροσίνης όπως Gefitinib, λαπατινίμπη και Η erlotinib έχει αποδειχθεί ότι έχουν περιορισμένη αποτελεσματικότητα στην PCa [21-23]. Ενώ η ενδοκυτταρική διακίνηση, την ανακύκλωση και την υποβάθμιση του EGFR έχουν ερευνηθεί εκτενώς, πολύ λίγα είναι γνωστά σχετικά με το αν EGFR διαφεύγει λυσοσωματικής διάσπασης και αντ ‘αυτού επιλεκτικά κυκλοφόρησε εξωκυτταρικά μέσω εξωσώματα.

In vitro

μελέτες έχουν πλέον δείξει ότι εξωσώματα απομονώθηκαν από το ανοσοποιητικό και τα καρκινικά κύτταρα περιέχουν EGFR, συνδέτες του EGFR και διαλυτές ισομορφές του EGFR. Επιπλέον, τα καρκινικά κύτταρα απελευθερώνουν εξωσώματα και /ή exosomal φορτίο στην κυκλοφορία του αίματος των ασθενών με καρκίνο [24-29]. Αυτές οι παρατηρήσεις μας οδήγησαν να υποθέσει ότι EGFR θα μπορούσε να απελευθερωθεί επιλεκτικά μέσω εξωσώματα και μπορεί πολύ καλά να παίζει ένα ρόλο στην εξέλιξη PCa. Επιπλέον, η πιθανότητα ότι η επιλεκτική πρόσληψη EFGR σε εξωσωμάτων μπορεί να είναι, τουλάχιστον εν μέρει, υπεύθυνη για την αποτυχία του κλινικού αποτελέσματος δεν μπορεί να παρακαμφθεί, όμως δεν συγκριτική ανάλυση μεταξύ των περιεχομένων exosomal και των καρκινικών κυττάρων έχει γίνει σε αυτό το χειρόγραφο. Για να καθοριστεί εάν PCa προέρχονται εξωσώματα περιέχουν EGFR, εμείς απομονωθεί και χαρακτηρισθεί εξωσώματα από ένα πάνελ κυττάρων προστάτη, καθώς και ορός από LNCaP ξενομοσχεύτηκε ποντίκια και ορού /πλάσματος από ασθενείς PCa. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δείχνει ότι EGFR περιέχεται στα εξωσώματα που προέρχονται από κυτταρικές σειρές προστάτη, τόσο LNCaP ξενομόσχευμα και του προστάτη στον ορό του ασθενούς. Αυτές οι παρατηρήσεις είναι ενθαρρυντικά για την περαιτέρω διερεύνηση του πιθανού ρόλου εξωσωμάτων EGFR που περιέχουν σε pro-επιβίωση και μηχανισμούς αντίστασης θεραπεία καθώς και το δυναμικό βιοδείκτες στη διάγνωση και την εξέλιξη του προστάτη.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Κατεψυγμένα προστάτη πλάσμα του ασθενούς /ορού αγοράστηκε από μια ιδιωτική αίματος και ιστού αποθετήριο, Bioserve του Παγκόσμιου Biorepository, 9000 Virginia Manor Road, Suite 207 Beltsville, MD 20705 USA (https://www.bioserve.com/ανθρώπινα δείγματα /παγκόσμιο-biorepository-overview.cfm). Ο ορός ελέγχου ελήφθη από 31 ετών υγιείς άνδρες εθελοντές με μια προφορική συγκατάθεση έχει εγκριθεί από το διοικητικό συμβούλιο δεοντολογίας (πιστοποιητικό # H09-01010). Το Πανεπιστήμιο του Βρετανικού Συμβουλίου Δεοντολογίας Κολούμπια Clinical Research (πιστοποιητικό # H09-01010) ενέκρινε τη χρήση των εμπορικά αποκτήσει ανθρώπινο ορό που πρέπει να χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της παρούσας έρευνας.

Η έγκριση για το έργο των ζώων ελήφθη από το Πανεπιστήμιο της Επιτροπής (IACC, # A11-0337) βρετανική Κολούμπια Θεσμικών Animal Care. Κατά τη διάρκεια της μελέτης, η περίθαλψη, η στέγαση και η χρήση των ζώων έγινε σύμφωνα με το Καναδικό Συμβούλιο για τις κατευθυντήριες γραμμές φροντίδας των ζώων και όλα έγιναν προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας.

Cell Culture

Ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κύτταρα, LNCaP [30] και C4-2 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 ενώ DU145 και PC3 σε τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με 5% FBS (Invitrogen) και αντιβιοτικό, στους 37 ° C σε 5% CO2. Καλοήθης RWPE-1 κύτταρα επίσης αναπτύχθηκαν σε κερατινοκύτταρα SFM (KSFM) με συμπλήρωμα ανάπτυξης (GIBCO) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 60-70% συρροή και τον ορό επί 48-72 ώρες πριν από την εξωσώματα απομόνωση. Όλες οι κυτταρικές σειρές ελήφθησαν από την ATCC.

Δείγματα ορού

Ποντίκια που φέρουν LNCaP ξενομοσχεύματα παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31, 32]. Εν συντομία, αθυμικά ποντίκια εμβολιάστηκαν με κύτταρα 2 χ 10

6 LNCaP. Οι όγκοι αναπτύχθηκαν για 28 ημέρες μετά την οποία ορός που προέρχεται από αίμα με καρδιακή παρακέντηση μετά ευθανασία. Δείγματα ορού συλλέχθηκαν με από τρία γυμνά ποντίκια ελέγχου και τρία ποντίκια που φέρουν διάφορα μεγέθη των όγκων: μικρό (& lt? 400 χιλιοστά

3)? μέσο (400-1000mm

3) και μεγάλα (& gt? 1.000 χιλιοστά

3). Κατεψυγμένα προστάτη πλάσμα του ασθενούς /ορού αγοράστηκε από μια ιδιωτική αίματος και ιστού αποθετήριο, Bioserve (Beltsville, MD, USA). Τέσσερα δείγματα ανθρώπινου πλάσματος και τρεις ορού που λαμβάνεται από ασθενείς PCa (Πίνακας 1) αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Ο ορός ελέγχου ελήφθη από δύο 31 ετών υγιείς άνδρες εθελοντές. Έγκριση ελήφθη από το Πανεπιστήμιο της Βρετανικής Κολομβίας Διοικητικού Συμβουλίου Δεοντολογίας Κλινικών Ερευνών για ανθρώπινο ορό που πρέπει να χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της παρούσας έρευνας

Η

Αντισώματα

Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν:. Αντι-ποντικιού CD-9 (C-4, # sc-13118), ποντικού αντι-Alix (1Α12, # sc-53540) και κατσίκα αντι-EGFR (Ν-20, # sc-31155) από την Santa Cruz Biotechnology Inc, (Santa Cruz , CA)? αντι-LAMP2 (# ab37024) από Abcam (Toronto, ON) και αντι-GRP94 (# 2104) από την Cell Signaling Technology (Whitby, ON). Όλα τα πρωτεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε μία συγκέντρωση 1: 1000 για αναλύσεις western blot. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανίχνευση ήταν Alexa Flour 680 γαϊδάρου αντι-κουνελιού (# A10043, 1: 10.000), γαϊδάρου αντι-ποντικού (# A10038, 1: 10.000) και γαϊδάρου αντι-κατσίκα (# A21084, 1: 10.000) από την Life τεχνολογίες (Invitrogen), Burlington ON.

Προετοιμασία των κλασμάτων εξωσωμάτων

εξωσώματα από τα κύτταρα του προστάτη απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας σειριακή μέθοδο φυγοκέντρηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Τα κατεψυγμένα δείγματα ορού πλάσματος /ορού ή LNCaP ξενομοσχεύματος ασθενής αραιώθηκαν με φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS) σε αναλογία 1: 1 [33]. Τα δείγματα πλάσματος /ορού στη συνέχεια προ-αγωγή με αντίσωμα αντι-IgG (αραίωση 1: 500) σε σύζευξη με σφαιρίδια A /G Sepharose (25 μλ) για να καθιζάνουν υπερβολική μη ειδικές ανοσοσφαιρίνες. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 4 ° C, οι προ-επεξεργασμένα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν στα 5000χ

g

για 15 λεπτά και το προ-καθαρίζεται ορός χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση εξωσώματα χρησιμοποιώντας μια πρότυπη μέθοδο υπερφυγοκεντρίσεως αναφερθεί στο παρελθόν [9, 33 ]. Εν συντομία, τα προ-καθαριστεί δείγματα ορού πέρασε από μια σειρά σταδίων φυγοκέντρησης (2000x

g

για 20 λεπτά και 20.000

g

για 45 λεπτά) και στη συνέχεια μεταφέρεται πάνω σε διάλυμα σακχαρόζης 30%, που ακολουθείται από υπερ-φυγοκέντρηση στα 110,000x

g

για 2 ώρες. Απομονωμένα εξωσώματα ανακτήθηκαν από το διάλυμα σακχαρόζης και φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι περαιτέρω αναλύσεων.

μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (ΤΕΜ)

εξωσώματα απομονώθηκαν από LNCaP ορό ξενομόσχευμα και PCa πλάσμα ασθενή /ορού ήταν προσροφάται πάνω λάμψη εξιτήριο 300 Formvar ματιών /πλέγματα ΤΕΜ επιχρισμένες με άνθρακα (Ted Pella, Redding Καλιφόρνια, ΗΠΑ) για 5 λεπτά. Τα δείγματα αρνητικά χρωματίστηκαν με 2% υδατικό οξικό ουρανύλιο για 5 λεπτά και παρατηρήθηκε με έναν Hitachi H7600 ΤΕΜ που λειτουργεί σε 80kV (Hitachi High-Technologies Corp., Tokyo, Japan). Εικόνες συνελήφθησαν με μια πλευρά τοποθετημένη 1K AMT Advantage ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (Advanced Μικροσκοπία Τεχνικές, Corp. Woburn, MA, USA) [9].

NanoSight

™ σωματιδίων παρακολούθησης ανάλυση

Η μέγεθος και η συγκέντρωση των απομονωμένων εξωσωμάτων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το NanoSight

™ σύστημα LM10-HS10 (NanoSight Amesbury, UK) όπως περιγράφεται πρόσφατα [34]. Κάθε δείγμα εξωσώματα διαλύθηκε σε εξωσώματα χωρίς προ-φιλτράρεται PBS για να αποκτήσετε μετρήσιμη συγκέντρωση μεταξύ 0,5 × 10

8 και 5 × 10

9 σωματίδια /ml. Για την ανάλυση, ένα μονοχρωματικό δέσμη λέιζερ (405 nm) εφαρμόστηκε σε αραιωμένα εξωσώματα πλάσματος που εγχύθηκε μέσα σε μία μονάδα προβολής LM12 χρησιμοποιώντας ένα ελεγχόμενο σύστημα λέιζερ σύριγγα. NanoSight

™ παρακολούθησης ανάλυση (ΝΤΑ) έκδοση λογισμικού 2.3 ανέλυσαν τα δείγματα σε σταθερή θερμοκρασία (25 ° C) με την ταχύτητα του κλείστρου της κάμερας σε 60 χιλιοστά του δευτερολέπτου και το κέρδος που να 1400. Το λογισμικό ΝΤΑ που παράγεται έξι βίντεο διάρκειας 60 δευτερολέπτων, με ένα 5-δευτερολέπτων καθυστέρηση μεταξύ των καταγραφών δημιουργία έξι επαναληπτικές ιστογράμματα που υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο για να δώσει την τελική εκτίμηση του μεγέθους των σωματιδίων και της συγκέντρωσης εξωσωμάτων. ρυθμίσεις ΝΤΑ προ-βελτιστοποιημένες και διατηρείται σταθερή μεταξύ των δειγμάτων.

ανάλυση Western blot

δείγματα εξωσωμάτων υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) ρυθμιστικό για να απελευθερώσει το περιεχόμενο exosomal. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πρωτεΐνης BCA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Thermo Scientific Pierce). Ίση ποσότητα πρωτεΐνης (30μg) φορτώθηκε για κάθε δείγμα σε μια 10% SDS-PAGE πηκτή. Exosomal δείκτες ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα ειδικά για λυσοσωμική σχετιζόμενη μεμβράνη πρωτεΐνη-2 (LAMP-2) (1: 1000), CD-9 (1: 1000) και Alix (1: 1000). Η έκφραση του EGFR σε εξωσώματα που προέρχονται από τις κυτταρικές σειρές προστάτη καθώς ξενομοσχεύματος ή ανθρώπινου πλάσματος /ορού ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας αντι-EGFR αντίσωμα κατσίκας το οποίο ανιχνεύει EGFR του ανθρώπου και ποντικού προέλευσης.

ELISA για την ανίχνευση EGFR

επίπεδα EGFR σε εξωσώματα απομονώθηκαν από LNCaP ξενομόσχευμα και ασθενής πλάσμα /ορό προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ ELISA EGFR (Sigma Aldrich, # RAB0160) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Λυοφιλοποιημένου ανθρώπινου προτύπου πρωτεΐνης EGFR, ολόκληρο πλάσμα /ορό και εξωσώματα δείγματα προστέθηκαν στο τρυβλίο 96 φρεατίων που είχε προ-επικαλυφθεί με αντίσωμα αντι-ανθρώπινο EGFR για 2.5 ώρες σε RT. RWPE-1 κυτταρόλυμα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος. Βιοτινυλιωμένο EGFR αντίσωμα προστέθηκε για 1 h σε RT ακόλουθες πλύσεις. HRP-Στρεπταβιδίνης στη συνέχεια επωάστηκε για 45 λεπτά. ELISA Χρωματομετρική 3,3 ‘, 5,5-τετραμεθυλοβενζιδίνη (ΤΜΒ) προστέθηκε για 30 λεπτά στο σκοτάδι και 0,2Μ θειικό οξύ (διάλυμα διακοπής) προστέθηκε αμέσως για να σταματήσει η αντίδραση κατά την οποία μετρήθηκε κίτρινου χρώματος προϊόν στα 450nm χρησιμοποίηση ενός αυτόματου αναγνώστη ELISA (Rayto, RT-1904C Chemistry Analyzer, Atlanta GA, USA) στα 450 nm. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το ποσό των EGFR σε μη επεξεργασμένα πλάσμα και καθαρισμένη εξωσώματα ως ng /ml. Η δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές και με κάθε δείγμα εις τριπλούν.

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση GraphPad Prism 6.0. Η διαφορά μεταξύ exosomal EGFR σε ασθενείς PCa και άτομα ελέγχου αναλύθηκε με εφαρμογή του t-test φοιτητών. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM.

Αποτελέσματα

Τρεις φορές εμπλουτισμό εξωσωμάτων σε προστάτη ορό του ασθενούς από τους υγιείς μάρτυρες

Χαρακτηρισμός εξωσωμάτων απομονώνεται από LNCaP ξενομοσχεύτηκε ορό ποντικού και PCa πλάσμα ασθενή /ορού διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΤΕΜ, NanoSight αναλύσεις

™ και Western blot, συλλογικά. Οι αναλύσεις ΤΕΜ αποκάλυψε μια πλειοψηφία των κυστιδίων στην κλίμακα μεγέθους 100 nm η οποία ήταν χαρακτηριστική εξωσωμάτων, σύμφωνα με την κλασική κυπελλοειδές μορφολογία τους, σε αντιπροσωπευτικές κύτταρα C4-2 PCa, LNCaP ορού ξενομοσχεύματος καθώς PCa ορό του ασθενούς (Σχήμα 1). Η παρουσία εξωσωμάτων επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας NanoSight

™ τεχνολογίας, όπως περιγράφεται στο [34]. Τα σχήματα 2 και 3 έδειξε ΝΤΑ προφίλ εξωσωμάτων με μια απλή κορυφή που αντιπροσωπεύει το μέγεθος του τρόπου εξωσώματα (85-150nm), σύμφωνα με το μέγεθος του εξωσωμάτων αναφερόμενη συνήθως στη βιβλιογραφία. Παρατηρήσαμε ότι η συνολική συγκέντρωση του εξωσωμάτων που προέρχονται από ποντίκια ελέγχου του ορού ήταν 1,98 χ 10

11 σωματίδια /ml (Σχήμα 2Α). Είναι ενδιαφέρον ότι ο αριθμός των σωματιδίων αυξήθηκε στον ορό που προέρχεται από ποντίκια που φέρουν μικρό (2,2 χ 10

11, Σχήμα 2Β), μέσης (3,98 χ 10

11 Σχήμα 2C) και μεγάλες (6,66 χ 10

11 Εικ 2D) όγκους που υποδηλώνει ότι εξωσώματα είναι πιο άφθονα σε ποντίκια που φέρουν όγκο από ό, τι τα φυσιολογικά ποντίκια. Επιπλέον, μετρήθηκε ο αριθμός των εξωσωμάτων από τον ορό που προέρχεται από τον ανθρώπινο έλεγχο και ασθενείς PCa. Σχήμα 3Α έδειξαν ότι έλεγχος ανθρώπινου ορού περιέχεται 4,15 χ 10

11 σωματίδια /ml, ενώ PCa πλάσμα του ασθενούς (13,3 χ 10

11) και ορού (9,9 χ 10

11) έδειξε διπλάσια αύξηση σε αριθμό των σωματιδίων δείχνει ότι τα καρκινικά κύτταρα παράγουν περισσότερο εξωσώματα από τα φυσιολογικά κύτταρα (Σχ 3Β και 3C). Η NanoSight ανέλυσε μεταξύ 3000-4000 σωματιδίων και ως εκ τούτου το SEM ήταν χαμηλή μεταξύ ± 0,12 έως 0,35.

Εκπρόσωπος TEM εικόνες εξωσωμάτων που προέρχεται από α) C42 προστάτη κυτταρική γραμμή β) LNCaP ξενομόσχευμα ορού και γ) στο πλάσμα των ασθενών με μέθοδος υπερφυγοκέντρησης. Τα εξωσώματα αρνητικά χρωματίστηκαν με 2% οξικό ουρακύλιο μετά την απομάκρυνση της υγρασίας. Τα βέλη δείχνουν δομές σε σχήμα κούπας, που αναγνωρίζονται ως εξωσώματα (30-100 nm σε διάμετρο).

Η

Η ανάλυση έδειξε ότι το μέσο μέγεθος εξωσωμάτων που απομονώθηκαν από το ποντίκι του ελέγχου ήταν 126 nm (α), ενώ LNCaP ξενομοσχεύτηκε ποντίκια που φέρουν μικρό όγκο ήταν 81nm (β), 137 nm από μέσο (γ) και 67 nm από μεγάλους όγκους (δ). Η συγκέντρωση του εξωσωμάτων εκκρινόμενη αυξήθηκε με την αύξηση του μεγέθους του όγκου.

Η

ΝΤΑ προφίλ εξωσωμάτων δείχνουν μια μόνο κορυφή που αντιπροσωπεύει το μέσο μέγεθος των σωματιδίων και τη συγκέντρωση των εξωσωμάτων από φυσιολογικό υποκείμενο (α) και το πλάσμα του ασθενούς ( β) και στον ορό (γ). Το μέσο μέγεθος σωματιδίων ~ 120nm nm επιβεβαίωσε την παρουσία εξωσωμάτων. Τα εξωσώματα που προέρχεται από PCa ασθενής ήταν σημαντικά υψηλότερο από το ανθρώπινο ορό ελέγχου.

Η

Προσδιορισμός των δεικτών επιβεβαιώνουν εξωσωμάτων απομόνωση από

ορού

αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί η έκφραση του εξωσωμάτων ειδικών δείκτες. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α, CD-9 (τετρασπανίνη), ένα συνήθως χρησιμοποιούμενο δεσμευμένη σε μεμβράνη δείκτη exosomal ήταν υψηλότερη στον ορό των μικρών ξενομοσχευμάτων LNCaP, σε σύγκριση με εκείνη σε εξωσώματα από τον έλεγχο γυμνό ποντίκι. Είναι ενδιαφέρον, δεν είδαμε μια σημαντικά υψηλότερη έκφραση στους μεγάλους όγκους. Αυτά τα δεδομένα συσχετίζονται επίσης με τα δεδομένα NanoSight (Σχήμα 2) που δείχνει μεγαλύτερο αριθμό εξωσωμάτων σε ορό ποντικών που φέρουν όγκο από τον ορό ποντικού μάρτυρα. Για την επικύρωση περαιτέρω η καθαρότητα των κλασμάτων που λαμβάνονται εξωσωμάτων, προσδιορίσαμε την παρουσία ενός γνωστού ενδοπλασματικό GRP94 δείκτη δίκτυο στα εξωσώματα απομονώθηκαν από δείγματα ξενομοσχεύματος ορού. Τα δεδομένα μας έδειξαν έλλειψη GRP94 στα κλάσματα εξωσωμάτων, υποδεικνύοντας επιτυχή εμπλουτισμό και απομόνωση εξωσωμάτων από δείγματα ορού μέσω σακχαρόζη υποβοηθούμενη υπερ-φυγοκέντρηση. Η έκφραση του λυσοσωμικής σχετιζόμενη μεμβράνη πρωτεΐνη-2 (LAMP-2) και Alix ερευνήθηκε επίσης ως εναλλακτική λύση εξωσωμάτων δείκτη. Σχήμα 4Β και 4C έδειξαν ότι LAMP-2 και Alix ανιχνεύθηκε στα κλάσματα εξωσωμάτων προέρχονται προστάτη ορού /πλάσματος και ήταν εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση. Ενώ ολόκληρο το πλάσμα ήταν άνευ LAMP-2, που δείχνει και πάλι την ποιότητα εξωσωμάτων εμπλουτίζεται για κατά τη διάρκεια της απομόνωσης.

α) CD9 ήταν παρούσα σε εξωσώματα που προέρχονται από LNCaP ξενομόσχευμα ποντίκια που φέρουν μικρές, μεσαίες και μεγάλες όγκους LNCaP, ενώ τον έλεγχο ορό του ποντικιού έλειπε CD9. GRP94, μια γνωστή ενδοπλασματικό δίκτυο πρωτεΐνη η οποία χρησιμοποιείται ως ένας αρνητικός έλεγχος ήταν απούσα στα εξωσώματα υποδηλώνοντας εμπλουτισμό β) LAMP2 ήταν παρούσα σε εξωσώματα προέρχονται από PCa πλάσμα του ασθενούς ενώ απουσία LAMP2 σε πλήρες πλάσμα υποδεικνύεται επιτυχής εμπλουτισμού. γ) Alix ήταν παρούσα σε εξωσώματα που προέρχεται από το πλάσμα του ασθενούς σε διαφορετικές συγκεντρώσεις πρωτεΐνης exosomal.

Η

προστάτη προέρχονται εξωσώματα περιέχει EGFR

EGFR είναι ένας ισχυρός ρυθμιστής των κυττάρων που σχετίζεται με την προχωρημένη εξέλιξη προστάτη. Είμαστε δίπλα καθοριστεί εάν τα κύτταρα του προστάτη και των παράγωγων εξωσώματα ορού περιέχει EGFR. Το σχήμα 5Α δείχνει διαφορική έκφραση του πλήρους μήκους 170 kDa EGFR σε συνολικά κυτταρολύματα καθώς εξωσώματα κλάσματα που προέρχονται από ένα πάνελ AR-θετικό (LNCaP, C4-2, RWPE-1) και AR-αρνητικό (DU145, PC3) κυτταρικές γραμμές . Συνολικά, η παρουσία του EGFR σε συνολικά κυτταρολύματα είναι υψηλότερη από τους ομολόγους εξωσωμάτων της, ενώ προέρχεται από κύτταρα εξωσώματα δείχνουν μεταβλητό περιεχόμενο EGFR για διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Είμαστε δίπλα προσδιορίζεται η παρουσία του EGFR στο

in vivo

δείγματα. Τα εξωσώματα από ποντικούς ελέγχου ορό έδειξαν καμία EGFR ωστόσο εξωσώματα απομονώθηκαν από τον ορό του ξενομοσχευμάτων LNCaP περιείχε EGFR ανεξαρτήτως της παρουσίας του όγκου και του όγκου μεγέθους (Σχήμα 5Β).

EGFR ήταν παρούσα σε εξωσώματα που προέρχονται από α) πάνελ AR -responsive και AR-αδιάφορη, καθώς και επιθηλιακά κύτταρα καλοήθους προστάτη (RWPE-1) και σε σύγκριση με το κυτταρικό λύμα, β) να ελέγχουν γυμνό ποντίκι και LNCaP ξενομοσχεύματος ορού. γ) EGFR περιέχεται σε εξωσώματα που προέρχονται από το πλάσμα τεσσάρων διαφορετικών ασθενών PCa ‘(1-4), 3 δείγματα ορού (5-7) και να ελέγχει το θέμα και σε μη επεξεργασμένα πλάσμα από υποκείμενο ελέγχου και ασθενή (1 και 2). δ) Η έκφραση του EGFR σε 170 kDa και 110kDa στον ορό και το πλάσμα είναι αυξημένη με την αύξηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης φόρτωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, υπάρχει μια σημαντική ποσότητα του EGFR σε μη επεξεργασμένα πλάσμα η οποία είναι πέρα ​​από το κλάσμα exosomal. Το ιστόγραμμα (ε) δείχνει τα επίπεδα EGFR (ng /ml) μετρήθηκε με ELISA σε μη επεξεργασμένα πλάσμα από υποκείμενο ελέγχου και PCa ασθενής πλάσμα /ορό και εξωσώματα που προέρχονται από αντίστοιχες πλάσματος /ορού. Τα επίπεδα του EGFR στον ορό είναι σχετικά παρόμοια σε θέματα ελέγχου και του προστάτη, ενώ εξωσώματα απομονώθηκαν από προστάτη ορό του ασθενούς περιείχε σημαντικά υψηλότερες ποσότητες του EGFR από το αντικείμενο του ελέγχου. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM, * ρ & lt?. 0.05

Η

Για να επικυρώσετε την κλινική σημασία των exosomal EGFR, εξετάσαμε αν εξωσώματα απομονώθηκαν από προστάτη πλάσμα ασθενή /ορού που περιέχονται EGFR. Οι αναλύσεις στυπώματος Western έδειξαν ανιχνεύσιμα επίπεδα ενός πλήρους μήκους 170 kDa EGFR σε δύο από τα τέσσερα κλάσματα εξωσωμάτων του πλάσματος ασθενούς PCa και τα τρία δείγματα ορού, ενώ τα εξωσώματα από δείγματα ελέγχου ήταν αρνητικά για EGFR (Εικόνα 5C). Όπως φαίνεται στο Σχ 5D, εξωσώματα περιέχεται EGFR σε εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Πιο ενδιαφέρον, τα μη επεξεργασμένα ολικού ορού έδειξε επίσης σημαντικά επίπεδα EGFR που υποδηλώνει την παρουσία του διαλυτή μορφή του EGFR που κυκλοφορούν στον ορό των ασθενών προστάτη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως για τον καρκίνο του παγκρέατος ορό ασθενούς σε μια μελέτη εξερεύνηση εξωσώματα σε ορό από αυτόν τον πληθυσμό ασθενών [35] . Επιπλέον, τα επίπεδα EGFR ανιχνεύτηκαν σε ολόκληρο το πλάσμα /ορό και εξωσώματα που προέρχονται από ασθενείς του προστάτη και υπό τον έλεγχο χρησιμοποιώντας δοκιμασία ELISA (Σχήμα 5Ε). μέτρηση ELISA έδειξαν ότι τα επίπεδα διαλυτού EGFR στο πλάσμα ή τον ορό του ασθενούς δεν ήταν αξιοσημείωτα διαφορετικός από τον ορό ελέγχου? Ωστόσο, τα επίπεδα EGFR ήταν σημαντικά υψηλότερη σε εξωσώματα που προέρχονται από ασθενείς προστάτη »πλάσμα /ορό σε σύγκριση με το αντικείμενο του ελέγχου.

Συζήτηση

Εξωσώματα που κυκλοφορεί στο αίμα μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες που μπορεί να αγνοηθεί συχνά σε προγνωστικές αξιολογήσεις. Το εργαστήριο μας που δημοσιεύθηκε πρόσφατα ένα εκτεταμένο πρωτεομική και λιπιδίων ανάλυση εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα του προστάτη

in vitro

με σκοπό την παροχή διορατικότητα βιοδείκτες πρωτεΐνη υποψήφιος που εξωσώματα έχουν τη δυνατότητα να δώσει [9]. Έχουμε αναπτύξει επίσης μια αναπαραγώγιμη μέθοδος για την απομόνωση και τον ποσοτικό προσδιορισμό των εξωσωμάτων από ανθρώπινο ορό [34]. Η απελευθέρωση εξωσωμάτων στο αίμα, ούρα και άλλα βιολογικά υγρά προσφέρει έτσι μια ευκαιρία να χρησιμοποιήσει μη επεμβατικές μεθόδους για την προγνωστική και διαγνωστική αξιολόγηση του προστάτη σε ασθενείς. Αυτό το έργο, με έμφαση στην σημασία του EGFR σε προστάτη, περιγράφει την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό εξωσωμάτων που προέρχονται από

in vitro

,

in vivo

και κλινικά δείγματα προστάτη ως προέκταση των προηγούμενων εργασιών μας σε προστάτη κυτταρικές γραμμές [9] [34].

η μελέτη μας δείχνει, η παρουσία του EGFR σε εξωσώματα καθαρίζεται από κύτταρα του προστάτη καλλιεργήθηκαν

in vitro

, ορό LNCaP ξενομοσχεύματος που φέρουν τα ποντίκια και PCa ορό του ασθενούς. Αρκετές αναφορές έχουν δείξει την παρουσία του EGFR σε εξωσώματα προέρχονται από γλοιοβλάστωμα, του παγκρέατος, του καρκίνου του μαστού και κυτταρικές σειρές ωοθηκών

in vitro

και σε εξωσώματα από καρκίνο του πνεύμονα ορό ασθενούς, αν και περιορισμένη είναι γνωστή από EGFR σε προστάτη προερχόμενα εξωσώματα [ ,,,0],36-39]. EGFR είναι συχνά υπερεκφράζεται και σχετίζεται με παρεκκλίνουσα σηματοδότηση οδηγεί σε επιθετικές κακοήθειες και χαμηλό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών [40]. Σε PCa, υπερκινητικότητα του EGFR συνδέεται με ανδρογόνο ανεξαρτησία και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [41, 42]. Δεδομένου ότι οι εξωσώματα εμπλέκονται στην κύτταρο- επικοινωνία κύτταρο που μεταβάλλει τον φαινότυπο των κυττάρων λήπτη /στόχου [43-45], exosomal-EGFR που εκφράζεται από διάφορους τύπους όγκων, συμπεριλαμβανομένου του προστάτη μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου. Παρατηρήσαμε ότι ο αριθμός των εξωσωμάτων ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ορό PCa και ξενομοσχεύματος από τον έλεγχο, γεγονός που υποδηλώνει ότι εξωσώματα μπορεί να παρουσιάσει ένα εργαλείο για να διαφοροποιήσει την κανονική και την κατάσταση ασθένειας. Τα αποτελέσματα μας είναι σε συμφωνία με μια πρόσφατη μελέτη από Turay et al, όπου δείχνουν ότι ο αριθμός των εξωσωμάτων αυξημένη συγκεκριμένα στον ορό των ασθενών με προστάτη σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου [46]. Οι Tumor-εξωσώματα πιστεύεται ότι έχουν ρόλο στην ανάπτυξη της αντοχής σε θεραπείες κατά του όγκου [47, 48]. Ωστόσο, ενώ τα προ-κλινικά δεδομένα δείχνουν ότι EGFR παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του προστάτη [21]? κλινικές μελέτες στις οποίες συμμετείχαν οι αναστολείς του EGFR (Gefitinib, λαπατινίμπη ή ερλοτινίμπη) έχουν δείξει περιορισμένο όφελος για τους ασθενείς του προστάτη [22, 23, 49].

Οι διαλυτές ισομορφές του EGFR (sEGFR) έχουν επίσης εντοπιστεί σε ρυθμισμένα μέσα του μαστού, μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα και του παγκρέατος καρκινικών κυττάρων όπως επίσης και κυκλοφορούν στο αίμα [35, 50, 51]. Ωστόσο, υπάρχουν περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με τη μηχανιστική ρόλο και βιοχημικές ιδιότητες αυτών των ισομορφών. Υπάρχουν ενδείξεις ότι η πλήρους μήκους EFGR υποβάλλεται σε πρωτεολυτική διάσπαση και τα νέα ισομορφές [52, 53]. Περαιτέρω, ένας υποδοχέας πλήρους μήκους και ένα 65kDa διαλυτό ισομορφή έχουν ταυτοποιηθεί σε εξωσώματα απελευθερώνονται από κερατινοκυττάρων ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές [50]. Ομοίως, παρατηρήσαμε μια πλήρους μήκους 170 kDa EGFR και μια ταινία εις 110 kDa στο πλάσμα του ασθενούς και εξωσώματα προερχόμενο από ορό υποδηλώνοντας ότι οι διαλυτές ισομορφές του EGFR μπορεί να υπάρχει σε εξωσώματα εκτός από το 170 kDa EGFR. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε κυτταρικές σειρές προστάτη και LNCaP όπως ζώνες ξενομόσχευμα ορό που φέρει το ποντίκι δεν παρατηρήθηκαν. παρατήρηση μας υποστηρίζεται από μια παρόμοια μελέτη σε κύτταρα καρκίνου του μαστού και τον ορό του ασθενούς που υποθέτει την παρουσία διαλυτών αυξητικών παραγόντων που κυκλοφορούν στον ορό του ασθενούς [54]. Διαπιστώσαμε επίσης μια ζώνη σε 110 kDa σε ασθενή πλάσμα /ορό που θα μπορούσε ενδεχομένως να είναι η ελεύθερη διαλυτή ισομορφή του EGFR. Προηγούμενες αναφορές που δείχνουν διαλυτή πρωτεΐνη EGFR σε ορό ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του μαστού και του πνεύμονα θα μπορούσε να στηρίξει τα αποτελέσματά μας [39, 54]. Παρά το γεγονός ότι σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού, οι διαλυτές ισομορφές EGFR σχετίστηκαν με σύντομη ποσοστό επιβίωσης, μερικοί σημαίνουν αυξημένη sEGFR ή καμία διαφορά μεταξύ υγιών ατόμων και των ασθενών [39]. Παρ ‘όλα αυτά, η εκτίμηση των επιπέδων sEGFR σε εξωσώματα και το περιφερικό αίμα μπορούν να παρέχουν κλινική σημασία σε μεταστατικούς καρκίνους. Οι ισομορφές EGFR που είναι παρόντα σε PCa ορό ασθενούς έχουν σαφώς ένα μη αναγνωρισμένο ρόλο στην ογκογένεση και περαιτέρω ποσοτικές αναλύσεις που απαιτούνται για την αξιολόγηση αυτών των ισομορφών σε PCA-προερχόμενα εξωσώματα. Συνοψίζοντας, η παρούσα μελέτη δείχνει εξωσώματα είναι άφθονα εκκρίνονται στον ορό των ποντικών που φέρουν ξενομόσχευμα όγκων και ασθενείς PCa από την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, αυτή η μελέτη προσδιόρισε EGFR σε εκκρίνεται εξωσώματα και παρέχει πειστικές αποδείξεις ότι κυκλοφορούν EGFR μπορεί να είναι συστατική σε εξωσώματα και περαιτέρω αξιολόγηση εξωσωμάτων EGFR σε PCa ορό του ασθενούς μπορεί να προσδιορίζει το ρόλο του στην αντίσταση του EGFR στοχευμένες θεραπείες δοκιμάζονται στην κλινική ενάντια εξέλιξη PCa ( σχηματική αναπαράσταση του ρόλου του EGFR, όπως φαίνεται στο Σχήμα 6).

δεσμευτικός Ligand επάγει ταχεία ενεργοποίηση και εσωτερίκευση του EGFR και ενδοκυττάρωση. Είτε EGFR διαφεύγει λυσοσωμική αποικοδόμηση και απελευθερώνεται εξωκυτταρικά μέσω εξωσώματα είναι άγνωστη. Η μεταφορά του EGFR μέσω εξωσωμάτων μπορεί να μεταβάλλει σημαντικά το μικροπεριβάλλον του όγκου και θα μπορούσε να είναι σχετικά με την εξέλιξη της επιθετικής προστάτη.

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 πίνακα ελέγχου. NC3Rs ΑΦΙΞΗ Checklist Οδηγίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154967.s001

(DOCX)

S1 Εικ. Ανάλυση κηλίδας Western που δείχνει την έκφραση CD9 σε εξωσώματα που προέρχονται από LNCaP ξενομόσχευμα ποντίκια που φέρουν μικρές, μεσαίες και μεγάλες όγκους LNCaP, ενώ ο ορός του ποντικιού έλεγχο έλειπε CD9

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154967.s002

(ΔΕΘ)

S2 Εικ. . Κηλίδα Western που δείχνει την πλήρη uncropped τζελ GRP94

Τα εξωσώματα έλειπε η παρουσία GRP94 επιβεβαιώνοντας την απομόνωση επιτυχημένη

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154967.s003

(JPG)

Ευχαριστίες

Αναγνωρίζουμε την υποστήριξη του Ιδρύματος Terry Fox για την υποστήριξη των αποδοχών που επέτρεψε την ολοκλήρωση των εργασιών που περιγράφονται.