Αφηρημένο

α-Actinins (ACTNs) είναι γνωστό για τη διασύνδεση νημάτια ακτίνης σε εστιακές συμφύσεις σε κύτταρα που μεταναστεύουν. Μεταξύ των τεσσάρων ισομορφές του ACTNs θηλαστικών, ACTN1 και ACTN4 εκφράζονται παντού. Πρόσφατα, αναφέρθηκε ACTN4 για να ενισχύσει την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση. Ωστόσο, ο μηχανισμός με τον οποίο ACTN4 κινεί αυτές τις κακοήθεις φαινοτύπους παραμένει ασαφής. Εδώ, δείχνουμε ότι ACTN4, αλλά όχι ACTN1, προκαλεί το σχηματισμό ανώριμων εστιακών συμφύσεων σε DLD-1 κύτταρα, που οδηγεί στην γρήγορη εναλλαγή των εστιακών συμφύσεων. Είναι ενδιαφέρον, zyxin (ΖΥΧ) συναρμολόγησης σε εστιακό συμφύσεις ήταν σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα ACTN4 εκφράζουν DLD-1, ενώ η πρόσληψη παξιλλίνη (PAX) εμφανίστηκαν κανονικά. Από την άλλη πλευρά, στα κύτταρα που εκφράζουν ACTN1-DLD-1, PAX και ΖΥΧ κανονικά προσλαμβάνονται σε εστιακές συμφύσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι ACTN4 εξασθενίζει ειδικά εστιακό ωρίμανση προσκόλληση μέσω της αναστολής της πρόσληψης του ΖΥΧ εστιακής σύμπλοκα. Χρησιμοποιώντας καθαρισμένες ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες, βρήκαμε ότι ΖΥΧ σύνδεση προς ACTN4 ήταν ελαττωματικό κάτω από συνθήκες όπου παρατηρήθηκε ΖΥΧ σύνδεση προς ACTN1. Επιπλέον, Matrigel εισβολής των κυττάρων SW480 που εκφράζουν υψηλά ενδογενή επίπεδα πρωτεΐνης ACTN4 αναστάλθηκε από έκτοπη έκφραση της ACTN1. Συνολικά, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι ΖΥΧ Ελαττωματική σύνδεση με ACTN4, το οποίο καταλαμβάνει συμφύσεων αντί ACTN1, προκαλεί το σχηματισμό ανώριμων εστιακών συμφύσεων, με αποτέλεσμα την ενίσχυση της κινητικότητας των κυττάρων και εισβολή

Παράθεση:. Φουκουμότο Μ, Kurisu S, Yamada Τ, Takenawa T (2015) α-ακτινίνης-4 Βελτιώνει παχέος Cancer Cell εισβολή καταστέλλοντας Focal Πρόσφυση Ωρίμανση. PLoS ONE 10 (4): e0120616. doi: 10.1371 /journal.pone.0120616

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Yves St-Pierre, INRS, Καναδάς

Ελήφθη: 5, Οκτωβρίου του 2014? Αποδεκτές: 24 Ιαν, 2015? Δημοσιεύθηκε: 10 Απριλίου του 2015

Copyright: © 2015 Φουκουμότο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από την Ιαπωνία Εταιρείας για την Προώθηση της Επιστήμης (JSPs) μέσω JSPs επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα Grant 25860215 (με σ Kurisu ) και JSPs επιχορηγήσεις-in-ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα Grant 23227005 (σε Τ Takenawa). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

α-Actinins (ACTNs) εκφράζονται παντού κυτταροσκελετού πρωτεϊνών που διασυνδέουν νημάτια ακτίνης σε διασταυρώσεις προσκόλληση σε επιθηλιακά κύτταρα και εστιακό συμφύσεις σε πολωμένα κύτταρα που μεταναστεύουν [1,2]. Σε εστιακές συμφύσεις, ACTNs αλληλεπιδρούν με μια ποικιλία άλλων εστιακής προσκόλλησης που σχετίζονται πρωτεΐνες όπως βινκουλίνης (VCL) [3,4] και ιντεγκρίνες [5,6], και στη συνέχεια σύνδεση νημάτια ακτίνης να εστιακές συμφύσεις [7-9]. Υπάρχουν τέσσερις ισομορφές της ACTNs σε κύτταρα θηλαστικών [10-12]. ACTN1 και ACTN4 εκφράζονται παντού και ονομάζονται ισομορφές μη μυών, ενώ ACTN2 και ACTN3 εκφράζονται ειδικά στους ιστούς των μυών. Μεταξύ ACTNs, ACTN4 εμπλέκεται κυρίως στην κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή του καρκίνου [12-21]. Κατά την κίνηση των κυττάρων, επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ACTN4 είναι σημαντικά αυξημένη και ACTN4 επικεντρώνεται στην αιχμή της που μεταναστεύουν κύτταρα [12]. ACTN4 knockdown καταστέλλει την μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων [15-18,20-22], ενώ η υπερέκφραση του σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα επάγει λεμφαδένα μετάστασης σε ανοσοανεπαρκείς ποντικούς [13]. Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης ACTN4 είναι στενά συνδεδεμένη με κακή έκβαση σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [12], του παχέος εντέρου [13], παγκρεατικό [20,23], των ωοθηκών [19], της ουροδόχου κύστης [21], και του πνεύμονα [24] του καρκίνου. Ωστόσο, ο λόγος για τον οποίο ACTN4, αντί ACTN1, συχνά συνδέεται με κακοήθειες καρκίνο παρά ομοιότητες στη δομή της περιοχής, πρόσδεσης ακτίνης και εγκάρσιας σύνδεσης δραστηριότητες, και Ca

2 + -sensitivity μεταξύ των δύο απομένουν να διευκρινιστεί [25] .

Focal συμφύσεις είναι μεγάλα ιντεγκρίνης-based, δυναμικές μακρομοριακές δομές που συνδέουν την εξωκυττάρια μήτρα με τα ενδοκυτταρικά δέσμες νημάτων ακτίνης ονομάζεται ίνες στρες. Εστιακή προσκόλληση είναι η κύρια δομή που μεταδίδει εξωκυτταρικό εφελκυστική δύναμη σε ένα κύτταρο. Έτσι, η συγκολλητική δύναμη των κυττάρων στο υπόστρωμα και τη διάρκεια ζωής ή η δυναμική των εστιακών συμφύσεων επηρεάζει κρισίμως τη δυναμική οργάνωση του κυτταρικού σχήματος, συμπεριλαμβανομένων κυτταρική κινητικότητα. Σε μεταναστεύουν κυττάρων ελασματοπόδια, εν τη γενέσει συμφύσεις, που αποτελείται από συμπλέγματος ιντεγκρινών και άλλων κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών, όπως η κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK), ACTN και βινκουλίνης (VCL) αρχικά σχηματίζουν. Αυτά είναι βραχύβια δομές που είτε ο κύκλος εργασιών ταχέως σε περίπου 60 δευτερόλεπτα ή ώριμη σε μεγαλύτερα (περίπου 1 μm σε διάμετρο) dot-όπως συμφύσεις αναφέρεται ως εστιακή σύμπλοκα που εξακολουθούν να υπάρχουν για αρκετά λεπτά. Εστιακό συγκροτήματα αυξηθεί περαιτέρω κεντρομόλου σε επιμήκη εστιακό συμφύσεις και, ταυτόχρονα, οι συνδεδεμένες ίνες στρες ακτίνης γίνει παχύτερο [26]. Πολυμερισμός lamellipodial ακτίνης καταλύεται από ακτίνης την προώθηση της δημιουργίας πυρήνων παράγοντες, οικογένεια WASP verprolin-ομόλογη πρωτεΐνη (WAVE) της οικογένειας των πρωτεϊνών και η πρωτεΐνη ακτίνη που σχετίζονται με 2/3 (ARP2 /3) συγκρότημα, το οποίο είναι επίσης απαραίτητη για τη συναρμολόγηση της εκκολαπτόμενη συμφύσεων. Lamellipodial νημάτια ακτίνης, σε συνεννόηση με ACTNs, πρόδρομοι μορφή που χρησιμεύουν ως πρότυπα για την ωρίμανση των εν τη γενέσει συμφύσεων μέσα σε εστιακό συμφύσεις [27,28]. Η ωρίμανση των εν τη γενέσει εστιακής προσκόλλησης περιλαμβάνει τη συμμετοχή των πρωτεϊνών σκαλωσιές, δηλαδή, παξιλλίνη (PAX) και zyxin (ΖΥΧ), για να σχηματίσουν σταθερή εστιακή συμφύσεις [7,26,29-31]. PAX φαίνεται να ρυθμίζει τη μετάβαση από εκκολαπτόμενο συμφύσεις εστιακής σύμπλοκα μέσω πολλαπλών φωσφορυλιωμένα υπολείμματα τυροσίνης του PAX. Από την άλλη πλευρά, η συμμετοχή ΖΥΧ σε εστιακές συμφύσεις είναι μια σχετικά αργά γεγονός που συμβαίνει μετά σχηματίζονται εστιακό σύμπλοκα. Έτσι, ΖΥΧ πιστεύεται ότι εμπλέκεται στο σχηματισμό και την αναδιοργάνωση του πλήρως ώριμα, κεντρομόλος εστιακό συμφύσεις. Σύμφωνα, πρόσφατες εκθέσεις υποδεικνύουν το ρόλο των ΖΥΧ του άγχους πύκνωσης ίνας σε απόκριση σε μηχανικές καταπονήσεις [32]. ACTN1 είναι παραδοσιακά πιστεύεται ότι είναι ένας συνδετήρας μεταξύ συμπλεγμάτων ιντεγκρίνης και ίνες στρες, αφού ACTN1 μπορεί να δεσμευτεί άμεσα με ιντεγρίνης β1, VCL, και ΖΥΧ [33,34]. Ωστόσο, ο ρόλος του ACTN4, το οποίο παρουσιάζει υψηλή ομοιότητα αμινοξέων (86%) για να ACTN1, δεν έχει ακριβώς δοκιμαστεί, τόσο στο λειτουργία και σε αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στο σχηματισμό εστιακών προσκόλλησης.

Σε αυτή τη μελέτη , έχουμε αποδείξει τα αντίθετα αποτελέσματα των μη μυϊκών ACTNs σε εστιακό ωρίμανση πρόσφυση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. ACTN1 ρυθμίζει θετικά σχηματισμό εστιακή πρόσφυση, ενώ ACTN4 προκαλεί αποσταθεροποίηση και γρήγορη εναλλαγή των συμφύσεων στα κύτταρα ACTN4-υπερεκφράζουν. Μπορούμε επίσης να αποδεικνύουν, για πρώτη φορά, μια σαφής διαφορά μεταξύ των δύο ισομορφών ACTN σε ΖΥΧ δεσμευτική. ACTN4 δεν δεσμεύεται σε ΖΥΧ, που πιθανόν κρύβεται πίσω από την παρατηρούμενη υψηλό ποσοστό του κύκλου εργασιών των συμφύσεων στα κύτταρα ACTN4-υπερεκφράζουν, ενώ ACTN1 συνδέεται με ΖΥΧ όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. αποτυχία ACTN4 να συνδεθεί με ΖΥΧ συνδέει στενά με παθογένεση του καρκίνου, διότι διακυβεύεται η προσκόλληση κυττάρου-υπόστρωμα συχνά οδηγεί σε αυξημένη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων και εισβολής.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Η αντι-ACTN1 αντίσωμα (H00000087) αγοράστηκε από Abnova (Taipei City, Ταϊβάν). Η αντι-ACTN4 αντίσωμα (ALX-210-356) αγοράστηκε από Enzo Επιστημών Ζωής (Plymouth Meeting, ΡΑ, USA). Η αντι-RhoA (sc-418) και αντι-μυοσίνης ρυθμιστική ελαφριά αλυσίδα (MRLC) (sc-28329) αντισώματα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Το αντι-φωσφο-MRLC (T18 /S19) αντίσωμα (# 3674) και αντίσωμα αντι-His-tag (# 2365) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Το αντι-FLAG (F3165), αντι-VCL (V9131), αντι-ΖΥΧ (HPA004835), και παν-ACTN (A5044) αντισωμάτων αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA). Το αντι-PAX αντίσωμα (610051) αγοράστηκε από την BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Το αντι-φωσφο-SRC (Y418) αντίσωμα (44-660G) και αντι-φωσφο-ΡΑΚ (Y397) αντίσωμα (44-624G) αγοράστηκαν από την Life Technologies (

Carlsbad

, CA, USA). Το αντι-ακτίνης αντίσωμα (MAB1501) αγοράστηκε από την EMD Millipore (Billerica, ΜΑ, USA). Ροδαμίνη-επισημασμένο φαλλοειδίνη αγοράστηκε από την Life Technologies. Παράγοντα Ανάπτυξης Μειωμένη Matrigel (# 354230) αγοράστηκε από την Corning (New York, NY, USA). πρωτεΐνες ακτίνης καθαρισμένο από σκελετικό μυ κουνελιού (AKL99-Α) αγοράστηκαν από την Cytoskeleton, Inc. (Denver, CO, USA).

Κυτταρική καλλιέργεια

Οι ανθρώπινες ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές σειρές DLD-1 , ΗΤ-29, LoVo, NCI-H508, και Caco-2 ήταν πλούσια δώρα από τον Dr. Τ Azuma (Τόκιο Dental College, Tokyo, Japan). Το ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή SW480 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Κ Ναγκάνο (The Institute of Medical Science, το Πανεπιστήμιο του Τόκιο, Τόκιο, Ιαπωνία). DLD-1 και LoVo αρχικά αγοράστηκαν από JCRB Τράπεζας Κυττάρων (Osaka, Japan). ΗΤ-29, NCI-H508, Caco-2, και SW480 ήταν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Όλες οι κυτταρικές σειρές, εκτός SW480, καλλιεργήθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ? Wako, Osaka, Japan) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), 4 mM L-γλουταμίνη, και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. κύτταρα SW480 καλλιεργήθηκαν σε Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640? Wako, Osaka, Japan) συμπληρωμένο με 10% FBS. FreeStyle 293F κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε FreeStyle 293 μέσο έκφρασης (Life Technologies).

πλασμίδια και την διαμόλυνση

πλήρους μήκους ανθρώπινου ACTN1, ACTN4, και ΖΥΧ cDNAs ελήφθησαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας cDNA κυττάρων DLD-1 ως πρότυπο. Οι ακόλουθες μεταλλάξεις διαγραφής του ΖΥΧ ενισχύθηκαν με PCR: ΖΥΧ-Ν (αμινοξέα [αο] 1-51) και ΖΥΧ-C (αα 52-572). Όλα τα cDNAs αλληλουχήθηκαν και στη συνέχεια υποκλωνοποιήθηκε εντός του pCMV2A, pCMV4A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), pEGFP-N2, pEGFP-N3, pEGFP-C1, pmCherry-Ν1 (TAKARA ΒΙΟ Inc., Otsu, Ιαπωνία), pGEX-6P-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), και pFastBacHT Α (Life Technologies). Η GFP-βινκουλίνης (VCL) κατασκεύασμα που περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Για ACTN σταθερή έκφραση σε DLD-1 κύτταρα, cDNA που κωδικοποιούν GFP, ACTN1-GFP, και ACTN4-GFP ενισχύθηκαν με PCR και εισήχθη εντός φορέα pIRESpuro3 (TAKARA ΒΙΟ Inc.).

Τα πλασμίδια επιμολύνθηκαν σε DLD- 1 ή SW480 κύτταρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 ή το FreeStyle 293F κύτταρα με FreeStyle Max αντιδραστηρίων σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Life Technologies).

παρεμβολής RNA (RNAi)

Μικρές παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που) με στόχο την ανθρώπινη ACTN1 και ACTN4 (siGENOME SMARTpool) και siGENOME μη στόχευση ελέγχου siRNA Pool # 2 αγοράστηκαν από GE Dharmacon (Lafayette, CO, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). siRNAs επιμολύνθηκαν σε DLD-1 κύτταρα με το αντιδραστήριο Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies) σε τελική συγκέντρωση 10 ηΜ. Τα διαμολυσμένα κύτταρα καλλιεργούνται σε ένα μέσο ανάπτυξης για 48-72 ώρες προτού υποβληθούν σε χρώση κηλίδωση Western ή ανοσοφθορισμού.

Δημιουργία σταθερών κυτταρικών γραμμών DLD-1-ACTNs-GFP

DLD- 1 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pIRESpuro3-GFP, -ACTN1-GFP, ή-ACTN4-GFP. Μονές αποικίες απομονώθηκαν μετά από 2 εβδομάδες επιλογής πουρομυκίνης (1.5 μg /mL). Η έκφραση της πρωτεΐνης στα κυτταρολύματα αξιολογήθηκε με ανοσοστύπωμα με αντι-ΟΡΡ αντίσωμα. Τα προκύπτοντα κύτταρα ονομαστεί ως DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, ή DLD-1-ACTN4-GFP.

Καθαρισμός των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Ανθρώπινο πλήρους μήκους ΖΥΧ και ΖΥΧ-C κλωνοποιήθηκαν εντός του φορέα pCMV2B κωδικοποιεί ένα Ν-τερματικό FLAG ετικέτα και διαμολύνθηκε σε FreeStyle 293F κύτταρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, και ο σβώλος επαναιωρήθηκε σε ανοσοκαταβύθιση (ΙΡ) ρυθμιστικό διάλυμα (20 mM Tris, ρΗ 7,4, 100 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40, 1 mM αιθυλενοδιαμινοτετραοξικό οξύ [EDTA] και 1 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο [PMSF]) συμπληρωμένο με λευπεπτίνης και απροτινίνη. Τα κύτταρα λύθηκαν με κατεργασία με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν στα 100.000 χ

g

για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο επωάστηκε με αντι-FLAG πηκτής συνάφειας Μ2 (Sigma-Aldrich) για 2 ώρες και στη συνέχεια πλένονται τέσσερις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα ΙΡ. Η σημαία-ΖΥΧ-πλήρη και-ΖΥΧ-C συνδέεται με αντι-FLAG Μ2 gel χρησιμοποιήθηκαν αμέσως για τον προσδιορισμό pull-down. Ανθρώπινη ΖΥΧ-Ν κλωνοποιήθηκε στον φορέα pGEX-6P-1. Αυτό το κατασκεύασμα χρησιμοποιήθηκε για να μετασχηματίσει BL21 (DE3) pLysS

Escherichia coli

κύτταρα (Promega, Madison, WI, USA). Τα κύτταρα που εκφράζουν τις πρωτεΐνες σύντηξης GST συλλέχθηκαν, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (40 mM Tris, ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% Triton Χ-100, 5 mM EDTA, και 1 mM PMSF, και Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablet [ ,,,0],Roche, Βασιλεία, Ελβετία]), λύθηκαν με υπερήχους, και φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 χ

g

για 30 λεπτά. Το υπερκείμενο επωάστηκε με γλουταθειόνη Sepharose 4Β (GE Healthcare) για 2 ώρες και στη συνέχεια πλύθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Bound GST-ΖΥΧ-Ν εκλούστηκε με γλουταθειόνη.

His-tagged ανθρώπινη πλήρους μήκους ACTN1 και ACTN4 εκφράστηκαν σε κύτταρα Sf9 με τη χρήση του συστήματος έκφρασης Bac-to-Bac Baculovirus (Life Technologies). Οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες καθαρίστηκαν χρησιμοποιώντας Νί-ΝΤΑ αγαρόζης (Qiagen, Venlo, Κάτω Χώρες).

ανοσοφθορισμού μικροσκοπία

Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με πλασμίδια ή siRNAs και την εκ νέου απλώθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel καλυπτρίδες μετά 24- 48 ώρες διαμόλυνσης. Τα κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξαπλωθούν επί 24 ώρες, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από διαπερατοποίηση χρησιμοποιώντας 0,2% Triton Χ-100 σε φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 5 λεπτά. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια κατεργάζεται με δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Alexa Fluor 568 αντι-κουνελιού IgG (Η + L) αντίσωμα και Alexa Fluor 647 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (H + L) αντίσωμα (αμφότερα από την Life Technologies) χρησιμοποιήθηκαν ως δεύτερα αντισώματα. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν με Permafluor Υδατικό Τοποθέτηση Medium (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) και παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα FluoView 1000-D ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan).

κηλίδωση Western

Όλα τα κύτταρα που χρησιμοποιούνται για κηλίδωση Western σπάρθηκαν σε πλαστικά πιάτα προεπικαλυμμένα με Matrigel. Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Laemmli, κατεργασία με υπερήχους για λίγο να διακόψει DNA, και βράζεται στους 95 ° C για 5 λεπτά. Κηλίδωση Western έγινε με τυπικές διαδικασίες με ανίχνευση με συζευγμένο με αλκαλική φωσφατάση γίδινο αντι-ποντικού ή κουνελιού-IgG δευτερογενή αντισώματα (Promega). λογισμικό ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση εντάσεων μπάντα.

Η ποσοτικοποίηση των συμφύσεων και ίνες στρες

εστιακών συμφύσεων ήταν ποσοτικά ως εξής. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντι-VCL αντίσωμα και ροδαμίνη-φαλλοϊδίνη, ή με αντι-PAX και αντισώματα αντι-ΖΥΧ. Εικόνες ελήφθησαν με συνεστιακή μικροσκοπία και με καθορισμό κατωφλίου για τρεις φορές το φόντο. Εστιακό αριθμοί πρόσφυση ήταν ποσοτικά μετρώντας VCL ή PAX πλάκες. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό ωριμότητα εστιακής προσκόλλησης, PAX- και ΖΥΧ-θετικές πλάκες ανά μονάδα επιφάνειας (κύτταρα DLD-1) ή ανά κύτταρο (SW480 κύτταρα) μετρήθηκαν. Οκτώ έως ογδόντα κύτταρα που ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν. Η αναλογία ΖΥΧ-θετικών προς ΡΑΧ-θετικό (σύνολο) πλάκες υπολογίστηκε για κάθε κύτταρο και, στη συνέχεια, κατά μέσο όρο μεταξύ των κυττάρων. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό εστιακό μέγεθος προσκόλληση, η μέση έκταση της ΡΑΧ-θετικών πλακών υπολογίσθηκε για κάθε κύτταρο και, στη συνέχεια, κατά μέσο όρο μεταξύ των κυττάρων. Όλη η επεξεργασία της εικόνας έγινε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ.

σχηματισμό ινών στρες προσδιορίστηκε ποσοτικά ως εξής. Κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο, ACTN1, και ACTN4 siRNAs, ή κύτταρα που εκφράζουν GFP, ACTN1-GFP, ή ACTN4-GFP χρωματίστηκαν με αντι-VCL αντίσωμα και ροδαμίνη-phalloidin και απεικονίστηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία κάτω από τις ίδιες ρυθμίσεις απόκτησης. σήματα φαλλοειδίνη είχαν κατώφλι στο ίδιο επίπεδο και το ποσοστό των κυττάρων που σχηματίζουν διακριτή ίνες στρες συνδεδεμένο με VCL πλάκες σε τουλάχιστον ένα άκρο ποσοτικοποιήθηκε. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τουλάχιστον 23 κύτταρα βαθμολογήθηκαν για κάθε πείραμα.

Ζωντανή-κυττάρων απεικόνιση της DLD-1 κύτταρα και ανάλυση του κύκλου εργασιών

DLD-1 κύτταρα επιμολυσμένα με GFP-VCL και mCherry, ACTN1-mCherry, ή ACTN4-mCherry επανα-επιστρώθηκαν σε επικαλυμμένα με Matrigel, 35-mm γυάλινο πυθμένα πιάτα (IWAKI, Tokyo, Japan) 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Περίπου 16 ώρες μετά την εκ νέου επίστρωση, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν για πάνω από 2 ώρες με το σύνολο των εσωτερικών φθορισμού ανάκλασης (TIRF) μικροσκοπία (Όλυμπος). Πριν από τη συλλογή των εικόνων, το μέσο αντικαταστάθηκε με ένα CO

2-ανεξάρτητο μέσο (Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% FBS και 4 mM L-γλουταμίνη. Οι εικόνες ελήφθησαν ως ένα καρέ κάθε λεπτό για 120 λεπτά. Οι απεικονίστηκαν συμφύσεις ταιριάζουν με τα κριτήρια σε ότι είχαν εντοπίζεται σε ένα προεξέχον ελασματοπόδια. Μια ακολουθία kymographs ελήφθη χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ. Η αλλαγή time-lapse στην ένταση φθορισμού της GFP-VCL απεικονίστηκε γραφικά χρησιμοποιώντας το Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA), και τα ποσοστά των εστιακών συναρμολόγησης πρόσφυση, τη σταθερότητα και την αποσυναρμολόγηση προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Αυτές οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν για 2-10 συμφύσεων ανά κύτταρο σε 8-10 κύτταρα για κάθε κατάσταση.

Matrigel δοκιμασία εισβολής

Η δοκιμασία εισβολή πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36], με κάποιες τροποποιήσεις. DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, και τα κύτταρα DLD-1-ACTN4-GFP (2.0 × 10

5 κύτταρα σε DMEM ελεύθερο ορού) σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα του BD Biocoat Matrigel εισβολής τμήμα (BD Biosciences) και επωάζονται με 10% FBS DMEM στον πυθμένα καλά και χωρίς ορό μέσο στον άνω θάλαμο. Μετά από 26 ώρες, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη σε PBS για πάνω από 30 λεπτά. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και τα εισέβαλαν GFP-θετικά κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης φίλτρου παρατηρήθηκαν με συνεστιακή μικροσκόπηση. Τα κύτταρα σε έξι τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία από διπλές θαλάμους μετρήθηκαν σε τρία ανεξάρτητα πειράματα. κύτταρα SW480 επιμολύνθηκαν με GFP ή ACTN1-GFP πλασμίδια. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα (5,0 χ 10

5 κύτταρα) σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο και επωάστηκε με 10% FBS RPMI 1640 στο κάτω φρεάτιο και απαλλαγμένο από ορό μέσο στον άνω θάλαμο.

Τραβήξτε καθόδου

δοκιμασία

GST-ΖΥΧ-Ν πρωτεΐνες δεσμευμένες σε γλουταθειόνη Sepharose 4Β επωάστηκαν με καθαρισμένο His-ACTN1 ή-ACTN4 His πρωτεΐνες σε ρυθμιστικό (ρυθμιστικό λύσης συν 1,0% αλβουμίνη βόειου ορού [BSA]) σύνδεση για 2 h, πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, και το δεσμευμένο ACTNs αναλύθηκαν με SDS-PAGE. FLAG-ΖΥΧ-πλήρη και FLAG-ΖΥΧ-C πρωτεΐνες δεσμευμένες σε γέλη συγγένειας αντι-FLAG Μ2 αναμίχθηκαν με καθαρίστηκαν His-ACTN1 ή His-ACTN4, επωάστηκαν για 2 ώρες σε ρυθμιστικό IP, και το δεσμευμένο ACTNs αναλύθηκαν. Οι ποσότητες των δραστικών RhoA ποσοτικοποιήθηκαν σε δοκιμασίες pull-down με GST-Rhotekin-RBD, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [36]. Οι εντάσεις σήματος μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Στατιστική ανάλυση

για πολλαπλές συγκρίσεις,

P τιμές

παρήχθησαν με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (one-way ANOVA) χρησιμοποιώντας τη δοκιμή του Dunnett για πολλαπλές συγκρίσεις. Για τις αναλύσεις δύο ομάδας, του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 6 λογισμικού (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA).

Αποτελέσματα

ACTN1 και έκφραση ACTN4 στο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα

ACTN4 αναφέρθηκε για την ενίσχυση της κυτταρικής κινητικότητας και την προώθηση λεμφαδένα μετάσταση καρκίνου του παχέος εντέρου [13]. Ωστόσο, δεν είναι σαφές εάν οι επιπτώσεις αυτές αποδίδονται σε ACTN4 λειτουργίες ισομορφή-ειδική ή αν ACTN1 κλασικής ισομορφή είναι ικανό να επάγει καρκινικούς φαινοτύπους ως ACTN4 κάνει. Εμείς ποσοτικοποιείται πρώτα τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των ενδογενών πρωτεϊνών ACTN1 και ACTN4 σε διάφορες καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας καθαρισμένο ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών ως εξωτερικούς ελέγχους (Σχήμα 1Α). έκφραση ACTN4 ήταν υψηλότερη από εκείνη της ACTN1 σε όλα τα κύτταρα, εκτός κύτταρα DLD-1. κύτταρα DLD-1 που εκφράζεται ACTN4 σε χαμηλό, αλλά παρόμοια, επίπεδο από εκείνο του ACTN1 (Σχήμα 1Β). Έτσι, προκειμένου να αποσαφηνιστεί η διαφορική λειτουργία του ACTN1 και ACTN4, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα DLD-1, επειδή οι επιπτώσεις της έκτοπη έκφραση ή αποσιώπηση της ACTNs ήταν ανιχνεύσιμα.

(Α) ανάλυση Western blot της ACTN1, ACTN4, και ακτίνη σε κυτταρικές σειρές καρκίνου ανθρώπινου κόλον. επίπεδα ACTN1 και πρωτεΐνης ACTN4 μετρήθηκαν σε σύγκριση με ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες ACTN1 His-tag και ACTN4 χρησιμοποιούνται ως εξωτερικά πρότυπα. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης και σκελετικό μυ κουνελιού καθαρισμένο ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εξωτερικό πρότυπο. (Β) Band εντάσεις προσδιορίστηκαν ποσοτικά, και οι μοριακές αναλογίες ACTNs υπολογίστηκαν και παρουσιάζονται ως mol% έναντι ακτίνης. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η ρόλοι

Διαφορικές ACTN1 και ACTN4 στο σχηματισμό συμφύσεων

ACTN1 και έκφραση ACTN4 στο DLD-1 κύτταρα σίγησε με siRNA (Σχ 2Α). ACTN1 νοκ ντάουν μειώθηκε ο αριθμός των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις. Ωστόσο, ACTN4 νοκ ντάουν απροσδόκητα αυξημένη ίνες στρες και τοπικές συμφύσεις (Σχήμα 2Β-2D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τόσο ACTN1 και ACTN4 εμπλέκονται στο σχηματισμό ινών στρες και τοπικές συμφύσεις στα κύτταρα DLD-1, αλλά σαφώς σε αντίθετες τρόπους: ACTN1 ενισχύει, ενώ ACTN4 καταστέλλει. Οι αντιθέσεις ρόλοι των ACTNs παρατηρήθηκαν επίσης με έκτοπη έκφραση της ACTN1-GFP και ACTN4-GFP σε DLD-1 κύτταρα (Σχήμα 2Ε). ACTN4 υπερέκφραση κατέστειλε το σχηματισμό των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις (Σχήμα 2F-2Η). Από την άλλη πλευρά, ACTN1 υπερέκφραση επάγεται η ανάπτυξη των ινών στρες και τοπικές συμφύσεις.

(Α) και ACTN1 ACTN4 έκφραση σίγησε με siGENOME SMARTpool siRNA σε κύτταρα DLD-1. Αποτελεσματική νοκ ντάουν επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας ACTN ισομορφής ειδικά αντισώματα. Το βέλος δείχνει την ενδογενή ACTN1. Ο αστερίσκος υποδεικνύει μία μη-ειδική ζώνη διασταυρωτικώς. (Β) Κύτταρα επιμολυσμένα με τις αναφερόμενες siRNAs βάφτηκαν για βινκουλίνης (VCL) και F-ακτίνης και παρατηρήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Τα βέλη και αιχμές βελών δείχνουν εστιακές συμφύσεις και ίνες στρες, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακας = 10 μm. (Γ) Τα ποσοστά των κυττάρων siRNA επεξεργασμένου ίνες σχηματισμού στρες απεικονίζονται γραφικά. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01. (Δ) Οι εστιακές αριθμοί προσκόλληση ανά κύτταρο των κυττάρων siRNA που έλαβαν θεραπεία με γράφημα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD από 71 κύτταρα για τον έλεγχο, 73 κύτταρα για si-ACTN1 κύτταρα, και 55 κύτταρα για τα κύτταρα-si ACTN4. *

P

& lt? 0.05. (Ε) Παροδική έκφραση του ACTN1-GFP και ACTN4-GFP σε κύτταρα DLD-1 επιβεβαιώθηκε με στύπωση western χρησιμοποιώντας ισομορφής ειδικά αντισώματα ACTN. (F) GFP, ACTN1-GFP, και ACTN4-GFP εκφράστηκαν σε κύτταρα DLD-1, το οποίο στη συνέχεια βάφτηκαν για VCL και F-ακτίνης και παρατηρήθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία. Τα βέλη και αιχμές βελών δείχνουν εστιακές συμφύσεις και ίνες στρες, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακας = 10 μm. (G) Τα ποσοστά των επιμολυσμένων κυττάρων που σχηματίζουν ίνες στρες απεικονίζονται γραφικά. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. TFX δηλώνει επιμόλυνση. **

P

& lt? 0.01. (Η) Οι εστιακές αριθμοί προσκόλληση ανά κύτταρο των κυττάρων που εκφράζουν GFP, ACTN1-GFP, και ACTN4-GFP απεικονίστηκαν γραφικά. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD 130 κυττάρων για GFP, 52 κύτταρα για ACTN1-GFP, και 73 κύτταρα για ACTN4-GFP. *

P

& lt? 0.05.

Η

Σημαντικά μόρια που μεταδίδουν πληροφορίες από πλάκες πρόσφυση σε ακτίνης ίνες στρες περιλαμβάνουν μυοσίνη ΙΙ σηματοδότησης, ΡΑΚ, SRC οικογένεια κινασών, και Rho οικογένεια ΘΤΡάσες. Έτσι, εξετάσαμε τις πρωτεΐνες που εμπλέκονται στο σχηματισμό εστιακών συμφύσεων με κηλίδωση Western σε κύτταρα στα οποία η έκφραση ACTN σίγησε με siRNA (S1 Εικ). Η φωσφορυλίωση των ρυθμιστικών μυοσίνης ελαφράς αλύσου (MRLC) επί θρεονίνη 18 και σερίνη 19, και φωσφορυλίωση τυροσίνης του FAK και SRC δεν μεταβλήθηκαν. δραστηριότητα RhoA μειώθηκε ειδικά σε ACTN1 siRNA-κατεργασμένα κύτταρα. Αν και μείωση της δραστηριότητας μυοσίνη ΙΙ στο ACTN1 ή ACTN4 νοκ ντάουν κύτταρα προηγουμένως αναφέρθηκε [14,17,37], δεν θα μπορούσε να ανιχνεύσει σημαντικές αλλαγές στην φωσφορυλίωση MRLC. Επιπλέον, η μείωση που παρατηρήθηκε σε δραστηριότητα RhoA ήταν μέτρια (λιγότερο από 40% μείωση για ACTN1 siRNA). Αυτές οι αλλαγές δεν συσχετίστηκε με φαινοτυπικές μεταβολές στο σχηματισμό ινών στρες και τοπικές συμφύσεις που παρατηρείται σε ACTN knockdown κυττάρων σε σχήμα 2Β-2D και 2F-2Η. Επιπλέον, η δραστηριότητα των ρυθμιστών της εν τω γεννάσθαι σχηματισμό σύμφυσης, δηλαδή FAK και SRC, ήταν παρόμοια σε έλεγχο και /4 κύτταρα siRNA επεξεργασμένα ACTN1, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι τροποποιήσεις του σχηματισμού ινιδίων του στρες και εστιακή αριθμούς προσκόλληση σε απόκριση σε χειραγώγηση της έκφρασης ACTN μπορούσε να αποδοθεί στις διαφορική δραστηριότητες της καθυστερημένης δράσης μορίων στην σταδιακή ωρίμανση των συμφύσεων, όπως ρυθμιστές της εστίασης συγκρότημα σταθερότητα ή ρυθμιστές της κεντρομόλου συναρμολόγησης εστιακής προσκόλλησης.

ACTN4 ενισχύει την εστιακή πρόσφυση ποσοστό του κύκλου εργασιών

Στη συνέχεια, συν-εκφράζεται ACTN1-mCherry ή ACTN4-mCherry με GFP-VCL και παρατηρείται VCL time-lapse εικόνες από TIRF μικροσκοπία για τον εντοπισμό της συναρμολόγησης και αποσυναρμολόγησης των εστιακών συμφύσεων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, S1 ταινία, S2 ταινία, και S3 ταινία, το ποσοστό του κύκλου εργασιών των συμφύσεων στα κύτταρα ACTN4 εκφράζουν εμφανίστηκε πιο γρήγορα από ότι του ελέγχου ή κύτταρα ACTN1 εκφράζουν. Ο χρόνος που απαιτείται για μία μόνο προσκόλληση να αποσυναρμολογείται ήταν 34 λεπτά κατά μέσο όρο σε έλεγχο mCherry-εκφράζοντα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η προσκόλληση οριοθετημένων από το σήμα GFP-VCL τεκμαίρεται να φθάσει σε ώριμη εστιακή προσκόλληση. Η διάρκεια ζωής των εν λόγω εστιακών συμφύσεων μπορούσε να διαιρεθεί σε τρία βήματα? συναρμολόγηση, σταθερότητα, και αποσυναρμολόγηση (Σχήμα 3Α). Μετρήσαμε το χρόνο που απαιτείται για κάθε βήμα (Σχήμα 3Β-3ϋ). Σε κύτταρα ACTN4 εκφράζουν, ο χρόνος που απαιτείται για τη σταθεροποίηση και την αποσυναρμολόγηση ήταν μικρότερη από ό, τι στον έλεγχο ή κύτταρα ACTN1 εκφράζουν. Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι στα κύτταρα ACTN4 εκφράζουν, η διάρκεια ζωής των εστιακών συμφύσεων βραχύνεται λόγω επιταχυνόμενο ρυθμό αποσυναρμολόγηση, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι εστιακές συμφύσεις αποσταθεροποιούνται σε μια ισομορφή-ειδικό τρόπο από ACTN4 υπερέκφραση.

(Α) mCherry , ACTN1-mCherry, ή ACTN4-mCherry συν-εκφράζεται με GFP-VCL και VCL time lapse εικόνα παρατηρήθηκε με συνολική εσωτερική φθορισμό ανάκλασης (TIRF) μικροσκοπία για τον εντοπισμό της συναρμολόγησης και αποσυναρμολόγησης των εστιακών συμφύσεων. Άνω πάνελ παρουσιάζουν αντιπροσωπευτικά kymographs φθορισμού GFP-VCL μαζί 5-μm παραγάδια που σε περιοχές της επέκτασης ελασματοπόδια. Η ένταση φθορισμού στο άνω φύλλο είχε συναρτήσει του χρόνου και παρουσιάζεται ως ένα γράφημα στο κάτω μέρος των αντίστοιχων kymographs. Οι φάσεις του κύκλου εργασιών της εστιακής προσκόλλησης συγκροτήματος, τη σταθερότητα, και η αποσυναρμολόγηση παρουσιάζονται ως κόκκινες διακεκομμένες γραμμές στο γράφημα φορέα mCherry. (Β-D) Διάρκεια κάθε φάσης του κύκλου εργασιών επεξηγείται στο αριστερό γράφημα στο Α αναλύθηκε και ποσοτικοποιήθηκε από 51 συμφύσεις για mCherry κύτταρα που εκφράζουν, 57 συμφύσεις για ACTN1-mCherry-εκφράζοντα κύτταρα, και 64 συμφύσεις για ACTN4-mCherry κύτταρα που εκφράζουν . Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως κιβώτιο και μουστακιού οικόπεδα με κουτιά που αντιπροσωπεύουν εικοστός πέμπτος με εβδομηκοστής πέμπτης σειράς εκατοστημόριο και μουστάκια που εκπροσωπούν δέκατου με ενενηκοστή φάσμα εκατοστημόριο. N.S., δεν είναι σημαντική, **

P

& lt? 0.01.

Η

ΖΥΧ προσλήψεων στην κεντρική συγκροτήματα είναι μειωμένη σε κύτταρα ACTN4 εκφράζουν

Δεδομένου ότι οι εστιακές συμφύσεις αποσταθεροποιείται από την έκφραση ACTN4 στο DLD-1 κύτταρα, υποθέσαμε ότι ACTN4 αναστέλλει το λειτουργία των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στο μετασχηματισμό του εστιακού συμπλοκών να κεντρομόλο εστιακές συμφύσεις. Ειδικότερα, εξετάσαμε τον εντοπισμό του ΖΥΧ, η οποία έχει αναφερθεί ότι εντοπίζονται ειδικά στο ώριμο κεντρομόλο εστιακές συμφύσεις [30]. Χρησιμοποιήσαμε PAX ως γενικός δείκτης των συμφύσεων σε όλη την ωρίμανση. Όπως φαίνεται στην άνω σειρά του Σχ 4Α, GFP που εκφράζουν ελέγχου DLD-1 κύτταρα που σχηματίζονται ΡΑΧ-θετικές πλάκες στη φολιδωτή κύτταρο περιφέρεια. Αυτές οι πλάκες θεωρείται ότι αντιστοιχεί σε δύο εστιακά συγκροτήματα και κεντρομόλος εστιακές συμφύσεις. Μεταξύ αυτών των πλακών, ώριμος κεντρομόλος εστιακές συμφύσεις μπορούν να διακριθούν με βάση την ΖΥΧ colocalization. Οι μέσοι αριθμοί των PAX- και ΖΥΧ-θετικών πλακών σε κύτταρα ελέγχου ήταν 0,14 και 0,073 ανά τετραγωνικό μικρόμετρο, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β και 4C). Ως εκ τούτου, περίπου το ήμισυ των συμφύσεων ήταν ΖΥΧ θετικά και, συνεπώς, θεωρείται ότι είναι ώριμα σε κύτταρα ελέγχου. κύτταρα ACTN4-GFP που εκφράζουν ACTN1-GFP- και σχηματίζεται παρόμοιους αριθμούς των PAX πλακών όπως παρατηρήθηκε στα κύτταρα ελέγχου, γεγονός που υποδηλώνει ότι ACTNs έχουν μικρή επιρροή στη διαμόρφωση της εστίασης συγκροτημάτων (Σχήμα 4Β). Αντιθέτως, τόσο ο αριθμός και η αναλογία των ΖΥΧ-θετικών πλακών σε κύτταρα ACTN4 εκφράζουν μειώθηκαν σημαντικά σε 0.049 πλάκες /μm

2 και 40%, αντίστοιχα, σε σύγκριση με εκείνα του ελέγχου και των κυττάρων ACTN1 εκφράζουν (Σχ 4C και 4D). Επιπλέον, η κυρίαρχη μορφή του συμφύσεων σε κύτταρα ACTN4 εκφράζουν άλλαξε σε ένα γύρο, dot-όπως δομή σε αντίθεση με τα επιμήκη κεντρομόλο συμφύσεις που συχνά παρατηρούνται σε έλεγχο και τα κύτταρα ACTN1 εκφράζουν (βλέπε βέλη στο Σχήμα 4Α, κάτω σειρά). Η αλλαγή στο σχήμα αντικατοπτρίζεται στο μέγεθος του PAX-θετικών πλακών που κατέστησαν μικρότερα σε κύτταρα που εκφράζουν ACTN4 (Σχήμα 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι εστιακή σύμπλοκα δεν μπορούν να φθάσουν τα ωρίμασε κεντρομόλος εστιακές συμφύσεις σε κύτταρα που εκφράζουν ACTN4. Επιπλέον, ACTN4 αναστέλλει ειδικά τη σωστή πρόσληψη ΖΥΧ εστιακής συγκροτήματα, η οποία μπορεί να εξηγήσει τις φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ ACTN1- και τα κύτταρα ACTN4 εκφράζουν.

(Α) GFP, ACTN1-GFP, και ACTN4-GFP ( εμφανίζεται με πράσινο χρώμα) εκφράστηκαν σε κύτταρα DLD-1, που χρωματίστηκαν για ΡΑΧ (μπλε) και ΖΥΧ () πρωτεΐνες κόκκινο και απεικονίστηκαν κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού. Εγκλωβιστούμε περιοχές στην αριστερή στήλη δείχνουν την περιφερειακή ελάσματα που χρησιμοποιούνται για PAX και ΖΥΧ ποσοτικοποίηση της πλάκας. Μια σειρά από διευρυμένης εικόνες των περιοχών κουτιά φαίνονται στα δεξιά. Τα βέλη και αιχμές βελών δείχνουν PAX-θετικά και PAX /ΖΥΧ-διπλό θετικές πλάκες, αντίστοιχα. μπαρ κλίμακας = 30 μm. (Β-Ο) Ο αριθμός των PAX και ΖΥΧ πλάκες ανά μονάδα επιφανείας της περιφερικής ελάσματα μετρήθηκαν σε GFP-, ACTN1-, ή κύτταρα ACTN4 εκφράζουν. Οκτώ έως δεκαέξι κύτταρα αναλύθηκαν ανά ομάδα. Οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε τυπικές αποκλίσεις μεταξύ των κυττάρων. N.S., δεν είναι σημαντική, *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01. (D) Αναλογία ΖΥΧ θετικά στην PAX-θετικών πλακών, δηλαδή, το σύνολο των συμφύσεων πλάκα. Οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε τυπικές αποκλίσεις μεταξύ των κυττάρων. N.S., δεν είναι σημαντική, **

P

& lt? 0.01. (Ε) PAX μέγεθος πλάκας σε GFP-, ACTN1- ή κύτταρα ACTN4 εκφράζουν μετρήθηκε σε τουλάχιστον 171 συμφύσεις 8-11 κύτταρα ανά ομάδα. Οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε τυπικές αποκλίσεις μεταξύ των κυττάρων. N.S., δεν είναι σημαντική, *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.01.

Η

ACTN4 δεν δεσμεύεται σε ΖΥΧ

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν η μειωμένη πρόσληψη ΖΥΧ σε εστιακές συμφύσεις στα κύτταρα ACTN4 εκφράζουν οφείλεται σε ελάττωμα δεσμευτική ΖΥΧ να ACTN4. *

P

& lt? 0.05, **

P

& lt? 0.05. **

P

& lt? 0.01. **

P

& lt?