Αφηρημένο

Ιστορικό

ουροθηλιακά καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι η ένατη πιο κοινή μορφή καρκίνου. Παρά τις χειρουργικές και χημειοθεραπευτική αγωγή η πρόγνωση παραμένει φτωχή φορά καρκίνο της ουροδόχου κύστης εξελίσσεται σε διηθητικό κατάσταση. Ανακάλυψη νέων διαγνωστικών δεικτών και παθοφυσιολογική δράστες θα μπορούσαν να βοηθήσουν να συμβάλει σε νέες διαγνωστικές και θεραπευτικές επιλογές. Η εξωκυτταρική μήτρα μικροπεριβάλλον διαμορφώνεται από την εξωκυττάρια μήτρα επηρεάζει κρισίμως λειτουργίες των κυττάρων του όγκου και των κυττάρων στρώματος. Ως εκ τούτου, σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η πιθανή επίπτωση των μικρών πλούσιων σε λευκίνη πρωτεογλυκανών διγλυκάνη στην εξέλιξη της ανθρώπινης ουροθηλιακό καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Για το σκοπό αυτό όγκου βιοψίες 76 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης με διάφορα στάδια όγκου (pTA, ρΤ1-Τ4) διερευνήθηκαν σε σχέση με διγλυκάνη έκφρασης και συσχετίζονται με μακροχρόνια (10 έτη) κλινική παρακολούθηση. Είναι ενδιαφέρον, υψηλότερη έκφραση διγλυκάνη mRNA συσχετίστηκε με υψηλότερα στάδια του όγκου και των μυών εισβολής.

Σε

vitro

knock-down του ενδογενούς διγλυκάνη σε ανθρώπινα κύτταρα καρκινώματος urothelial (κύτταρα J82) αυξημένο πολλαπλασιασμό, ενώ προσθήκη ανασυνδυασμένου διγλυκάνης και υπερέκφραση του διγλυκάνη πολλαπλασιασμού ανέστειλε κυττάρου όγκου. Σύμφωνα με αυτή της ανάπτυξης-ανασταλτική δράση των διγλυκάνη, η μεταμόσχευση των κυττάρων J82 μετά knock-down της διγλυκάνη οδήγησε σε σημαντική αύξηση της ανάπτυξης του υποδόριου ξενομοσχεύματος όγκων σε γυμνά ποντίκια

στο

vivo

. Επιπλέον, η θεραπεία με δύο αντι-πολλαπλασιαστική, multi-υποδοχέα κινάσης τυροσίνης αναστολείς-sunitinib και sorafenib-έντονα αυξητικά διγλυκάνη έκφρασης. Συλλογικά, τα πειραματικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι η υψηλή έκφραση διγλυκάνη σχετίζεται με μειωμένη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Σύμφωνα, ανάλυση Kaplan-Meier έδειξε υψηλότερη επιβίωση 10 ετών σε ασθενείς με υψηλή έκφραση διγλυκάνη mRNA σε βιοψίες όγκων.

Συμπέρασμα

Εν κατακλείδι, τα παρόντα δεδομένα δείχνουν ότι είναι διγλυκάνη ένας αναστολέας της ενδογενούς του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων ουροδόχου κύστης που ρυθμίζεται αυξητικά σε απόκριση προς αντι-πολλαπλασιαστική αναστολείς κινάσης τυροσίνης. Επιπλέον, η υψηλή διγλυκάνη έκφραση συνδέεται με ευνοϊκή πρόγνωση

Παράθεση:. Niedworok C, ροκ Κ, Kretschmer Ι, Freudenberger Τ, Νάγκι Ν, Szarvas T, et al. (2013) ανασταλτικό ρόλο των Μικρών πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνων βιογλυκάνη στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 8 (11): e80084. doi: 10.1371 /journal.pone.0080084

Επιμέλεια: Νίκος Κ Καραμάνος, Πανεπιστήμιο Πατρών, Ελλάδα |

Ελήφθη: 2 Μάη του 2013? Αποδεκτές: 9 Οκτωβρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 6 Νοεμβρίου του 2013

Copyright: © 2013 Niedworok et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Ifores Πρόγραμμα του Πανεπιστημίου Κλινικές Έσσεν (D107-10800? https://www.uni-due.de/med/forschung/forschungsfoerderung/ifores.shtml) και από την Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG (FI 682 /4-1? https://gepris.dfg.de/gepris/OCTOPUS/;jsessionid=E43949FD6A49E805D72DE1129F1DB078?context=person displayMode=print findButton=Finden id=1433803 keywords_criterion=Jens+Fischer module=gepris nurProjekteMitAB=false task=showDetail). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ουροθηλιακά καρκίνο της ουροδόχου κύστης είναι η ένατη πιο κοινή ανθρώπινη κακοήθη καρκίνο με την αυξανόμενη επίπτωση και τον επιπολασμό [1]. μη μυών διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης αντιμετωπίζεται με διουρηθρική εκτομή και επικουρική θεραπεία με ενστάλαξη σε περίπτωση υψηλού βαθμού νόσου ή σε περιπτώσεις με πολλαπλές, συχνά επαναλαμβανόμενες όγκους. Η χαμηλής ποιότητας μη-μυϊκό διεισδυτική νόσο μπορεί να εξελιχθεί σε μυ διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης υψηλού κινδύνου. Η θεραπεία εκλογής για τον καρκίνο των μυών της ουροδόχου κύστης είναι επεμβατική ριζική κυστεκτομή [2,3], η οποία παρέχει ακόμα μόνο ένα χαμηλό (~ 50%) 5-ετή επιβίωση. Η κύρια αιτία για αυτή την καταστροφική επιβίωση συχνά εμφανιζόμενες μεταστατική εξέλιξη σε αυτούς τους ασθενείς [6,7]. Η σισπλατίνη σε συνδυασμό με γεμσιταβίνη αποτελεί την πρώτη γραμμή επικουρική θεραπευτική επιλογή για τους ασθενείς με τοπικά προχωρημένο ή μεταστατικό της ουροδόχου κύστης Καρκίνος. Νέες χημειοθεραπευτικές στρατηγικές, που περιλαμβάνουν αναστολείς κινάσης τυροσίνης υποδοχέα, σήμερα διερευνηθεί σε προκλινικά μοντέλα και σε κλινικές μελέτες [4,5]. Έτσι, παρά τις χειρουργικές και χημειοθεραπευτικών επιλογές θεραπείας η σοβαρότητα της νόσου και η κακή πρόγνωση παρόρμηση για την ανακάλυψη νέων δεικτών για την εξέλιξη της νόσου, καθώς και νέες γνώσεις σχετικά με την παθοφυσιολογία της εξέλιξης του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Για το σκοπό αυτό, έχουμε ως στόχο να ερευνήσει συγκεκριμένες αλλαγές στο εξωκυτταρικό micromilieu όπως ορίζεται από την εξωκυττάρια μήτρα (ECM) που σχετίζονται με την εξέλιξη του καρκίνου της ουροδόχου κύστης και αν μια συγκεκριμένη βιολογική δραστηριότητα θα μπορούσε να αποδοθεί σε υποψήφια μόρια . ECM είναι γνωστό ότι επηρεάζει και τα δύο, τα καρκινικά κύτταρα και στρωματικά σε σχέση με φαινοτυπικά χαρακτηριστικά τους που είναι σημαντικές για την πρόοδο του καρκίνου, όπως η εισβολή, πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Περαιτέρω, η σύνθεση της micromilieu ECM είναι πιθανό μέρος της διακυτταρικής επικοινωνίας μεταξύ των κυττάρων του όγκου και στρώματος. Πρωτεογλυκάνες, βασικά συστατικά της ECM, γίνονται όλο και πιο σημαντικές για τη βιολογία του καρκίνου, λόγω της πληθώρας των λειτουργιών που είναι κρίσιμες για τον όγκο του στρώματος αλληλεπιδράσεις [8]. Οι πρωτεογλυκάνες αποτελούνται από ένα πυρήνα πρωτεΐνης και γλυκοζαμινογλυκάνης αλυσίδα που υπόκειται σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις. Αμφότερες οι πρωτεΐνες πυρήνα και γλυκοζαμινογλυκάνης αλυσίδες συμβάλλουν στην λειτουργία των πρωτεογλυκανών εντός της ECM. Μικρές πλούσιες σε λευκίνη πρωτεογλυκάνες (SLRP) είναι μία οικογένεια εξωκυτταρικών πρωτεογλυκανών που χαρακτηρίζονται από πλούσιες σε λευκίνη επαναλήψεις στον πυρήνα της πρωτεΐνης. Οι SLRPs εκκρίνονται στον εξωκυτταρικό χώρο, όπου μπορούν να αλληλεπιδράσουν με άλλες πρωτεΐνες που συμπεριλαμβάνουν παράγοντες ανάπτυξης, κυτοκίνες [9-11] και διαμεμβρανικών υποδοχέων [12]. Διγλυκάνη (BGN) είναι μέλος του SLRPs που αλληλεπιδρά με διαμεμβρανικών υποδοχέων της πουρινεργικών τύπου Ρ2Χ7 και με ΤοΙΙ υποδοχέα (TLR) 2 και TLR4 [13,14]. Ο πρώην εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του inflammasome, ενώ το τελευταίο αιτία ενεργοποίηση του έμφυτου ανοσοποιητικού συστήματος. Οι δράσεις αυτές αποδίδουν ανοσοποιητικού ιδιότητες διαμόρφωσης σε BGN που θα μπορούσαν να έχουν σημασία για τους δύο, καρκινογένεση και την εξέλιξη του όγκου, καθώς και για μετάσταση. Επιπλέον, BGN έχει αποδειχθεί ότι συμβάλλουν στο σχηματισμό δίκτυο κολλαγόνου και σταθερότητα, σε ινονεκτίνη ινιδιογένεσης, να ινοβλαστών διαφοροποίηση και προτείνεται να συμβάλει στην αγγειογόνες αποκρίσεις [15-18]. Συνοπτικά, BGN πιθανόν διαμορφώνει βιολογία του όγκου κατά την πραγματοποίηση σημαντικών μηχανισμών ελέγχου, όπως ανοσολογικές αποκρίσεις, τη συναρμολόγηση και την μήτρα διαμόρφωσης της δραστικότητας αυξητικού παράγοντα. Αυτό είναι πιθανό επιτυγχάνεται τόσο από άμεση κυτταρική σηματοδότηση που προκαλείται από BGN καθώς και με τη διαμόρφωση του μικροπεριβάλλοντος μέσω των αποτελεσμάτων της επί του σχηματισμού κολλαγόνου και ινωδονεκτίνης μήτρας.

Σύμφωνα με το γεγονός ότι BGN παρουσιάζει δύο, ανασταλτικά και την προώθηση επιδράσεις στα κύτταρα του όγκου, αμφιλεγόμενη ρόλοι έχουν περιγραφεί για λέβα σε διάφορους καρκίνους. Για παράδειγμα, σε γαστρικό και του παχέος εντέρου, καθώς και σε παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα, έκφραση BGN βρέθηκε να συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [19-21]. Από την άλλη πλευρά, η υπερέκφραση του BGN παρατηρήθηκε σε ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος και βρέθηκαν να αναστέλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος

in vitro

[22]. Επιπλέον, BGN ρύθμιση προς τα κάτω συνδέθηκε με HER-2 /neu ογκογόνο μετασχηματισμό τη μεσολάβηση οποία συσχετίστηκε ισχυρώς με τον κακοήθη φαινότυπο των κυττάρων αυτών [23]. Ως εκ τούτου, ο ρόλος των BGN στην πρόοδο του όγκου πιθανόν εξαρτάται από τον τύπο του όγκου, το στάδιο και τη διαφοροποίηση. Κατά συνέπεια, αυτές οι ερωτήσεις πρέπει να απευθύνονται ειδικά στις διάφορες οντότητες του όγκου. Επιπλέον, η ανταπόκριση των BGN σε θεραπευτικές παρεμβάσεις δεν έχει ερευνηθεί ακόμα. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογηθεί για πρώτη φορά την έκφραση και το ρόλο των BGN σε ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα όγκων

ανάλυση γονιδιακής έκφρασης εκτελούνται σε κατεψυγμένα δείγματα ιστών από 76 ασθενείς (19x pTa, 15x ρΤ1, 14x pT2, 14x ρΤ3 και 14x pT4), οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική θεραπεία, λόγω ουροφόρων καρκίνου της ουροδόχου κύστης στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο του Essen μεταξύ 1990 και 2004. Όλα τα δείγματα κατεψυγμένου ιστού ήταν κόβονται και χρωματίζονται με Η &? Ε για την επαλήθευση του περιεχομένου του όγκου τους. Μόνο δείγματα που περιέχουν ≥ κύτταρα του όγκου 70% υποβλήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Επιπλέον, 20 περιπτώσεις εμπεδωθεί με παραφίνη καρκινώματα ουροδόχου κύστης (4x pTa – pT4) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται τεκμηριωμένη έγγραφη συγκατάθεση και την Επιτροπή Δεοντολογίας του Νοσοκομείου ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης. Το κύριο καταληκτικό σημείο της μελέτης αυτής ήταν ο καρκίνος-συγγραφή fi γ επιβίωσης (εκτός από όλες τις άλλες αιτίες θανάτου). Αιτία θανάτου λήφθηκε από fi ποιητικών θάνατο πιστο. Τα υποκείμενα παρακολουθήθηκαν από την αρχική τιμή (ημερομηνία της χειρουργικής επέμβασης) έρευνα μέχρι τον Ιούλιο του 2009. Η κανονική ιστό της ουροδόχου κύστης ελήφθησαν από ασθενείς που πάσχουν από μη-κακοήθη νόσο (pyeloureteral στένωση, νευρογενή δυσλειτουργία της ουροδόχου κύστης) και υπηρέτησε ως έλεγχος για την ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης.

Ανοσοϊστοχημεία

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με βάση τα πρωτόκολλα που παρέχονται από τον κατασκευαστή. Για BGN ανοσοχρώση, οι τομές προκατεργάστηκαν με χονδροϊτινάση ABC για να εκθέσει τα επίτοπα της πρωτείνης πυρήνα BGN όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, η πέψη με chrondroitinase ABC διεξήχθη δια κατεργασίας των διαφανειών με χονδροϊτινάση ABC πριν από την επώαση με το πρωτεύον αντίσωμα σε 37 ° C για 1 ώρα. Τομές ιστού στη συνέχεια επωάστηκαν για 16 ώρες στους 4 ° C με αντι-BGN-IgG (1: 250 ευγενώς από Larry Fisher, Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής Έρευνας, National Institutes of Health, Bethesda, USA). Τμήματα με παράλειψη του πρωτογενούς αντισώματος χρησίμευσαν ως αρνητικοί έλεγχοι. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB). Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Leica

® σύστημα DM2000 και αντιπροσωπευτικές περιοχές όλων βάφονται πλάκες τεκμηριωμένες. Επιπλέον το ποσοστό των θετικών κυττάρων Κί67 ως δείκτη πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων προσδιορίστηκε σε ξενομοσχεύματος όγκους (κουνελιού αντι-Κί67 IgG, 1:25 Novus Biologicals, Ltd., Cambridge, UK). Η μέση πυκνότητα μικροαγγείων (MVD) προσδιορίστηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Εν συντομία, τουλάχιστον δύο ξεχωριστά τμήματα ιστού (10 μm) των 6 ποντικών σε κάθε ομάδα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας την κύρια κουνελιού πολυκλωνικό αντίσωμα CD31 (1:50, Abcam®, Cambridge, UK,) και δευτερεύον Alexa Fluor αντίσωμα αντι-κουνελιού κατσίκας 568 (1 : 200, Invitrogen, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Εικόνες από το σύνολο του τμήματος ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Zeiss Παρατηρητής Z1 με 10x στόχο. Στη συνέχεια, τρεις ιδιαίτερα vascularized τομείς 0,49 mm

2 επιλέχθηκαν για να μετρήσει τα πλοία. Κάθε ξεχωριστή CD31-θετικό σύμπλεγμα ενδοθηλιακών κυττάρων ξεχωριστά από τα παρακείμενα σκάφη ορίστηκε ως μικροαγγείων. Οι προκύπτουσες τιμές υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο για κάθε ποντικό.

Ανάλυση των εντάσεων χρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ImageJ 1,46 λογισμικού (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [26].

Αντίστροφη μεταγραφή ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (RT -qPCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από δείγματα όγκων flash-κατεψυγμένα χρησιμοποιώντας RNeasy ολικό RNA κιτ (Qiagen, Hilden, Germany). Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα αξιολογήθηκαν από φωτομετρική μέτρηση στα 260 /280nm. 1 μα RNA χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση cDNA με τη χρήση του QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Οι αντιδράσεις PCR διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Platinum® SYBR® Πράσινο qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) στο σύστημα PCR 7300 πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Το γονίδιο GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση της έκφρασης του γονιδίου-στόχου. Σχετικά επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCq μέθοδο. Οι ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν:. Ανθρώπινη BGN, εμπρός CTCCTCCAGGTGGTCTATCT, αντίστροφη GGTTGTTGAAGAGGCTGATG και τα ανθρώπινα GAPDH, εμπρός GTGAAGGTCGGAGTCAACG, αντίστροφη TGAGGTCAATGAAGGGGTC

καλλιέργειας κυττάρων

J82 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τυροσίνης υποδοχέα κινάσης αναστολείς sorafenib και sunitinib χρησιμοποιήθηκαν ως διάλυμα σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε μια συγκέντρωση 10 μΜ (sorafenib) και 1 μΜ (sunitinib) και DMSO χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 1×10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε δίσκους καλλιέργειας 6 φρεατίων (Sigma-Aldrich

®, Αμβούργο, Γερμανία) με αποτέλεσμα 60-70% συρροή των καλλιεργειών κατά την επόμενη ημέρα. Ακολούθως, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS, Gibco

®) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο άνευ ορού για 6 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και προστέθηκε μέσο που περιέχει 10% ορό και η αντίστοιχη αναστολέα κινάσης τυροσίνης υποδοχέα. 12, 24 και 48 ώρες μετά τη διέγερση το υπερκείμενο συλλέχθηκε και χρησιμοποιήθηκε για ανοσοκηλίδωση, ενώ τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση mRNA όπως περιγράφεται προηγουμένως [27]. Καθαρισμένη BGN (ανασυνδυασμένη ανθρώπινη BGN, R &? D Systems® GmbH, Wiesbaden, Γερμανία) προστέθηκε στην καλλιέργεια σε 0,01-1 μg /ml (0,26 – 26 ηΜ). σύνθεση DNA αναλύθηκε χρησιμοποιώντας [

3Η] -θυμιδίνης δοκιμασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Επιπλέον πειράματα για να προσδιοριστεί η επίδραση της BGN επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου διεξήχθησαν μετά την σπορά των κυττάρων σε 10.000 κύτταρα /3,9 cm

2 plusminus ανασυνδυασμένη BGN σε 2% ορό εμβρύου μόσχου, όπως ορίζεται παραπάνω. Μετά από 7 ημέρες ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας FACS και Flow-Count (Beckman Coulter, Krefeld, Γερμανία) ως εσωτερικό πρότυπο. Τρία ανεξάρτητα πειράματα, κάθε ένα από αυτά με έξι αντίγραφα.

ανοσοαποτύπωσης

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν και μεσαίου υπερκείμενα συλλέχθηκαν την ημέρα 7 μετά βραδέος ιού μεταγωγή (βλέπε παρακάτω). απομόνωση BGN και ανίχνευση με ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] χρησιμοποιώντας το LF159 αντίσωμα πολυκλωνικό BGN κουνελιού (1: 500, ευγενική προσφορά από τον Larry Fisher, Εθνικό Ινστιτούτο Οδοντιατρικής Έρευνας, National Institutes of Health, Bethesda, USA) ή αντι-BGN (1: 1000, Santa Cruz, Χαϊδελβέργη, Γερμανία). β-τουμπουλίνης ανιχνεύτηκε χρησιμοποιώντας το ab11323 αντίσωμα ποντικού αντι-β-τουμπουλίνης (1: 5000, Abcam®, Cambridge, UK). Η ποσοτικοποίηση επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα και το Σύστημα Οδύσσεια υπέρυθρη απεικόνιση (LI-COR Biosciences, Lincoln, USA). Χονδροϊτινάση ABC (0,4 U /δείγμα, Sigma-Aldrich®, Αμβούργο, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση GAG αλυσίδες όπως υποδεικνύεται. Μέσο που προέρχονται από ανθρώπινα στεφανιαία κύτταρα λείου μυός (Promocell, Heidelberg, Germany) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για BGN ανοσοστυπώματα.

λεντοϊών μεταγωγή

J82 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 60-70% συρροή. Για να knock-down BGN σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα J82 ουροδόχου κύστης, μικρή φουρκέτα RNA (shRNA) αλληλουχία στόχευσης BGN (προς τα εμπρός: 5’CCGGGAACATGAACTGCATCGAGATCTCGATGCAGTTCATGTTCTTTTTTG-3 ‘) στο φορέα pLKO.1 χρησιμοποιήθηκε (Sigma-Aldrich®, Αμβούργο, Γερμανία). Κωδικοποιημένα shRNA χρησιμοποιήθηκε για την ομάδα ελέγχου. Λεντοϊών BGN υπερέκφραση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. Παραγωγή φορέα, καλλιέργεια ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα (ΗΕΚ-293Τ), συγκομιδή του ανασυνδυασμένου σωματιδίων και λεντοϊού μεταγωγή ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων J82 urothelial διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως για βραδέος υπερέκφραση και knock-down γονιδίων μήτρας [16,26]. BGN πρωτεογλυκάνης υπερέκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το πλήρες cDNA της διγλυκάνη όπως αναφέρεται πριν από [16]. Για

in vivo πειράματα

κύτταρα J82 μετήχθησαν σε πολλαπλότητα μόλυνσης της τάξης του 1:10 για knock-down. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν την ημέρα 7 μετά βραδέος μεταγωγή και BGN knock-down ή υπερέκφραση επαληθεύτηκε με RT-qPCR πριν από την περαιτέρω λειτουργικές δοκιμασίες.

μοντέλο ξενομοσχεύματος

Αρσενικά NMRI nu /nu γυμνοί ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν για ξενομεταμόσχευση ανθρώπινων κυττάρων J82 όγκου και ανάλυση της αύξησης ξενομοσχεύματος όγκου. Κάθε ομάδα αποτελείτο από 6 ζώα. Τα κύτταρα (1×10

6 καρκινικά κύτταρα αιωρούνται σε 100 μΙ PBS) εγχύθηκαν αμφίπλευρα στα πλευρά κάθε ζώου. Στη συνέχεια, τα ζώα παρακολουθήθηκαν για 7 εβδομάδες. Μέτρηση του μεγέθους του όγκου διεξήχθη δύο φορές την εβδομάδα. Τα ζώα στη συνέχεια θυσιάζονται και καρκινικό ιστό, το ήπαρ και ο πνεύμονας συλλέχθηκαν. Κατεψυγμένες τομές παρασκευάζονται από όλα τα δείγματα όγκων για BGN χρώση, του πνεύμονα και του ήπατος τομές παρασκευάζονται για Η &? Χρώση Ε για αναζήτηση για μετάσταση. Η τοπική διευκόλυνση των ζώων, καθώς και η LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) ενέκρινε τα πειράματα σε ζώα και τα πρωτόκολλα για το χειρισμό και την παρακολούθηση.

Η στατιστική ανάλυση

δεδομένα γονιδιακής έκφρασης ήσαν αναλύθηκαν είτε με ανάλυση διακύμανσης και το post hoc δοκιμασία Bonferroni ή

t

δοκιμή Student όπως αρμόζει. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± S.E.M. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε στο επίπεδο του

σ

& lt? 0,05. Τα δεδομένα που αφορούν κλινικά αποτελέσματα από τις παραμέτρους του ασθενούς έλειπαν κανονική κατανομή, που δείχνει τη χρήση μη-παραμετρικές δίπλευρη δοκιμή Wilcoxon Rank Sum (Mann-Whitney) για ζεύγη συγκρίσεις ομάδας. Η ανάλυση των δεδομένων επιβίωσης των ασθενών διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας πρότυπο αλγόριθμο Kaplan-Meier (PROC LIFETEST, SAS-PC 9.3, SAS-Institute, Cary, USA). Για βέλτιστο διαχωρισμό των ομάδων σε σχέση με την σχετική έκφραση λέβα, μεταβλητά σημεία κοπής αξιολογήθηκαν και p-τιμές δοκιμασία log-rank καταγράφηκαν. Βέλτιστο διαχωρισμό των δύο ομάδων που αντιστοιχεί σε μία ελάχιστη τιμή ρ βρέθηκε σε σχετική αξία έκφραση BGN 0.09. Για την πολυμεταβλητή ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν αναλογικών κινδύνων κατά Cox μοντέλων παλινδρόμησης. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό στατιστικής ανάλυσης IBM® SPSS® (έκδοση 18.0, Chicago, IL, USA).

Ηθική δήλωση

Το πρωτόκολλο της μελέτης και η διαδικασία συναίνεσης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Duisburg-Essen, Γερμανία και κάθε ασθενής έδωσε γραπτή συγκατάθεση. Ο αριθμός του έργου ήταν 07 – 3537 για την αποθήκευση κατεψυγμένα και παραφινοποιήθηκαν υλικό του όγκου και των σχετικών κλινικών δεδομένων.

Τα πειράματα ποντίκια έγιναν σύμφωνα με τους κανόνες και τα πρότυπα της LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) και την τοπική διευκόλυνση των Ζώων του Heinrich-Heine-Universität του Ντίσελντορφ. Η LANUV ενέκρινε τα πειράματα και επιβεβαίωσαν τη συμμόρφωση των προτύπων ποιότητας. Το έργο αναγνωρίζεται από τον αριθμό 87-51.04.2010.A149.

Αποτελέσματα

έκφραση BGN mRNA σε ανθρώπινο καρκίνο της ουροδόχου κύστης

Πρώτον, τα δείγματα 76 ασθενών με διάφορα στάδια του καρκίνου της ουροδόχου κύστης αναλύθηκαν σε σχέση με την έκφραση BGN mRNA και σε σύγκριση με η έκφραση σε υγιή ιστό της ουροδόχου κύστης. Είναι ενδιαφέρον, σημαντικές διαφορές ανιχνεύθηκαν στα επίπεδα έκφρασης του mRNA σε σχέση με την διεισδυτικότητα όγκου (Σχήμα 1Α), την ταξινόμηση (Εικόνα 1Β) και στάσης (Σχήμα 1 C), υποδεικνύοντας αυξημένη BGN mRNA σε προοδευτικό στάδια του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Ωστόσο, παρά την θετική συσχέτιση με όγκο στάσης πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το επίπεδο έκφρασης BGN mRNA (

σ

= 0,155) δεν ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. Σε αντίθεση, το στάδιο του όγκου (

σ

= 0.012) και η εμπλοκή λεμφαδένα (

σ

= 0.039) ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για την ειδική για τον καρκίνο επιβίωση όπως αναμενόταν (Πίνακας 1). Επιπλέον, δεν υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης και του χρόνου BGN mRNA με την εμφάνισή της μετάστασης (

σ

= 0,862), την εξέλιξη της νόσου (

σ

= 0,624) ή την υποτροπή της νόσου (

p

= 0,142). BGN ήταν υψηλότερη στα δείγματα όγκου των θηλυκών σε σύγκριση με εκείνες των ανδρών (4,86-φορές έναντι 1,66 φορές του ελέγχου, αντίστοιχα,

σ

= 0,003) και σε καπνιστές σε σύγκριση με εκείνες των μη καπνιστών (3,40-φορές ? καπνιστές 2,01 φορές αντίστοιχα,

σ

= 0,008, Πίνακας 2)

BGN mRNA ερευνήθηκε σε 76 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης με RT-qPCR και σε σύγκριση με μη κακοήθη ιστό της ουροδόχου κύστης. . Μια σημαντική ανύψωση της έκφρασης mRNA BGN ανιχνεύθηκε σε διηθητικό σε σύγκριση με μη επεμβατικές όγκους (Α) και σε υψηλής ποιότητας σε σύγκριση με τους όγκους χαμηλής ποιότητας (Β). Επιπλέον, η έκφραση του mRNA BGN συσχετίζεται με την αύξηση το στάδιο του όγκου (Γ). n = 76 ασθενείς, *

σ

& lt?. 0.05, ***

σ

= 0,0003

Η ειδική για τον καρκίνο επιβίωση

μεταβλητές

HR

95% CI

σ

Στάδιο (μυϊκή επεμβατική) 1.4881.090-2.0300.012Grade (υψηλής ποιότητας) 2.1260.954-4.7400.065Lymphnodes (Ν +) 2.4001.045-5.5090.039BGN (υψηλής ) 0.9460.876-1.0210.155Table 1. στάδιο του όγκου και την κατάσταση των λεμφαδένων είναι ανεξάρτητος προγνωστικός παράμετροι για καρκίνο της ουροδόχου κύστης ειδικά επιβίωσης.

σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση Cox παλινδρόμησης αναλογικού επιβίωση κινδύνου σε n = 76 ασθενείς το στάδιο του όγκου και την κατάσταση των λεμφαδένων ήταν σε θέση να προβλέψει ειδική για τον καρκίνο επιβίωση ανεξάρτητα από άλλες παραμέτρους,

p-τιμές

& lt? 0,05 προσδιορίστηκαν ως σημαντικές. CSV CSV Κατεβάστε

Η γονιδιακή έκφραση BGN

P

valuesΣ = 76median (εύρος) Ηλικία ≤ 65 352,81 (0.06-24.33) 0,847 & gt? 65 n1.95 (0,06 – 8,28) Φύλλο Αντρας 591,66 (0,06 – 8,28) 0.003 Γυναίκα 174,86 (0,16 – 24,33) Στάδιο Ta 191.00 (0,13 – 4,01) 0,986 T1 151,06 (0,12 – 4,26) 0.512 Τ2 141,30 (0,06 – 5,53) 0.069 Τ3 143,78 (0,23 – 12,62) 0.909 Τ4 145,21 (0,24 – 24,33) μη επεμβατική 341,03 (0,12 – 4,26) 0.004 διηθητικό 423,37 (0,06 – 24,33) Βαθμολογία G1 130,76 (0,12 – 4,01) 0.919 G2 271,08 (0,13 – 4,26) 0.002 G3 363,80 (0,06 – 24,33) χαμηλής ποιότητας (G 1-2) 380,97 (0,12 – 4,26) 0.001 υψηλής ποιότητας (G 3) 373,76 (0,06 – 24,33) λεμφαδένων N0 /Nx622.05 (0,06 – 24,33) 0,196 Ν 143,66 (0,23 – 15,3) Primer 433,01 (0,12 – 24,33) 0.883Recurrent 331,44 (0,06 – 8,08) κάπνισμα ναι 422,01 (0,06 – 24,33) 0.008 καμία 233,40 (0,13 – 15,28) άγνωστη επίπεδα έκφρασης 18Table 2. BGN mRNA είναι αυξημένα σε μυών επεμβατικές όγκους, όγκους υψηλής ποιότητας, το κάπνισμα και οι ασθενείς γυναικείο φύλο. επίπεδα γονιδιακής έκφρασης

mRNA του n = 76 ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα δεδομένα ελήφθησαν από δείγματα όγκων flash-κατεψυγμένα. Μονοπαραγοντική Cox αναλογικών κινδύνων ανάλυση παλινδρόμησης επιβίωσης χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση δεδομένων, μια

σ

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως σημαντική. CSV Λήψη CSV

έκφραση πρωτεΐνης BGN σε ανθρώπινα καρκινώματα της ουροδόχου κύστης

BGN χρώση σε δείγματα όγκου ανθρώπου αποκάλυψε μόνο αμυδρά σήματα σε στρωματικό ιστό του μη επεμβατική Ta και όγκους Τ1 (Σχήμα 2Α). BGN ένταση χρώσης αυξήθηκε σε στάδια όγκου διηθητικό (Σχήμα 2Β και C). Όπως ήταν αναμενόμενο, η μορφολογία του όγκου σε επιφανειακές στάδια ήταν παρόμοια με την κανονική μορφολογία της κύστης με σαφή διαφοροποίηση μεταξύ των ιστών του όγκου και στρωματικό ιστό. Στα ανώτερα στάδια όγκου (Τ4), στρωματικά κύτταρα και καρκινικά κύτταρα αναμειγμένα και οι δύο τύποι κυττάρων έδειξαν συσχέτιση με BGN χρώση (Σχήμα 2Β και C). Ωστόσο, επειδή BGN είναι μία εκκρινόμενη πρωτεογλυκάνη η κυτταρική πηγή δεν μπορεί να συναχθεί από ανοσοχρώση των ιστών. Η ποσοτικοποίηση του κλάσματος θετική περιοχή επιβεβαίωσε την αυξημένη ένταση χρώσης των BGN σε στάδια όγκου διηθητικό (T2-4) σε σύγκριση με μη-επεμβατικές μυών Ta και τα στάδια Τ1 (Σχήμα 2D). Επιπλέον, ένας συσχετισμός της BGN κλάσματος θετική περιοχή και διεισδυτικότητα του όγκου ανιχνεύθηκε (

σ

= 0,0025, Σχήμα 2Ε).

Α – Γ, BGN ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε σε τομές ιστών εγκλεισμένα σε παραφίνη. (Α), Ta? (Β), Τ2? (C), Τ4. (D), ποσοτική ανάλυση εικόνας των λέβα σε μη επεμβατικές όγκους (Ta, T1) και τα στάδια του όγκου των μυών-επεμβατική (Τ2-Τ4). (Ε), η συσχέτιση της BGN κλάσμα θετική περιοχή με σταδιοποίηση του όγκου. n = 5 βιοψίες κάθε στάδιο του όγκου του ασθενούς, ***

σ

& lt? 0,0001, **

σ

= 0,0025

Η

αντιπολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα των BGN in. καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστεως

in vitro

η

Τα αποτελέσματα από δείγματα ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης πρότεινε ότι η έκφραση BGN σχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου. Για να αποκτήσετε μηχανιστικές γνώσεις, διερευνήθηκαν πιθανές επιπτώσεις της BGN για φαινοτύπου των κυττάρων του όγκου

in vitro

, όπως περιγράφεται παρακάτω. Πρώτον, μια ανοσοκηλίδα που εκκρίνεται BGN διεξήχθη από ρυθμισμένα μέσα της κυτταρικής γραμμής ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, J82 (Σχήμα 3Α). Όπως ανιχνεύεται στο δείγμα κυττάρων J82 χωρίς χονδροϊτινάση ABC πέψη BGN πρωτεογλυκάνης κυκλοφόρησε σε σχετικά μικρές ποσότητες εντός του μέσου. Επιπλέον, πρωτεΐνη πυρήνα BGN ανιχνεύθηκε σε αυτά τα δείγματα, καθώς και. Ως μάρτυρας για κύτταρα που εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες BGN πρωτεογλυκάνης, η ανοσοκηλίδα ρυθμισμένο μέσο που προέρχεται από ανθρώπινο στεφανιαίο αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα συμπεριλήφθηκε (δύο λωρίδες στα αριστερά). Η ανοσοκηλίδωση έδειξε περαιτέρω ότι η ανασυνδυασμένη BGN χρησιμοποιήθηκαν στα επόμενα πειράματα αποτελούνταν κυρίως από πρωτεΐνη πυρήνα επειδή οι λωρίδες δεν μετατοπίστηκε από χονδροϊτινάση ABC (Σχήμα 3Α) και τρέχει στο τυπικό μέγεθος για την πρωτεΐνη πυρήνα. Στη συνέχεια, η ανασυνδυασμένη διγλυκάνη πυρήνα πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε σε μια δοκιμασία πολλαπλασιασμού (Σχήμα 3Β). Η προσθήκη 0,26 – 26 ηΜ BGN πυρήνα (0,01-1 μg /ml) προκάλεσε μια δοσο-εξαρτώμενη αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα J82 (Σχήμα 3Β). Τέλος, να θέσει τη βάση για μια

in vivo

πείραμα ξένου μοσχεύματος και να διαλευκάνουν το ρόλο της ενδογενούς BGN, λεντοϊού knock-down της BGN διεξήχθη στην κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκίνου της ουροδόχου κύστης, J82. Είναι σημαντικό, knock-down της BGN προκάλεσε αυξημένο πολλαπλασιασμό (shBGN 1,39 ± 0,06 φορές του ελέγχου,

σ

& lt? 0.05), η οποία ανατράπηκε με την προσθήκη (2,6 nM) εξωγενών BGN (0.83 φορές του ± ελέγχου 0,06) (Σχήμα 3C). Η προσθήκη εξωγενούς BGN σε κύτταρα μεταδιεγείρονται με περιπλεγμένο shRNA προκάλεσε τάση να μειωμένο πολλαπλασιασμό. Στη συνέχεια, ο πολλαπλασιασμός προσδιορίσθηκε μετά την υπερέκφραση του ανθρώπινου BGN. Δωρεάν στο προ-πολλαπλασιαστική επίδραση μετά BGN knock-down, BGN υπερέκφραση οδήγησε σε σημαντική μείωση της σύνθεσης του DNA σε σύγκριση με το κενό φορέα ελέγχου (oeBGN, 0,50 ± 0,06 φορές του ελέγχου? PCL-1, 1,0 ± 0,09 φορές του ελέγχου, Εικόνα 3C).

(Α) Ανοσοκηλίδωση των BGN καθαρίστηκαν από ρυθμισμένα μέσα από κύτταρα ανθρώπινου J82 κύστη καρκίνωμα και του ανασυνδυασμένου BGN plusminus χονδροϊτινάση ABC πέψη. Ως μάρτυρας ρυθμισμένο μέσο από ανθρώπινα στεφανιαία αγγειακά κύτταρα λείου μυός (CASMC) χρησιμοποιήθηκε επειδή τα κύτταρα αυτά είναι γνωστό ότι εκκρίνουν μεγάλες ποσότητες BGN πρωτεογλυκάνης (αριστερά δύο λωρίδες). Χονδροϊτινάση ABC εφαρμόστηκε ως πρόσθετος έλεγχος (δεξιά λωρίδα) (Β) κύτταρα J82 επωάστηκαν σε χαμηλό ορό (2%) με αυξανόμενες ποσότητες ανασυνδυασμένων BGN και κυττάρων αριθμό προσδιορίστηκε με ανάλυση FACS μετά από 7 ημέρες? n = 3. Αντιπροσωπευτικά φως μικροσκοπικές εικόνες. κύτταρα (C) Ανθρώπινη J82 είτε lentivirally μετάγονται σε knock-down της έκφρασης BGN ή να υπερεκφράζουν την ανθρώπινη BGN. Οι αντίστοιχοι έλεγχοι ήταν κύτταρα μετάγονται με τα ανακατωμένα shRNA (SCR) ή κενό φορέα ελέγχου (PCL-1). Επιπλέον, η ανασυνδυασμένη BGN χρησιμοποιήθηκε. Εννέα ημέρες μετά την μεταγωγή, πολλαπλασιασμός προσδιορίστηκε όπως αποδεικνύεται από τη σύνθεση του DNA. Η BGN knock-down είχε ένα πολλαπλασιαστικό αποτέλεσμα που αντιστράφηκε με την προσθήκη ανασυνδυασμένης BGN (2,6 ηΜ = 100 ng /ml). Η υπερέκφραση της BGN οδήγησε σε μειωμένη σύνθεση DNA? n = 5, *

σ

& lt? 0,05.

Η

Νοκ-κάτω της BGN επιταχύνει την ανάπτυξη J82 ξενομοσχεύματος σε γυμνά ποντίκια

κυττάρων J82 μεταγωγή με shRNA στόχευση BGN και κωδικοποιημένα shRNA ήταν ξενο-μεταμόσχευσις σε nu /nu γυμνά ποντίκια για να ερευνηθεί η επίδραση της BGN κάτω ρύθμιση και

in vivo

. Μέτρηση του όγκου ξενομοσχεύματος όγκου αποκάλυψε σημαντική αύξηση της ανάπτυξης του όγκου στην ομάδα knock-down BGN σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με περιπλεγμένο shRNA 49 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων (ημέρα 49, shBGN 374,7 χιλιοστά

2 ± 82,8 mm

2, ομελέτα shRNA 204,2 χιλιοστά

2 ± 28,5 χιλιοστά

2, n = 6,

σ

& lt? 0.001, Εικόνα 4). Οι όγκοι ήταν σταθερή εμφάνιση χωρίς σημάδια νέκρωσης και μόνο μία από τις όγκοι στην ομάδα shBGN ήταν διηθούν τον περιβάλλοντα ιστό (στην περίπτωση αυτή οι κάτω πλευρά). Κανένας από τους όγκους της ομάδας ελέγχου ήταν διηθούν τον περιβάλλοντα ιστό. Δεν υπήρχε ορατή μεταστατικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων στον πνεύμονα και το ήπαρ όπως κρίνεται από την ιστολογική εξέταση. Επόμενο ανοσοϊστοχημική ανάλυση έδειξε ότι η χρώση BGN ακόμα μειώθηκε στο knock-down ομάδα BGN (λέβα κλάσμα θετική περιοχή στην ομάδα shBGN 10,82 ± 2,3% και 25,25 ± 2,4% σε ομελέτα ομάδα ελέγχου shRNA) μετά από 7 εβδομάδες (Σχήμα 5 Α-Γ). Είναι σημαντικό ότι, σύμφωνα με το

in vitro

δεδομένα που δείχνονται στο Σχήμα 3, ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων του όγκου αυξήθηκε μετά BGN knock-down, όπως αποδεικνύεται από κηλίδωση Κί67 σύγκριση με τον έλεγχο (Κί67 κλάσμα θετική περιοχή στην ομάδα shBGN 16.68 ± 2.1 % και 7,18 ± 1,2% στην ομάδα ελέγχου ομελέτα shRNA,

σ

= 0,005, σχήμα 5D-F). Όγκου αγγείωση δεν επηρεάστηκε, όπως αποδεικνύεται από χρώση CD31 (Σχήμα 5G-Ι).

Μετά knock-down της BGN στα ανθρώπινα κύτταρα J82

στο

vitro

τα μεταγωγή κύτταρα εγχύθηκαν αμφίπλευρα στα πλευρά γυμνών ποντικών και ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε επί μία περίοδο 7 εβδομάδων. Ως αποτέλεσμα, ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά υψηλότερη μετά την εφαρμογή των κυττάρων J82 μεταδιεγείρονται με shRNA στόχευση BGN σύγκριση με κωδικοποιημένο ελέγχου (375 mm

2 έναντι 204 mm

2)? n = 6, ***

σ

& lt? 0.001.

Η

Οι όγκοι ξενομοσχεύματος συλλέχθηκαν μετά από 7 εβδομάδες και υποβάλλονται σε επεξεργασία για ανοσοκηλίδωση και μορφολογική ανάλυση. BGN ανοσοχρώση και ανάλυση εικόνας έδειξε μειωμένη έκφραση BGN σύγκριση με κωδικοποιημένο ελέγχου (Α, Β). Το κλάσμα περιοχή της BGN θετική χρώση ήταν 25,3% σε ελέγχους έναντι 10,8% σε όγκους ξενομοσχεύματος που προέρχονται από κύτταρα shBGN, η = 6, **

σ

= 0,0087 (C). Στη συνέχεια, η πολλαπλασιαστική δείκτης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το αντιγόνο Κί67. Σε σύγκριση με τον έλεγχο (D) το ποσοστό του κλάσματος περιοχής του Κί67 θετικών κυττάρων ήταν σημαντικά αυξημένα σε όγκους που αποτελείται από shBGN σε μεταγωγή J82 κύτταρα (E, F? 7,2% έναντι 16,7%, η = 6, **

ρ

= 0,005). (GI) Η μέση πυκνότητα μικροαγγείων (MVD), όπως καθορίζεται από CD31 ανοσοχρώση δεν επηρεάστηκε στους όγκους ξενομοσχεύματος, n = 6.

Η

αναστολείς Multi-υποδοχέα τυροσινικής κινάσης επάγει BGN

Ο

in vivo

και

in vitro

δεδομένα που περιγράφονται ανωτέρω έντονα πρότεινε ότι BGN είναι ένας αναστολέας της ανάπτυξης σε καρκινικά κύτταρα ανθρώπινης κύστεως. Μέχρι σήμερα δεν έχουν καμία θεραπευτική ρυθμιστές της έκφρασης BGN στον καρκίνο έχουν περιγραφεί. Ως εκ τούτου, η επίδραση των μικρών μορίων αναστολέων της κινάσης τυροσίνης υποδοχέα επί της έκφρασης BGN διερευνήθηκε. Για το σκοπό αυτό οι αναστολείς κινάσης τυροσίνης πολλαπλών υποδοχέων, sorafenib και sunitinib, χρησιμοποιήθηκαν σε συγκεντρώσεις που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου της ουροδόχου κύστης (J82) κύτταρα [30-32]. μορφολογία των κυττάρων δεν επηρεάστηκε εντός 24 ωρών από τη θεραπεία με sorafenib και sunitinib. Αξίζει να σημειωθεί ότι η θεραπεία με sorafenib (10 μΜ) και sunitinib (1 μΜ) οδήγησε σε ισχυρή αυξητική ρύθμιση της έκφρασης mRNA BGN μετά από 24 ώρες (Σχήμα 6Α).