Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) παίζουν κρίσιμο ρόλο σε πολλές βιολογικές διαδικασίες και τα έκτροπα που εκφράζονται σε ανθρώπινους καρκίνους. Ιδιαίτερη λειτουργία miRNAs είτε ως καταστολείς όγκων ή ογκογονίδια και φαίνεται να έχουν διαγνωστική και προγνωστική σημασία. Αν και πολυάριθμες miRNAs είναι dys ρυθμίζονται σε καρκίνο του παχέως εντέρου (CRC) μόνο ένα μικρό κλάσμα έχει χαρακτηρισθεί λειτουργικά. Χρησιμοποιώντας υψηλής απόδοσης λειτουργικό έλεγχο και miRNA προφίλ των κλινικών δειγμάτων η παρούσα μελέτη αποσκοπεί στον προσδιορισμό miRNAs σημαντικό για τον έλεγχο της κυτταρικής ανάπτυξης και /ή την απόπτωση σε CRC. Η λειτουργική διαλογής υψηλής απόδοσης διεξήχθη σε έξι κυτταρικές γραμμές CRC επιμολυσμένα με ένα προ-miR βιβλιοθήκη συμπεριλαμβανομένων 319 συνθετικό ανθρώπινο προ-Mirs. Φαινοτυπική αλλοιώσεις αξιολογήθηκαν με ανοσοχρώση διασπάται cPARP (απόπτωση) ή MKI67 (πολλαπλασιασμού). Επιπλέον, TaqMan Ανθρωπίνων microRNA Array Ρυθμίστε v2.0 χρησιμοποιήθηκε στο προφίλ της έκφρασης των miRNAs 667 σε 14 φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου και 46 μικροδορυφορικού σταθερή φάση ΙΙ ασθενείς CRC. Μεταξύ των miRNAs που επάγονται διακοπή αύξησης και απόπτωση στις κυτταρικές γραμμές CRC, και ταυτόχρονα ήταν dys ρυθμίζονται στα κλινικά δείγματα, επελέγη miR-375 για περαιτέρω ανάλυση. Ανεξάρτητη

in vitro

ανάλυση παροδικής και σταθερής διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές CRC επιβεβαίωσε ότι miR-375 μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων μέσω της επαγωγής του αποπτωτικού θανάτου. Εντοπίσαμε YAP1 ως άμεσο στόχο miR-375 στο CRC και δείχνουν ότι HELLS και NOLC1 είναι στόχοι κατάντη. Νοκ-κάτω της YAP1 μιμήθηκε τον φαινότυπο που προκαλείται από miR-375 υπερ-έκφραση που δείχνει ότι το miR-375 πιθανότατα ασκεί προ-αποπτωτικό ρόλο της μέσω YAP1 και αντι-αποπτωτικών κατάντη στόχους BIRC5 και BCL2L1. Τέλος,

in vivo

ανάλυση των όγκων ξενομοσχεύματος ποντικού έδειξαν ότι miR-375 έκφραση μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η υψηλής απόδοσης διαλογή εντοπίστηκαν επιτυχώς miRNAs που επάγουν απόπτωση και /ή αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC. Τέλος, συνδυάζοντας τη λειτουργική προβολή με προφίλ των δειγμάτων ιστού CRC εντοπίσαμε κλινικά σχετική miRNAs και τους στόχους miRNA στην CRC

Παράθεση:. Christensen LL, Holm Α, Rantala J, Kallioniemi O, Rasmussen MH, Ostenfeld MS, et al. (2014) Λειτουργική Εξέταση Χαρακτηρίζει miRNAs Ώθηση απόπτωση και τον πολλαπλασιασμό στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (6): e96767. doi: 10.1371 /journal.pone.0096767

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 24 Ιούλη 2013? Αποδεκτές: 11 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 3 Ιούνη του 2014

Copyright: © 2014 Christensen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Ίδρυμα της Δανίας Εθνικό Advanced Technology, το Κοινωφελές Ίδρυμα Ιωάννη και Birthe Meyer, το Συμβούλιο της Δανίας για ανεξάρτητη έρευνα (Medical Sciences), το Συμβούλιο της Δανίας Στρατηγικών Ερευνών, το Ίδρυμα Lundbeck και έβδομο πρόγραμμα-πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης (SYSCOL ΥΓΕΙΑ-F5 -2010 – 258.236). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια κοινή κακοήθη ασθένεια και η κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο. Ο κίνδυνος ζωής είναι περίπου 5% και η αύξηση του [1]. CRC προκαλείται από την συσσώρευση πολλών γενετικών και επιγενετικών αλλοιώσεις. Χρωμοσωμική αστάθεια που οδηγεί σε αλληλόμορφες λογαριασμούς ανισορροπία για το 70-85% των όγκων, ενώ 20-15% έχουν ελαττώματα στην επιδιόρθωση του DNA αναντιστοιχία οδηγεί σε μικροδορυφορική αστάθεια. Οι μοριακές αλλοιώσεις στο CRC έχουν εντατικά μελετηθεί, προκειμένου να ανακαλύψουν διαγνωστικούς και προγνωστικούς δείκτες. Μεταξύ άλλων, το mRNA προφίλ έκφρασης έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί για την ταυτοποίηση διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με προγνωστικές και διαγνωστικές επιπτώσεις. Ωστόσο, προς το παρόν κανένα από αυτά έχουν μεταφραστεί σε κλινική πρακτική και, κατά συνέπεια, εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη για περαιτέρω μοριακό χαρακτηρισμό και την ταξινόμηση των CRC.

Τα microRNAs (miRNAs) αποτελείται από μια πλούσια κατηγορία των μικρών (19-24 nt), μη-κωδικοποίησης ρυθμιστικά μόρια RNA [2]. Παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο από συμπληρωματικά πρόσδεση του κλώνου miRNA με την αλληλουχία-στόχο mRNA, οδηγώντας είτε σε αποδόμηση του mRNA ή μεταφραστικά αναστολή [3]. Περισσότερο από το 60% όλων των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες περιέχουν συντηρημένες θέσεις πρόσδεσης miRNA και είναι έτσι δυνητικοί στόχοι της miRNAs [4]. έχουν miRNAs δειχθεί ότι εμπλέκεται σε πολλές βιολογικές διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, την απόπτωση, τη διαφοροποίηση και την αγγειογένεση [5] – [7]. Προς το παρόν, έχουν miRNAs δειχθεί ότι παίζουν σημαντικούς ρόλους σε πολλούς τύπους καρκίνων (ανασκόπηση από Γκαρθόν et al. [8]). Ο ρόλος των miRNAs στην ανάπτυξη του CRC έχει μελετηθεί εντατικά. Το 2006, Cummins και τους συναδέλφους δημοσίευσε την πρώτη λεπτομερή και συστηματική ανάλυση της έκφρασης των miRNAs στην CRC, που δείχνει επάνω και κάτω ρύθμιση των συγκεκριμένων miRNAs [9]. Έκτοτε αρκετές μελέτες έχουν επιβεβαιώσει την dys ρύθμιση των miRNAs σε CRC [10] – [15]. Παρ ‘όλα αυτά, οι γνώσεις μας για τη λειτουργία των επιμέρους miRNAs περιορίζεται σε ένα σχετικά μικρό αριθμό των miRNAs. Λειτουργικό έλεγχο έχει χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό miRNAs που έχουν αιτιακή σχέση με συγκεκριμένους φαινότυπους (επανεξετάζονται από Izumiya et al. [16]). Στο CRC, λειτουργική διαλογή έχει χρησιμοποιηθεί σε λίγες περιπτώσεις να προσδιορίσει miRNAs που επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του θανάτου [17], [18]. Ωστόσο, η μελέτη που εκπονήθηκε από Nakano et al. διεξήχθη σε μία μόνο κυτταρική σειρά και τα ευρήματά τους δεν συσχετίστηκαν με την έκφραση των miRNAs σε κλινικά δείγματα CRC. Τέλος, λειτουργικό έλεγχο εντόπισε κλινικά σημαντική miRNAs στην παγκρέατος και των όρχεων όγκοι των γεννητικών κυττάρων [19], [20].

Το αναγνώρισε διαγνωστικές και προγνωστικές δυνατότητες των miRNAs και η ανάγκη για περαιτέρω συστηματική λειτουργική ανάλυση των miRNAs στην CRC μας ενθαρρύνονται να συνδυάζουν υψηλής απόδοσης λειτουργικό έλεγχο με την έκφραση των miRNAs προφίλ σε κλινικά δείγματα. Η έκτοπη έκφραση της 319 miRNAs σε 6 διαφορετικές κυτταρικές σειρές CRC συνδυάστηκε με miRNA προφίλ έκφραση της 14ης φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου και του παχέος 46 όγκους. Οι αναλύσεις αυτές εντοπίζονται μια σειρά από miRNAs που φαίνεται να εκφράζονται διαφορικά σε CRC και να έχει αντίκτυπο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και /ή την απόπτωση

in vitro

. Μεταξύ αυτών επιλέχθηκε miR-375 για περαιτέρω

in vitro

και

in vivo

αναλύσεις, η οποία επιβεβαίωσε ότι το miR-375 μειώνει την ανάπτυξη του όγκου μέσω της επαγωγής της αποπτωτικό θάνατο. Για τον εντοπισμό δυνητικών miR-375 mRNA στοχεύει η έκφραση του miR-375 συσχετίστηκε με γονιδιώματος σε επίπεδο προφίλ έκφρασης του mRNA. ανάλυση συσχέτισης των δύο

in vitro

μοντέλο συστήματα και κλινικά δείγματα CRC αποκάλυψε ότι η έκφραση Ναι-πρωτεΐνης που συνδέεται με 1 (YAP1) σχετίστηκε αρνητικά με miR-375. Ago2 ανοσοκατακρήμνισης έδειξαν ότι YAP1 είναι ένας άμεσος στόχος του miR-375 στο CRC. Περαιτέρω λειτουργικές μελέτες έδειξαν ότι η προ-αποπτωτική ρόλος του miR-375 πιθανότατα διαμεσολαβείται από YAP1 και αντι-αποπτωτικά κατάντη στόχοι BIRC5 και BCL2L. Τέλος, λεμφικών ειδικά ελικάση (HELLS) και πυρηνισκικός και τυλιγμένο το σώμα πρωτεΐνης φωσφόρου 1 (NOLC1) ταυτοποιήθηκαν ως στόχοι προς τα κάτω ροή του miR-375 ενδεχομένως να παίζει ρόλο στην κυτταρικό κύκλο ρύθμιση μονοπάτια.

Υλικά και μέθοδοι

Μια πλήρης περιγραφή των υλικών και των μεθόδων που παρέχονται στο συμπληρωματικό υλικό (μέθοδοι S1).

Δήλωση Ηθικής

Η χρήση των δειγμάτων ανθρώπινου ιστού για ερευνητικούς σκοπούς εγκρίθηκε από το Διοικητικό συμβούλιο Έρευνας στο Walter και Eliza Hall Ινστιτούτο Ιατρικών Ερευνών HREC (Cohort 1 AUS? HREC Όχι 12/19), η Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Pomeranian (Cohort 1 POL? BN-001/174/05) , οι Κεντρικές Δανία Περιοχή επιτροπές Ιατροβιολογικών Ερευνών Δεοντολογίας (Cohort 1 DK? 1999/4678) και την περιοχή επιτροπές Νότιας Δανίας Βιοϊατρικής Έρευνας Ηθικής (Cohort 2 DK? VF-20040047). Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση δόθηκε από όλους τους συμμετέχοντες. Όλα τα πειράματα σε ζώα εγκρίθηκαν από την (αριθμός φακέλου: 2013-15-2934-00861 /ACHOV) Πειράματα σε ζώα Δανική Επιθεώρηση

Κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές

Cohort 1 αποτελούνταν από συνολικά 46 κατεψυγμένα μικροδορυφορικού σταθερό (MSS), πρωτογενές στάδιο ΙΙ (T2-4, N0, M0) CRCs και 14 φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου. Μια ανεξάρτητη ομάδα που αποτελείται από 25 φυσιολογικού βλεννογόνου του παχέος εντέρου και 63 MSS, πρωταρχικό στάδιο I-IV (T2-4, N0-3, M0 /1) CRCs (ομάδα 2) χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση. Οι ασθενείς και τα χαρακτηριστικά του δείγματος συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Οι κυτταρικές σειρές, συνθήκες ανάπτυξης και ταυτότητας κυτταρική γραμμή μπορεί να βρεθεί στο συμπληρωματικό υλικό (Μέθοδοι S1).

Η

Ζώα

BALB /cAnNTac -nude ανοσοποιητικό ανεπαρκή ποντίκια (6-8 εβδομάδων, 20-22 g) αγοράστηκαν από την Taconic Ευρώπη (DK-4623 Ll. Skensved, Denmark). Πριν από τα πειράματα, οι ποντικοί απέδωσε περίοδο προσαρμογής τουλάχιστον 14 ημέρες. Τα ποντίκια διατηρήθηκαν στις ίδιες συνθήκες (δηλαδή σταθερή θερμοκρασία δωματίου (22 ° C) και ένα φυσικό κύκλο ημέρας /νύχτας φως. Συνήθης εργαστηριακός τροφή και νερό παρέχονταν κατά βούληση.

Mirna λειτουργική οθόνη βιβλιοθήκης

Η τεχνολογία μικροσυστοιχιών κηλίδα των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία υψηλής πυκνότητας προ-miRNA μικροσυστοιχίες διαμόλυνση όπως περιγράφηκε προηγουμένως με ελάσσονες τροποποιήσεις [21]. Εν συντομία, μια βιβλιοθήκη που κατέχουν 319 συνθετικό ανθρώπινο προ-miRNAs (Ambion προ-miR v1.0) (Ambion , Austin, TX, USA) χρησιμοποιήθηκε για την εκτύπωση των συστοιχιών. Στη συνέχεια, τα κύτταρα CRC (HCT116, LS174T TR4, DLD1 TR7, ΗΤ29, Caco2 και SW480) σπάρθηκαν πάνω στις συστοιχίες και αντίστροφοι επιμολύνθηκαν για 48 ώρες. για να επιτραπεί μικροσκοπική ανίχνευση των αποτελεσμάτων προ-miRNAs επηρεασμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή /και της απόπτωσης των συστοιχιών ανοσοχρωματίστηκαν για Ki-67 (δείκτης πολλαπλασιασμού) και για διασπασμένου πολυ ΑϋΡ-ριβόζη πολυμεράση (cPARP) (δείκτης απόπτωσης). DNA χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας 4 ‘, 6 διαμιδινο -2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ή SYTO60 (Invitrogen). Η ανάλυση μικροσυστοιχιών εκτελέστηκε με μικροσκοπική απεικόνιση των συστοιχιών που χρησιμοποιούν scanR απεικονιστή υψηλή περιεκτικότητα (Olympus) και την επίδραση της miRNA υπερέκφραση σε απόπτωση και κυτταρικό πολλαπλασιασμό θεωρήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]. Εν συντομία, μετά την εξομάλυνση ένα z-score (z = (χ-μ) /σ) υπολογίστηκε για τη βαθμολόγηση των μετρούμενων τιμών spot. χ = κανονικοποιημένη τιμή επίπεδο σημείο, μ = παγκόσμια σειρά σημαίνει και σ = τυπική απόκλιση (SD)

RNA και την απομόνωση miRNA

Το συνολικό RNA (& gt? 200 βάσεις). απομονώθηκε από σφαιρίδια κυττάρου και δείγμα φρέσκου κατεψυγμένου ιστού χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα μικρά RNAs (& lt? 200 βάσεις) ανακτήθηκαν από το κλάσμα διερχόμενης ροής χρησιμοποιώντας RNeasy Micro Kit μαζί με τις στήλες RNeasy MinElute σπιν (Qiagen) (που περιγράφεται στο συμπληρωματικό υλικό (Methods S1)). Τα μικρά RNAs από το RNAlater διατηρημένα δείγματα ιστού απομονώθηκαν άμεσα χρησιμοποιώντας το RNeasy Micro Kit (Qiagen).

miRNA προφίλ σε κλινικά δείγματα

Το προφίλ έκφρασης miRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το στέλεχος βρόγχου ΚΤ- qPCR βάση TaqMan Ανθρωπίνων microRNA Array Ορισμός v2.0 όπως υποδεικνύεται από τον κατασκευαστή (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) [22]. Ο αλγόριθμος NormFinder χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει τα κατάλληλα γονίδια αναφοράς [23].

miRNA και mRNA RT-qPCR

Ενιαία σωλήνα TaqMan microRNA ή προσδιορισμούς mRNA (Applied Biosystems) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση μεμονωμένες ώριμη miRNAs ή mRNAs (λεπτομέρειες στο συμπληρωματικό υλικό (Μέθοδοι S1)). Η Applied Biosystems Δοκιμασία TaqMan ID και ο εκκινητής που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του mRNA του γονιδίου αναφοράς ουβικιτίνη C (UBC) απαριθμούνται στον Πίνακα S1 στο S1 File.

ΜΤΤ δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 -Λοιπόν πλάκες, αντίστροφη-επιμολυσμένα και επωάστηκαν για 72 ώρες με προ-Mirs ή siRNAs. Η βιωσιμότητα των κυττάρων /πολλαπλασιασμός μετρήθηκε χρησιμοποιώντας 3- [4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ] -2,5-βρωμιούχου διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) (Roche Applied Science, Penzberg, Γερμανία) (που περιγράφεται στο συμπληρωματικό υλικό (Methods S1)). Οι Applied Biosystems προ-miR και

σιλανσιέ

Επιλέξτε siRNA ταυτότητες και τις ακολουθίες του YAP1 siRNAs από GenePharma (Σανγκάη, Κίνα) παρατίθενται στον Πίνακα S2 σε S1 αρχείου.

δοκιμασίας LDH

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και αντίστροφοι επιμολυσμένα για 48 ή 72 ώρες με προ-Mirs ή siRNAs (Πίνακας S2 σε S1 File) (περαιτέρω λεπτομέρειες βρίσκονται στο συμπληρωματικό υλικό (Methods S1)). Στη συνέχεια, κυτταρικό θάνατο (δραστηριότητα LDH) μετρήθηκε με τη χρήση της ανίχνευσης κυτταροτοξικότητας Kit

PLUS (LDH) (Roche Applied Science).

κασπάσης 3/7 δραστηριότητα δοκιμασία

Η κασπάσης 3 /7 δοκιμασία δραστικότητας χρησιμοποιείται για να μετρηθεί αποπτωτικό θάνατο και εκτελείται κυρίως όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και ανάστροφης επιμολυσμένα με προ-Mirs ή siRNAs για 48 ώρες (Πίνακας S2 σε S1 File). Το 3/7 αναστολέας κασπάσης (Ζ-DEVD-fmk) (Biovision, San Francisco, CA, USA) προστέθηκε 6 ώρες μετά την επιμόλυνση (τελική συγκέντρωση 25 μΜ). Κασπάση 3/7 δραστικότητα σε προϊόντα λύσης κυττάρου, μετρήθηκε με την απελευθέρωση του AFC (διέγερση, 400 nm? Εκπομπή 489 nm) από το υπόστρωμα Ac-DEVD-AFC (Biomol, Plymouth Meeting, ΡΑ, USA), μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη πολλαπλών δίσκων ? Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Scientific).

Σύλληψη Laser μικροανατομίας

Capture Laser μικροανατομίας (LCM) διεξήχθη σε κρυοτομές από ζεύγη καρκίνο και γειτονικό φυσιολογικό βιοψίες βλεννογόνου του παχέος εντέρου (που περιγράφεται λεπτομερώς στο συμπληρωματικό υλικό (Μέθοδοι S1)). Τα επιθηλιακά κύτταρα συνελήφθησαν σε επιμέρους καλύμματα με το μικροανατομίας Μέσο Veritas 704 (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας κοπής υπεριώδους λέιζερ, σύμφωνα με τις οδηγίες που παρέχονται από τον κατασκευαστή.

Τα επίπεδα μεθυλίωσης MIR-375 σε κυτταρικές σειρές CRC και κλινικά δείγματα

Bisulfite τροποποιημένο DNA ήταν ολόκληρο το γονιδίωμα ενισχύεται και υβριδοποιήθηκε σε Infinium HumanMethylation450 BeadChips (Illumina, San Diego, CA) όλη τη νύχτα όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. BeadChips σαρώθηκαν με ένα όργανο BeadXpress Reader (Illumina) και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Στεφάνη Studio μεθυλίωση Ενότητα λογισμικού (Illumina). επίπεδα μεθυλίωσης δόθηκαν σε τιμές βήτα, με μια τιμή βήτα 0 αντιστοιχεί σε κανένα μεθυλίωση, και 1 αντιστοιχεί σε πλήρη μεθυλίωση. Τα αναγνωριστικά των θέσεων CpG σε άμεση γειτνίαση με

MIR-375

ήταν ως εξής CPG1? cg00215432, CPG2? cg00218620, CpG3? cg00705280, CpG4? cg02257674, CpG5? cg04348419, CpG6? cg06214770, CpG7? cg14358282, CpG8? cg21615583, CpG9? cg22306928, CpG10? cg01822124 και CpG11? cg26394220.

ChIP ανάλυση

Η ανάλυση ChIP διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται για να ενισχύσουν τις περιοχές DNA τσιπ που αναφέρονται στον πίνακα S1 στο S1 αρχείου.

Εντοπισμός πιθανών στόχων miR-375 βασίζεται στο προφίλ mRNA και

in silico

πρόβλεψη στόχο

το προφίλ mRNA του miR-375 επιμολυσμένα κύτταρα HCT116 και τα κλινικά δείγματα περιγράφονται στο συμπληρωματικό υλικό (Methods S1). Η θέση και ο αριθμός των miR-375 σειρές σπόρων (δηλαδή συμπληρωματικά στη θέση 2-8 του miRNA) εντός της αλληλουχίας πλήρους μήκους mRNA χαρτογραφήθηκαν χρησιμοποιώντας δεδομένα ακολουθίας που ανακτώνται από TargetScan v5.2 και Ensembl 62 βάσεις δεδομένων [26], [27 ].

ago2 ανοσοκατακρήμνιση

SCR και miR-375 επιμολυσμένων κυττάρων (-3.5 × 10

6) ξύστηκαν των φιαλών καλλιέργειας σε πάγο σε ήπιο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM TRIS ρΗ 7.5 , 10 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40, 2 mM EDTA συμπληρωμένο με αναστολέα RNase RNaseOut (Invitrogen) και Πλήρες κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης Mini (Roche)) και υπερτονικά λύθηκαν με αύξηση της συγκέντρωσης του NaCl σε 150 mM. Μετά από φυγοκέντρηση στους 4 ° C και 19.000 * g για 10 λεπτά συλλέχτηκε το υπερκείμενο και υποβλήθηκε σε ανοσοκαταβύθιση (10% χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο εισόδου) με επώαση με μονοκλωνικό αντίσωμα ago2 (11A9) (Sigma-Aldrich) -συνδεδεμένης Protein G-συζευγμένο μαγνητικά Dynabeads (τεχνολογίες ζωής) (15 mg 11A9 ανά 25 ml σφαιρίδια) μετά από τις συστάσεις του κατασκευαστή. Anti-FLAG ανοσοκαταβύθιση έγινε παράλληλα ως αρνητικός έλεγχος (F1804 αντίσωμα, Sigma). Τα σφαιρίδια πλύθηκαν 5 φορές σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης (50 mM TRIS ρΗ 7,5, 150 mM NaCl και 0.05% ΝΡ-40). Ολικό RNA από την είσοδο, ago2-IP και συγκροτήματα FLAG-IP καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας QIAZol (Qiagen).

Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση

Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση (ΜΠΒ), το λογισμικό (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να αποκτήσουν εικόνα για τις συνολικές βιολογικές αλλαγές που εισάγονται από την έκτοπη έκφραση των miR-375. Κανονικοποιημένα και φιλτραρισμένα δεδομένα mRNA είχαν ανεβάσει στο ΙΡΑ. Χρησιμοποιώντας την εφευρετικότητα Μονοπάτια της Γνωσιακής Βάσης (IPKB) κάθε γονίδιο που συνδέεται με συγκεκριμένες λειτουργίες, τις οδούς και τις ασθένειες καθώς και μια ανάλυση εμπλουτισμός έγινε εξέταση του κατά πόσον τα δεδομένα εμπλουτίστηκαν για τα γονίδια που σχετίζονται με μια συγκεκριμένη λειτουργία. ακριβής δοκιμασία του Fisher εφαρμόστηκε για να αξιολογηθεί η σημασία του εμπλουτισμού

εκχύλιση πρωτεϊνών και κηλίδωση Western

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση Western κηλίδωση πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με πρότυπες διαδικασίες (λεπτομέρειες στο συμπληρωματικό υλικό (Μέθοδοι S1) ).

Κατασκευή πλασμιδίων για την

δοκιμασία λουσιφεράσης δημοσιογράφος

Επιλεγμένα θραύσματα των 3’UTRs της κολάσεις (NM_018063) και NOLC1 (NM_004741) που περιέχει υποθετικό miR-375 θέσεις δέσμευσης ενισχύθηκαν από την κανονική ανθρώπινο γενωμικό DNA και κλωνοποιήθηκε κατάντι του

Renilla

γονίδιο λουσιφεράσης στο siCHECK-2 (Promega, Fitchburg, WI, USA). Επιλεγμένα κατασκευάσματα μεταλλάχθηκαν στην υποθετική περιοχή πρόσδεσης miRNA χρησιμοποιώντας QuickChange Lightning τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση Kit (Agilent Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχονται. Τα στοιχεία που παρέχονται στο συμπληρωματικό υλικό (Μέθοδοι S1) και οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση και κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση περιγράφονται στον πίνακα S3 στο S1 αρχείου.

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

κύτταρα ΗΕΚ-293Τ αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Glo σύστημα διπλών δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega) όπως περιγράφεται προηγουμένως [28] (λεπτομέρειες περιγράφονται στην συμπληρωματικό υλικό (Methods S1)). Η φωταύγεια ανιχνεύεται με έναν αναγνώστη πολλαπλών δίσκων? Multiscan MCC /340 (ThermoFisher Επιστημονική, Waltham, MA, USA). Η

ΚβηϊΙΙθ

δραστηριότητα της λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με το

Firefly

δραστηριότητα της λουσιφεράσης για κάθε επιμολυσμένα καλά, να διορθώσει τις διαφορές στην επιμόλυνση και η συγκομιδή της αποτελεσματικότητας.

Δημιουργία και χαρακτηρισμός των σταθερών HCT116 κυττάρων με επαγώγιμο miR-375 έκφραση

η παραγωγή σταθερών HCT116 κυττάρων με επαγώγιμη έκφραση του miR-375 περιγράφεται λεπτομερώς στο συμπληρωματικό υλικό (Methods S1). Αρχικά,

MIR-375

κλωνοποιήθηκε εντός της περιοχής 3 ‘UTR από το

turbo κόκκινο φθορισμό του γονιδίου της πρωτεΐνης

(TRFP) του φορέα pSBInducer10 (

MIR375

_pSBInducer10). Ο φορέας pSBInducer10 κατασκευάστηκε με αντικατάσταση λεντοϊού στοιχεία στον φορέα pINDUCER [29] με SleepingBeauty ανεστραμμένες τερματικές επαναλήψεις. Σταθερό πισίνες κύτταρο HCT116_miR-375 και HCT116_Scr δημιουργήθηκαν ως εξής. Πρώτον, 1.5 × 10

6 κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με pCMV-SB100XCO (διάνυσμα με τρανσποζάσης) και είτε

MIR375

_pSBInducer10 (HCT116_miR-375) ή

Scr

_pSBInducer10 (HCT116_scr). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση πουρομυκίνης (τελική συγκέντρωση 1 μg /mL) (Sigma) προστέθηκε για την επιλογή των σταθερά επιμολυσμένων κυττάρων. Η επιλογή πουρομυκίνη πραγματοποιήθηκε για 5 ημέρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μg /ml δοξυκυκλίνης (DOX) (Sigma) για 48 ώρες που οδηγεί σε μεταγραφική ενεργοποίηση του tRFP-

MIR375

κασέτα. Ο δείκτης φθορισμού TRFP χρησιμοποιήθηκε ως υποκατάστατο για την ταξινόμηση για κυτταρικών πληθυσμών που εκφράζουν το υψηλότερο επίπεδο miR-375 μετά από την επαγωγή της DOX. Εν συντομία, τα κύτταρα με την υψηλότερη στάθμη TRFP (100-1000 φορές πάνω από το επίπεδο αναφοράς σε μη επεξεργασμένα κύτταρα) (HCT116_miR-375H και HCT116_ScrH) απομονώθηκαν με φθορισμό ενεργοποιημένων κυττάρων (FACS) χρησιμοποιώντας ένα FACSAriaIII 4-λέιζερ (BD Biosciences, San Jose, CA) και χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις επόμενες αναλύσεις. Dox εξαρτάται από την έκφραση του ώριμου miR-375 στα κύτταρα HCT116_miR-375H αναλύθηκε χρησιμοποιώντας RT-qPCR όπως περιγράφεται νωρίτερα. Τα κύτταρα HCT116_miR-375H ήταν φαινοτυπικά χαρακτηρίζεται χρησιμοποιώντας xCELLigence (Roche Applied Science), κασπάσης 3/7 δοκιμασίες και YAP1 κηλίδωση Western (λεπτομέρειες στο συμπληρωματικό υλικό (Μέθοδοι S1)).

In vivo

ανάπτυξη του όγκου ανάλυση

HCT116_miR-375H κύτταρα (3.5 × 10

6 κύτταρα ανά ένεση) εναιωρήθηκαν σε 200 μΙ PBS και ενέθηκαν υποδορίως σε αριστερό πλευρό αναισθητοποιημένων ποντικών (n = 12) το. Οι ποντικοί διαιρέθηκαν σε δύο ομάδες με 6 ζώα σε κάθε: Ομάδα Α? miR-375 (+ DOX) και Ομάδα Β? ελέγχου (- DOX). Οι όγκοι μετρήθηκαν σε τακτά διαστήματα (μήκος και πλάτος) από τον ίδιο παρατηρητή. Για την επαγωγή της έκφρασης του miR-375, DOX (Vibradox Sandoz) (0,2 mg /ml) προστέθηκε στο πόσιμο νερό των ποντικών στην ομάδα Α, όταν οι όγκοι έφθασαν σε μέγεθος περίπου 50 mm

3. Τα ποντίκια στην ομάδα Β δόθηκαν συνηθισμένο πόσιμο νερό. Η θεραπεία DOX διεξήχθη επί 14 ημέρες. Τέσσερα ποντίκια ελήφθησαν από τη μελέτη πριν από τη θεραπεία DOX (δύο είχαν πολύ γρήγορα αναπτυσσόμενους όγκους και δύο είχαν όγκους που σταμάτησε να αυξάνεται), δηλαδή η = 4 στην ομάδα Α και Β Ο εκτιμώμενος όγκος του όγκου (EV) υπολογίστηκε ως EV = μήκος Χ (πλάτος)

2 × 1.2. EV σχεδιάστηκε έναντι του αριθμού των ημερών μετά την έναρξη της θεραπείας καμπυλών DOX και ανάπτυξη ξενομοσχεύματος παρήχθησαν.

Στατιστική ανάλυση

Η σημασία των αλλαγών έκφρασης miRNA αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Mann Whitney U στο πολλαπλών Πείραμα Viewer (MeV), το λογισμικό του αναλυτή array [30]. Η ιεραρχική ομαδοποίηση των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs έγινε χρησιμοποιώντας Gene Cluster 3.0 [31]. Μόνο, συμπεριλήφθηκαν miRNAs που εκφράζονται σε περισσότερο από το 80% των δειγμάτων. χάρτες θερμότητας δημιουργήθηκαν με Java TreeView [32]. το αταίριαστο φοιτητής

t-test

εφαρμόστηκε σε σύγκριση miRNA μεταβολές που προκαλούνται με τις αντίστοιχες ελέγχους στη δοκιμασία ΜΤΤ, προσδιορισμός LDH, δοκιμασία απόπτωση, ανάλυση RT-qPCR και

in vivo

ανάλυση της ανάπτυξης του όγκου. paired t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση RT-qPCR δειγμάτων μικροτομή ιστού. Ένα

σ

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

διαλογής υψηλής απόδοσης προσδιορίζει μια σειρά miRNAs που επάγει απόπτωση ή /και αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό σε CRC κυττάρων. γραμμές

για την αναγνώριση miRNAs με την πιο συνεπή επίδραση στην ανάπτυξη ή /και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων CRC πραγματοποιήσαμε μια διαλογή υψηλής απόδοσης σε έξι κυτταρικές σειρές CRC, χρησιμοποιώντας μια βιβλιοθήκη κατέχει 319 συνθετικό ανθρώπινο προ-miRNAs. Προ-miR επέφερε αλλαγές στα cPARP και Ki-67 χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιορίσουν miRNAs που επάγεται απόπτωση ή /και αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό, αντίστοιχα. Οι κατανομές των z-scores για κάθε προ-miR φαίνεται στο Σχήμα S1. Τα προϊόντα rank z-score χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της συνέπειας των προ-miRNA αποτελέσματα σε όλες τις δοκιμαζόμενες κυτταρικές σειρές CRC [33]. Το προϊόν κατάταξη είναι Top-40 προ-Mirs παρατίθενται στον Πίνακα S4 στο αρχείο S2 (αυξημένη cPARP) και στον Πίνακα S5 στο αρχείο S2 (μειωμένη Ki-67). Αρκετοί από το Top-40 κατάταξη miRNAs έχουν προηγουμένως αποδειχθεί ότι επηρεάζουν είτε την απόπτωση ή /και τον πολλαπλασιασμό

in vitro

(ένα υποσύνολο από αυτά παρουσιάζονται στον Πίνακα S6 στο S1 αρχείου).

miRNA προφίλ έκφρασης των κλινικών δειγμάτων

Για την αντιμετώπιση του

in vivo s

ignificance των miRNAs που προσδιορίζονται στο λειτουργικό διαλογής υψηλής απόδοσης εμείς προφίλ της έκφρασης των 667 μοναδικών miRNAs σε 14 κανονικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου και του ιστού δείγματα από 46 δείγματα CRC κλινικό στάδιο ΙΙ. Συνολικά, 53 miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ της κανονικής βλεννογόνου και CRC (Mann Whitney U test p≤0.01 και 1.5≤FC

(log2) ≤-1,5) (Σχήμα 1 και Πίνακας 2). Ένα υποσύνολο των 25 miRNAs έδειξαν αυξημένη έκφραση σε CRC όγκους σε σχέση με το φυσιολογικό βλεννογόνο ενώ 28 miRNA ήταν κάτω-ρυθμίζονται στους όγκους CRC. Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα του χαρακτηρισμού miRNA κλινικών δειγμάτων με τα αποτελέσματα της λειτουργικής διαλογής υψηλής εντοπίσαμε 10 miRNAs που εκφράζονται διαφορικά σε κλινικά δείγματα CRC και την ίδια στιγμή που επάγεται φαινοτυπικές αλλαγές στη λειτουργική διαλογής (Top-40 κατάταξη) (Πίνακας 2 και Πίνακας S6 σε File S1). Επιπλέον, οκτώ dys ρυθμιζόμενων miRNAs επαγόμενη φαινοτυπικές αλλαγές σε τουλάχιστον μία κυτταρική σειρά, αλλά δεν ήταν Top-40 κατετάγη (Πίνακας 2). Έντεκα από τα ανωτέρω miRNAs ήταν κάτω-ρυθμίζονται και ως εκ τούτου αυτά τα miRNAs είναι όγκου των υποψηφίων καταστολέα. Τέλος, 20 από τα dys ρυθμιζόμενων miRNAs δεν περιλήφθηκαν στην προ-miRNA βιβλιοθήκη από Ambion και ως εκ τούτου την ικανότητά τους να επάγουν φαινοτυπικές αλλαγές δεν μπορούν να αναλυθούν στην παρούσα μελέτη (Πίνακας 2). Εν κατακλείδι, εντοπίσαμε 11 miRNAs που κάτω-ρυθμίζονται σε δείγματα CRC και ταυτόχρονα προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό ή /και ανέστειλε την απόπτωση σε κυτταρικές σειρές CRC και ως εκ τούτου αυτά τα miRNAs είναι δυνητικά εμπλέκονται στην ογκογένεση του παχέος εντέρου.

Ιεραρχική ομαδοποίηση των miRNAs με σημαντική διαφορετική έκφραση μεταξύ του παχέος αδενοκαρκινώματα και φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου του παχέος εντέρου (p≤0.01). Οι σειρές αντιπροσωπεύουν μεμονωμένες miRNAs και οι στήλες αντιπροσωπεύουν μεμονωμένα δείγματα ιστού. Η κλίμακα αντιπροσωπεύει την ένταση της έκφρασης γονιδίου (κλίμακα log2 κυμαίνεται μεταξύ -2,98 και 2,98) (οι τιμές ρ και FCs βρέθηκε στον Πίνακα 2). Τα miRNAs που σημειώνονται με μπλε βρέθηκαν να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό και /ή επάγει απόπτωση στην οθόνη υψηλής απόδοσης (Top-40 κατάταξη miRNAs).

Η

Επικύρωση των φαινοτύπων που προσδιορίζονται στην υψηλής οθόνη διακίνηση

Για την επικύρωση των εντοπισμένων φαινοτύπους, τα miRNAs που κάτω-ρυθμίζονται σε κλινικά δείγματα και Top-40 κατετάγη στην οθόνη φαινότυπο (miR-150, miR-375, miR23b, miR-138, ΜΙΚ 139-5p και miR-9) υποβλήθηκαν σε λεπτομερή λειτουργική ανάλυση χρησιμοποιώντας HCT116, ΗΤ29, LS174T TR4, DLD1 TR7 και καρκινικές κυτταρικές σειρές SW480 του παχέος εντέρου. Έχουμε δημοσίευσε πρόσφατα μια λεπτομερή λειτουργική ανάλυση του miR-139-5p και ως εκ τούτου miR-139-5p δεν περιλαμβάνονται σε αυτές τις αναλύσεις [25]. Η έκτοπη έκφραση του miR-375, miR-9 και miR-138 μείωσε σημαντικά την βιωσιμότητα του περισσότερες από μία κυτταρική γραμμή (μείωση ΜΤΤ & gt? 20% και p ≤ 0,05) (Σχήμα 2Α (HCT116) και στο σχήμα S2), δυνατή λόγω σε ένα γενικό αντι-πολλαπλασιαστική ή προ-αποπτωτικών ρόλος αυτών των miRNAs. miR-150 και miR-23b μειωθεί μόνο τη βιωσιμότητα μιας κυτταρικής σειράς (DLD1 TR7). Μεταξύ των υπολοίπων miRNAs, miR-375 ταυτοποιήθηκε ως απόπτωση που προκαλεί miRNAs στην οθόνη υψηλής απόδοσης. Για την επικύρωση αυτή τη διαπίστωση, θα πραγματοποιηθεί LDH και κασπάσης 3/7 δοκιμασίες σε επιμολυσμένα κυτταρικές σειρές CRC. MiR-375 αυξήθηκε κασπάσης 3/7 δραστηριότητα και απέδειξαν συμπίπτει αύξηση του κυτταρικού θανάτου (απελευθέρωση LDH) και στα δύο HCT116 και DLD1 TR7 (Εικόνες 2Β και C, καθώς και το σχήμα S3). Επιπλέον, το αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από miR-375 μπορούσε να ανασταλεί με Ζ-DEVD-fmk (Caspase 3/7 αναστολέα) (Εικόνα 2D) αποδεικνύοντας ότι η απόπτωση που επάγεται εξαρτάται από δραστικότητα Caspase 3/7. Εν κατακλείδι, η ανάλυση επικύρωση επιβεβαίωσε την αντι-πολλαπλασιαστική ρόλο του miR-9 και miR-138, και την απόπτωση ικανότητα του miR-375 που προκαλεί, όπως προσδιορίζονται στην ανάλυση υψηλής απόδοσης. Οι παραπάνω miRNAs έχουν προηγουμένως δειχθεί ότι είναι dys ρυθμίζεται σε ανθρώπινους καρκίνους και για τη μείωση του πολλαπλασιασμού και /ή επάγει απόπτωση

in vitro

(Πίνακας S6 σε File S1). miR-375 και miR-138 δεν έχουν χαρακτηρισθεί λειτουργικά λεπτομερώς στο CRC. Τέλος, miR-375, επιλέχθηκαν miR-138 και miR-9 για περαιτέρω ανάλυση, λόγω ρύθμιση προς τα κάτω τους σε κλινικά δείγματα και την ικανότητά τους να προκαλείται από αλλαγές φαινοτυπική

in vitro

.

( Α) Κυτταρική βιωσιμότητα (ΜΤΤ δοκιμασία): τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ± sd. τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα το καθένα με τρεις βιολογικούς επαναλήψεις και ομαλοποιήθηκε ως προς Scr. * Τιμή p & lt? 0.05 και ΜΤΤ μείωση & gt? 20%. (Β) Κυτταρική θανάτου (δοκιμασία απελευθέρωσης LDH): Το κυτταρικό θάνατο εκφράστηκε ως ποσοστό της απελευθερωμένης LDH από το σύνολο των κυτταρικών LDH. Τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν και εκτελούνται εις τριπλούν. Το αποτέλεσμα από έναν εκπρόσωπο πειραμάτων ± SD. φαίνεται. * Τιμή p & lt? 0,05. (C) Επαγωγή της απόπτωσης (κασπάσης 3/7 δραστηριότητα): Η δράση της κασπάσης 3/7 στο λύμα προ-miRNA επιμολυσμένα κύτταρα εξετάστηκε με φθορομετρική κινητική ανάλυση και εκφράζεται σε σχέση με τη δράση της κασπάσης 3/7 σε «Scr« επιμολυσμένο κύτταρα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως ± sd. τουλάχιστον 2 ανεξάρτητα πειράματα το καθένα με τρεις βιολογικούς επαναλήψεις. * Τιμή p & lt? 0,05. (D) Αναστολή της miR-375 επαγόμενη απόπτωση από την κασπάση 3/7 αναστολέα Ζ-DEVD-fmk. Η δραστικότητα κασπάσης 3/7 μετρήθηκε όπως περιγράφεται στο (C). Ζ-DEVD-fmk (DEVD) (25 μΜ) προστέθηκε στα κύτταρα έξι ωρών μετά την διαμόλυνση. Μη κατεργασμένα κύτταρα (ΝΤ), Lipofectamine μόνο (Lipo) και προ-miR miRNA πρόδρομα μόρια-αρνητικού μάρτυρα # 1 (SCR) συμπεριλήφθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες σε όλες τις δοκιμασίες. Οι προ-miR-145 επιμολυσμένα κύτταρα συμπεριλήφθηκαν ως θετικός έλεγχος για την εκτέλεση της ανάλυσης ΜΤΤ. (Ε) Η προς τα κάτω ρύθμιση του miR-375 είναι ένα αποτέλεσμα της μειωμένης έκφρασης στα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. Έκφραση του miR-375 στην σύλληψη λέιζερ μικροτομή ορθοκολικό καρκινικό ιστό. Η έκφραση αναλύθηκε σε κύτταρα επιθηλιακών και στρωματικών από ζεύγη αδενοκαρκινώματα του παχέος (n = 3) και γειτονικό φυσιολογικό (n = 3) βιοψίες βλεννογόνου παχέως εντέρου LCM χρησιμοποιώντας RT-qPCR. Οι στήλες αντιπροσωπεύουν τη μέση έκφραση στα τρία δείγματα ± sd.

Η

Ανίχνευση του miR-375, miR-138 και miR-9 σε λέιζερ μικροτομή ορθοκολικό ιστό

Για να διευκρινιστεί η κυτταρική προέλευση του miR-375, miR-138 και miR-9, μετρήσαμε την έκφρασή τους σε λέιζερ δεν σταματούν αδενοκαρκινώματα του παχέος μικροτομή και γειτονικό φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (Σχήμα 2Ε και το σχήμα S4). Αυτές οι αναλύσεις έδειξαν ότι σε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου miR-375 εκφράστηκε σε υψηλότερο επίπεδο στα επιθηλιακά κύτταρα σε σύγκριση με στρωματικά κύτταρα (ρ = 0,02) (Σχήμα 2Ε). Ενώ στην αδενοκαρκίνωμα miR-375 εκφράστηκε σε συγκρίσιμα επίπεδα σε κύτταρα επιθηλιακών και στρωματικών (p = 0.27). Επιπλέον, miR-375 έκφραση σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ήταν σημαντικά υψηλότερη από την έκφραση σε επιθηλιακά κύτταρα από αδενοκαρκίνωμα (p = 0.03). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του miR-375 σε CRC είναι αποτέλεσμα της μείωσης στην έκφραση miR-375 σε επιθηλιακά κύτταρα του όγκου. miR-9 και miR-138 εκφράστηκαν κυρίως από στρωματικά κύτταρα τόσο από την κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου και αδενοκαρκινωμάτων (Σχήμα S4). Τα αποτελέσματα αυτά συμφωνούν με προγενέστερα δημοσιευθείσες προφίλ έκφρασης miRNA με λέιζερ-μικροδιατομή φυσιολογικό βλεννογόνο, αδενώματα και αδενοκαρκινώματα [34]. *

σ

& lt? 0,05.