Αφηρημένο

Γονιδιωματική και πρωτεομική ανάλυση των φυσιολογικών και καρκινικών ιστών έχει δώσει άφθονο μοριακό πληροφορίες για τους πιθανούς βιοδεικτών και θεραπευτικών στόχων. Λαμβάνοντας υπόψη πιθανά πλεονεκτήματα της προσβασιμότητας φαρμακολογική παρέμβαση, ο εντοπισμός των στόχων που κατοικούν στο αγγειακό ενδοθήλιο εντός όγκων είναι ιδιαίτερα ελκυστική. Χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία μάζας (MS) ως εργαλείο για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που υπερ-εκφράζεται σε όγκο ενδοθήλιο που σχετίζεται σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, στοχεύσαμε να ανακαλύψουν στόχους που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στη θεραπεία των όγκων του καρκίνου αγγειογένεση. Αναπτύξαμε πρωτεομική μεθόδους που μας επέτρεψε να εστιάσουμε τις μελέτες μας σχετικά με την ανακάλυψη του /εκκρινόμενων πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας, δεδομένου ότι αντιπροσωπεύουν βασικά θεραπευτικά και βιοδεικτών ευκαιρίες αντισώματος. Πρώτον, απομονώσαμε ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) από ανθρώπινο κανονικό και νεφρό καρκινικούς ιστούς με FACS χρησιμοποιώντας CD146 ως δείκτη. Επιπρόσθετα, διασκορπισμένα ανθρώπινου κόλον και ο καρκίνος του πνεύμονα ιστών και αντίστοιχοι φυσιολογικοί ιστοί τους καλλιεργήθηκαν

ex-vivo

και ενδοθηλιακά το περιεχόμενό τους ήταν προτίμηση επεκταθεί, απομονωμένη και ανακαλλιεργήθηκαν. κυτταρικής επιφάνειας πρωτεΐνες στη συνέχεια κατά προτίμηση συλληφθεί, σε πέψη με θρυψίνη και υποβλήθηκε σε πρωτεομική ανάλυση MS-based. Τα πεπτίδια πρώτα ποσοτικοποιούνται, και στη συνέχεια, οι αλληλουχίες των διαφορικά εκφρασμένων πεπτιδίων αναλύθηκαν με ανάλυση MS. Ένα σύνολο από 127 μοναδικό μη-επικαλυπτόμενα (157 συνολικά) του όγκου των ενδοθηλιακών κυττάρων υπερ-εκφραζόμενες πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν από άμεσα απομονωθεί των νεφρών που σχετίζονται με ECs και εκείνων που προσδιορίζονται από το

ex-vivo

καλλιεργημένων ιστών του πνεύμονα και του παχέος εντέρου συμπεριλαμβανομένων των γνωστών δεικτών ΕΚ όπως ως CD146, CD31, και VWF. Η έκφραση αναλύσεις ενός πάνελ των καθορισμένων στόχων επιβεβαιώθηκαν με ανοσοϊστοχημεία (IHC), συμπεριλαμβανομένων των CD146, B7H3, Thy-1 και ATP1B3. Για να προσδιορίσετε αν οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται μεσολαβήσει κανένα λειτουργικό ρόλο, πραγματοποιήσαμε μελέτες siRNA που οδήγησε στην προηγουμένως αγνώστων λειτουργική εξάρτηση για B7H3 και ATP1B3

Παράθεση:. Mesri M, Birse C, Heidbrink J, K McKinnon, Brand Ε, Bermingham CL, et al. (2013) Ταυτοποίηση και Χαρακτηρισμός αγγειογένεση Στόχοι μέσω πρωτεομικής προφίλ των ενδοθηλιακών κυττάρων στον ανθρώπινο καρκίνο ιστούς. PLoS ONE 8 (11): e78885. doi: 10.1371 /journal.pone.0078885

Επιμέλεια: Benedetta Bussolati, Κέντρο Μοριακής Βιοτεχνολογίας, Ιταλία

Ελήφθη: May 30, 2013? Αποδεκτές: 16, Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 13 Νοεμβρίου, 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα ακόλουθα συμφέροντα. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από και πραγματοποιήθηκε στο Celera, ο εργοδότης όλων των συγγραφέων κατά τη διάρκεια αυτών των μελετών. Celera έχει 3 εκδίδονται διπλώματα ευρεσιτεχνίας των ΗΠΑ να δηλώσει: 7.582.441, 8.110.373, και 8.334.106, περιγράφουν ενώσεις πρωτεΐνης βητα3 Na-K ATPase σε διάφορες κακοήθεις καταστάσεις. Δεν υπάρχουν προϊόντα στην ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η αγγειογένεση είναι η ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων από την προ-υπάρχοντες και είναι μια σημαντική φυσική διαδικασία που συμβαίνουν στο σώμα, τόσο στον τομέα της υγείας και στη νόσο. Κανονική φυσιολογική αγγειογένεση εμφανίζεται σε ενήλικες κατά την επούλωση των πληγών και του ενδομητρίου αναγέννηση κατά τη διάρκεια του έμμηνου κύκλου. Ωστόσο, η υπερβολική παθολογική αγγειογένεση μπορεί επίσης να προκύψει σε συνθήκες όπως στον καρκίνο, διαβητική τύφλωση, ηλικιακή εκφύλιση της ωχράς κηλίδας και χρόνιες φλεγμονώδεις καταστάσεις [1] – [3].

Από καιρό ήταν γνωστό ότι το ενδοθήλιο που συνιστούν τα αιμοφόρα αγγεία και τις γύρω στρώμα σε όγκους διαφέρει από αυτή σε φυσιολογικούς ιστούς, αλλά μόνο πρόσφατα οι διαφορές αυτές έχουν αρχίσει να χαρακτηρίζεται στο μοριακό επίπεδο [4], [5]. Αποκλεισμός παθολογικά αιμοφόρα αγγεία που σχετίζονται με τον καρκίνο και άλλες ασθένειες χρησιμοποιώντας αντιαγγειογόνα μέσα έχει γίνει ένα σημαντικό θεραπευτική στρατηγική. Επειδή η αγγειογένεση είναι απαραίτητη για κανονικές φυσιολογικές διεργασίες, οι δείκτες που μπορούν να διακρίνουν φυσιολογικά και της παθολογικής αγγειογένεσης που απαιτείται, προκειμένου να παραδώσει επιλεκτικά αντιαγγειογενή παραγόντων σε νοσούντες ιστούς ελαχιστοποίηση των πιθανών παρενεργειών.

πρωτεΐνες-στόχοι που βρίσκονται γύρω από τα αιμοφόρα αγγεία του όγκου και σε το στρώμα είναι ιδιαίτερα κατάλληλα για στοχευμένες αντικαρκινικές στρατηγικές ενόψει της προσπέλασης για ενδοφλέβια χορηγούμενο θεραπευτικά [4], [6]. Στρατηγικές για την ταυτοποίηση των δεικτών ενδοθηλιακού που σχετίζονται με όγκους περιλαμβάνουν

in vitro

ECs απομονώσεις εκτίθεται σε συνθήκες καλλιέργειας που μιμούνται εκείνες στις φυσιολογικών και καρκινικών ιστών [7], η παγκόσμια προφίλ της γονιδιακής μετεγγραφής [8], [9], η βιοπληροφορική ανάλυση των εκφρασμένων ετικετών αλληλουχίας [10],

in vivo στόχευση

τη χρησιμοποίηση του πεπτιδίου εμφάνισης φάγου βιβλιοθήκες [11], [12], διαδικασία επίστρωσης πυριτίας που ακολουθείται από απογύμνωση της μεμβράνης [13] και

in vivo

μέθοδοι βιοτινυλιώσεως [14].

Ένας τεχνικός περιορισμός στη μοριακή προφίλ των ΑΕΚ είναι ότι αντιπροσωπεύουν ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων στον ιστό. Έχουμε αναπτύξει μία μεθοδολογία για την εκχύλιση, την ταυτοποίηση και χαρτογράφηση μεγάλης κλίμακας της κυτταρικής επιφάνειας πρωτεώματος του μικροαγγειακό ενδοθήλιο όπως υπάρχει

in vivo

σε ανθρώπινο νεφρό όγκους και παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους. Η μεθοδολογία αυτή βασίζεται σε χρώση κυτταρομετρίας ροής των αγγειακών οργάνων με γνωστή δείκτες της ECS. Βαμμένα κύτταρα μπορεί να καθαριστεί αποτελεσματικά με ταξινόμηση κυττάρων. Μετά τη σύλληψη κυτταρικής πρωτεΐνης suface και τρυπτική πέψη, τα προκύπτοντα πεπτίδια πρωτεολυτική υποβλήθηκε σε υγρή χρωματογραφία – φασματομετρία μάζας (LC /MS), προκειμένου να προσδιοριστούν οι αντίστοιχες πρωτεΐνες. Μια συγκριτική ανάλυση των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται σε δείγματα ιστών μπορεί να αποκαλύψει διαφορές στην έκφραση σε διαφορετικά όργανα ή συνθήκες π.χ. κανονική έναντι του καρκίνου. Επίσης αναλύσαμε

ex-vivo

καλλιεργημένα κύτταρα που λαμβάνονται από τα καρκινικά και τα παρακείμενα φυσιολογικό ανθρώπινο πνεύμονα και του παχέος εντέρου μικροαγγειακή ενδοθηλιακά

Μέθοδοι

Χημικά και Υλικά |

Χημικά. αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Aldrich-Sigma (St. Louis, ΜΟ). στήλη POROS R2 (POROS R2 /10, 4,6 χ 50 mm) και στήλη POROS MC (2.1 × 30 mm, που στήλη IMAC) αγοράστηκαν από την Applied Biosystems (Framingham, ΜΑ) και στήλες HPLC αντίστροφης φάσης ελήφθησαν από την Vydac (Hesparia, CA). δοκιμασίες πρωτεΐνης DC αγοράστηκαν από την BioRad (Richmond, CA). Τροποποιημένο θρυψίνη αγοράστηκε από την Promega (Madison, WI). Αντισώματα έναντι CD146, CD31, CD45, EpCAM, CD105, CD62E, Thy-1 (CD90) και B7H3 (CD276) αγοράστηκαν από την BD Biosciences. Dil-Ac-LDL αγοράστηκε από την Biomedical Technologies Inc, ΜΑ.

επεξεργασία ιστών και φαινοτυπική χαρακτηρισμός

Ανθρώπινο νεφρού, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και γαστρικό ιστοί ελήφθησαν από εμπορικές πηγές λίγο μετά τη χειρουργική αφαίρεση. Εμπορικές πηγές περιλαμβάνουν Asterand (Detroit, MI, www.asterand.com) και BIOOPTIONS (Brea, CA, www.biooptions.com). Φυσιολογικό ιστό λήφθηκε από περιοχές & gt? 10 εκατοστά μακριά από το μεγαλύτερο μέρος του ιστού του όγκου που είχε σαφώς καθορισμένα περιθώρια. Οι ιστοί ζυγίστηκαν, κομμένο σε 1 κύβους εκατοστά με ψαλίδι, ξεπλένονται, και κιμά σε τεμάχια 1 mm. Ο ιστός ακολούθως επωάστηκε με τύπου Ι μέσον πέψη ιστού που περιέχει κολλαγενάση, υαλουρονιδάση, ϋΝάση Ι, CaCl

2, και δισπάση για μία ώρα στους 37 ° C με συνεχή ανάδευση. Οποιαδήποτε αχώνευτος ιστός διηθήθηκε μέσω πλέγματος 40-μm, και τα ερυθρά κύτταρα απομακρύνθηκαν με επώαση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης ACK για 5 λεπτά. ακολουθούμενη από κύτταρο πλύσεις και του αριθμού των κυττάρων. Κλάσματα του απλά εναιωρήματα κυττάρου βάφτηκαν με CD146, CD31, CD45, και EpCAM, για να προσδιοριστεί το προφίλ των ενδοθηλιακών, επιθηλιακών και διηθητικά λευκοκύτταρα. Το EpCAM αρνητική, CD146 θετικά ενδοθηλιακά περιεχόμενο του πληθυσμού κυττάρων Ακολουθεί η διαλογή και απομονώθηκαν από ένα διαλογέα κυττάρων MoFlo. Για κυτταρομετρία ροής, ECs βάφτηκαν με Thy-1 ή αντισώματα B7H3 (BD ​​Biosciences) ή ελέγχου, και η ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε ένα LSR I (BD Biosciences) κυτταρόμετρο ροής.

In vitro

καλλιέργεια κανονικών και όγκου κόλου και των πνευμόνων ECs

Δείγματα των εναιωρημάτων απλού κυττάρου από εμπορικώς λαμβάνεται (παραπάνω) κανονικό και όγκου κόλου και των πνευμόνων ιστοί παρασκευάστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Ο πληθυσμός των ενδοθηλιακών κυττάρων στη συνέχεια θετικώς επιλεγμένα χρησιμοποιώντας σφαιρίδια κυττάρων CD31 Endothelial Dynal ανά ένθετο του προϊόντος. Τα επιλεγμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε Τ-φιάλες με EGM της Lonza ™ -2-MV media. Αυτό το μέσο αυτό αναπτύχθηκε για να ενισχυθεί η ανάπτυξη των ενδοθηλιακών κυττάρων (Cambrex). Τα μέσα ανάπτυξης αλλάχθηκε κάθε 2-3 ημέρες έως ότου καλλιέργεια έφθασε 90-100%. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας της Lonza ReagentPack ™. Οι φιάλες πλύθηκαν με Hepes ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα που ακολουθείται από επώαση με θρυψίνη /EDTA για την απελευθέρωση των κυττάρων και ενός διαλύματος θρυψίνης εξουδετέρωσης. Η θετική επιλογή των ενδοθηλιακών κυττάρων επαναλήφθηκε για περαιτέρω καθαρισμό του πληθυσμού των ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα επιλεγμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε Τ-φιάλες με EGM της Lonza ™ -2-MV media. Αυτά τα πρωτογενή κύτταρα δεν οδήγησε σε δημιουργία κυτταρικών γραμμών και η περιορισμένη ικανότητα διαστολής τους παρέχεται επαρκής κύτταρα μόνο για να ολοκληρωθεί πειράματα που περιγράφονται εδώ.

κυτταρόλυμα και πεπτίδιο προετοιμασία

Τα καθαρισμένα ECs πλύθηκαν και επωάστηκαν με 1 mM υπεριωδικό νάτριο στους 4 ° C για 10 λεπτά για να οξειδωθεί γλυκοπρωτεΐνες [15]. Τα κύτταρα πλύθηκαν και ελέγχθηκαν για βιωσιμότητα. Τα κύτταρα ήταν μεγαλύτερες από 85% βιώσιμα όπως προσδιορίστηκε με αποκλεισμό ΡΙ χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει 0,05 Μ HEPES, ρΗ 7,0, 150 mM NaCl, 2% SDS, 5 mM EDTA, 0.5% ΝΡ40 και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma) με στροβιλισμό και διάτμηση μέσω μιας βελόνας 18-gauge. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε στη συνέχεια χρησιμοποιώντας DC κιτ αντιδραστηρίου δοκιμασίας πρωτεΐνης (BioRad, Hercules, CA). Οξειδωμένο γλυκοπρωτεΐνες στη συνέχεια συζευγμένο με υδραζίδιο ρητίνη (Bio-Rad) στους 4 ° C όλη τη νύκτα [16]. Μετά πλύση διαδοχικά με: 2 Μ NaCl, 2% SDS, 200 mM προπανολαμίνη (0.1 Μ NaOAc, ρΗ 5.5), 40% αιθανόλη και 80% αιθανόλη? δεσμευμένες πρωτεΐνες μειώθηκαν σε 2,5 mM διθειοθρεϊτόλη (DTT) (BioRad, Hercules, CA) για 1 ώρα στους 37 ° C και αλκυλιώθηκε με ICAT (φως μόνο «C0») σύμφωνα με τις διαδικασίες που συνιστώνται από τον κατασκευαστή (Applied Biosystems, Framingham, ΜΑ).

αλκυλιωμένα πρωτεΐνες υπέστησαν πέψη όλη την νύκτα στους 37 ° C χρησιμοποιώντας βαθμού αλληλουχίας, τροποποιημένη τρυψίνη (Promega, Madison, WI) με ένα λόγο ενζύμου προς υπόστρωμα 1:25. Πέψης θρυπτικού αφαλατώθηκαν χρησιμοποιώντας 3-cm3 Oasis HLB στήλες εκχύλισης στερεάς φάσης (Waters, Milford, ΜΑ) και ξηραίνεται υπό κενό.

κυστεΐνες και γλυκοπεπτίδια σύλληψη και δείγμα καθαρισμού

Τα πεπτίδια ανασυστάθηκαν σε ένα διάλυμα 10% ακετονιτρίλιο σε PBS. Τα πεπτίδια φορτώθηκαν πάνω σε μία στήλη αβιδίνης (2 mL, Applied Biosystems, Foster City, CA) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα όρασης σταθμό εργασίας (Applied Biosystems) με PBS. Η αβιδίνη στήλη πλύθηκε με διττανθρακικό αμμώνιο 50 mM (EMD, Gibbstown, NJ), 20% μεθανόλη, που ακολουθείται από μια πλύση με νερό. Μη-κυστεΐνη πεπτίδια που περιέχουν πλύθηκαν επί ενός /10 στήλη R2 (4,6 χ 50 mm, Applied Biosystems) με 5% ακετονιτρίλιο σε 0,1% TFA και εκλούσθηκε με το συλλέκτη κλάσματος με μια σταδιακή βαθμίδα έως 95% ακετονιτρίλιο, 0.1% TFA. Τα πεπτίδια που περιέχουν κυστεΐνη εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας 50% ακετονιτρίλιο, 0,1% TFA (Pierce, Rockford, IL), συλλέγεται, και ξηραίνεται υπό κενό. Συλλαμβάνονται ICAT-επισημασμένα πεπτίδια διασπάστηκαν όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο που παρέχεται από την Applied Biosystems. Η περίσσεια και διασπάται αντιδραστήριο ICAT απομακρύνθηκε χρησιμοποιώντας το ίδιο αβιδίνη /R2 καθαρισμού που περιγράφεται παραπάνω. Τα R2 /10 κλάσματα (πεπτίδια που περιέχουν κυστεϊνη) ξηραίνονται υπό κενό και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C πριν από την ανάλυση LC-MS.

Εκτός από το πεπτίδιο κλάσματος που περιέχουν κυστεΐνη, πεπτίδια δεσμεύονται στην ρητίνη ήταν επίσης συλλέγονται και αναλύονται. Απελευθέρωση των πεπτιδίων επιτεύχθηκε μέσω της πέψης PNGase-F (New England BioLabs, Ίπσουιτς, ΜΑ). Ενώ βρήκαμε κάποια επικάλυψη μεταξύ των πρωτεϊνών που προσδιορίζονται στα δύο κλάσματα, ανάλυση τόσο του κλάσματος που περιέχει κυστεΐνη και το κλάσμα δεσμευμένο σε ρητίνη οδήγησε σε συμπληρωματική κάλυψη του πληθυσμού πρωτεΐνη επιφανείας κυττάρου.

LC αντίστροφης φάσης /MS και LC /MS /MS

διαχωρισμό HPLC αντίστροφης φάσης πραγματοποιήθηκε σε ένα σύστημα Agilent 1100 (Palo Alto, CA) ρυθμισμένη σε ρυθμό ροής 2 μL /λεπτό. Το σύστημα ήταν εξοπλισμένο με μια προστήλη C18 για αφαλάτωση (50 mm Χ 0,15 mm), μία βαλβίδα μεταγωγής, και μία αναλυτική στήλη C18 (150 mm × 0,15 mm) για το διαχωρισμό πεπτιδίων. MS και MS /MS αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν σε ένα Q-Star φασματογράφο μάζας (MDS /Sciex, Τορόντο, Καναδάς). Ο χρόνος απόκτησης δεδομένων ορίστηκε σε 3 δευτερόλεπτα ανά φάσμα πάνω από ένα

m /z

εύρος από 400 έως 1500 Da για LC /MS αναλύσεις. Η τάση ψεκασμού ιόντων ορίστηκε στα 5,2 kV.

ταυτοποίηση πεπτιδίων και ποσοτικοποίηση

κορυφές ιόντων πεπτίδιο από τους χάρτες LC /MS ανιχνεύθηκαν σε σχέση με

λογισμικού TM (PPL, Ηνωμένο Βασίλειο), και ΜΑΣΚΩΤ (www.matrixscience.com) χρησιμοποιήθηκε για να αναζητήσετε MS /MS φάσματα για την ταυτοποίηση πεπτιδίων /πρωτεϊνών με μαζική βάση δεδομένων αλληλουχίας πρωτεΐνης φασματομετρία (MSDB, το Imperial College του Λονδίνου, Λονδίνο, Ηνωμένο Βασίλειο). κορυφές ιόντων πεπτίδιο LC χάρτες /MS από την κανονική και όγκου δείγματα ευθυγραμμίστηκαν με βάση μάζας προς φορτίο αναλογία (

m /z

), διορθωμένο χρόνο κατακράτησης (RT) και την κατάσταση φόρτισης (

z

). Οι εντάσεις των ιόντων σε κάθε χάρτη συγκρίθηκαν με τις μέσες εντάσεις των εν λόγω ιόντων σε όλα τα χάρτες για την ευθυγράμμιση. Ένας παράγοντας κανονικοποίησης δημιουργήθηκε (χρησιμοποιώντας ιόντα με μέσες εντάσεις στο 10

ου-90

ου εκατοστημόρια) για κάθε χάρτη, με τη χρήση χωρίς περιορισμούς μη γραμμικής βελτιστοποίησης, ελαχιστοποιώντας το άθροισμα των διαφορών μεταξύ εντάσεων κάθε ιόντος και την μέση ένταση για την εν λόγω ιόντων σε όλους τους χάρτες. Μετά ένταση ομαλοποίηση, πεπτίδιο ιόντα με διαφορική έκφραση μεγαλύτερη από 3 φορές μεταξύ όγκου και φυσιολογικών δειγμάτων χειροκίνητα επαληθεύονται πριν αλληλουχίας πεπτιδίων LC-MS /MS με βάση.

ανοσοϊστοχημεία (IHC)

Ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε με διάρκεια ζωής Biosciences επί ιστούς παραφίνης σταθεροποιημένο με φορμαλίνη χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες ιστό. Η συστοιχία αποτελείτο καρκίνος του ομογενούς καρκινικών κυττάρων. Οι ιστοί αποπαραφινοποιήθηκαν, και ανάκτηση αντιγόνου έγινε χρησιμοποιώντας EZ-Retriever (Biogenex, San Ramon, CA). Τα δείγματα προ-μπλοκαρίστηκαν με μπλοκ πρωτεΐνη μη-ορού (ϋΑΚΟ Α /δ, Carpinteria, CA) για 15 λεπτά. Αντίστοιχη πρωτοταγή αντισώματα επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου. Envision Plus σύστημα HRP (DAKO) χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση με 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη ως υπόστρωμα για δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Τα πλακίδια στη συνέχεια με το χέρι Ο ένας παθολόγος και βασίστηκαν σε (i) χρώση ένταση και (ii) τροποποιητές συχνότητα χρώση. Η αρνητική ένταση χρώσης ανατέθηκε το σκορ του «0», ρουζ χρώση βαθμολογία «1», αμυδρή χρώση ένα σκορ «2», μέτρια χρώση μια βαθμολογία των «3», και ισχυρή χρώση βαθμολογία των «4». Επιπλέον, όταν 0,1% έως 30% των κυττάρων έδειξαν θετική χρώση, η χρώση ποσοτικοποιήθηκε ως σπάνια ή περιστασιακή, 30% έως 75% των κυττάρων να παρουσιάζουν θετική χρώση ποσοτικοποιήθηκαν ως «πολλοί ή συχνή», και περισσότερο από 75% των κυττάρων χρώση θετικό χαρακτηρίστηκαν «πιο». Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε ως αντι-κηλίδας. Εκπρόσωπος εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας αντικειμενικά 40 Χ (400 Χ μεγέθυνση).

ανοσοφθορισμού

Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφαλικής φλέβας (HUVEC, Cambrex) αναπτύχθηκαν σε πλακίδια καλλιέργειας ιστών θαλάμου Lab-Tek. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 10 μg /ml Dil-Ac-LDL στους 37 ° C σε κανονικό μέσο για 4 ώρες. Το μέσο στη συνέχεια απομακρύνθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με ανιχνευτή-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης για 10 λεπτά, ξεπλύθηκαν με PBS, και στη συνέχεια μονιμοποιήθηκαν με 10% ρυθμισμένο με φωσφορικό φορμαλίνη για 5 λεπτά. Καλυπτρίδες τοποθετούνται πάνω από την πλάκα με μία σταγόνα από 10% PBS σε γλυκερίνη πριν από την προβολή.

Παρέμβαση RNA

Ατομική duplex συνθετικά siRNA ειδικό για B7H3 και ATP1B3, αγοράστηκαν από Dharmacon (Lafayette, CO). Για siRNA επιμόλυνση, HUVECs ή ανθρώπινα μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HMVECs, Cambrex) σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας ιστών 96 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο. Οι επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 και αντιδραστήριο Plus (Invitrogen) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Knockdown των επιπέδων mRNA B7H3 παρακολουθήθηκε με ποσοτική RT-PCR 1 ημέρα μετά την διαμόλυνση χρησιμοποιώντας TaqMan Gene Expression Assay (Applied Biosystems). mRNA έκφραση τοις εκατό για νοκ ντάουν επικύρωση υπολογίστηκε με τη μέθοδο της ΔΔCt [17]. RPLP0 χρησίμευσε ως το ενδογενές ελέγχου για την κανονικοποίηση για φορτίο πρότυπο, και κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητικό siRNA ελέγχου ήταν το δείγμα αναφοράς. Η ανάπτυξη των κυττάρων εκτιμήθηκε 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση χρησιμοποιώντας Alamar blue αντιδραστήριο (Invitrogen) και SPA-θυμιδίνης kit ενσωμάτωση από GE Healthcare (Piscataway, NJ). Κυτταρική απόπτωση μετρήθηκε με κασπάσης 3/7 κιτ δραστηριότητα από την Promega (Madison, WI).

Αποτελέσματα

Αξιολόγηση των ενδοθηλιακών περιεχομένου σε πολλούς τύπους καρκίνου

Για να αξιολογηθεί η σχετική περιεχόμενο ΕΚ όγκων σε πολλαπλές ενδείξεις τύπο καρκίνου, και μόνο τα κύτταρα που λαμβάνονται μετά την επεξεργασία του ιστού από όγκο και φυσιολογικό παρακείμενων ιστών από νεφρό, πνεύμονα, του παχέος εντέρου και του γαστρικού καρκίνου και αναλύθηκαν για παρουσία ΕΚ (Σχήμα 1). ECs Οι μπλεχτεί σε ένα σύνθετο ιστό που περιέχει ένα εξωκυτταρικό πλέγμα της μεταβλητής σύνθεσης και πολλαπλές μη endothelail κυτταρικούς τύπους όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και λευκοκύτταρα. Η αρχική μας προσπάθειες να καθαρίσει ECs εμπλέκονται αναγνώριση αντισώματος των συμβατικών γνωστών δεικτών κυτταρικής επιφάνειας ΕΚ συμπεριλαμβανομένων των CD31, CD105, CD146 και. Ωστόσο, CD31 αποδείχθηκε ότι είναι υποβέλτιστη λόγω της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας με αιμοποιητικά κύτταρα. CD105 επίσης μπορεί να εκφράζεται από ενεργοποιημένα μονοκύτταρα και επίσης αποδειχθεί υποβέλτιστες στην ανίχνευση όλων των πηγών ECs. Αντι-CD146 έδειξε μέγιστη αναγνώριση ΕΚ, όπως επιβεβαιώνεται από διπλή χρώση των CD31 και CD146 με FACS και θετική ακετυλιωμένη LDL (Dil-Ac-LDL) πρόσληψη με ανοσοκυτταροχημεία σε καλλιεργημένα ECs που προέρχονται από το παχύ έντερο και των πνευμόνων ιστών. Ως εκ τούτου, αντι-CD146 Ab χρησιμοποιήθηκε για την ΕΚ διαλογή, την απομόνωση, τον εμπλουτισμό και τη σχετική εκτίμηση του περιεχομένου ΑΕΚ καρκινικών ιστών. Οι αναλύσεις μας έδειξε ότι τα νεφρά ιστοί που περιέχονται το υψηλότερο ποσοστό (0,6 έως 33,1) του ECs (Σχήμα 2) που ακολουθείται από πνεύμονα (0,8 έως 7,2), κόλον (0,2 έως 5,1) και γαστρικών όγκων (0,2-1, που δεν φαίνεται στο σχήμα 2) . Συνολικά 46 συμφωνημένα όγκου και των παρακείμενων ιστών φυσιολογικό νεφρό αναλύθηκαν αντιπροσωπευτική όλων των τεσσάρων σταδίων του καρκίνου του νεφρού. Το περιεχόμενο του φυσιολογικό νεφρό ECs κυμαίνεται από 1.1-14.7% σε σύγκριση με 0,6 έως 33,1% σε καρκίνους νεφρού. Η αυξημένη περιεκτικότητα σε ECs όγκων του νεφρού ήταν επίσης εμφανής όταν συγκρίνεται με το καθένα να αντιστοιχεί συμφωνημένα φυσιολογικό γειτονικό ECs που υποδηλώνει ότι όγκος νεφρού ECs μπορεί να είναι πιο πολλαπλασιαστική σε σύγκριση με πιο ήρεμες φυσιολογικό γειτονικό ECs τους. Η τάση αυτή, ωστόσο, δεν ήταν εμφανής σε πνεύμονα και του παχέος εντέρου ιστούς. Επειδή ποσότητα πρωτεΐνης είναι ένας περιοριστικός παράγοντας για την ανάλυση MS, εμείς επομένως εκτελείται προσπάθεια ανακάλυψης μας σχετικά με τον καρκίνο των νεφρών που παρέσχε την υψηλότερη ανάκτηση ECs από τους ιστούς.

Β) Για την απομόνωση των καθαρών πληθυσμών ΕΚ από κολλαγενάση διεσπαρμένο ιστούς, η EpCAM αρνητικό, CD146 θετικό περιεχόμενο των ενδοθηλιακών του πληθυσμού κυττάρων διαλογή, απομονωμένο και εμπλουτισμένο με ένα διαλογέα κυττάρων MoFlo. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε LC-MS και ανίχνευση χαρακτηριστικό είτε άμεσα είτε έμμεσα μετά την επέκταση σε καλλιέργεια.

Η

Single κυττάρων μετά την επεξεργασία του ιστού από όγκο και φυσιολογικό γειτονικό από νεφρό, πνεύμονα, και οι ιστοί κόλου χρωματίστηκαν με αντι -CD146 Ab και αναλύθηκαν για την παρουσία ΕΚ.

Η

Η προετοιμασία των δειγμάτων και MS

ποιοτικού ελέγχου

Το έργο επικεντρώθηκε ανακάλυψη σχετικά με τους δείκτες που περιέχουν μικρή, tryptically-διασπαστεί 5-25 πεπτίδια αμινοξέων που κωδικοποιεί είτε ένα κατάλοιπο κυστεΐνης ή μία Ν-συνδεδεμένη θέση γλυκοζυλίωσης, παρέχοντας ευρεία κάλυψη του πρωτεώματος. Για την αξιολόγηση της καταλληλότητας του συστήματος MS, η εκτίμηση της αναπαραγωγιμότητας διεξήχθη για τον προσδιορισμό του ελάχιστου αξιόπιστο δείκτη των επιπέδων του πεπτιδίου /πρωτεΐνης για περαιτέρω ποσοτική ανάλυση. Που περιέχει κυστεΐνη πεπτιδίων από το θρυπτικό προϊόν πέψης εμπλουτίστηκαν με χρωματογραφία συγγενείας, και παράχθηκαν LC-MS χάρτες των πεπτιδικών μιγμάτων από δύο δείγματα. Στα πειράματά μας, η ετικέτα ICAT (φως μόνο) υπηρέτησε ως λαβή για να τραβήξετε έξω κυστεΐνη που περιέχει πεπτίδια, απλοποιώντας έτσι το μίγμα πεπτιδίων. Ενώ τα δείγματα που αναλύθηκαν τεχνικώς περιέχουν μια ετικέτα, η ανάλυση μας είναι ουσιαστικά αυτό που είναι γνωστό ως μέθοδος «ετικέτα-free» στην εν λόγω περιοχών κορυφής πεπτιδίου ιόντων από ένα συγκεκριμένο δείγμα και LCMS χάρτης συγκρίνονται με εκείνα από ένα διαφορετικό δείγμα και LCMS χάρτη για τη σχετική ποσοτικοποίηση. Έτσι ονομάζουμε πειράματα μας «αποσυνδεδεμένες», που σημαίνει ότι τα επισημασμένα δείγματα δεν συνδυάζονται σε μία ανάλυση φασματομετρίας μάζας όπως γίνεται τυπικά σε μία ροή εργασίας ICAT ή την επισήμανση. Οι κατάλογοι χαρακτηριστικό του, για παράδειγμα, Normal επαναληπτικές 1 και Κανονική επαναληπτικές 2 ευθυγραμμίστηκαν για να δημιουργήσει ένα πλέγμα ένταση. Σύκο. 3 δείχνει το διάγραμμα διασποράς των log2 μετασχηματισμένη εντάσεις (log2 Int) από τα κοινά χαρακτηριστικά στις αποσυνδεδεμένες πειράματα (αναπαράγουν 1 vs αναπαράγουν 2). υπολογίστηκαν αναλογίες log2 (λόγος = ένταση ιόντων στο δείγμα 1 /ιόντων ένταση σε δείγμα 2) του συνόλου των κοινών χαρακτηριστικών. Τα συνοπτικά στατιστικά στοιχεία εμφανίζονται με τη boxplot διάγραμμα. Για τη διανομή αναλογία των αποσυνδεδεμένων επαναλήψεις, 2SDUL (ανώτερο όριο του 2 τυπικές αποκλίσεις (SD) από τη μέση τιμή), 2SDLL (κατώτερο όριο του 2SD από τη μέση τιμή), και μέσες τιμές σε γραμμική κλίμακα παρουσιάζονται στο Σχ. 3. Η εκτίμηση αυτή αναπαραγωγιμότητα αναφέρεται ότι για επανάληψη των πειραμάτων (Normal ή όγκου) το 95% του συνόλου των κοινών χαρακτηριστικών έχουν εντάσεις εντός περίπου 2-πλάσια διαφορά. Ως εκ τούτου, οποιαδήποτε διαφορά στην αναλογία έκφρασης που είναι & gt? 2-φορές μπορεί να θεωρηθεί ως εκφράζονται διαφορικά με επίπεδο εμπιστοσύνης 95%. Σε αυτή τη μελέτη, ωστόσο, λόγοι που ήταν & gt? 3 φορές θεωρήθηκαν ως διαφορικά εκφρασμένων

Scatter οικόπεδα κοινά χαρακτηριστικά από το κανονικό και όγκου δείγματα και διαφορική ανάλυση με τη χρήση αποσυνδεδεμένης χάρτες εμφανίζονται.. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης προσδιορίζεται από την ευθυγράμμιση του πεπτιδίου χαρακτηριστικά ιόντων από διαφορετικά πειράματα MS (LC /MS χάρτες). Οι εντάσεις log2 κοινά χαρακτηριστικά ανιχνεύονται στην διεργασία (Α) επαναλήψεις του δείγματος ελέγχου? (Β) διαδικασία αναπαράγει του δείγματος όγκου? (C) ελέγχου έναντι δείγματα όγκων σχεδιάζονται. Η αντίστοιχη Θηκόγραμμα (σε κλίμακα log2) της διανομής αναλογία για κάθε σύνολο δεδομένων εμφανίζεται δίπλα από το οικόπεδο διασποράς. Το κουτί περιλαμβάνει το 50% των χαρακτηριστικών, όπου το 95% από τα χαρακτηριστικά είναι εντός των οριζοντίων ράβδων. (Δ) Η επικράτηση γνωστών πρωτεϊνών επιφάνειας ΕΚ ερευνήθηκε και οι εκπρόσωποι της περιόδου αυτής.

Η

Heat χάρτη της παγκόσμιας ανάλυσης πεπτιδίου στο ανθρώπινο ενδοθήλιο των νεφρών όγκου

Ένα σύνολο 6 όγκων και 2 φυσιολογικό γειτονικό δείγματα νεφρού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για όγκου σε σχέση υπερέκφραση ανάλυση. Συνολικά /εκκρινόμενων πρωτεϊνών 74 κυτταρικής επιφάνειας αναγνωρίσθηκαν με MS με τουλάχιστον 3 φορές υψηλότερη ένταση στο νεφρό που σχετίζονται με όγκους ενδοθήλιο σύγκριση με το κανονικό ενδοθήλιο.

Οι σειρές heatmap ταξινομήθηκαν από την αναλογία της μέσης έντασης στο δείγματα όγκων με τη μέση ένταση των κανονικών δειγμάτων. Ο χάρτης θερμότητα παρουσιάζει την ανάλυση των 233 κυστεΐνη πεπτιδίου που περιέχει εντάσεις που προσδιορίζονται στο ενδοθήλιο των νεφρών και του όγκου ταξινομούνται έτσι ώστε οι πιο διαφορικά-εκφρασμένα πεπτίδια είναι στην κορυφή (Σχήμα 4). Σειρές συμπεριλήφθηκαν μόνο αν υπήρχε τουλάχιστον μία αναγνώριση MS /MS ενός ιόντος στη σειρά. Τα χρώματα της οθόνης προσδιορίσθηκαν για κάθε σειρά ξεχωριστά αναθέτοντας το μαύρο στο διάμεσο ένταση στη σειρά, πράσινο για τη χαμηλότερη ένταση στη σειρά, και το κόκκινο στην υψηλότερη ένταση. Σε σειρές με μια μέση τιμή μηδέν, οι μηδενικές τιμές που εμφανίζονται ως μαύρα. Παραδείγματα αναγνωρισμένων πρωτεϊνών απεικονίζονται στο χάρτη θερμότητα.

Ο χάρτης θερμότητας παρουσιάζεται η ανάλυση του πεπτιδίου εντάσεις για τις 233 πεπτίδια που προσδιορίζονται στο ενδοθήλιο των νεφρών και του όγκου ταξινομούνται έτσι ώστε οι πιο διαφορικά-εκφρασμένα πεπτίδια είναι στην κορυφή. Τα χρώματα της οθόνης προσδιορίστηκαν για κάθε γραμμή ξεχωριστά αναθέτοντας το μαύρο με τη μέση ένταση στη σειρά, πράσινο στη χαμηλότερη ένταση στη σειρά, και το κόκκινο με την υψηλότερη ένταση.

Η ανάλυση

MS πρωτεϊνών με αυξημένη έκφραση σε

in vitro

καλλιεργημένα ανθρώπινα παχέος εντέρου και του πνεύμονα όγκου ενδοθήλιο

Εμείς καλλιεργήθηκαν περαιτέρω και να επεκταθεί φυσιολογικά και καρκινικά ενδοθηλιακά

in vitro

από ενδείξεις τύπο καρκίνου που δεν παράγει επαρκή ενδοθηλιακά πρωτεΐνες από την άμεση

in vivo

απομόνωσης για MS ανάλυση. Οι ενδείξεις αυτές περιλαμβάνονται καρκίνοι του παχέος εντέρου και του πνεύμονα. Ταυτότητα αυτών των κυττάρων ως ECs επιβεβαιώθηκε με διπλή χρώση των CD31 και CD146 με FACS και θετική πρόσληψη Dil-Ac-LDL με ανοσοκυτταροχημεία (Σχήμα 5). Αυτά τα κύτταρα ήταν αρνητικά για έκφραση άλφα ακτίνης, ένα τυπικό δείκτη των λείων μυϊκών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον, μόνο ένα κλάσμα (20-30%) του

in vitro

καλλιεργημένα ECs που προέρχονται από πνεύμονα και του παχέος εντέρου όγκοι χρωματίστηκαν για πρόσληψη Dil-AC-LDL με ανοσοκυτταροχημεία (δεν φαίνεται), παρά τη θετική τους έκφραση CD31 και CD146 όπως παρατηρήθηκε με FACS (Σχήμα 5β). Αντίθετα, όλο το

in vitro

καλλιεργημένα ECs που προέρχονται από φυσιολογικό πνεύμονα και του παχέος εντέρου χρωματίζονται για πρόσληψη Dil-AC-LDL με ανοσοκυτταροχημεία (Σχήμα 5α) και χρωματίστηκαν θετικά για CD31 και CD146 όπως παρατηρήθηκε με FACS (Σχήμα 5Β ). Αυτό μπορεί να υποδεικνύει ότι ο όγκος ECs μπορεί να διαφέρει φαινοτυπικά από την κανονική τους ομολόγους τους. Συνολικά /εκκρινόμενων πρωτεϊνών κυτταρικής επιφάνειας 56 του παχέος εντέρου και του πνεύμονα 27 ταυτοποιήθηκαν με & gt?. 3 φορές υπερ-έκφραση με MS σε όγκο ενδοθήλιο που σχετίζεται σύγκριση με τα φυσιολογικά

(Α) έντονος φθορισμός στικτή καταδεικνύοντας την πρόσληψη με Dil-Ac-LDL σε φυσιολογικό πνεύμονα μικροαγγειακή ECs. (Β) Καλλιεργημένα φυσιολογικών και καρκινικών ιστών ECs που προέρχεται από το παχύ έντερο και πνεύμονα χρωματίστηκαν με ΕΚ ειδικών δεικτών CD146 και CD31, και υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής.

Η

Μια περίληψη των ECs ανακάλυψη στόχου και στις τρεις καρκίνο Τύπος ενδείξεις παρουσιάζεται στον πίνακα 1. Ένα σύνολο 127 μοναδικό μη-επικαλυπτόμενα (157 συνολικά) του όγκου των ενδοθηλιακών κυττάρων υπερ-εκφραζόμενες πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν από άμεσα απομονώνονται νεφρό που σχετίζονται με ECs και εκείνες που προσδιορίζονται από το

ex-vivo

καλλιεργημένα πνεύμονα και τους ιστούς του παχέως εντέρου. Η ανάλυσή μας έδειξε ότι από πρωτεΐνες εντοπίζονται, 4 πρωτεΐνες επικαλύπτονται σε όλους τους τρεις τύπους καρκίνου? 17 πρωτεΐνες επικαλύπτονται μεταξύ νεφρού και του παχέος εντέρου? 9 πρωτεΐνες επικαλύπτονται μεταξύ των νεφρών και των πνευμόνων? και 8 πρωτεΐνες επικαλύπτονται μεταξύ του πνεύμονα και του κόλου. Ο κατάλογος των MS προσδιορίζονται στόχους, την πηγή τους ιστούς του λόγου ανίχνευσης και έκφραση απεικονίζεται στον Πίνακα S1. Κατά την ανάλυση υπερ-εκφρασμένων πρωτεϊνών, εντοπίσαμε γνωστές δείκτες ECs συμπεριλαμβανομένων VWF (5 φορές πάνω από το κανονικό, μέγιστη αναλογία), PECAM (CD31, 36-φορές), CD36 (16 φορές), και MCAM (CD146, 15 φορές).

η

Target επικύρωση

για να επικυρώσετε τις πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από τα κράτη μέλη, είχαμε διενεργήσει επιπρόσθετες επιβεβαιωτικές μελέτες συμπεριλαμβανομένης ανοσοϊστοχημείας (IHC), κυτταρομετρία ροής και μεσολάβηση RNAi επίδραση στον πολλαπλασιασμό ΕΚ και /ή την απόπτωση σε ένα υποσύνολο των πρωτεϊνών που είχαν επιλεγεί με βάση κριτήρια όπως druggability των πρωτεϊνών με αντισώματα, καινοτομία, και η ένταση του όγκου υπερ-έκφραση. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από έναν αριθμό πρωτεϊνών που παρουσιάζονται παρακάτω. Μία αντιπροσωπευτική ανάλυση MS του πεπτιδίου ιόντων από CD146 φαίνεται στο Σχ. 6. MS ανάλυση μας προσδιορίζονται 11 πεπτίδια που προέρχονται από CD146 σε 7 διαφορετικές ενδείξεις ασθένειας συμπεριλαμβανομένων 4 πεπτίδια σε νεφρό ECs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Το άνω πάνελ δείχνει τα χρωματογραφήματα ιόντων εκχυλίζονται από νεφρό δειγμάτων ECS από φυσιολογικών και καρκινικών δείγματα. Τα φάσματα μάζας φαίνονται στο κάτω πάνελ. Το κόκκινο βέλος δείχνει το επίπεδο έντασης σε δείγμα φυσιολογικού ιστού.

Η

ένταση έκφραση ενός αριθμού πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων CD146, B7H3, Thy-1 και νάτριο /κάλιο-μεταφορά ΑΤΡάσης υπομονάδας βήτα-3 (ATP1B3) εκτιμήθηκαν με IHC. Αναλύσαμε τομές παραφίνης που λαμβάνονται από πολλαπλούς ανεξάρτητους ιστούς ασθενών από μια ποικιλία τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του νεφρού, ή κανονικό γειτονικούς ιστούς. Όλα τα δείγματα εκπροσωπείται άσχετες περιπτώσεις από εκείνες που χρησιμοποιούνται για τις αναλύσεις MS. Αντιπροσωπευτικές χρώσεις IHC απεικονίζεται στο Σχ 7. IHC διεξήχθη επί τομών από πολλαπλούς κανονικούς και καρκίνωμα δείγματα, συμπεριλαμβανομένων του μαστού, του πνεύμονα και δείγματα νεφρών. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του CD146 βρίσκεται στα καρκινικά κύτταρα, ενώ φυσιολογικό επιθήλιο ήταν αρνητική σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου (Σχ. 7α). Αξίζει να σημειωθεί ότι το πρωτόκολλο διαλογής μας αποκλείονται CD146 και EpCAM θετικά επιθηλιακά κύτταρα από πρωτεομική ανάλυση. CD146 υπερ-έκφραση συχνά ανιχνεύεται στο ενδοθήλιο των κυττάρων του όγκου, ενώ φυσιολογικό επιθήλιο ήταν ομοιόμορφα αρνητική (Εικ. 7b). IHC εικόνες των ECs δηλώνουν σημαντική υπερ-έκφραση του B7H3 στο στήθος, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα και καρκίνωμα του νεφρού τα αιμοφόρα αγγεία σε σύγκριση με φυσιολογικά αγγεία (Εικ. 7c). Επιπλέον, σε πολλές των όγκων που εξετάστηκαν, ανιχνεύσαμε υπερέκφραση του B7H3 πρωτεΐνης από τα ίδια τα κύτταρα του όγκου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για Thy-1, IHC εικόνες ανέφεραν επίσης σημαντική υπερ-έκφραση στο νεφρό, και τα σκάφη καρκίνωμα του πνεύμονα σε σύγκριση με φυσιολογικά αγγεία (Εικ. 7d). IHC εικόνες υποδεικνύεται υπερέκφραση ATP1B3 σε πλοία καρκίνωμα σε σύγκριση με κανονικά δείγματα (Εικ. 7e). Υπερ-έκφραση του ATP1B3 καταδείχθηκε επίσης σε κύτταρα όγκου σε σύγκριση προς τα κανονικά δείγματα σε κόλον και καρκίνων του πνεύμονα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) IHC εικόνες των κανονικών και καρκίνωμα δείγματα. Υπερ-έκφραση του CD146 βρίσκεται στα καρκινικά κύτταρα, ενώ φυσιολογικό επιθήλιο ήταν ομοιόμορφα αρνητική σε πολλαπλές ενδείξεις ογκολογίας. (Β) Οι εικόνες δείχνουν σημαντική υπερ-έκφραση του CD146 σε ECs σκαφών καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα. (Γ) Σημαντικές υπερέκφραση B7H3 σε ECs σκαφών καρκίνωμα σε σύγκριση με δείγματα φυσιολογικού απεικονίζεται. (D) Σημαντικές υπερ-έκφραση Thy-1 στα αγγεία καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικά εμφανίζεται. (Ε) IHC εικόνες των ΑΕΚ δείχνουν σημαντική υπερέκφραση του ATP1B3 σε πλοία καρκίνωμα σε σύγκριση με φυσιολογικά δείγματα.

Η

Επιπλέον επιβεβαιωτικές μελέτες διεξήχθησαν με κυτταρομετρία ροής. Σύκο. 8α αντιπροσωπεύει τα δεδομένα ΡΑΟδ για τον χαρακτηρισμό των διαλεγμένων κυττάρων εντός του όγκου υποδεικνύοντας την παρουσία των επιθηλιακών κυττάρων και haematolymphoid κύτταρα χωρίς την έκφραση του CD146 σε δείγματα νεφρού, ενώ υπάρχει σημαντική υπερ-έκφραση του CD146 επί ενδοθηλιακών συνιστώσα του όγκου σε σύγκριση με παρακείμενο φυσιολογικό νεφρό. Σχ. 8β και 8γ αντίστοιχα δείχνουν ότι CD146 θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα των νεφρών και των πνευμόνων όγκοι εκφράζουν πρωτεΐνες B7H3 και Thy-1. Για την αξιολόγηση των δυνητικών λειτουργικό ρόλο της παραπάνω πρωτεΐνες, εκτελέσαμε siRNA αναλύει σε καλλιεργημένα ECs. Επειδή υπήρχαν πολλαπλές περιορισμοί για τη διεξαγωγή πειραμάτων siRNA σε όγκο ECs χρησιμοποιήσαμε HUVECs ή HMVECs ως διαθέσιμα συστήματα μοντέλο. Η ικανότητα να διατηρηθεί όγκου προερχόμενα ECs

ex-vivo

ήταν περιορισμένη σε συχνότητα και ποσότητα πέρασμα. Όπως φαίνεται στο Σχ.