Αφηρημένο

Ο καρκίνος παραμένει η κύρια αιτία θανάτου σε παγκόσμιο επίπεδο και το συνολικό αριθμό των περιπτώσεων σε παγκόσμιο επίπεδο αυξάνεται. Novel στρατηγικές θεραπείας είναι ως εκ τούτου απεγνωσμένα απαιτούνται για ριζική θεραπεία καρκίνων και μακράς επιβίωσης των ασθενών. Μια νέα τεχνολογία που χρησιμοποιεί υψηλής παλμικού ηλεκτρικού πεδίου έχει προκύψει από τη στρατιωτική εφαρμογή σε βιολογίας και της ιατρικής εφαρμόζοντας nsPEF ως μέσο για την αναστολή του καρκίνου. Ωστόσο, μοριακοί μηχανισμοί της nsPEF σε όγκους ή καρκίνοι είναι ακόμα ασαφής. Σε αυτή την εργασία, διαπιστώσαμε ότι nsPEF είχε εκτεταμένες βιολογικές επιδράσεις σε καρκίνους, και διευκρίνισε δυνατόν μοριακών μηχανισμών της

in vitro

και

in vivo

. Θα μπορούσε όχι μόνο να επάγει απόπτωση των κυττάρων μέσω εξαρτώμενη-μιτοχονδρίων μονοπάτι εγγενείς απόπτωσης που προκλήθηκε από ανισορροπία του αντί- ή απόπτωση πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2, αλλά επίσης αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω καταστολή NF-κΒ οδού σηματοδότησης για τη μείωση των εκφράσεων των πρωτεϊνών κυκλίνης . Επιπλέον, θα μπορούσαν επίσης να nsPEF αδρανοποιήσουν μετάσταση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων καταστέλλοντας Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι προς τα κάτω ρύθμιση έκφρασης των πρωτεϊνών της οικογένειας VEGF και MMPs σηματοδότησης. Το πιο σημαντικό, nsPEF θα μπορούσε να λειτουργήσει με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα ως αντι-καρκινική θεραπεία μέσω επαγωγής της απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων, καταστρέφοντας μικροπεριβάλλον του όγκου, και καταθλιπτικό αγγειογένεση στον ιστό του όγκου

in vivo

. Τα ευρήματα αυτά μπορεί να παρέχει μια δημιουργική και αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για καρκίνους

Παράθεση:. Ρεν Z, Chen X, Cui G, Γιν S, Chen L, Jiang J, et al. (2013) νανοδευτερόλεπτο παλμικού ηλεκτρικού πεδίου αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου Ακολουθούμενη από μεταβολή στην Εκφράσεις του NF-κΒ και Wnt /β-κατενίνης Σηματοδοσίας μόρια. PLoS ONE 8 (9): e74322. doi: 10.1371 /journal.pone.0074322

Επιμέλεια: Irina U Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2013? Αποδεκτές: 25 του Ιουλίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Ren et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την Εθνική S & amp? T μεγάλο έργο της Κίνας (2012ZX10002-017, 2012ZX10002-004), NSFC Καινοτόμων Ομάδα Έρευνας της Κίνας (81.121.002), Zhejiang Ιατρικής Έρευνας Χρηματοδότηση (2008B079, LY13H180003), SRF για ROCS, SEM (J20120279 ), και στο Xinjiang Επιστήμης και Τεχνολογίας του Προεδρείου του έργου (2013911131). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι ακόμα μια κύρια αιτία θανάτου παγκοσμίως και αντιπροσώπευαν το 7,6 εκατομμύρια θανάτους (το 13% περίπου του συνόλου των θανάτων) το 2008, σύμφωνα με την πΟΥ, καθώς και οι θάνατοι από καρκίνο προβλέπεται να αυξηθεί σε πάνω από 11 εκατομμύρια το 2030 [ ,,,0],1]. Ένα σημαντικό ποσοστό των καρκίνων μπορούν να θεραπευτούν με χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία ή χημειοθεραπεία, ειδικά εάν ανιχνεύονται νωρίς. Ωστόσο, ορισμένα είδη καρκίνων, δεν μπορεί να ανακαλυφθεί σε πρώιμο στάδιο και έχουν μικρή απόκριση σε ραδιοθεραπεία και χημειοθεραπεία, έτσι οι ασθενείς με καρκίνους όπως έχουν φτωχή πρόγνωση. Για παράδειγμα, ο καρκίνος του παγκρέατος έχει περίπου 23% 1-ετή επιβίωση μετά τη διάγνωση και 5% 5-ετή επιβίωση στην καλύτερη περίπτωση [2]. Επιπλέον, υπήρχαν περίπου 43.140 νέες περιπτώσεις και το 36, 800 θάνατοι που αποδίδονται στον καρκίνο του παγκρέατος στις Ηνωμένες Πολιτείες [3,4]. Είναι σημαντικό να αναζητήσετε μια νέα τεχνική θεραπείας για τη βελτίωση της πρόγνωσης και την επιβίωση των ασθενών με καρκίνο.

Μια νέα τεχνολογία που χρησιμοποιεί υψηλής παλμικού ηλεκτρικού πεδίου έχει προκύψει από τη στρατιωτική εφαρμογή στην βιολογία και την ιατρική με την εφαρμογή του παλμού nanosecond ηλεκτρικού πεδίου (nsPEF ) ως ένα μέσο για την αναστολή του καρκίνου [5]. Το κύριο χαρακτηριστικό της nsPEF είναι υψηλή ισχύ και χαμηλή ενέργεια που οδηγεί σε πολύ λίγο την παραγωγή θερμότητας και ειδικά την ικανότητά του να διεισδύει σε κυτταρικές να επηρεάσει ενδοκυτταρικά οργανίδια [6,7]. Αρκετά διαφορετικό από ηλεκτροδιάτρηση μεμβράνη κλασική πλάσματος, nsPEF μπορεί να παράγει υψηλής συμπίεσης δύναμη (δισεκατομμύρια watt), εξαιρετικά σύντομες διάρκειες παλμών (νανοδευτερόλεπτο), η ταχεία φορές αύξηση (νανοδευτερόλεπτο) και υψηλή ηλεκτρικά πεδία (kV /cm). Το προκύπτον παλμός nanosecond μπορεί να διεισδύσει σε κελί πριν μεμβράνη πλάσματος είναι πλήρως φορτισμένη επιτρέποντας nsPEF να έχουν ελάχιστες επιπτώσεις μεμβράνη του πλάσματος, ως εκ τούτου δεν προκαλεί ηλεκτροπόρωση [8]. Τα τελευταία χρόνια, μελέτες έχουν γίνει για να καθορίσει επιπτώσεις της nsPEF σε πειραματικά και το μοντέλο έρευνες. Τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι nsPEF θα μπορούσε να προκαλέσει απόπτωση σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου

in vitro

[9,10] και ένας όγκος ινοσαρκώματος

ex vivo

[7], και την εξάλειψη B16F10 μελανώματος όγκου

in vivo

[11,12,13]. Ωστόσο, μοριακοί μηχανισμοί βιολογικές επιδράσεις της nsPEF επί όγκων ή καρκίνων είναι ακόμα ασαφής.

Σε αυτή την έρευνα, επιδιώξαμε να ερευνήσει αντικαρκινικό αποτέλεσμα των nsPEF και πιθανών μοριακών μηχανισμών της μέσω

in vitro

και

in vivo πειράματα

. Εδώ, δείξαμε ότι nsPEF θα μπορούσε να παρεμποδίσει σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών

in vitro

και

in vivo

μέσω επαγωγής απόπτωσης, αναστολή του πολλαπλασιασμού, αδρανοποίηση εισβολή και μετάσταση, και την καταστροφή μικροπεριβάλλον του όγκου, η οποία θα δώσει μία νέα και αποτελεσματική θεραπευτική στρατηγική για καρκίνους.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινο παγκρεατική κυτταρική γραμμή καρκινώματος κυτταρική γραμμή (PANC-1) και HCC (Hep-3Β) ήταν αγοράζονται από τη Cell Τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα). Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, SAFC Biosciences, Lenexa, KS, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 mg /mL στρεπτομυκίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

επαγωγή κυτταρικού θανάτου από nsPEF

Όπως και τα προηγούμενα περιγραφή μας [11], nsPEF γεννήτρια με διάρκεια 100 -NS δείχθηκε στο Σχήμα S1. Τα ηλεκτρικά πεδία κυμαίνεται από 20kV /cm έως 60kV /cm. Κυματομορφές παρακολουθήθηκε με ένα ψηφιακό παλμογράφο φωσφόρου (Εικόνα S1 Α & amp? Β, DPO4054, Tektronix, USA) εξοπλισμένο με καθετήρα υψηλής τάσης (P6015A, Tektronix, USA). κύτταρα PANC-1 συλλέχθηκαν με τρυψίνη και επαναιωρήθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο ϋΜΕΜ με 10% FBS σε συγκέντρωση 5.0 × 10

6 κύτταρα /ml. 500 μΐ κυτταρικού αιωρήματος τοποθετήθηκαν σε μια κυψελίδα 0,1 εκατοστά κενό (ηλεκτρόδια Σχήμα S1 C, Biosmith, πλάκα αλουμινίου) και εκτέθηκαν σε 100 παλμούς σε 0, 20, 40 και 60 kV /cm ηλεκτρικού πεδίου, αντίστοιχα. Οι περισσότεροι από ανιχνεύσεις των κυτταρικών αποκρίσεων διεξήχθησαν σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία, κυρίως συμπεριλαμβανομένης δοκιμασίας Transwell, κύτταρο ΤΕΜ, δοκιμασία σκάλα DNA, δοκιμασία TUNEL κύτταρο, κυτταρομετρία ροής και τη δυτική-blot. Η βιωσιμότητα των κυττάρων και πολλαπλασιαστικών ρυθμός αναστολής μετρήθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά τη θεραπεία για να παρατηρήσει μια σταδιακή ενεργή διαδικασία. Το σύνολο πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

Μέτρηση της βιωσιμότητας των κυττάρων και πολλαπλασιασμού ρυθμός αναστολής

PANC-1 κύτταρα εκτέθηκαν σε nsPEF και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν. 2 × 10

5 κύτταρα εκτέθηκαν σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις, και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν για 0, 0,5, 1, 2, 24 και 48 ώρες αντίστοιχα. Τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν και βιώσιμα κύτταρα μετρήθηκαν με έναν αναλυτή κυτταρικής βιωσιμότητας (Vi-κύτταρο, Backman). Μετά από επώαση για 24, 48 και 72 ώρες αντίστοιχα, τα κύτταρα υπολογίστηκε με Καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 (CCK-8) δοκιμασίας (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, αντανακλώντας κυτταρική πολλαπλασιαστική αναστολής.

Ανίχνευση κυτταρικής μετάστασης και την ικανότητα εισβολής με Transwell δοκιμασία

σε 1 ώρα μετά την αγωγή nsPEF, τα κατεργασμένα κύτταρα επιβίωση στον ίδιο αριθμό ελήφθησαν για την εκτέλεση Transwell δοκιμασίες που βασίζονται σε επικοινωνούντα δοχεία (Millipore, USA), αντανακλώντας τη μετάσταση των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

Παρατήρηση του κυττάρου ultrastructure με ΤΕΜ

σε 1 ώρα μετά την αγωγή nsPEF, τα επεξεργασμένα κύτταρα ελήφθησαν και σταθεροποιήθηκαν με 2,5% γλουταραλδεΰδη να παρατηρήσει κύτταρο υπερδομή με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (TEM) σε Imaging διευκόλυνση των βασικών εγκαταστάσεων, Zhejiang University School of Medicine, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

Προσδιορισμός του DNA κατακερματισμού με

δοκιμασία σκάλα του DNA

στο 1 h μετά την αγωγή nsPEF, τα επεξεργασμένα κύτταρα ελήφθησαν για τη διερεύνηση του κατακερματισμού του DNA των κυττάρων με τη δοκιμασία σκάλα DNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφεται προηγουμένως [11].

Μέτρηση της μονής κυτταρικής απόπτωσης με δοκιμασία TUNEL

σε 1 ώρα μετά τη θεραπεία nsPEF, τα επεξεργασμένα κύτταρα ελήφθησαν για τον προσδιορισμό μονοκύτταροι απόπτωση χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία της TdT-dUTP Terminal Nick-end επισήμανση (ΤΟΥΝΕΛ) με

In Situ

κιτ ανίχνευσης κυτταρικού θανάτου (Millipore, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14].

ανίχνευση κυτταρικής απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής

σε 1 ώρα μετά την αγωγή nsPEF, τα επεξεργασμένα κύτταρα ελήφθησαν για την ανίχνευση των κυττάρων απόπτωσης από Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16].

Ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής

σε 1 ώρα μετά την αγωγή nsPEF, τα επεξεργασμένα κύτταρα ελήφθησαν σε καθορίσει την αλλαγή του κυτταρικού κύκλου. δοκιμασία κυτταρικού κύκλου και η ανάλυση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [17].

κηλίδωση Western ανάλυση

Σε 1 ώρα μετά την αγωγή nsPEF, τα επεξεργασμένα κύτταρα ελήφθησαν για την εκχύλιση των πρωτεϊνών. εκχύλιση πρωτεϊνών και ανάλυση Western blotting πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Τα πρωτογενή αντισώματα και τα στοιχεία που αναφέρονται στον πίνακα S1.

επαγωγή όγκων σε άτριχα ποντίκια με κύτταρα Hep-3Β

Τα 5 εβδομάδων γυμνά ποντίκια είχαν αγοραστεί από τη Σαγκάη Κέντρο ζωικά πειραματικά, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών . Πειραματόζωα παρέμειναν στην κεντρική εγκατάσταση ζώο της Zhejiang University School of Medicine και στεγάζεται σε laminar- fl ow ντουλάπια κάτω συγγραφή fi γ συνθήκες άνευ παθογόνου στους 22 ° C με σκότους /12 ωρών φωτός. Όλοι οι ποντικοί αναισθητοποιήθηκαν με κεταμίνη (100 mg /kg ενδοπεριτοναϊκά). μοντέλα φέροντα-όγκους ποντίκια καθορίστηκαν με ένεση 2 × 10

6 κύτταρα Hep-3Β στη δεξιά κοιλία σε ποντίκια. Σε 1 εβδομάδα μετά την ένεση των κυττάρων, όγκου ήταν τυπικά πλάτους 3 mm και είχαν εκτεθεί αγγειογένεση. Όταν οι όγκοι αναπτύχθηκαν σε ευρείες 10 mm ή περισσότερο — τυπικά περίπου 4 εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων, 50 μοντέλα ποντικών που φέρουν όγκο με επιτυχία εγκατεστημένος και χωρίζονται σε δύο ομάδες: ομάδα ελέγχου (n = 17) και ομάδα nsPEF (n = 33) . Τα ποντίκια στην ομάδα nsPEF εκτέθηκαν σε nsPEF (Σχήμα S1 D & amp? Ε, 100 παλμοί, 20kV /cm) με το σφιγκτήρα. Τα ηλεκτρόδια σφιγκτήρα έγιναν από πλαστικό σφιγκτήρα κάτοχο με μεγάλη λεπτό χαλκού 5-mm για να καλύψει τον όγκο. Εμείς επικαλυμμένα αυτών των ηλεκτροδίων με ένα υπερηχογράφημα γέλη για το διαχωρισμό του δέρματος από το ηλεκτρόδιο. Για τη θεραπεία, κάθε όγκος ήταν τοποθετημένη ανάμεσα σε δύο παλάμες των σφιγκτήρων με διαχωρισμό 0,5 mm, ενώ 100 ns παλμούς διάρκειας και 20 kV /cm σε ένταση εφαρμόστηκαν σε μια συχνότητα 0,5 Hz. Καθ ‘όλη τη πείραμα, το ποντίκι αναισθητοποιήθηκε και τοποθετείται σε ένα στάδιο θέρμανσης που διατηρεί την θερμοκρασία του σώματος του ποντικού εντός του φυσιολογικού εύρους. Φυσικές δραστηριότητες και βάρη των ποντικών, καθώς και κάθε όγκου παρατηρήθηκαν και καταγράφηκαν μία φορά ή δύο φορές την εβδομάδα. Όλες οι διαδικασίες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τη » Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση Ζώων Εργαστηρίου » που δημοσιεύθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (ΝΙΗ δημοσίευση 86-23 αναθεωρημένο 1985). πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από τη φροντίδα και εγκαταστάσεις Επιτροπής Ζώων του Πανεπιστημίου Zhejiang.

όγκου

in vivo

απεικόνισης με ειδική μαγνητική τομογραφία του

ποντικιού

ποντίκια που έφεραν όγκο από την ομάδα ελέγχου και nsPEF ομάδα αναισθητοποιούνται και βάλτε μέσα στο μικρό πηνίο για ποντίκι υπολογιστή (Πανεπιστήμιο του Πεκίνου, Κίνα), και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε μηχάνημα NMR (Advance 400, Hruker Company, της Ελβετίας). Η

in vivo

εικόνα των ποντικών με όγκο ελήφθη.

Δείγμα συλλογή

Σε περίπου 6,5 εβδομάδες μετά την έγχυση των κυττάρων, όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν με υπερβολική δόση αναισθησίας και όλα όγκοι αποκόπηκαν να συγκρίνουν. Ιστός όγκου στερεώθηκε σε Φωσφορικό ρυθμιστικό φορμαλίνης (10%) για να εκτελέσει Η &? Ε χρώση, δοκιμασία TUNEL, και χρώση IHC. Εν τω μεταξύ, ένα μέρος του όγκου στερεώθηκε σε 2,5% γλουταραλδεΰδη (4 ° C, ρΗ 7,4) για να εκτελέσει ΤΕΜ όγκου

Η &?. Χρώση Ε και ανοσοϊστοχημεία

Η &? Χρώση Ε και ανοσοϊστοχημεία (IHC ) διεξήχθησαν όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [19]. Οι πρωτογενείς αντισώματα και τα στοιχεία που παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Tumor in situ ανίχνευση της απόπτωσης με TUNEL

δοκιμασία

όγκου κυτταρικής απόπτωσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία TUNEL, διεξάγεται όπως περιγράφεται προηγουμένως [14].

η στατιστική ανάλυση

Τα παρόντα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM. λογισμικό Graph Pad Prism 5 εφαρμόστηκε για στατιστική ανάλυση. Κυτταρική απόπτωση και κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν από FlowJo 7.6.1 Λογισμικό. Σχετική ένταση της κάθε ζώνης πρωτεΐνης αναλύθηκε με το λογισμικό Photoshop CS4. Αποτελέσματα IHC αναλύθηκαν από Image λογισμικού Pro-Plus. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) με πολλαπλές συγκρίσεις του Dunnett και ένα ασύζευκτο, δίπλευρη δοκιμασία t του Student χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση δεδομένων. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε σε τιμή Ρ & lt? 0.05.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Παρά τις εντατικές προσπάθειες των πρακτικών καρκίνους θεραπεία, τα ποσοστά επιβίωσης για ορισμένα είδη καρκίνων δεν έχουν ουσιαστικά βελτιωθεί τα τελευταία χρόνια, όπως ο καρκίνος του παγκρέατος [2], του προστάτη καρκίνωμα [20] και τον καρκίνο του πνεύμονα [21]. Novel στρατηγικές θεραπείας είναι ως εκ τούτου απεγνωσμένα απαιτείται για τη θεραπεία καρκίνων και μακράς επιβίωσης των ασθενών. Κατά τη διάρκεια της πολλαπλών σταδίων ανάπτυξης, ανθρώπινων καρκίνων αποκτήσει δέκα βιολογικά χαρακτηριστικά, συμπεριλαμβανομένων αντιστέκονται κυτταρικό θάνατο, τη διατήρηση πολλαπλασιαστικών σηματοδότησης, ενεργοποιώντας την εισβολή και τη μετάσταση, επιτρέποντας αντιγραφική αθανασία, αποφεύγοντας καταστολείς ανάπτυξη, την πρόκληση αγγειογένεσης, επαναπρογραμματισμό του μεταβολισμού της ενέργειας, αποφεύγοντας ανοσοποιητικό καταστροφή, φλεγμονή όγκου-προώθηση, και γονιδιώματος αστάθεια και η μετάλλαξη [22,23]. Αυτά τα χαρακτηριστικά αποτελούν οργανωτική αρχή για τον εξορθολογισμό της πολυπλοκότητας των νεοπλασματικών παθήσεων και επίσης να γίνουν μεγάλες στόχοι για έρευνα για τον καρκίνο και θεραπευτικές στρατηγικές. Ως μια σχετικά νέα τεχνολογία για να ερμηνεύσει τον καρκίνο, nsPEF είναι αποτελεσματική σε διάφορες κυτταρικές σειρές

in vitro

[5,9,10], και B16F10 μελανώματος και ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [11,24], καθώς επίσης και ανθρώπινο παγκρεατικό καρκίνωμα [25]

in vivo

, καταδεικνύοντας πιθανή προοπτική εφαρμογής των nsPEF για τη θεραπεία του καρκίνου. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, παραμένει ασαφές για τους μοριακούς μηχανισμούς της nsPEF σε καρκίνους.

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε τον καρκίνο μοντέλα τόσο

in vitro

και

in vivo πειράματα για να

αναζήτηση για πιθανές μοριακούς μηχανισμούς.

NsPEF που προκαλείται από τα καρκινικά κύτταρα του θανάτου και πολλαπλασιασμού αναστολή

in vitro

Η

για την αντιμετώπιση επίδραση της nsPEF σε PANC-1 κύτταρα, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε nsPEF με ηλεκτρικό πεδίο σε 0, 20, 40 και 60 kV /cm αντίστοιχα (Σχήμα 1Α). Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων /έλεγχος ανιχνεύθηκε με απαρίθμηση trypan blue αρνητικά κύτταρα σε 0h, 0.5Η, 1 ώρα και 2 ώρες μετά τη παλμού (Σχήμα 1Β). Βρήκαμε ότι τα βιώσιμα κύτταρα μετά την παλμού ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τον έλεγχο (ρ & lt? 0.001), αλλά ο χρόνος-εξαρτώμενο τρόπο και κατά τρόπο που εξαρτάται από τη δόση του μειωμένου αυτού τάση δεν παρατηρήθηκαν σε σύντομο χρονικό διάστημα μετά την παλμού, τουλάχιστον εντός 2 ώρες. Επιπλέον, κατεργασμένα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και 48 ώρες, και στη συνέχεια υπολογίζεται αντίστοιχα. Βρήκαμε ότι τα βιώσιμα κύτταρα επίσης αξιοσημείωτα μειωμένη σε σχέση με τον έλεγχο (και τα δύο ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 1 C & amp? D). Επιπλέον, τα ποσοστά αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, που ανιχνεύεται με CCK-8 δοκιμασίας, ήταν αξιοσημείωτα αυξάνει σε διαφορετικές εντάσεις σε 48 ώρες και 72 ώρες μετά την έκθεση σε nsPEF. Ειδικά σε 72 ώρες μετά παλμό, υψηλότερες εντάσεις απέκτησε υψηλότερα ποσοστά αναστολής, η οποία εμφανίζεται μία δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, υποδεικνύοντας ότι ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων επιβίωσης επηρεάστηκε με δοσοεξάρτηση (Σχήμα 1 Ε). Το σχήμα 1 έδειξε όχι μόνο τα κύτταρα θανάτους, αλλά και η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από nsPEF.

(Α) Χρονοδιάγραμμα των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις για τα βιώσιμα κύτταρα μετρούν και CCK-8 δοκιμασίας. (Β) Το ποσοστό των βιώσιμων κυττάρων /έλεγχος ανιχνεύθηκε με απαρίθμηση trypan blue αρνητικά κύτταρα σε 0 h, 0,5 h, 1 h, και 2 ώρες μετά παλμούς με διαφορετικές εντάσεις. *** P & lt? 0.001. (Γ και Δ) Οι αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων υπολογίστηκαν μετά από έκθεση σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις για 24 ώρες και 48 ώρες αντίστοιχα. * P & lt? 0,05, *** p & lt? 0.001. (Ε) Σύμφωνα με την CCK-8 δοκιμασίας, ανιχνεύθηκαν ποσοστά αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων που προκαλείται από nsPEF με διαφορετικές εντάσεις. ** P & lt?. 0.01

Η

NsPEF που προκαλείται κυτταρική απόπτωση μέσω του μονοπατιού εξαρτάται μιτοχονδρίων εγγενή αποπτωτικών

in vitro

Η

Κατ ‘αρχάς, να διερευνήσει τα χαρακτηριστικά του θανάτου που προκαλείται από nsPEF σε κύτταρα παγκρεατικού καρκινώματος, ανιχνεύσαμε αλλαγές μορφολογία των κυττάρων μετά από θεραπεία με ΤΕΜ (Σχήμα 2Α). Τα αποπτωτικά χαρακτηριστικά των κυττάρων σπάνια παρατηρείται στον έλεγχο (0 kV /cm). Εντούτοις, επεξεργασμένα κύτταρα με 20kV /cm nsPEF άρχισαν να παρουσιάζουν την κυτταρική μορφολογία αλλοίωση πρώιμη απόπτωση: πυρηνική συρρίκνωση, η πυρηνική εγκοπή, συμπύκνωση της χρωματίνης και περιθωριοποίηση, και μικρές εκφυλισμό των μιτοχονδρίων. Κάτω από επίδραση του /cm nsPEF 40kV, παρατηρήθηκαν περαιτέρω αλλαγές, κυρίως συμπεριλαμβανομένων χρωματίνη clumping, κυτταρόπλασμα συμπύκνωσης και μερικές χυμοτόπια που εμφανίζονται στην κυτταρική μεμβράνη ή στην κυτταρόπλασμα. Εν τω μεταξύ, τα πυρηνικά θραύσματα και κυτταρόπλασμα συστατικά συσκευάστηκαν σε αποπτωτικά σώματα, και τα μιτοχόνδρια έδειξαν κενοτοπικής εκφυλισμό. Όταν ηλεκτρικά πεδία αυξηθεί μέχρι 60kV /cm, επεξεργασμένα κύτταρα παρουσιάζονται λύσης μεμβράνης, διόγκωση πυρηνική μεμβράνη, την πυρηνική λύση και τον κατακερματισμό, καθώς και βλάβες στα μιτοχόνδρια, τα οποία συνήθως θεωρούνται ως νέκρωση.

(A) μεταβολές Μορφολογία του καρκίνου κύτταρα που εκτίθενται σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις παρατηρήθηκαν με μετάδοσης ηλεκτρονίου κύτταρο μικροσκοπία (ΤΕΜ). Ν: πυρηνική αλλαγές συμπεριλαμβανομένης της πυρηνικής συρρίκνωση, διόγκωση πυρηνική μεμβράνη και την πυρηνική λύση. Μ: μιτοχόνδρια εκφύλιση ή κενοτοπικής εκφυλισμό. (Β) Single κυτταρικής απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις υπολογίστηκε με δοκιμασία TUNEL κύτταρο. Αρχική μεγέθυνση, 400 ×. *** P & lt? 0.001. (C) Cell DNA κατακερματισμό των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF παρατηρήθηκε με δοκιμασία σκάλα απόπτωσης DNA. συντελεστές (D) απόπτωσης των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις ελέγχθηκαν με δοκιμασία χρώσης ΡΙ και αννεξίνης-ν με κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με FlowJo 7.6.1 Λογισμικό. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. (Ε) εκφράσεις πρωτεΐνης του αντι- /απόπτωση οικογένεια Bcl-2, κυτόχρωμα C και κασπάσης-3 σε καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία Western-κηλίδος. Σχετική ένταση της κάθε πρωτεΐνης αναλύθηκε με λογισμικό Photoshop CS4. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt?. 0.001

Η

Στη συνέχεια, μελετήσαμε βλάβη του DNA και του κατακερματισμού με TUNEL δοκιμασία και δοκιμασία σκάλα απόπτωσης DNA. Στην χρώση TUNEL, οι ετικέτες συνδυασμένες κατεστραμμένο θέσεις του DNA, και αποπτωτικά κύτταρα βάφτηκαν καφετί-κίτρινο. Παρατηρήσαμε ότι TUNEL θετικούς ρυθμούς προφανώς ανεβαίνει στα κύτταρα PANC-1 δημοσιεύσετε παλμό στα 20, 40, και 60 kV /cm σε σχέση με τον έλεγχο, αντίστοιχα (όλα τα p & lt? 0.001) (Σχήμα 2Β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα TUNEL, κατάτμηση του DNA που παρουσιάζονται σε PANC-1 κύτταρα που εκτίθενται σε nsPEF στα 20 και 40 kV /cm, σε σύγκριση με θετικό έλεγχο και αρνητικός μάρτυρας από δοκιμασία σκάλα DNA (Σχήμα 2C).

Για να διερευνήσουν περαιτέρω αποπτωτικά πτυχίο σε καρκινικά κύτταρα μετά την παλμού, ελέγξαμε αποπτωτική ποσοστά των επεξεργασμένων κυττάρων με Annexin-V /χρώση ΡΙ με κυτταρομετρία ροής (Εικόνα 2D). Σε σύγκριση με τον έλεγχο, το ποσοστό της αννεξίνης V

-ΡΙ

– κύτταρα (ζωντανά κύτταρα) μειώθηκε σημαντικά μετά από έκθεση σε nsPEF, αλλά ο ρυθμός της αννεξίνης V

+ PI

– κύτταρα (πρώιμη απόπτωση) ήταν αξιοσημείωτα αυξημένη στα 20kV /cm (ρ & lt? 0.001), και στη συνέχεια μειώθηκε σημαντικά στα 40kV /cm (ρ & lt? 0,05) και 60kV /cm (ρ & lt? 0,01). Σε έντονη αντίθεση, το ποσοστό της αννεξίνης V

+ PI

+ κύτταρα (τέλη απόπτωση ή νέκρωση) ήταν συνεχώς αυξάνεται σε εξάρτηση δόσης σε 20, 40 και 60 kV /cm (όλα τα P & lt? 0,01). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν κύτταρα θάνατο που επάγεται από nsPEF παρουσιάζονται από πρώιμη απόπτωση σε αργά απόπτωση ή νέκρωση με αυξημένη ένταση του nsPEF, με άλλα λόγια, η δόση-εξάρτηση. Τα αποτελέσματα αυτά ήταν πανομοιότυπα με τα ευρήματά μας μέσω του κυττάρου TEM.

Πρόσφατες έρευνες απέδειξαν ότι η απόπτωση έπαιξε σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από nsPEF [11,26]. Σε συμφωνία με τις μελέτες αυτές, βρήκαμε αποπτωτικά σώμα και τα μιτοχόνδρια εκφυλισμό με ΤΕΜ μετά τη θεραπεία nsPEF. Επιπλέον, τα αποτελέσματα της δοκιμασίας TUNEL, δοκιμασία σκάλας απόπτωσης DNA και χρώση /ΡΙ Annexin-V αποδείχθηκε επίσης απόπτωση που επάγεται από nsPEF σε κύτταρα PANC-1. Ορισμένες μελέτες [5,9] ανέφεραν ότι ο καρκίνος του κυτταρικού θανάτου που προκαλείται από nsPEF αποδόθηκε κυρίως στην απόπτωση, και να ερμηνευθεί ότι η αύξηση της αννεξίνης V

+ PI

+ κυττάρων στη δόση-εξάρτηση θα μπορούσε να αποδοθεί σε μια ειδική «που μιμείται νέκρωση «ότι η υψηλή δόση παλμό που προκαλείται μεγαλύτερες τρύπες στις μεμβράνες των κυττάρων και στη συνέχεια εισήλθε PI λεκέ κύτταρα. Ωστόσο, περαιτέρω στοιχεία μας μέσω κυττάρου TEM απέδειξε ότι ο κυτταρικός θάνατος που παρουσιάζονται από την πρώιμη απόπτωση έως τα τέλη απόπτωση ή νέκρωση με αυξημένη ένταση του nsPEF, όχι μόνο κυτταρικής απόπτωσης.

Η εγγενής απόπτωση που προκαλείται από ερεθίσματα που προκαλούν στρες και εξωγενών απόπτωση μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα θανάτου είναι δύο κύριες οδούς της απόπτωσης. λειτουργία μιτοχονδρίων και αντι- /απόπτωση πρωτεΐνες Bcl-2 οικογένεια παίξει ουσιαστικό ρόλο στην ενδογενή οδό της απόπτωσης [27]. Αντι /απόπτωση μέλη Bcl-2 πρωτεϊνών της οικογένειας είναι αρχικά ενσωματωμένες μεμβρανικές πρωτεΐνες που βρέθηκαν στα μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο (ER), ή πυρηνικής μεμβράνης [28]. Μια σημαντική θέση ενεργοποίησης των πρωτεϊνών Bcl-2 είναι μιτοχονδριακής μεμβράνης [27]. Για να διερευνηθεί πιθανοί μηχανισμοί της απόπτωσης που επάγεται από nsPEF, ανιχνεύσαμε σχετική πρωτεΐνες έκφραση της ενδογενούς οδού αποπτωτικά, όπως προ-απόπτωσης Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών (Bad, ρ-Bad, Bax, Bik, Bim, BID, Bak και Puma) , προ-επιβίωσης οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών (π-Bcl-2, Bcl-2, Bcl-xL και Mcl-1), και την απόπτωση άμεσα σχετική πρωτεΐνες (Cytochrome-C και Caspase-3) (Σχήμα 2Ε). Σε σύγκριση με τον μάρτυρα, οι εκφράσεις του αντι-απόπτωσης Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών, κυρίως συμπεριλαμβανομένων ρ-Bcl-2, Bcl-xL και Mcl-1, ήταν σημαντικά μειωμένη σε διαφορετικούς βαθμούς, ενώ εκφράσεις των προ-απόπτωσης Bcl-2 πρωτεϊνών της οικογένειας , κυρίως συμπεριλαμβανομένων Bax, Bim και BID, ήταν σημαντικά αυξημένα σε διαφορετικούς βαθμούς με αυξημένη ένταση του nsPEF. Εν τω μεταξύ, οι εκφράσεις του κυτοχρώματος-C και κασπάσης-3 ήταν προφανώς αυξήθηκαν μετά από έκθεση σε nsPEF. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η απόπτωση που επάγεται από nsPEF πυροδοτήθηκε με τη ρύθμιση ανισορροπία των αντι ή απόπτωση πρωτεΐνες της οικογένειας Bcl-2 επί της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με μιτοχόνδρια εκφυλισμό και βλάβη σε υπερ-δομή των κυττάρων. Συλλογικά, αυτά τα αποπτωτικά δεδομένα έδειξαν ότι nsPEF επαγόμενη απόπτωση σε PANC-1 κύτταρα μέσω της εξαρτημένης μιτοχόνδρια ενδογενή οδό απόπτωσης που προκλήθηκε από ανισορροπία του αντί- ή απόπτωση οικογένειας Bcl-2 πρωτεϊνών.

NsPEF ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό μέσω καταστολή NF-κΒ οδού σηματοδότησης

in vitro

η

Εκτός απόπτωση, nsPEF είχε μια αξιοσημείωτη επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από δοκιμασία μας CCK-8 ότι το ποσοστό αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αξιοσημείωτα αυξημένο κατά έναν τρόπο της δόσης-εξάρτηση και χρονική εξάρτηση μετά από 48 ώρες μετά παλμό. Σε κυτταρικό κύκλο, η μετάφραση από G1 φάση σε φάση S και το ποσοστό της G2 φάσης /Μ αντανακλά συνήθως κυτταρικού πολλαπλασιασμού ικανότητα. Εξετάσαμε κυτταρικού κύκλου των επεξεργασμένων κυττάρων, και βρήκε ότι το ποσοστό των G1 φάση προφανώς αυξημένη (ρ & lt? 0,01), ενώ το ποσοστό του G2 φάση /M μειώθηκε (ρ & lt? 0,05) μετά από έκθεση σε nsPEF (Σχήμα 3Α), υποδεικνύοντας ότι nsPEF μπορούσε να συλλάβει G1 φάση του κυτταρικού κύκλου για την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού.

(Α) του κυτταρικού κύκλου καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις εξετάστηκε με δοκιμασία χρώσης ΡΙ με κυτταρομετρία ροής, και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με FlowJo 7.6 0.1 Λογισμικό. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01. (Β) Protein εκφράσεις μονοπατιού σηματοδότησης ΝΡ-κΒ περιλαμβανομένων ΙΚΚ-α, β ΙΚΚ-ΙκΒ-α, ρ65 και ρ-ρ65 σε καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία Western-κηλίδος. (Γ) Πρωτεΐνη εκφράσεις πρωτεϊνών κυκλίνης, συμπεριλαμβανομένων Κυκλίνη D1 και Κυκλίνη Α σε καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία Western-κηλίδος. Σχετική ένταση της κάθε πρωτεΐνης αναλύθηκε με λογισμικό Photoshop CS4. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt?. 0.001

Η

NF-κΒ οδού σηματοδότησης παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [29]. Καρκίνος αναστολή της ανάπτυξης μέσω αναστολής της NF-κΒ μονοπάτι έχει πρόσφατα αναφερθεί σε πολλά ανθρώπινα καρκινώματα, όπως του παχέος εντέρου [30], του πνεύμονα [31] και του μαστού [32]. Τα στοχευόμενα γονίδια που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω NF-κΒ οδού περιλαμβάνουν c-myc, CyclinD1, κυκλίνη Ε και CDK2 οποίες διαδραματίζουν ουσιαστικό ρόλο στην θετική ή αρνητική ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [33,34]. Για την περαιτέρω διερεύνηση πιθανών μηχανισμών πολλαπλασιαστικών αδράνειας του παλμικού κυττάρων, ανιχνεύσαμε εκφράσεις του ΝΡ-κΒ σηματοδότησης πρωτεΐνες μονοπάτι και πρωτεΐνες κυκλίνης σε κύτταρα PANC-1. Τα αποτελέσματα μας αποκάλυψαν ότι οι εκφράσεις των πρωτεϊνών μονοπατιού ΝΡ-κΒ περιλαμβανομένων ΙΚΚ-α, ΙΚΚ-β, ΙκΒ-α, ο ΝΡ-κΒ ρ-65 και ρ-ρ65 ήταν προφανώς μειώθηκαν μετά την έκθεση σε nsPEF έναντι του ελέγχου (όλα ρ & lt? 0,01 ή 0.001) (Σχήμα 3Β). Υψηλότερη ένταση του nsPEF οδήγησε σε πολύ χαμηλότερα εκφράσεις αυτών των πρωτεϊνών σε σύγκριση με τον έλεγχο. Εν τω μεταξύ, οι εκφράσεις των πρωτεϊνών κυκλίνης, συμπεριλαμβανομένων CyclinD1 και Κυκλίνη Α μειώθηκαν επίσης σημαντικά μετά από έκθεση σε nsPEF έναντι του ελέγχου (ρ & lt? 0,01, 0,001, ή 0,05) (Σχήμα 3C). Έτσι, θεωρήσαμε ότι nsPEF θα μπορούσε να συμπιέσει NF-κΒ μονοπάτι για τη μείωση των εκφράσεων των πρωτεϊνών κυκλίνης σηματοδότησης.

Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι nsPEF ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω καταστολή NF-κΒ μονοπατιού σηματοδότησης για τη μείωση των εκφράσεων των πρωτεϊνών κυκλίνης, συλλαμβάνοντας έτσι φάσης G1 του κυτταρικού κύκλου.

NsPEF αδρανοποιημένο μετανάστευση των κυττάρων και εισβολής μέσω καταστολή Wnt /β-κατενίνης μονοπατιού σηματοδότησης

in vitro

η

η ενεργοποίηση της μετάστασης και εισβολής είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της καρκίνο [22,23]. Ο βαθμός της μετάστασης και εισβολής είναι ένα πρότυπο για την ταξινόμηση στάδιο των κακοήθων όγκων, και επίσης καθορίζει άμεσα θεραπευτικές στρατηγικές καρκίνου και την επιβίωση των ασθενών [35]. , Έτσι ώστε να ανιχνεύεται η ικανότητα της μετανάστευσης και εισβολής των καρκινικών κυττάρων μετά την αγωγή. Στη μελέτη μας, η ικανότητα μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων μετά την παλμός απότομα κόβονται σε σύγκριση με τον έλεγχο με δοκιμασία Trans-φρεατίων (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Α). Επιπλέον, βρήκαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε nsPEF κατείχε μια σημαντικά αδύναμη ικανότητα να εισβάλλουν σε σύγκριση με τον έλεγχο με χρήση του προσδιορισμού Matrigel εισβολής (ρ & lt? 0.001) (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα απέδειξαν ότι nsPEF θα μπορούσε να μειώσει κυτταρική μετάσταση και εισβολή σε καρκίνους.

(Α) ικανότητα μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF ελέγχθηκε με τη δοκιμασία trans-καλά. Τα μετανάστευσαν κύτταρα εκτίθενται σε nsPEF βάφτηκαν μωβ κατά 0,1% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους, παρατηρήθηκε υπό μικροσκόπιο φωτός για 40 ή 400 μεγεθύνσεις, και μετρήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση. Αρχική μεγέθυνση, 40 × & amp? 400 ×. *** P & lt? 0.001. (Β) Εισβολή ικανότητα των καρκινικών κυττάρων που εκτίθενται σε nsPEF ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Matrigel εισβολής. Μετά την επεξεργασία nsPEF, τα κύτταρα που κατείχε ικανότητα εισβολής διεισδύσει μέσα από την Matrigel, βάφτηκαν πορφυρό κατά 0,1% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους, και μετρήθηκαν για τη στατιστική ανάλυση. Αρχική μεγέθυνση, 40 × & amp? 400 ×. *** P & lt? 0.001. (Γ) Πρωτεΐνη εκφράσεις του Wnt /β-κατενίνης οδό σηματοδότησης περιλαμβανομένων hDPR1, β-κατενίνης και c-Myc σε καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία Western-κηλίδος. εκφράσεις (D) Protein των MMPs οικογένεια και VEGF σε καρκινικά κύτταρα μετά από έκθεση σε nsPEF με διαφορετικές εντάσεις ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία Western-κηλίδος. Σχετική ένταση της κάθε πρωτεΐνης αναλύθηκε με λογισμικό Photoshop CS4. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001

Η

Συσσωρευμένες αποδείξεις απέδειξε ότι Wnt /β-κατενίνης οδού σηματοδότησης παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην εμβρυϊκή ανάπτυξη και την ανθρώπινη διάφορες κακοήθειες. [36]. Οι δράσεις του Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης σε κύτταρα στόχους περιλαμβάνουν κυρίως μεταβολές στη γονιδιακή έκφραση, κυτταρική πόλωση, τη μετανάστευση και εισβολή μέσω της ρύθμισης των διακριτών κατάντη αποκρίνονται μόρια [37]. Ως καθοδικός τελεστής του /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt, οικογένεια MMPs πρωτεΐνες και VEGF παίζουν ένα κρίσιμο ρόλο στην εισβολή και μετάσταση όγκου [38]. Έτσι ανιχνεύεται πρωτεΐνη εκφράσεις της Wnt /β-κατενίνης μονοπατιού σηματοδότησης, οικογένεια MMPs και VEGF. Βρήκαμε ότι οι εκφράσεις του Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως πρωτεϊνών πορεία, περιλαμβανομένων κυρίως hDPR1, β-κατενίνης και c-Myc στα καρκινικά κύτταρα που εκτίθενται σε nsPEF είχαν σημαντικά μειωμένα με τη δόση εξάρτηση έναντι του ελέγχου (ρ & lt? 0,05 σε 20kV /cm, ρ & lt ? 0,01 στα 40kV /cm, ρ & lt? 0,001 στα 60kV /cm) (Εικόνα 4C). Επιπλέον, τα αποτελέσματα έδειξαν επίσης ότι οι εκφράσεις των πρωτεϊνών της οικογένειας VEGF και MMPs, συμπεριλαμβανομένων κυρίως ΜΜΡ1, ΜΜΡ2, ΜΜΡ9, ΜΜΡ 11, ΜΜΡ 12, ΜΜΡ14 και MMP21 μειώθηκαν σημαντικά σε διαφορετικούς βαθμούς με διαφορετικές εντάσεις nsPEF έναντι του ελέγχου (Σχήμα 4D). Έτσι θεωρήσαμε ότι θα μπορούσε να καταστείλει nsPEF Wnt /β-κατενίνης οδού σηματοδότησης προς τα κάτω ρύθμιση του γονιδίου έκφρασης των πρωτεϊνών της οικογένειας VEGF και MMPs.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν έντονα ότι nsPEF μπορούσαν να αδρανοποιήσουν τη μετάσταση και εισβολή ικανότητες των καρκινικών κυττάρων με αναστολή Wnt /β-κατενίνης οδού σηματοδότησης προς τα κάτω ρύθμιση του γονιδίου έκφρασης των πρωτεϊνών της οικογένειας VEGF και MMPs.

NsPEF λειτούργησε με ασφάλεια και αποτελεσματικότητα ως αντικαρκινική θεραπεία

in vivo

η

Με βάση την

in vitro

πείραμα, nsPEF μπορεί να επάγει κυτταρική απόπτωση, αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και αδρανοποιούν μετάσταση και εισβολή. Να προσδιορίσει περαιτέρω τη λειτουργία αντι-όγκου των nsPEF, εκτελέσαμε το πείραμα nsPEF στην έκτοπη ποντίκια που φέρουν όγκους μοντέλο. Η έκτοπη μοντέλο όγκου είναι μια πιλοτική μελέτη για περισσότερο σε βάθος ορθοτοπικό μοντέλο που αντικατοπτρίζει περισσότερο κλινικές εφαρμογές.

Κατά τη διάρκεια του πειράματος ζώων στο σύνολό τους, 2 ποντίκια στην ομάδα nsPEF πέθανε από υπερβολική δόση αναισθησίας και 1 στην ελέγχου πέθαναν από διφορούμενη αιτίες. Παρατηρήσαμε κατάσταση επιβίωση των υπολοίπων 47 ποντίκια που φέρουν όγκο (16 στον έλεγχο και 31 στην ομάδα nsPEF), και σημείωσε ότι nsPEF διατηρείται ποντίκια φυσιολογική σωματική δραστηριότητα και δεν είχε καμία επίδραση στο βάρος ποντίκια (Σχήμα 5Α), υποδεικνύοντας ότι η αντι- συνάρτηση του όγκου των nsPEF ήταν ασφαλής για τον ίδιο τον οργανισμό

in vivo

.