Αφηρημένο

Aneuploidy με το χρωμόσωμα αστάθεια είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου. Μελετήσαμε χρωμόσωμα 7 (CHR7) παραλλαγή αριθμό αντιγράφων (CNV) σε γλοιώματα και σε πρωτογενείς καλλιέργειες που προέρχονται από αυτά. Βρήκαμε ετερογένεια του όγκου με κύτταρα που έχουν CHR7-CNV συνήθως συμβαίνει σε γλοιώματα, με ένα υψηλότερο ποσοστό κυττάρων σε υψηλής ποιότητας γλοιώματα μεταφέρουν περισσότερους από 2 αντίγραφα του CHR7, σε σύγκριση με χαμηλού βαθμού γλοιώματα. Είναι ενδιαφέρον ότι, όλες οι CHR7-ανευπλοειδές τύπους κυττάρων στο γονικό καλλιέργεια των καθιερωμένων κυτταρικών γραμμών γλοιώματος επανεμφανίστηκε σε μονοκύτταρους προερχόμενο υποκαλλιέργειες. Στη συνέχεια χαρακτηρίζεται από τη βιολογία των τριών συγγενικών καλλιέργειες γλοιώματος κυριαρχείται από διαφορετικές CHR7-ανευπλοειδές κυτταρικούς τύπους. Βρήκαμε φαινοτυπικά απόκλιση για τα κύτταρα μετά από CHR7 mis-διαχωρισμού, η οποία επωφελήθηκε η συνολική αύξηση του όγκου

in vitro

και

in vivo

. Η μαθηματική μοντελοποίηση προτείνει την εμπλοκή του χρωμοσώματος αστάθεια και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών υποπληθυσμών στην αποκατάσταση της βέλτιστης ισορροπίας του κυττάρου όγκου τύπων. Τόσο τα πειραματικά μας δεδομένα και μαθηματική μοντελοποίηση έδειξε ότι η πολυπλοκότητα της ετερογένειας του όγκου θα μπορούσε να ενισχυθεί με την ύπαρξη των χρωμοσωμάτων με δομική ανωμαλία, εκτός από τους mis-διαχωρισμούς. Συνολικά, τα ευρήματά μας δείχνουν, για πρώτη φορά, η συμμετοχή του χρωμοσώματος αστάθεια στη διατήρηση της ετερογένειας των όγκων, η οποία αποτελεί τη βάση της ενίσχυσης της ανάπτυξης, την επιμονή και τη θεραπεία αντίσταση των καρκίνων

Παράθεση:. Hu Υ, Ru Ν, Xiao Η , Chaturbedi Α, Hoa NT, Tian XJ, et al. (2013) Tumor-Specific χρωμόσωμα Mis-Διαχωρισμός Ελέγχει τον καρκίνο πλαστικότητας με τη διατήρηση του όγκου ετερογένεια. PLoS ONE 8 (11): e80898. doi: 10.1371 /journal.pone.0080898

Επιμέλεια: Anita Β Hjelmeland, Cleveland Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 30, 2013? Αποδεκτές: 17 Οκτωβρίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 25 Νοέμβρη 2013

Copyright: © 2013 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από UC Irvine set-up κεφαλαίων και μια γενναιόδωρη δωρεά Stern Οικογένεια (YHZ και ML), οι επιχορηγήσεις που παρέχονται από UC Cancer Research Συντονιστικής Επιτροπής, UC Irvine Επιτροπή Έρευνας, Κέντρο Καρκίνου Σπόρος Grant (Βραβείο Αριθμός P30CA062203 από το National Cancer Ινστιτούτο), Musella Ίδρυμα για Brain Tumor Έρευνας & amp? Πληροφορίες και φωνής κατά Brain Καρκίνο (YHZ), National Science Foundation DMS-0969417 (JX), VA Merit κριτική Grant (MRJ). Zhenyu Jia υποστηρίζεται μερικώς από Guizhou Normal College, Γκουιγιάνγκ, Guizhou, της Κίνας, QKHJ [2013] 2238. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Liping Yu είναι υπάλληλος της Ziren Research LLC, Irvine, CA, USA. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Σύμφωνα με την αρχική υπόθεση κλωνική εξέλιξη Nowell [1], η ανάπτυξη του καρκίνου είναι μια εξελικτική και οικολογική διαδικασία, με πολλούς τρόπους μοιάζει με την εξέλιξη του Δαρβίνου [2]. Αυτή η υπόθεση υποστηρίζεται από την πρόβλεψη της εξέλιξης όγκων με γενετική διαφορετικότητα κλώνων σε οισοφαγικό αδενοκαρκίνωμα [3], και τώρα έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως μια εξήγηση για την ετερογένεια του όγκου παρατηρήθηκε σε περισσότερες μορφές καρκίνου κατά τη στιγμή της κλινικής διάγνωσης, τόσο στο αρχικό και μεταστατικών περιοχές [4], [5]. Η έννοια του καρκίνου ως μια εξελικτική διαδικασία, με όγκους που έχουν γενετικά και φαινοτυπικά ποικίλες υποπληθυσμών κυττάρων είναι συνεπής με την πρόσφατη μοντέλο καρκίνου των βλαστικών κυττάρων, η οποία δίνει έμφαση στη σημασία του καρκίνου που έχει ένα τύπο κυττάρου ικανό να παράγει άλλους τύπους κυττάρων σε έναν μονοκατευθυντικό τρόπο [6 ] – [9]. Ωστόσο, η διαπίστωση των φαινοτυπικών δια-μετατροπή μεταξύ τριών υποπληθυσμών των κυττάρων εντός κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού, που οδηγεί σε μια ισορροπία πληθυσμό κυττάρων [10] αποκάλυψε την ικανότητα των καρκινικών να ανακτήσει βιολογικής ποικιλότητας από περισσότερο από το στέλεχος που μοιάζει με κύτταρο υποπληθυσμό. Τέτοια δυνατότητα να ανακτήσει τις συνθήκες ισορροπίας μετά από μια διαταραχή είναι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα ενός καθιερωμένου, καλά ισορροπημένο οικοσύστημα. Το ερώτημα παραμένει κατά πόσο και με ποιο τρόπο μετάβασης των καρκινικών κυττάρων φαινοτυπική εκδηλώνεται ως μια κληρονομική χαρακτηριστικό.

Συσσωρευμένα στοιχεία υποστηρίζουν την άποψη ότι η μιτωτική λάθη αιτία χρωμόσωμα αστάθεια, η οποία οδηγεί την εξέλιξη του καρκίνου, με τη φυσική επιλογή δρα στο επίπεδο οικολογίας καρκίνου για να αποφευχθεί η κυτταρογενετική χάος. Προφανώς, η μη-τυχαία κατανομή των χρωμοσωμικών κέρδη και τις ζημίες εμφανίζονται σε συγκεκριμένους τύπους όγκων είναι ένα συνδυασμένο αποτέλεσμα του χρωμοσώματος αστάθειας και επιλογή για ειδικές φαινοτύπων μεταξύ μαζικές αλλαγές του μεταγραφικό [11] – [15]. Τα γλοιώματα είναι πρωτοταγείς κακοήθεις όγκοι του εγκεφάλου που έχει αστροκυτταρικές ή /και ολιγοδενδρογλοιακή χαρακτηριστικά κυμαινόμενης κακοήθειας. Το υψηλότερο βαθμό, δυστυχώς, η πιο συχνά δει γλοίωμα, είναι πολύμορφο γλοιοβλάστωμα (GBM, βαθμού IV), μορφολογικά, γενετικά, και κυτταρογενετικά ετερογενή, και ομοιόμορφα θανατηφόρα λόγω της ταχείας κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την έντονα επεκτατική συμπεριφορά [16] – [19]. Είναι γνωστό ότι η μεταβολή του χρωμοσώματος 7 (CHR7) αριθμός αντιγράφων εμφανίζεται σε αμφότερες τις υψηλού και χαμηλού βαθμού γλοιώματα και ότι αυτές οι αλλαγές φαίνεται να σχετίζονται με επεμβατικές και πολλαπλασιαστικών φαινοτύπων κυττάρου [20] – [24]. Εδώ αναφέρουμε μελέτες των CHR7-ανευπλοειδίας που σχετίζονται με την ποικιλομορφία των κυττάρων και του ρόλου των CHR7 MIS-διαχωρισμού (CHR7-MS) για τη διατήρηση της φαινοτυπικής ποικιλότητας του γλοιώματος κυττάρου υποπληθυσμών, η οποία παράγει μια συνεργική επίδραση στη συνολική ανάπτυξη του όγκου.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

τα κατεψυγμένα και νωπά δείγματα γλοιώματος δόθηκαν από τις Τραπεζών ιστών του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, Irvine και το Πανεπιστήμιο του Αρκάνσας Ιατρικών Επιστημών, με την έγκριση Institutional Review Board.

εργασιών των ζώων και του υποδόριου (sc) και ενδοκρανιακής (sc) ξενομοσχεύματα

Το έργο ζώο εγκρίθηκε από φροντίδας των ζώων και της Επιτροπής Χρήση (IACUC) του Πανεπιστημίου της Καλιφόρνια, Irvine. Για μελέτες χρησιμοποιώντας ενδοκρανιακής (Ic) ξενομοσχεύματα, κύτταρα γλοιώματος (1 × 10

5/3 μΙ ϋΜΕΜ /F12) εγχύθηκαν στο μετωπιαίο λοβό του ηλικίας 4-6 εβδομάδων, θηλυκό, γυμνών ποντικών (κηλίδα NCrNu-M, Taconic , Hudson, ΝΥ), ακολουθώντας IACUC εγκεκριμένες χειρουργικές διαδικασίες. Μετά την ε.δ. εμφύτευση, τα ποντίκια παρατηρήθηκαν καθημερινά και σε τακτά χρονικά διαστήματα ζυγιστεί για ετοιμοθάνατα πινακίδες (καμπούρα στάση, σημειώνεται απώλεια βάρους και την απομείωση βάδισμα). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία όταν αναπτύσσονται συμπτώματα του εγκεφάλου-ζημιά (αταξία, hemiparesia, κλπ) και /ή 20% απώλεια σωματικού βάρους, και την επόμενη μέρα ήταν ρεκόρ ως ημερομηνία επιβίωσης για ανάλυση επιβίωσης.

Για μελέτες που χρησιμοποιούν υποδόρια (sc) ξενομοσχεύματα, κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /50 μΙ ϋΜΕΜ /F12) εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς, πρόσθια προς τα δεξιά και αριστερά τους μηρούς, και στις δύο πλευρές. Οι μετρήσεις του όγκου ελήφθησαν κάθε 3-4 ημέρες μετά την εμφύτευση, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο V = (L * W

2) /2 (L, το μήκος? W, πλάτος). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε έναν προκαθορισμένο χρόνο του όγκου του όγκου πείραμα ή όταν υπερβαίνεται 1,5 cm

3.

Γλοίωμα πρωτογενείς καλλιέργειες και κυτταρικές γραμμές

Φρέσκα ανθρώπινους ιστούς γλοιώματος διαχωρίστηκαν ενζυμικά (0,05% θρυψίνη-ΕϋΤΑ επί 30-45 λεπτά στους 37 ° C), διασπάστηκαν μηχανικά (περνώντας μέσα από ένα γυάλινο σιφώνιο σε DMEM /F12 που περιείχε 0,10 mg /ml DNase και 10% ορού), και καλλιεργήθηκαν σε δύο επικαλυμμένες με κολλαγόνο (3-4 μg /cm

2) πιάτα καλλιέργειας σε ϋΜΕΜ /Ρ12 που συμπληρώνεται με 5% ορό εμβρύου βοοειδών, που ορίζεται ως προσκολλημένα ορού (SA) συνθήκες καλλιέργειας, και άγαρ (1%) – επικαλυμμένα πιάτα καλλιέργειας σε ϋΜΕΜ /F12 συμπληρωμένο με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF, 20 ng /ml), βασικό αυξητικό παράγοντα ινοβλαστών (FGF, 10 ng /ml), και 1-5% Β27 (Invitrogen, Carlsbad, CA), που ορίζονται ως συνθήκες καλλιέργειας νευρικών σφαίρα (NS). Οι πολυκύτταροι σφαίρες γλοιώματος που σχηματίζεται σε συνθήκες καλλιέργειας NS πέρασαν σε φιμπρονεκτίνη (1 μg /cm

2) με επικάλυψη πιάτα στο ίδιο μέσο καλλιέργειας πριν από την κατάψυξη ή την υποβολή σε ανάλυση FISH.

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές γλοιώματος ( Α172, LN229, LG11, T98G, U251, και U87) ελήφθησαν από το Τμήμα νευρο-Ογκολογίας, του Πανεπιστημίου του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου. Τα γενετικά προφίλ (δείκτες 7-STR παρέχονται από IDEXX Radil, Columbia, ΜΟ) που χρησιμοποιείται από αυτή τη μελέτη ήταν πανομοιότυπα ή πολύ παρόμοια με τα γενετικά προφίλ που αναφέρονται για κάθε κυτταρική γραμμή (Πίνακας S1). A172 που αναφέρονται εδώ ονομάστηκε αρχικά ως D54, αλλά μεταφέρει γενετικό προφίλ προτείνοντας μια παραλλαγή του A-172 που αναφέρθηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC). U251 ανέφεραν εδώ ονομάστηκε αρχικά ως U251HF, με γενετικό προφίλ προτείνοντας μια παραλλαγή του U251, σε σύγκριση με το U251 σε NCI-60 Cancer Cell Γραμμή Panel. Οι συγκρίσεις των παραλλαγών U251 (Πίνακας S2) παρέχονταν από Beth Bauer (IDEXX Radil).

Όλες οι κυτταρικές σειρές γλοιώματος (γονική) καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες ΑΕ. Τα παράγωγα SA και NS κλώνοι καθιερώθηκαν από απλές αποικίες σχηματίζονται στο 0,3% μαλακό άγαρ πάνω σε ένα στρώμα άγαρ πυθμένα (0,5%) σε DMDM ​​/F12 συμπληρωμένο με 5% βόειο ορό ή EGF /bFGF /B27 όπως και για NS καλλιέργειες, πήρε από ένα γυάλινο σωλήνα, και επεκτάθηκε σε ΑΕ ή NS συνθήκες. Για U251 οι ίδιες ομόζυγη μεταλλάξεις του PTEN [E242fs * 15 (723 724 insTT)] και ΤΡ53 (R273H) σε γονική και ΑΕ και NS-υποκουλτούρες εντοπίστηκαν από Mariam Youssef, Nirvi Shah και Anthony Wong (UC Irvine).

φθορισμού in situ υβριδισμού (FISH)

διαφάνειες μεταφάσης εξάπλωση-ελήφθησαν με έκθεση 80% confluently αναπτυσσόμενα κύτταρα να nacadozole διάλυμα (100 μg /ml τελική, Sigma) για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν (0.25% τρυψίνη /ΕϋΤΑ, Invitrogen) για τη συλλογή κυτταρικά ιζήματα, τα οποία υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα υποτονικό διάλυμα (ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών) για 5 λεπτά στους 37 ° C. Τα σφαιρίδια του κυττάρου στερεώθηκαν (μεθανόλη: παγόμορφο οξικό οξύ = 3:01) για τουλάχιστον 30 λεπτά. Τέλος, τα κυτταρικά εναιωρήματα έπεσαν πάνω διαφάνειες για να πάρει μετάφαση spreads χρωμόσωμα. Το πρότυπο Β-banding έγινε για τα πλακίδια που έγιναν όπως (ταυτόχρονα) κατεργασία με θρυψίνη, και χρωματίστηκαν με χρώση Giemsa (Invitrogen). FISH διεξήχθη σε μετάφαση spreads και τα τμήματα κατεψυγμένων όγκων (7 μm) χρησιμοποιώντας απευθείας Επισημασμένο φθορισμού DNA Probe κιτ με CEP Χ /CEPY, EGFR /CEP 7 και PTEN /CEP10 (Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL). Υβριδισμός, πλύση, και αντιχρωματισμός διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 250-300 κύτταρα ανά δείγμα μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο φθορισμού με ένα φακό 100 ×.

μόλυνση Lentivirus

Infectious φακοϊό παρήχθη με συν-επιμόλυνση του πλασμιδίου φορέα λεντοϊού pGIPZ-Κενό και pTRIPZ -Empty (Open Biosystems) με τη συσκευασία πλασμίδιο psPAX2 και φάκελο πλασμίδιο pCMV-VSVG στα κύτταρα ΗΕΚ-293Τ, ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

ανοσοφθορισμού αναλύσεις ic ξενομοσχεύματα

Οι κατεψυγμένες τομές (7-8 μm) του εγκεφάλου ποντίκι με ε.δ. ξενομοσχεύματα ήταν τοποθετημένα για άμεση παρατήρηση του φθορισμού εκφράζεται από το RFP και τα καρκινικά κύτταρα GFP-σημαίνονται με τη χρήση 2 × 20 × φακούς ενός μικροσκοπίου φθορισμού Keyence BZ8100, μετά την πυρηνική χρώση με DAPI. Δίπλα κρυοτομές υποβλήθηκαν σε αναλύσεις ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας 15 μg /ml κουνελιού BMI1 (ab38432, Abcam), 15 μg /ml ποντικό CD133 (130-090-422, Miltenyi Biotec), 10 μg /ml ποντικού CD31 (CBL1337, Chemicon), 15 μg /ml κατσίκα GFAP (SC-6170, Sana Cruz), 10 μg /ml Melk κουνέλι (A01390, GenScript), και 15 μg /ml του ποντικιού SPARC (SC-73051, Sana Cruz) πρωτογενή αντισώματα, που ακολουθείται από κατάλληλη δευτερογενές αντίσωμα, γαϊδάρου αντι-ποντικού, κουνελιού, αρουραίου ή αιγός Alexa Fluor 350 (μπλε), Alexa Fluor 488 (πράσινο), και Texas Red (Invitrogen), σύμφωνα με τη διαδικασία ανοσοφθορισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Οι τομές ιστού στερεώθηκαν με αντιδραστήριο αντιξεθωριάσματος παρατείνει Gold (Invitrogen), απεικόνιση με ένα φακό ενός μικροσκοπίου φθορισμού 40 × και απεικονίζεται με μια φωτογραφική μηχανή σημείο. εικόνες συν-εντοπισμός αποκτήθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nikon δύο λέιζερ (HeNe και αργό) PCM 2000 Ομοεστιακή συστήματος σε Eclipse E800 μικροσκόπιο με 100 × στόχος (Melville, ΝΥ) _ENREF_20.

νευρικών βλαστικών δοκιμασία διαφοροποίηση των κυττάρων

κύτταρα γλοιώματος (5-10 × 10

3) διατηρούνται σε νευρωνικά συνθήκες σφαίρα καλλιέργειας σπάρθηκαν σε 8 φρεατίων ολισθαίνει προ-επικαλυμμένες με ινωδονεκτίνη (10 ng /ml) για ολονύκτια καλλιέργεια στην αρχική μέσο ( μη διαφοροποίηση), ή σε πολυ-L-λυσίνη (15 μg /ml) επικαλυμμένα φρεάτια σε DMEM /F12 που περιέχει 1% FBS για 7-10 ημέρες καλλιέργειας (διαφοροποίησης)? ένας όγκος ενός δεύτερου φρέσκου μέσου προστέθηκε κάθε 3 ημέρες, πριν από την σταθεροποίηση για αναλύσεις ανοσοφθορισμού. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 4% PFA και αποκλείστηκαν με 10% ορό γαϊδάρου. Πρωτογενή αντισώματα (κουνέλι νεστίνη (1:1000) από Millipore (AB5922), ΜΑΡ2 ποντίκι (1:200) από Abcam (ab11267), και κατσικίσιο GFAP (1:300) από Sana Cruz (sc-6170), το ποντίκι Beta τουμπουλίνης III (1:200) από CHEMCON (MAB1637)), CD133 ποντίκι (1:50) από τη Miltenyi Biotec (130-090-422), Melk κουνέλι (1:200) από GenScript ΗΠΑ (A01390), και κουνελιών ΔΜΣ (1: 200) από Abcam επωάστηκαν με κύτταρα όλη τη νύχτα στους 4 ° C και αναπτύχθηκε με τη χρήση AlexaFluor δευτερεύοντα αντισώματα (ποντικού ή κουνελιού Alexa Fluor 488 nm και 594 nm (1:200) από Invitrogen).

σε πραγματικό χρόνο συγκριτική ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (CQ-PCR) και ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή (qRT-) PCR

δείγματα DNA από κατεψυγμένα δείγματα γλοίωμα απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ DNeasy (QIAGEN, Valencia, CA). CQ-PCR πρότυπο (CQ101 προϊόντος) και εκκινητές PCR για την ποσοτικοποίηση

EGFR

και τρία γονίδια αναφοράς στο 2q34 (

SPAG16

), 3p14.3 (

ERC2

), και 5q31.2 (

SPOCK1

) ήταν από Ziren Research LLC (Irvine, CA). Είναι ένα ανασυνδυασμένο DNA που περιέχει θραύσματα PCR του

EGFR

και αναφορά γονιδίων σε ένα κομμάτι για να προσδιοριστεί CNV όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ταχείας εκκίνησης SYBR-Green Ι Master Mix (Roche).

Το συνολικό RNA (~ 1 μg) που εξάγονται χρησιμοποιώντας Ultraspec (Biotecx) από την ΑΕ και NS-προσκολλημένες καλλιέργειες, μετά από μια 24 ώρες καλλιέργειας σε βασικό μέσο, ​​μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας 5 μονάδες αντίστροφης μεταγραφάσης Superscript II (Invitrogen). Τα δείγματα cDNA αραιώνονται και ποσοτικά για γονιδιακή έκφραση με πραγματικού χρόνου qRT-PCR (SYBR Green Ι) χρησιμοποιώντας ένα ενιαίο πρότυπο για τα γονίδια δείκτη και αναφοράς [27], κανονικοποιημένη στο

ACTB

. Ποσοτικοποίηση των

GAPDH

πραγματοποιήθηκε επίσης να συγκρίνουν με το γονίδιο ενδιαφέροντος. Οι αλληλουχίες εκκινητή για τα γονίδια σε qRT-PCR και CQ-PCR είναι διαθέσιμα από Ziren Research LLC (www.zirenresearch.com) κατόπιν αιτήματος.

Συγκριτική γονιδίωμα υβριδισμός (CGH)

DNA (1,5 μα) δείγματα κυττάρων γλοιώματος και ελέγχου (μια δεξαμενή έξι δείγματα φυσιολογικού ανθρώπινου DNA του αίματος) έχουν διαφορικά σημασμένο με Cy5 και Cy3-dUTP, αντίστοιχα, καθαρίζεται και στη συνέχεια υβριδοποιήθηκε με ένα Agilent Ανθρώπινου Γονιδιώματος CGH 244 k Microarray. Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά και κατέστησαν ορατά με χρήση δύο ανεξάρτητων μεθόδων, συμπεριλαμβανομένων Agilent Genomic Workbench 6.5 (Agilent) με αλγόριθμο Ζ-βαθμολογίας και ένα πρόγραμμα γραμμένο σε R (https://www.r-project.org/), που ανιχνεύεται με τον ίδιο χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Το κατώφλι του Z-score που χρησιμοποιείται για τη μέθοδο της Agilent ορίστηκε σε 4.

Η ζελατίνη zymography, ένζυμο ανοσομετρικές δοκιμασίες, κηλίδωση Western, και immunocytofluorescence

Οι πρωτεΐνες σε 24-ωρη μέσα καλλιέργειας κυττάρων κλιματιζόμενο καταβυθίστηκαν με 4 όγκους ψυχρής ακετόνης, περιστρέφεται αμέσως στις 14.000 rpm για 5 λεπτά στους 4 ° C, και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας ραδιοανοσοκατακρήμνισης (RIPA) που περιέχει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Η ίδια ποσότητα του ρυθμισμένου μέσου πρωτεΐνη χρησιμοποιήθηκε για να τρέξει ζυμογραφία ζελατίνης. Ρυθμισμένο μέσο υποβλήθηκε σε ενζυμική ανοσοπροσροφητική δοκιμασία (ELISA) για VEGFA (VEGF-165) και SPP1 (οστεοποντίνη) χρησιμοποιώντας κιτ από Assay Designs (Αηη Arbor, ΜΙ), και ΡΤΝ από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Σε υπερήχους ολόκληρων κυττάρων σε RIPA λύμα χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει κηλίδωση Western, με αντισώματα του EGFR από τη Cell Signaling, και ακτίνης από EMD Bioscience. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πολυ-Ε-λυσίνη ή Ινονεκτίνης επικαλυμμένα πλακίδια θαλάμου 8 φρεάτων, 2 × 10

4 κύτταρα ανά θάλαμο, και επωάστηκαν όλη τη νύκτα, μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη σε PBS, με μια σύντομη διαπερατοποίηση σε 0.1% Triton Χ -100, και μια ολονύκτια επώαση με πρωτογενές αντίσωμα EGFR στους 4 ° C. Το σήμα immunocytofluorescence ανιχνεύθηκε μετά από επώαση με Alexa Fluor® 594 δευτερεύον αντίσωμα.

μαλακό άγαρ σχηματισμού αποικίας δοκιμασία

800-1000 κύτταρα αναμείχθηκαν με 1 ml 0,3% μαλακό άγαρ σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 5% βόειο ορό ή ένα συμπλήρωμα μιτογόνο για NS καλλιέργειες όπως περιγράφεται λεπτομερώς ανωτέρω, απλώνεται πάνω σε σκληρυμένες 0,5% μαλακό άγαρ στο ίδιο μέσο (1 ml ανά φρεάτιο σε τέσσερα γωνιακά φρεάτια μιας 6-φρεατίων). 1 ml του ίδιου μέσου προστέθηκαν 2 και 3 εβδομάδες αργότερα και οι αριθμοί αποικιών μετρήθηκαν 4 εβδομάδες αργότερα κάτω από ένα μικροσκόπιο με 4 × φακό.

Στατιστική ανάλυση

ανάλυση MANOVA χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με τριμερή οικόπεδα (https://www.davidgraham.org.uk) να συγκρίνουν GBM σε δείγματα OG για τα ποσοστά των κυττάρων που φέρουν ένα αντίγραφο, σε δύο αντίγραφα, ή ≥3 αντίγραφα CHR7. Stem-όπως σε κύτταρα και nonstem-σαν κύτταρο-εμπλουτισμένα υποκαλλιέργειες συγκρίθηκαν για διαφορές στην έκφραση των γονιδίων, ELISA, και τα δεδομένα ζυμογραφία με τη βοήθεια 2-δείγματος ίσο-διακύμανση t-tests. Συνολική επιβίωση ποντικών που έφεραν ξενομοσχεύματα γλοιώματος ενδοκρανιακής εκτιμήθηκε μέσω καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier, στη συνέχεια συγκρίνονται για διαφορές χρησιμοποιώντας ένα στρωματοποιημένο μοντέλο παλινδρόμησης Cox, προκειμένου να προσαρμοστεί για τους πιθανούς παραλλαγή ( «επιδράσεις Day») μεταξύ των διαφόρων πειραμάτων. εκδόσεις SAS 9.2 και 9.3 (Η SAS Institute, Cary, NC) χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις αναλύσεις και

P

& lt?. 0.01 χρησιμοποιήθηκε ως τιμή σημασία για την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις χωρίς overinflating σφάλμα τύπου ΙΙ

Μαθηματική μοντελοποίηση

Μαθηματικό μοντέλο κατασκευής.

Δείξτε x1, x2, x3, x4, x5 και τις αφθονίες των κυττάρων με 1-5 αντίγραφα των CHR7. Εμείς παραμεληθεί κύτταρα με 6 αντίγραφα, υποθέτοντας ότι ήταν ανάφαση τα στάδια της 3-αντίγραφο κύτταρα CHR7. Δεν περιμέναμε ότι τα παρακάτω αποτελέσματα θα επηρεαστούν σημαντικά από αυτήν την υπόθεση αφού το ποσοστό των κυττάρων 6-αντίγραφο είναι χαμηλή σε όλες τις μετρήσεις. Για λόγους απλότητας μπορούμε επίσης να υποθέσουμε ότι τα ποσοστά mis-διαχωρισμό των φυσιολογικών και μη φυσιολογικών CHR7 είναι το ίδιο. Για κέντρων αειφόρου εμπορίου (2Chr7: 1η, 1δ), υποθέτουμε τα κύτταρα μπορούν είτε να διαιρούνται συμμετρικά, ή έχουν ένα CHR7 mis-διαχωρισμού, όπως συνοψίζονται παρακάτω

Επίσης, για τρίτες μεσογειακές χώρες (3Chr7: 2η, 1δ), έχουμε

Οι παράμετροι

r

i είναι η σταθερά ρυθμού αύξησης των ειδών

i

, p

2 και p

3 αναφέρονται στις πιθανότητες της ασύμμετρης (εσφαλμένη) διαχωρισμό ενός ζεύγους CHR7 στις κέντρων αειφόρου εμπορίου και οι τρίτες μεσογειακές χώρες ανά την κυτταρική διαίρεση, αντίστοιχα. Σε γενικές γραμμές αυτές οι πιθανότητες εξαρτώνται από την x, αλλά για λόγους απλότητας αμελούμε τέτοια πιθανή εξάρτηση. Παρατηρήστε ότι για την TMCs, διπλό mis-διαχωρισμός των δύο ζευγών CHR7 μπορεί να οδηγήσει είτε 1 + 5 ή 3 + 3, για το οποίο υποθέτουμε ίσες πιθανότητες. Για τα κύτταρα με άλλα CHR7 αντιγράψετε αριθμούς, δεδομένου ότι τα ποσοστά τους είναι πολύ χαμηλή, θα παραμεληθεί τα ακόμη μικρότερα εισφορές των πιθανών γεγονότων χρωμοσώματος mis-διαχωρισμού. Οι εξισώσεις ποσοστό

Για την ευκολία της συζήτησης μπορούμε επίσης να δηλώσει το ποσοστό του κάθε υποπληθυσμό α σε ένα δεδομένο χρονικό σημείο i ως. Οι ποσότητες αυτές ήταν αυτό που μετρούνται πειραματικά χρησιμοποιώντας FISH.

Θεωρούμε τρεις περιπτώσεις

Δεν mis-διαχωρισμού, δηλαδή, p

2 = p

3 = 0 ΠΚ και MCs δεν έχουν άμεση αμοιβαία επιρροή

υπάρχει Mis-διαχωρισμού, κέντρων αειφόρου εμπορίου και οι τρίτες μεσογειακές χώρες δεν έχουν άμεση αμοιβαίες επιδράσεις

υπάρχουν Missegragation, κέντρων αειφόρου εμπορίου αναστέλλει μερικώς την ανάπτυξη του τρίτες μεσογειακές χώρες, η οποία διαμορφώνεται από μια συνάρτηση Χιλ, όπως και MCs ενεργοποιήσετε την ανάπτυξη της SCS, που έχει ως πρότυπο, όπως, όπου και είναι το σταθερό ρυθμό αύξησης της TMC, όταν STIC ποσοστό και, αντίστοιχα, και είναι και το σταθερό ρυθμό αύξησης των STIC όταν TMC ποσοστό και, αντίστοιχα. Μπορούμε πραγματικά να εξετάσει και την περίπτωση με συντελεστή Χιλ 4 αντί για 2, αλλά το αποτέλεσμα δεν δείχνει σημαντική αλλαγή

Η

Αριθμητική μέθοδος

Τα παραπάνω συνήθεις διαφορικές εξισώσεις επιλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Matlab. Στην αρχή κάθε διέλευση, εμείς rescale έτσι. Πειραματικά. Για τη μαθηματική μοντελοποίηση μας ο ακριβής αριθμός των Ν

0 δεν επηρεάζει τα αποτελέσματα. Για πέρασμα 1, χρησιμοποιήσαμε τις τιμές των ρ χρησιμοποιούνται πειραματικά ως τις αρχικές τιμές. Για τις επόμενες περάσματα, χρησιμοποιήθηκαν οι τιμές ρ υπολογίζεται στο τέλος του προηγούμενου εδαφίου καθώς οι αρχικές τιμές.

Για κάθε περίπτωση, το καλύτερο σύνολο των παραμέτρων που λαμβάνονται με την ελαχιστοποίηση όπου και αναφέρονται στις υπολογίζεται και μετριέται ποσοστά υποπληθυσμός α στο τέλος του περάσματος i, αντίστοιχα. Χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση του απλού κάτω-λόφο [28] για την εκτέλεση της ελαχιστοποίησης. Με κάθε καλύτερο σύνολο των παραμέτρων, προβλέψαμε τους χρόνους διπλασιασμού.

Αποτελέσματα

ετερογένεια του όγκου καθορίζεται από CHR7-CNV υπάρχει συνήθως σε υψηλή και χαμηλή γλοιώματα βαθμού

Για να προσδιορίσετε CHR7 παραλλαγή αριθμό αντιγράφων (CNV) σε κυτταρικό επίπεδο υποπληθυσμό, εκτελέσαμε φθορισμού

in situ

υβριδισμός (FISH), με διπλή ανιχνευτές για την

EGFR

γονίδιο και την κεντρομερική περιοχή του χρωμοσώματος 7 (CEP7 ). Εξετάσαμε GBM και ολιγοδενδρογλοιακή όγκου (ΟΤ), το δεύτερο πιο κοινή ομάδα γλοιώματα, που χαρακτηρίζεται από ολιγοδενδρογλοιακή χαρακτηριστικά. OT περιλαμβάνει ολιγοδενδρογλοίωμα (ΦΕΚ, βαθμός ΙΙ), ολιγοαστροκύτωμα (ΟΑ, βαθμός ΙΙ)? και αναπλαστικό ολιγοδενδρογλοίωμα (AO, βαθμού ΙΙΙ), με βάση τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Ο αριθμός των CHR7 κεντρομερών ανά πυρήνα, ανιχνεύεται από τον ανιχνευτή FISH CEP7, προσδιορίστηκε μετρώντας πάνω από 250 κύτταρα ανά όγκο, και τα δεδομένα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για να καθοριστεί το επίπεδο της ετερογένειας των όγκων σε σχέση με CHR7-CNV. Στη συνέχεια πραγματοποιείται μια σύγκριση των διαφορών στην κατάσταση ισορροπίας για την ετερογένεια του όγκου βασίζεται σε δεδομένα CHR7-CNV από 14 GBMs και 12 OGS. Υπήρχε ένα σημαντικά υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων που μεταφέρουν περισσότερους από 2 αντίγραφα CHR7 (ενίσχυση) σε GBM σε σύγκριση με το OG (

P

& lt? 0,0005) (Εικόνα 1Α). Σε αντίθεση με OG, η CHR7-CNV στην ΟΑ και ΑΟ ήταν κοντά σε αυτή του GBM, με αντιπροσωπευτικά δεδομένα που παρουσιάζονται στο Σχήμα 1Β.

Α, τριαδικό οικόπεδο αναλογίες πληθυσμού με 1 αντίγραφο (διαγραφή), 2 αντίγραφα (κανονικό), και 3 ή περισσότερα (ενίσχυση) αντίγραφα των CHR7, με βάση τα σήματα CEP7 στο Ffuorescent

in situ

υβριδισμός (FISH) της multiformes 14 γλοιοβλάστωμα (GBMs,

Κόκκινο τρίγωνο

) και 12 ολιγοδενδρογλοιακή όγκου (OGS,

μαύρο τετράγωνο

),

P

= 0,0012 από την ανάλυση MANOVA. Β, η σύγκριση της ετερογένειας των όγκων σε σχέση με χρωμόσωμα 7 (CHR7) ανευπλοειδία στην αρχική όγκου (Τ) και τα αντίστοιχα ηλικίας 3-4 εβδομάδων πρωτογενείς καλλιέργειες υπό προσκολλημένα ορού (SA) ή συνθήκες καλλιέργειας νευρικών σφαίρα (NS). C-D, τα πρότυπα των κυττάρων με CHR7-CNV σε διαδοχική και υψηλής EGFR ενισχύεται GBMs. Εκπρόσωπος φωτογραφίες FISH των κυττάρων που φέρουν 1-4 αντίγραφα CHR7 με εστιακή ενίσχυση του EGFR.

Η

Για να διαπιστώσετε εάν CHR7 CNV-χαρακτηρίζεται πληθυσμούς καρκινικών κυττάρων είναι βιώσιμα και να συνεισφέρουν στην διαφορετικότητα κλώνων μέσα σε κάθε όγκο, εξετάσαμε βραχυπρόθεσμα (4-6 εβδομάδες με 1-2 περάσματα) πρωτογενείς καλλιέργειες κάτω προσκολλημένη στον ορό (Α.Ε.) ή /και συνθήκες καλλιέργειας νευρικών σφαίρα (NS). Βρήκαμε κύτταρα υποπληθυσμού με CHR7-CNV σε όλες τις πρωτεύουσες καλλιέργειες εξετάστηκαν γλοιώματος (Σχήμα 1Β). Υπήρχε ένα υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων με CHR7-ενίσχυση σε καλλιέργειες από GBM σε σχέση με εκείνους από OG. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, το ποσοστό των κυττάρων με CHR7-ampliciation ήταν υψηλότερη σε πρωτογενείς καλλιέργειες από ό, τι στο αντίστοιχο όγκο. Για AO, η οποία είναι μια πιο προοδευτική τύπος του ΟΤ, παρατηρήσαμε επίσης μια παρόμοια CHR7-ενίσχυση στον όγκο και σε παράγωγα πρωτογενή καλλιέργεια της. Είναι ενδιαφέρον ότι, σε ολιγο-Astro μικτή ΟΤ, που ονομάζεται «ΟΑ», η ισορροπία στη σύνθεση των κυττάρων για CHR7-ετερογένεια στις αρχικές όγκους ήταν παρόμοιο με αυτό στην GBM. Ωστόσο, στην ΟΑ που προέρχεται από πρωτογενείς καλλιέργειες, παρατηρήσαμε ετερογένεια εντυπωσιακά που μοιάζει με εκείνη του OG, με την πλειοψηφία των κυττάρων που έχουν δύο αντίγραφα CHR7 και λιγότεροι από το 40% των κυττάρων που φέρουν τρία ή περισσότερα αντίγραφα του CHR7 (Εικόνα 1Β).

στη συνέχεια, σε σύγκριση με τα πρότυπα της CHR7-ετερογένεια στο ΦΕΚ ή GBM με υποτροπιάζουσες και

de novo

κατάσταση, και δεν βρήκε κανένα συσχετισμό. Ωστόσο, υπήρξαν οριακές αυξήσεις στο ποσοστό των κυττάρων με CHR7-ενίσχυσης με διαδοχική GBMs (δηλαδή οι όγκοι του δείγματος συναρτήσει του χρόνου σε υποτροπή ή εξέλιξη) από έναν ασθενή με νευροϊνωμάτωση (Σχήμα 1 C). Αυτό είναι σύμφωνο με την παραπάνω ανάλυση δείχνει ταχύτερη ικανότητα ανάπτυξης για κύτταρα με CHR7-amplificaiton.

Μια άμεση μοριακή συνέπεια της CHR7 ενίσχυσης είναι η ενίσχυση του EGFR ογκογονίδιο που κατοικούν μέσα σε αυτό, το οποίο προσδίδει ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης. Εστιακό ενίσχυση του EGFR παρατηρείται συχνά στην κλασική υπότυπο του GBM [29]. Έτσι, σε σύγκριση CHR7-CNV με EGFR-CNV, που καθορίζεται από πραγματικό χρόνο συγκριτική ποσοτική PCR. Βρήκαμε μια ισορροπημένη

EGFR

σε σχέση με γονίδια αναφοράς (αναλογία 0.7-1.3, δεδομένου μία παραλλαγή 20-30% σε ποσοτικού προσδιορισμού) σε όλες τις ολιγοδενδρογλοιακή όγκους (n = 17) και σε 53% των GBMs (n = 51), και ένα χαμηλό επίπεδο

EGFR

ενίσχυση (αναλογία 1,4 έως 2) σε 23,5% του GBMs, όλα καλά συσχετίζεται με υπολογίζεται

EGFR

επίπεδα, με βάση το ποσοστό των κυττάρων και τους αριθμός CHR7. Στο υπόλοιπο 23,5% της GBM, βρήκαμε ένα υψηλό επίπεδο

EGFR

ενίσχυση (αναλογία μεταξύ 5 – 48), η οποία επιβεβαιώθηκε από τον EGFR /CEP7 FISH να είναι εστιακή ενίσχυση EGFR (Εικόνα 1D). Σε EGFR (εστιακό) ενισχύεται GBMs, η εξέλιξη του ετερογένειας CHR7-όγκου βρέθηκε να είναι παρόμοια με εκείνη GBMs χωρίς EGFR (εστιακή) ενίσχυση.

Όλα μαζί, παρατηρήσαμε μια σημαντική επίπεδο ετερογένειας των όγκων, με κύτταρα που δείχνουν CHR7-CNV συνήθως συμβαίνουν σε δύο χαμηλής και υψηλής ποιότητας γλοιώματα. Μονοσωμία του χρωμοσώματος 10 είναι επίσης μια αστάθεια χρωμόσωμα σχετίζονται λειτουργικά κακοήθειας του όγκου [30] και εμφανίζεται σε περίπου 80% των όγκων GBM. Όταν υπάρχει, μονοσωμία 10 φαίνεται ομοιογενώς, σε αντίθεση με την ετερογένεια δει για CHR7. Αυτή η διαφορά δείχνει ότι πρέπει να υπάρχει μια ενεργός διαδικασία για τη διατήρηση CHR7 ετερογένεια σε όγκους, τα οποία έχουμε εντοπίσει να είναι CHR7-MS. Να μελετήσει περαιτέρω τη διαδικασία αυτή εξετάσαμε CHR7-MS και CHR7-CNV σε καθιερωμένες κυτταρικές σειρές γλοιώματος.

CHR7-MS εμπλέκεται στη διατήρηση της κυτταρικής ετερογένειας σε κυτταρικές σειρές που ιδρύθηκε γλοιώματος

Πραγματοποιήσαμε B- banding χρησιμοποιώντας χρώση Giemsa για επάλειψη χρωμόσωμα έξι ανθρώπινης κακόηθες γλοίωμα κυτταρικές σειρές και προσδιορίζεται το εύρος των ακέραιων αριθμών χρωμοσωμάτων (WCN) συγκεντρωμένα γύρω από τη λειτουργία βασίζεται σε περισσότερα από 7 κύτταρα. EGFR /CEP7 FISH πραγματοποιήθηκαν και μετρήσεις των σημάτων CEP7 σε περισσότερες από 250 μεσόφαση κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί το ποσοστό των κυττάρων που φέρουν διαφορετικούς αριθμούς CHR7 (Εικόνα 2Α). Όλες οι κυτταρικές σειρές γλοιώματος έδειξε συνύπαρξη διαφορετικών υποπληθυσμών κυττάρων βασίζεται σε CHR7-CNV, με ένα σημαντικό ποσοστό των κυττάρων που φέρουν 2-, 3- και 4-αντίγραφα CHR7 με ένα σχεδόν διπλοειδές καρυότυπο (U251, U87 και LG11) , 4-, 5-, και 6-αντίγραφα CHR7 σε εγγύς-τριπλοειδείς /τετραπλοειδή (Α172 και LN229), και 6-, 7- και 8-αντίγραφα CHR7 σε σχεδόν pentaploid καρυότυποι (T98G).

Α-Β, το ποσοστό των κυττάρων με CHR7-CNV σε κυτταρικές σειρές γλοιώματος, και SA και NS υποκουλτούρες τους από ενιαίο (π.χ. 1, 2) ή να αναμιχθεί (mix) μαλακό άγαρ αποικίες, αντίστοιχα. Ακέραιους αριθμούς χρωμοσωμάτων (WCN) που κυμαίνονται κοντά τον τρόπο βρέθηκαν σε & gt? Το 50% των κυττάρων σε κάθε κυτταρική σειρά γλοιώματος. D, FISH εικόνες που δείχνουν την κανονική (Ν) και παράγωγο (δ) CHR7 και το άγνωστο (?) Χρωμόσωμα που φέρει ένα μετατοπιζόμενο EGFR από ένα αντιπροσωπευτικό μετάφασης κυττάρων για κάθε κυτταρική γραμμή. Το χρωμόσωμα φαίνεται από DAPI (μπλε), κεντρομερίδιο και EGFR παρουσιάζονται με ανιχνευτές FISH για CEP7 (πράσινο) και EGFR (κόκκινο).

Η

Σύμφωνα με τους όρους SA-κουλτούρα που έχουν χρησιμοποιηθεί για την καλλιέργεια αυτών των κυτταρικές σειρές γλοιώματος, ιδρύσαμε υποκαλλιέργειες από μονοκύτταρους επιμετάλλωση ή μονές αποικίες μαλακό άγαρ των κυτταρικών γραμμών γλοιώματος, το οποίο ονομάσαμε SA κλώνοι (SA1, SA2, κλπ). FISH έδειξαν εκ νέου εμφάνιση του CHR7-κυττάρων ετερογένεια σε κάθε ένα από τους κλώνους SA (Σχήμα 2Β), διατηρώντας τα χαρακτηριστικά γνωρίσματα του CHR7 και

EGFR

ενίσχυση και /ή μετατόπιση που βρέθηκαν σε γονική καλλιέργειες τους (Σχήμα 2D) . Είναι ενδιαφέρον ότι, το ποσοστό αυτών των κυττάρων που ήταν στην πλειοψηφία στην γονική καλλιέργεια μειώθηκε στα κλωνική υποκαλλιέργειες SA. Η εξαίρεση ήταν LN229, η οποία είχε αρχικά αποτελείται από δύο υποπληθυσμών των κυττάρων σχεδόν ίση σε ποσοστό. Προφανώς, η ετερογένεια του όγκου διατηρήθηκε στην καθιερωμένη κυτταρική γραμμή γλοιώματος με CHR7-MS. Αναφέρει επίσης ότι μια καθιερωμένη κυτταρική γραμμή είναι ένα καλλιεργημένο κύτταρο οικοσύστημα με υποπληθυσμών φθάνοντας ορισμένη ισορροπία πάροδο του χρόνου. Στη συνέχεια αναρωτήθηκε αν με την αλλαγή των συνθηκών καλλιέργειας θα μπορούσε να αλλάξει την ισορροπία ετερογένεια, έτσι ώστε να επιτρέπουν σε ένα παρελθόν μειονότητα υποπληθυσμό των κυττάρων για να γίνει κυρίαρχη υπό τις νέες συνθήκες καλλιέργειας. Αν αυτό αποδειχθεί ότι είναι η περίπτωση, θα είμαστε σε θέση να ποικίλουν συνθήκες καλλιέργειας για να αποκτήσει επαρκή αριθμό των διαφόρων μειονοτικών κύτταρα για περαιτέρω μελέτη των φαινοτύπων και των εισφορών για την συνολική ανάπτυξη τους.

Είμαστε εκτεθειμένοι κυτταρικές σειρές γλοιώματος στην NS συνθήκες καλλιέργειας, οι οποίες αναπτύχθηκαν αρχικά για την καλλιέργεια νευρικών βλαστικών κυττάρων και στη συνέχεια να τροποποιηθούν για εμπλουτισμό κύτταρα γλοιώματος που εκφράζουν νευρικά βλαστικά-όπως χαρακτηριστικά γνωρίσματα των κυττάρων [31], [32]. Βρήκαμε ότι μετά την καλλιέργεια ενός μήνα σε συνθήκες NS, κατά την οποία υπήρχε μαζική πεθαίνουν από κύτταρα, (με τα νεκρά κύτταρα επανειλημμένα απομακρύνθηκε με διαβίβαση κύτταρα εμπρός και πίσω μεταξύ μη προσκολλημένα και φιμπρονεκτίνη μεσολάβηση προσκολλημένα συνθήκες σε μέσο NS), ένα μειονότητα υποπληθυσμός κυττάρων στην γονική γραμμή ήρθε να κυριαρχούν στις υποκουλτούρες NS. Ιδρύσαμε περαιτέρω κλωνική υποκουλτούρες NS από μεμονωμένες αποικίες σχηματίζονται σε μαλακό άγαρ παρασκευάζεται χρησιμοποιώντας μέσο NS, και το όνομα αυτών των «NS κλώνοι» (NS1, NS2, κλπ). Σχήμα 2C παρουσιάζει αντιπροσωπευτικά δεδομένα FISH της NS υποκουλτούρες του γλοιώματος κυτταρικές σειρές. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν εκ νέου εμφανίσεις της CHR7-κυττάρων ετερογένεια από κλωνική υποκουλτούρες NS.

Πήρε 4 εβδομάδες για να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό άγαρ, πριν από τη μεταφορά τους σε συνθήκες καλλιέργειας SA ή NS για περαιτέρω ανάπτυξη. Μετά τη μεταφορά, χρειάστηκαν περίπου 2 εβδομάδες για να αποκτήσουν αρκετά κύτταρα (2 × 10

5) για την ανάλυση FISH. Ο χρόνος που απαιτείται για την αποκατάσταση ετερογένεια πολιτισμού από ένα μόνο κύτταρο ήταν λιγότερο από 18 κυτταρικές διαιρέσεις, η οποία διήρκεσε περίπου 6-7 εβδομάδες. Re-κερδίζει ετερογενών κυτταρικών καλλιεργειών με CHR7-CNV σε κλωνική ΑΕ και NS υποκουλτούρες από όλες τις μελετηθεί κυτταρικές σειρές γλοιώματος έδειξε ότι CHR7-MS θα μπορούσε να συμβεί σε οποιοδήποτε κύτταρο υποπληθυσμό να οδηγήσετε την ποικιλομορφία του πληθυσμού των όγκων, ενώ οι συνθήκες καλλιέργειας καθόρισαν την ετερογένεια ισορροπίας του τύπους καρκινικών κυττάρων.

Δραματικές αλλαγές στην ισορροπία των κυτταρικών υποπληθυσμών μεταξύ ΑΕ και πολιτισμών NS σημειώθηκαν για τις δύο γλοιώματος κυτταρικές σειρές με τους κοντινούς διπλοειδή καρυότυποι, U251 και U87.