Αφηρημένο

διανομής φαρμάκων στα κύτταρα είναι θεμελιωδώς σημαντικό, αλλά συχνά παραβλέπεται, μεταβλητή στην αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Πολλοί ασθενώς βασική αντικαρκινικούς παράγοντες συσσωρεύονται εκτεταμένα στις όξινες λυσοσώματα των φυσιολογικών κυττάρων μέσω παγίδευσης ιόντων. Οι λυσοσωμικές παγίδευσης μειώνει τη δραστηριότητα των αντικαρκινικών φαρμάκων, δεδομένου ότι οι στόχοι αντικαρκινικών φαρμάκων συχνά εντοπίζονται στο κυτοσόλιο του κυττάρου ή πυρήνα. Ορισμένα καρκινικά κύτταρα έχουν ελαττωματικά οξίνιση των λυσοσωμάτων, η οποία προκαλεί ανακατανομή των παγιδευμένων φαρμάκων από τα λυσοσώματα στο κυτοσόλιο. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι τέτοιες διαφορές στον εντοπισμό των ναρκωτικών μεταξύ φυσιολογικών και καρκινικών κυττάρων μπορεί να συμβάλει στην προφανή εκλεκτικότητα του ασθενώς βασικών φαρμάκων στα καρκινικά κύτταρα

in vitro

. Στην εργασία αυτή, εξετάσαμε αν αυτή η ενδοκυτταρική διανομή με βάση την επιλεκτικότητα του φαρμάκου θα μπορούσε να βελτιστοποιηθεί με βάση την σταθερά διάστασης οξέος (pKa) του φαρμάκου, η οποία είναι μία από τους καθοριστικούς παράγοντες της ικανότητας δέσμευσης του λυσοσωματικής. Συνθέσαμε επτά ασθενώς βασική δομικά ανάλογα του αναστολέα Hsp90 γκελνταναμυκίνη (GDA) με τιμές pKa κυμαινόμενες από 5 έως 12. Η επιλεκτικότητα κάθε αναλόγου εκφράστηκε με τη λήψη αναλογίες αντι-πολλαπλασιαστική IC

50 τιμές των αναστολέων σε φυσιολογικούς ινοβλάστες με την IC

50 τιμές σε ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα HL-60. Παρόμοιες εκτιμήσεις εκλεκτικότητα διεξήχθησαν σε ένα ζεύγος κυτταρικών σειρών καρκίνου που διέφεραν σε λυσοσωμική ρΗ ως αποτέλεσμα της siRNA μεσολάβηση μεταβολή της έκφρασης ΑΤΡάσης υπομονάδας χυμοτοπίου πρωτονίων. Βέλτιστη επιλεκτικότητα παρατηρήθηκε για ανάλογα με τις τιμές pKa κοντά 8. Παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν με την εμπορική αντικαρκινικών παραγόντων με ποικίλες ασθενώς βασικές τιμές pKa. Οι αξιολογήσεις διευρύνει την κατανόηση του τρόπου με τον ασθενώς βασικές ιδιότητες μπορούν να βελτιστοποιηθούν για να επιτευχθεί η μέγιστη επιλεκτικότητα αντικαρκινικό φάρμακο προς τα καρκινικά κύτταρα με ελαττωματικό λυσοσωμικής οξίνιση

in vitro

. Πρόσθετες

in vivo

μελέτες απαιτούνται για να εξετάσει τη χρησιμότητα αυτής της προσέγγισης για την ενίσχυση της επιλεκτικότητας

Παράθεση:. Ndolo RA, Λουάν Υ, Duan S, Forrest ML, Krise JP (2012) Lysosomotropic Properties ασθενώς βασικών Anticancer Agents Προώθηση Cancer Cell Επιλεκτικότητα

In Vitro

. PLoS ONE 7 (11): e49366. doi: 10.1371 /journal.pone.0049366

Επιμέλεια: Irina V. Λεμπέντεβα, Enzo Life Sciences, Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1, Ιούνη του 2012? Αποδεκτές: 10 του Οκτωβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 του Νοέμβρη 2012

Copyright: © 2012 Ndolo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το NIH RO1 CA106655 επιχορήγησης (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Πολλά αντικαρκινικά φάρμακα υποφέρουν από κακή επιλεκτικότητα σε κύτταρα στόχους, που οδηγεί σε υψηλό βαθμό τοξικότητας και δυνητικά παρενέργειες που απειλούν τη ζωή? Ως εκ τούτου, η χημειοθεραπεία συχνά πρόωρα σταματήσει, μειώνοντας τις πιθανότητες ενός φαρμάκου επίτευξη πλήρως τις δυνατότητές του. Αντικαρκινικά φάρμακα έχουν συνήθως κάποιο βαθμό εγγενούς επιλεκτικότητας προς τα καρκινικά κύτταρα οφείλεται σε βιοχημικές και /ή μεταβολικές διαφορές μεταξύ φυσιολογικών και μετασχηματισμένων κυττάρων [1] – [3]. Η εγγενής εκλεκτικότητα ενός αντικαρκινικού παράγοντα μπορεί να ενισχυθεί περαιτέρω με τη χρήση μίας ποικιλίας προσεγγίσεων χορήγησης φαρμάκων με βάση την προτεινόμενη «μαγική σφαίρα» Ehrlich [4], [5]. Όλες αυτές οι στρατηγικές που στοχεύουν μοιράζονται ένα κοινό απαίτηση, η οποία είναι ότι η ενεργός κυτταροτοξικός παράγοντας πρέπει να συγκεντρώσουν σε μεγαλύτερο βαθμό μέσα ή γύρω από μετασχηματισμένα κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Παρά το γεγονός ότι έχουν πολλές δημιουργικές στρατηγικές έχουν εξεταστεί, όπως στρατηγικές προφάρμακο και σύζευξης αντισώματος-φαρμάκου, η θεραπευτική χρησιμότητά τους έχει κάπως περιοριστεί [6].

Η ενδοκυτταρική διανομή ενός φαρμάκου είναι ένα θεμελιωδώς σημαντικός παράγοντας για την αποτελεσματικότητα του φαρμάκου. Τα θηλαστικά κύτταρα εκτενώς σε διαμερίσματα, και τα δύο φάρμακα και οι στόχοι τους μπορούν να έχουν συγκεκριμένα και διακριτά ενδοκυττάρια μοτίβα εντοπισμού. Κατά συνέπεια, για να συμβεί η επιδιωκόμενο θεραπευτικό αποτέλεσμα, η ενδοκυτταρική θέση εντοπισμού του φαρμάκου πρέπει να είναι το ίδιο, σε κάποιο βαθμό, όπως εκείνη του στόχου του φαρμάκου. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει προηγουμένως ότι οι φυσικοχημικές ιδιότητες των φαρμάκων μπορούν να επηρεάσουν προβλέψιμα ενδοκυτταρικό μοτίβο εντοπισμού τους [7] – [10]. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι ένα μόνο φάρμακο μπορεί να έχουν ουσιαστικά διαφορετικές ενδοκυτταρικό εντοπισμό μοτίβα και της διακίνησης σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων [11], [12].

Η σκόπιμη στόχευση αντικαρκινικών φαρμάκων σε ενδοκυτταρικά διαμερίσματα στα καρκινικά κύτταρα αντιπροσωπεύει μια αναδυόμενη περιοχή της εξερεύνησης [13], [14]. Για παράδειγμα, τα μιτοχόνδρια έχουν δυνητικά αρνητικές μεμβράνη που συνδέεται με την εσωτερική μεμβράνη τους, η οποία έχει αποδειχθεί ότι οδηγεί την συσσώρευση των φαρμάκων με μετατοπισμένο κατιονικού φορτίου [15]. Σε αυτό το πλαίσιο, έχουν τα παράγωγα των αναστολέων Hsp90 έχουν αναπτυχθεί για να εκμεταλλευτεί αυτό το εύρημα και επομένως επιλεκτικά στοχεύουν ένα μιτοχονδριακό μορφή Hsp90 [16].

Εναλλακτικά, πολλά ασθενώς βασικά φάρμακα με εντοπισμένο κατιονικά φορτία έχουν δειχθεί ότι είναι εκτενώς απομονωμένος σε όξινα λυσοσώματα των κυττάρων μέσω ενός μηχανισμού παγίδευσης ιόντων, και οι ιδιότητες του κυττάρου και του φαρμάκου που επηρεάζουν αυτό έχουν αναθεωρηθεί [17]. Εν συντομία, το ρΗ των λυσοσώματα, σε σχέση με το ρΗ του κυτοσολίου, είναι ένα από τα βασικά φυσιολογικών παραμέτρων που υπαγορεύει την προβλεπόμενη βαθμός συσσώρευσης λυσοσωμικού [12], [17]. Όσο μεγαλύτερη είναι η βαθμίδα ρΗ λυσόσωμα-to-κυτοσόλιο, τόσο μεγαλύτερη η έκταση της δέσμευσης του λυσοσωμικών είναι. Για πολλούς αμίνες, λυσοσωμική παγίδευσης έχει αποδειχθεί ότι είναι αρκετά εκτεταμένη, και πιστεύεται ότι η προσέγγιση της συνολικής κυτταρικής συσσώρευσης [18]. Δεδομένου ότι οι στόχοι του φαρμάκου είναι σπάνια εντοπισμένη σε λυσοσώματα, η εκτεταμένη παγίδευση ασθενών βάσεων σε αυτό το επιμέρους μπορεί να μειώσει σημαντικά τις αλληλεπιδράσεις στόχου, μειώνοντας έτσι δραστικότητα του φαρμάκου.

Είναι ενδιαφέρον, εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι διάφοροι τύποι καρκινικών κυττάρων έχουν μια λυσοσωμική οξίνιση ελάττωμα [19] – [22]. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η λυσοσωμική ρΗ των καρκινικών κυττάρων έχει αναφερθεί ότι είναι 2 μονάδες ρΗ υψηλότερο από την λυσοσωματική ρΗ των φυσιολογικών κυττάρων [22]. Αυτή η αύξηση στο λυσοσωμικό ρΗ προβλέπεται να έχει μια βαθιά επίδραση στην ενδοκυτταρική κατανομή των ασθενώς βασικές αμίνες που είναι υποστρώματα για παγίδευση ιόντων σε λυσοσώματα (lysosomotropic παράγοντες). Συγκεκριμένα, η συγκέντρωση τέτοιων φαρμάκων θα μειωθεί στα λυσοσώματα των κυττάρων αυτών και ταυτόχρονα να αυξήσει στο κυτταρόπλασμα, καθώς και σε άλλα διαμερίσματα extralysosomal. Προτείνουμε ότι αυτή η διαφορά στη συμπεριφορά της διανομής φαρμάκων θα διευκολύνει την ενίσχυση της δραστηριότητας του φαρμάκου στα καρκινικά κύτταρα σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα.

Έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν τη βάση για αυτό το ενδοκυτταρικό φάρμακο διανομής που βασίζεται (BID) στόχευση πλατφόρμας χρησιμοποιώντας τόσο

in vitro

και

in vivo

προσεγγίσεις [12], [23], [24]. Χρησιμοποιώντας κύτταρα που αναπτύσσονται σε καλλιέργεια, εμείς ποσοτικά μέτρησε τις αναλογίες συγκέντρωσης λυσόσωμα-to-κυτοσόλιο των φαρμάκων σε κύτταρα με χαμηλή ή υψηλή λυσοσωματική ρΗ. Ασθενώς βασική αντικαρκινικά φάρμακα δείχθηκαν να ανακατανείμει από τα λυσοσώματα στο κυτοσόλιο όταν ανυψώθηκε λυσοσωματικής ρΗ. Αυτή η ενδοκυτταρική ανακατανομή των φαρμάκων είχε σαν αποτέλεσμα εντονότερη κυτοτοξικότητα έναντι κυττάρων με αυξημένα ρΗ λυσοσωματικής. Είναι σημαντικό ότι, όπως μεταβολές στην ενδοκυτταρική διανομή και τοξικότητα δεν παρατηρήθηκε για αντικαρκινικά φάρμακα χωρίς lysosomotropic ιδιότητες. Πιο πρόσφατα, ιδρύσαμε τη βάση για την πλατφόρμα στόχευσης IDB σε ποντίκια με την αξιολόγηση του βαθμού τοξικότητας που προκαλείται από φάρμακα σε ποντίκια με χαμηλά ή πειραματικά αυξημένα λυσοσωμικής pH [24].

Στην έκθεση αυτή συγκεκριμένα το ερώτημα κατά πόσον η lysosomotropic δυναμικό ενός αντικαρκινικού φαρμάκου συσχετίζεται με το βαθμό της IDB επιλεκτικότητας. Αυτό είναι ένα πολύ σημαντικό ζήτημα που θα μπορούσε να καθοδηγήσει τον ορθολογικό σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών παραγόντων με ιδιότητες που βελτιστοποιούν lysosomotropism και ως εκ τούτου IDB επιλεκτικότητα, ή την τροποποίηση των υφιστάμενων φαρμάκων για να μεταδώσει αυτές τις ιδιότητες.

Αποτελέσματα

επιλογή και σύνθεση των αναλόγων της γκελνταναμυκίνη με μια σειρά από ασθενώς βασικές τιμές pKa

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι ασθενώς βασικών αντικαρκινικών φαρμάκων με lysosomotropic ιδιότητες εμφανίζουν μεγαλύτερη επιλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα από ό, τι μη-lysosomotropic ομολόγους τους [12]. Στην παρούσα εργασία, εξετάσαμε την πρόβλεψη ότι η lysosomotropic δυναμικό των ασθενώς βασικών φαρμάκων συσχετίζεται με το βαθμό της διαφοράς εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα.

Για την αντιμετώπιση του ζητήματος αυτού, θεωρήσαμε τους παράγοντες ναρκωτικά που σχετίζονται που είναι γνωστό ότι συμβάλλουν στην lysosomotropism. Όλα τα υποστρώματα για lysosomotropism παγίδευση ιόντων και με βάση είναι ασθενώς βασική, αλλά δεν είναι όλες οι ασθενώς βασικές μόρια είναι lysosomotropic. Σε σχόλιό του σχετικά με το θέμα, de Ντουβέ πρότεινε ότι δύο ανεξάρτητες ιδιότητες του φαρμάκου που σχετίζονται επηρεάζουν την lysosomotropic δυναμικό ενός συγκεκριμένου φαρμάκου. Η πρώτη παράμετρος ονομάζεται άλφα και αντιπροσωπεύει την αναλογία διαπερατότητα της λυσοσωμικής μεμβράνης για το φάρμακο σε ιονισμένη του έναντι μη ιονισμένων μορφών. Έχουμε προηγουμένως προσδιοριστεί πειραματικά άλφα για έναν αριθμό ενώσεων με μέτρηση συντελεστών κατανομής οκτανόλης /ρυθμιστικού ως συνάρτηση του ρΗ και συσχετίστηκε αυτές τις τιμές με λυσοσωματικές παγίδευση [7]. Η δεύτερη σημαντική παράμετρος του φαρμάκου που σχετίζεται με το ρΚα του συζυγούς οξέος της βάσης. Έχουμε ήδη πειραματικά καθοριστεί πώς pKa των φαρμάκων επηρεάζουν λυσοσωμικών παγίδευση σε καλλιεργημένα κύτταρα [8].

Σε αυτό το έργο, επιλέξαμε να αξιολογηθεί η επίδραση της pKa στην επιλεκτικότητα με τη χρήση αναστολέων της kD πρωτεΐνη θερμικού σοκ 0 (Hsp90 ) που συστηματικά διέφερε σε ασθενή βάση τους pKa. Εμείς επιλέξαμε να τροποποιήσει τη θέση 17 του GDA αναστολέα Hsp90 να δημιουργήσουν παράγωγα με ποικίλη pKa δεδομένου ότι προηγούμενες εκθέσεις είχε δείξει ότι οι τροποποιήσεις σε αυτή τη θέση δεν μετέβαλε δραστηριότητα [25].

Για να βοηθήσει τον οδηγό μας επιλογή των παραγώγων με ποικίλες pKa, θεωρήσαμε μια περιγράφηκε προηγουμένως θεωρητική σχέση μεταξύ ασθενούς βάσης pKa και άλφα από την αναλογία λυσόσωμα προς εξωκυτταρική συγκέντρωση [17], η οποία δίνεται από την ακόλουθη έκφραση.

το συζυγές οξύ του ασθενούς βάσεως σταθερά διάστασης συμβολίζεται με Κ

α, και [η

+] υποδηλώνει τις συγκεντρώσεις πρωτονίων (δείκτης Ε αντιπροσωπεύει εξωκυττάριο και ο δείκτης L αντιπροσωπεύει λυσοσωμικής). Ο όρος άλφα (α) δηλώνει την αναλογία της διαπερατότητας της μεμβράνης λυσοσωμικής για το ιονισμένο βάση διαιρούμενο με αυτή των un-ιονισμένο ειδών [26]. Χρησιμοποιώντας αυτή την εξίσωση, υπολογίσαμε την θεωρητική αναλογία συγκέντρωσης λυσόσωμα προς εξωκυτταρικό μιας σειράς φαρμάκων με τιμές pKa κυμαινόμενες από 4 έως 14. Για τους υπολογισμούς, χρησιμοποιήθηκαν λυσοσωμική και εξωκυτταρικό τιμές ρΗ 4,4 και 7,4, αντίστοιχα, τα οποία είναι τυπικά τιμές για τα κανονικά κύτταρα [27], και μία τιμή άλφα του 0.01, το οποίο είχε προηγουμένως μετρηθεί για 17-DMAG, ένα ασθενώς βασικό παράγωγο του GDA [12]. Για να αποδειχθεί η πιθανή επίδραση των άλφα για λυσοσωμικών παγίδευση, έχουμε συμπεριλάβει οικόπεδα στα οποία αυτή η παράμετρος μεταβάλλεται. Χάραξη τις προβλεπόμενες λυσόσωμα προς εξωκυτταρικό αναλογίες συγκέντρωσης έναντι pKa έδωσε μια κωδωνοειδή καμπύλη, με την οποία ο μέγιστος βαθμός λυσοσωματικής παγίδευσης και το ρΚα στις οποίο συνέβη αυτό ήταν ευαίσθητα στο μέγεθος της παραμέτρου άλφα (βλέπε Εικόνα 1). Με βάση αυτές τις προσομοιώσεις, μπορούμε υποτεθεί ότι αντικαρκινικών παραγόντων που ποικίλουν σε ρΚα από περίπου 5 έως 12, θα χαρακτηριστούν επαρκώς την επίδραση των λυσοσωμικών παγίδευση στην επιλεκτικότητα όγκου.

Η εξίσωση που χρησιμοποιείται για αυτές τις προσομοιώσεις μπορούν να βρεθούν στο κείμενο. Το ρΗ του λυσοσώματα και εξωκυτταρικό χώρο ορίστηκαν σε 4.4 και 7.4, αντίστοιχα. Η παράμετρος άλφα μετεβάλλετο όπως σημειώνεται.

Η

Ως εκ τούτου, συντίθενται από έναν αριθμό ασθενώς βασικών αναλόγων του GDA σε μια προσπάθεια να αναπτύξουν από μικρό σύνολο των παραγώγων που είχαν τιμές pKa εκτείνεται αυτό το εύρος. Τα παράγωγα GDA συντέθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι και χαρακτηρίζεται από

1H-NMR (βλέπε κείμενο S1). Οι τιμές pKa για τα ανάλογα 1, 2, 3, 5 και 6 (βλέπε Σχήμα 2 για χημικές δομές) μετρήθηκαν στους 37 ° C χρησιμοποιώντας

1Η NMR. Για να προσδιοριστεί η pKa χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, οι χημικές μετατοπίσεις των πρωτονίων άλφα ως προς την αμίνη ιονιζόμενο σχεδιάστηκαν έναντι ρΗ, αποδίδοντας σιγμοειδή καμπύλες (Σχήμα S1) από το οποίο προέρχεται pKa. Για τις ενώσεις 4 και 7, pKa δεν μπορούσε να μετρηθεί με

1Η NMR οφείλεται είτε περιορισμένη διαλυτότητα σε D

2Ο και /ή κακώς επιλυθεί κορυφές πρωτονίων. Ως εκ τούτου, έχουμε αναφέρει προηγουμένως μετρούμενη τιμή pKa για την ένωση 4 που είχε αγοραστεί χρησιμοποιώντας μια εναλλακτική προσέγγιση [12], και θα αναφέρουν μια υπολογισμένη τιμή για την ένωση 7 (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Η ένωση 5 είχε δύο τιμές ρΚα 9.9 και 4.2. Μόνο η υψηλότερη τιμή pKa αναφέρεται στο Σχήμα 2, επειδή το δεύτερο είναι πολύ χαμηλή για να συμβάλει θεωρητικά να ιόν παγίδευση σε λυσοσώματα. Συλλογικά, οι τιμές pKa για καθένα από τα παράγωγα κυμαίνονταν από 5,8 να 12.4 (Σχήμα 2).

Οι επτά παράγωγα με διαφορετικές τροποποιήσεις ασθενή βάση στην θέση 17 του GDA απεικονίζεται. Οι τιμές pKa για τα παράγωγα 1, 2, 3, 5 και 6 μετρήθηκε πειραματικά χρησιμοποιώντας NMR πρωτονίων (n = 1). Η pKa για την ένωση 4 μετρήθηκε πειραματικά σε μια παλαιότερη χειρόγραφο (δείτε αποτελέσματα). Η pKa για την ένωση 7 εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι). Η συγγένεια δέσμευσης για κάθε ένα από τους αναστολείς με rHsp90 δείχνεται (n = 2), και βασίστηκε σε ένα προηγουμένως καθιερωμένο προσδιορισμό πόλωσης φθορισμού (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι).

Η

Για να δοκιμαστεί καταλλήλως την επίδραση της ασθενής βάση pKa στην επιλεκτικότητα, όλα τα παράγωγα του GDA πρέπει να διατηρήσουν κάποια ικανότητα να δεσμεύουν Hsp90 και δρουν ως αναστολείς. Για την εκτίμηση αυτή, αξιολογήσαμε τη συγγένεια δέσμευσης του καθενός από τα παράγωγα σε ανασυνδυασμένο Hsp90 και συγκρίθηκε η συγγένεια σύνδεσης με αυτήν του μη τροποποιημένου GDA. συγγένειες δέσμευσης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία πόλωσης φθορισμού που μετρά την ικανότητα των ενώσεων δοκιμής να εκτοπίσει ανταγωνιστικά FITC-συζευγμένο GDA από Hsp90. Οι τιμές (ΜΡ) πόλωση μετατράπηκαν σε ποσοστό ελέγχου (χωρίς φάρμακο) και παρίσταται γραφικώς έναντι της συγκέντρωσης του υπό εξέταση ενώσεων, δίδοντας σιγμοειδή καμπύλη από την οποία το IC

50 τιμή προσδιορίστηκε μέσω καμπύλης (σχήμα S2). Το K

i τιμές υπολογίστηκαν από IC

50 αξίες όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28] χρησιμοποιώντας μια ηλεκτρονική αριθμομηχανή (ελεύθερα διαθέσιμο σε https://sw16.im.med.umich.edu/software/calc_ki/). Η υπολογιζόμενη IC

50 για μη παραγωγοποιημένη GDA ήταν 230 nm, η οποία είναι παρόμοια με προηγουμένως αναφερθείσες τιμές που λαμβάνονται χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία [29]. Μια σύγκριση των τιμών Κ, δια GDA και των παραγώγων του υποδηλώνει ότι όλοι διατηρούν κάποια ικανότητα να δεσμεύουν Hsp90 και συνεπώς είναι κατάλληλες για τις αξιολογήσεις που περιγράφονται εδώ (Σχήμα 2).

Αξιολόγηση της ενδοκυτταρικής επιλεκτικότητας διανομής που βασίζονται

Για να εκφράσουν ποσοτικά επιλεκτικότητα, έχουμε συγκριτικά αξιολογούνται αντιπολλαπλασιαστικά IC

50 τιμές σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα που είχαν χαμηλές και υψηλές λυσοσωμικών pH, αντίστοιχα. Για αυτές τις αξιολογήσεις, χρησιμοποιήσαμε την ανθρώπινη λευχαιμική κυτταρική σειρά HL60, το οποίο έχουμε προηγουμένως δείξει ότι έχουν μια υπερυψωμένη λυσοσωματικής ρΗ [22]. Για τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε φυσιολογικών ανθρώπινων ινοβλαστών ακροποσθίας που είχαν προηγουμένως προσδιορισθεί να έχει ένα λυσοσωματική ρΗ 4.4 [22]. Οι καμπύλες κυτταροτοξικότητα και IC

50 τιμές που λαμβάνονται από αυτούς φαίνεται στο Σχήμα S3. Με τη διαίρεση του IC

50 καθορίζεται σε φυσιολογικά κύτταρα από το IC

50 στα καρκινικά κύτταρα, πήραμε το συνολικό επιλεκτικότητας (Εικόνα 3). Ο αναστολέας GDA μη lysosomotropic είχε μια συνολική επιλεκτικότητα κοντά σε δύο, γεγονός που δείχνει ότι GDA ήταν σχεδόν δύο φορές πιο ενεργό στην λευχαιμικών κυττάρων γραμμή όπως ήταν στα φυσιολογικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον, ασθενώς βασική αναστολείς με τιμές ρΚα κοντά 8 είχε αρκετές φορές μεγαλύτερη δραστικότητα στα λευχαιμικά κύτταρα με αυξημένα ρΗ λυσοσωματικής σύγκριση με τα φυσιολογικά κύτταρα. Ανάλογα του GDA που είχαν τιμές pKa πολύ πάνω ή κάτω από 8 δεν είχε εμφανή αύξηση της εκλεκτικότητας προς τα καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με μη παραγωγοποιημένη GDA. Σε γενικές γραμμές, η επίδραση του pKa στην επιλεκτικότητα έτειναν να δώσει ένα σχήματος καμπάνας διανομή η οποία ήταν παρόμοια με τη θεωρητική οικόπεδο συσχετίζοντας pKa με lysosomotropism (Σχήμα 1).

Συνολικά εκλεκτικότητα αντιπροσωπεύει το IC

50 για ένα παράγωγο σε φυσιολογικούς ανθρώπινους ινοβλάστες διαιρείται με την τιμή που λαμβάνεται σε ΗΙ_60 ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. (N = 3)? *,

σ

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με το GDA

Η

Η επιλεκτικότητα είναι πολυπαραγοντική, και κάθε επιτυχημένο φάρμακο κατά του καρκίνου θα πρέπει να παρουσιάζει μεγαλύτερη δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων σε σχέση με τα φυσιολογικά κύτταρα, μέσω μηχανισμών που δεν έχουν σχέση σε μεταβολές σε ενδοκυτταρικά συμπεριφορά διανομής που αξιολογούνται σε αυτό το χειρόγραφο [2], [3]. Για απ ‘ευθείας ο εξεταστεί η εκλεκτικότητα που μπορεί να αποδοθεί ειδικά σε αλλαγές στην ενδοκυτταρική συμπεριφορά κατανομή μεταξύ φυσιολογικών και μετασχηματισμένων κυττάρων, θεωρήσαμε επιτακτική για να συγκριθεί η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα ενός δεδομένου φαρμάκου σε δύο κυτταρικές γραμμές που είναι κατά τα άλλα όμοια αλλά έχουν χαμηλή (κανονικό) και αυξημένα (καρκίνος-παρόμοια) λυσοσωμική ρΗ. Αυτή η προσέγγιση θα ήταν πιο επιθυμητή επειδή οποιαδήποτε μεταξύ των κυψελών μεταβλητότητα σε παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν τη δραστηριότητα του φαρμάκου (π.χ., έκφραση των μεταφορέων εκροής φαρμάκου) θα μετριαστεί.

Αν και πολλές κυτταρικές σειρές καρκίνου έχουν δειχθεί ότι έχουν ελαττωματικό οξίνιση της λυσοσώματα, βρήκαμε ότι ένας αριθμός από αυτούς διατηρούν συνήθως οξινισμένο λυσοσώματα. Για παράδειγμα, η αδενοκαρκινώματος μαστού κυτταρική γραμμή MDA-MB-231 διατηρεί ένα λυσοσωμική ρΗ 4,2, παρόμοια με την λυσοσωματική ρΗ περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα [27]. Χρησιμοποιώντας αυτή την κυτταρική γραμμή, ερευνήσαμε μια προσέγγιση siRNA να ανυψώσει παροδικά λυσοσωμικών pH. Οι λυσοσωμικές ρΗ ρυθμίζεται από την ΑΤΡάσης κενοτοπική πρωτονίου (VH

+ – ΑΤΡάσης) [30], και Lu και οι συνεργάτες έχουν δείξει προηγουμένως ότι η μείωση της έκφρασης ενός υπομονάδα αυτού του ενζύμου, χρησιμοποιώντας siRNA, απέδωσε κυττάρων με αλλαγμένη V-ΑΤΡάση πρωτονίων άντληση δραστηριότητα, με καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [31]. Χρησιμοποιήσαμε μία παρόμοια τεχνική για να δημιουργήσει MDA-MB-231 κυττάρων με αυξημένο ρΗ λυσοσωματικής. Συγκεκριμένα, έχουμε στόχο το V1E1 υπομονάδα του V-ΑΤΡ για νοκ ντάουν χρησιμοποιώντας φορέα λεντοϊού shRNA. Η λεντοϊού μεταφορά επιτελούμενη επιλέχθηκε επειδή αυτή η προσέγγιση επιτρέπει την αποτελεσματική, υψηλής απόδοσης και σταθερών knockdown των πρωτεϊνών στόχων [30]. MDA-MB-231 κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με λεντοϊού σωματίδια που περιέχουν μη στόχους (κωδικοποιημένο) αλληλουχία shRNA διατήρησε χαμηλό λυσοσωματικής ρΗ και υπηρέτησε ως ένα σημαντικό έλεγχο για τυχόν μη ειδικά αποτελέσματα της λεντοϊού μόλυνσης στην βιωσιμότητα των κυττάρων. Knockdown έκφρασης V1E1 σε κύτταρα που λαμβάνουν ιικά σωματίδια στόχος επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western (Σχήμα 4Α). Σημαντικά, knockdown της υπομονάδας V1E1 οδήγησε σε καμία διακριτή επιδράσεις στην ανάπτυξη των κυττάρων κατά τη χρονική πορεία της IC

50 αξιολογήσεις (Σχήμα 4Β). Πειραματική αξιολόγηση της λυσοσωμικής pH μετά από να χτυπήσει κάτω το V-Η

+ – ΑΤΡάσης υπομονάδας έδειξε ότι λυσοσωμικής pH ήταν σημαντικά αυξημένα από ρΗ 4,4 έως ρΗ 5,8 (Σχήμα 4Α)

Α.. Η ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης υπομονάδας V1E1 παρουσιάζεται μαζί με τον έλεγχο φόρτωσης ακτίνης. Πειραματικά προσδιορισμένες τιμές pH λυσοσωμικών στη θεραπεία, ομελέτα shRNA- και V1E1 shRNA-κατεργασμένων κυττάρων φαίνεται (τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD, η = 3) B. V-ΑΤΡ υπομονάδα νοκ ντάουν δεν μεταβάλλει το ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων MDA-MB 231 κύτταρα . Οι μαύροι κύκλοι αντιπροσωπεύουν κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με το περιπλεγμένο φορέα shRNA και οι λευκοί κύκλοι αντιπροσωπεύουν κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τον V-ΑΤΡάση V1E1 shRNA. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 3 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο σε μια πλάκα 6 φρεατίων και θρυψινοποιήθηκαν, μετρήθηκαν και ανακαλλιεργήθηκαν κάθε 24 ώρες για 3 ημέρες (τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν την μέση τιμή ± SD, η = 3).

η

εν συνεχεία, αξιολογείται το IC

50 από τους αναστολείς Hsp90 και στους δύο τύπους κυττάρων (Εικόνα S4) και υπολογίζεται εκλεκτικότητα ως IC

50 σε MDA-MB-231 κυττάρων με χαμηλό pH λυσοσωματικές διαιρούμενο με IC

50 σε MDA-MB-231 κυττάρων με αυξημένο ρΗ λυσοσωματικής. Συνεπής με τις προσδοκίες μας, η δραστηριότητα των μη lysosomotropic GDA δεν επηρεάστηκε από την κατάσταση λυσοσωμικό ρΗ του κυττάρου και ως εκ τούτου δεν είχε εμφανή IDB επιλεκτικότητα (δηλαδή, IDB αξία επιλεκτικότητα κοντά σε μία, βλέπε Εικόνα 5). Οι τάσεις στην IDB εκλεκτικότητα ως συνάρτηση της Hsp90 αναστολέα pKa ακολούθησαν ένα παρόμοιο προφίλ σχήματος καμπάνας όπως έκαναν τα συνολικά αποτελέσματα επιλεκτικότητα που φαίνεται στο Σχήμα 3. Επιπλέον, οι συγκρίσεις του μεγέθους του IDB με συνολική εκλεκτικότητα υποδηλώνουν ότι IDB εκλεκτικότητα είναι ένας σημαντικός συμβάλλοντας παράγοντας στη συνολική εκλεκτικότητα αυτών των παραγόντων.

IDB εκλεκτικότητα ορίζεται ως το IC

50 σε MD MB-231-κύτταρα κατεργασμένα με περιπλεγμένο shRNA, τα οποία έχουν χαμηλό λυσοσωμικών pH, διαιρείται με την τιμή που λαμβάνεται από η ίδια κυτταρική γραμμή κατεργάζεται με shRNA έναντι του V1E1 υπομονάδα της ΑΤΡάσης πρωτονίων χυμοτοπίων, τα οποία έχουν αυξημένα λυσοσωματικής ρΗ. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. (N = 3)? *,

σ

& lt?. 0.05 σε σύγκριση με το GDA

Η

προηγούμενα αποτελέσματα μας είναι συνεπείς με την έννοια ότι οι αναστολείς Hsp90 με βέλτιστη ιδιότητες lysosomotropic (δηλαδή, οι τιμές pKa κοντά 8) θα έχουν ο μεγαλύτερος βαθμός IDB επιλεκτικότητα προς μετασχηματισμένα κύτταρα. Για την περαιτέρω αξιολόγηση αυτή, αξιολογήσαμε την IDB επιλεκτικότητα των συμπληρωματικών κατηγοριών αντικαρκινικών παραγόντων που κάνουν ή δεν διαθέτουν lysosomotropic ιδιότητες.

Η μιτοξαντρόνη και δαουνορουβικίνη είναι ασθενώς βασικών αντικαρκινικών παραγόντων που έχουν πυρηνικά στόχους και τις αξίες pKa κοντά στο 8 [32 ], η οποία θα πρέπει να προωθήσει lysosomotropism και IDB επιλεκτικότητα. Εναλλακτικά, η αντιμεταβολίτη 5-φθοριοουρακίλη είναι ασθενώς όξινο, με ρΚα 8 [33], και έτσι δεν θεωρούνται ένα υπόστρωμα για την παγίδευση ιόντων σε όξινα λυσοσώματα. Η 5-φθοροουρακίλη θα πρέπει ως εκ τούτου δεν έχουν ούτε ενδοκυτταρική κατανομή ούτε δραστηριότητα που επηρεάζεται από την κατάσταση λυσοσωματική ρΗ ενός κυττάρου. Ομοίως, αντικαρκινικοί παράγοντες που είναι αμφιοντικές, και με τα δύο ασθενώς όξινες και ασθενώς βασικές ομάδες, όπως χλωραμβουκίλη [34], δεν έχουν lysosomotropic και δεν θα πρέπει να παρουσιάζει IDB εκλεκτικότητα. Σύμφωνα με την επιχειρηματολογία μας, το μη lysosomotropic αντικαρκινικούς παράγοντες 5-φθοριοουρακίλη και χλωραμβουκίλη είχε IDB τιμές εκλεκτικότητος κοντά σε μία, παρόμοια με GDA (Σχήμα 6). Εναλλακτικά, οι παράγοντες lysosomotropic μιτοξαντρόνη και η δαουνορουβικίνη και οι δύο έδειξαν σημαντική αλλά διαφορετικούς βαθμούς IDB επιλεκτικότητας (Εικόνα 6). Οι καμπύλες κυτταροτοξικότητας για τις αξιολογήσεις αυτές φαίνεται στο Σχήμα S5.

Η μιτοξαντρόνη και δαουνορουβικίνη είναι ασθενώς βασικό με τιμές pKa κοντά στο 8 και έχουν σημαντικές IDB επιλεκτικότητα. Μη lysosomotropic αντικαρκινικούς παράγοντες 5-φθοριοουρακίλη και χλωραμβουκίλη έχουν IDB τιμές εκλεκτικότητα κοντά 1, πράγμα που αποδεικνύει ότι η δραστηριότητά τους δεν επηρεάζεται από λυσοσωματική ρΗ. Ράβδοι αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± Τ.Α. (N = 3).

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη που έχουμε, για πρώτη φορά, συστηματικά διερευνηθεί πώς η pKa των ασθενώς βασικών αντικαρκινικών παραγόντων επηρεάζει το βαθμό της IDB επιλεκτικότητα προς καρκινικά κύτταρα με αυξημένα ρΗ λυσοσωματικής. Προτείνουμε ότι η στόχευση πλατφόρμας IDB φάρμακο παρουσιάζει μια παραδειγματική στροφή στην προσέγγιση της σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών παραγόντων με βελτιωμένη και βελτιστοποιημένη εκλεκτικότητα προς τα καρκινικά κύτταρα. Παραδοσιακά SAR προσεγγίσεις για την ενίσχυση της επιλεκτικότητας εστίαση κυρίως στο σχεδιασμό φαρμάκων με μεγαλύτερη δραστικότητα έναντι καρκινικών κυττάρων, με λίγη προσοχή στην δραστικότητα του φαρμάκου σε φυσιολογικά κύτταρα. Οι περισσότερες προσεγγίσεις παράδοση που βασίζεται φάρμακο που προσπαθούν να αυξήσουν την επιλεκτικότητα βασίζονται σε ογκο-ειδική συσσώρευση του φαρμάκου /παράδοσης, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι αρκετά δύσκολο και δύσκολο να επιτευχθεί. Η IDB προσέγγιση στόχευση φαρμάκων που περιγράφεται εδώ επιτρέπει στο φάρμακο να διανείμει εξίσου τόσο σε φυσιολογικά όσο και μετασχηματισμένα κύτταρα? Ωστόσο, ο θεραπευτικός δείκτης του φαρμάκου διευρύνεται με σκόπιμα το σχεδιασμό του φαρμάκου να έχουν δυσμενείς ενδοκυτταρική ιδιότητες διανομής στα φυσιολογικά κύτταρα, μειώνοντας έτσι δραστικότητας του φαρμάκου σε αυτά τα κύτταρα.

προηγούμενη μελέτη μας απέδειξε ότι lysosomotropic μόρια είχαν μετρήσιμη IDB εκλεκτικότητα, αλλά παρέμεινε ασαφές εάν ο βαθμός lysosomotropism συσχετίζονται με το βαθμό της IDB επιλεκτικότητας. Η υπόθεσή μας οδηγεί σε αυτή τη μελέτη ήταν ότι αντικαρκινικών παραγόντων με βέλτιστη lysosomotropic ιδιότητες θα πρέπει βέλτιστη IDB επιλεκτικότητα. Αρχικά χρησιμοποιείται αρχές παγίδευση ιόντων για τη δημιουργία θεωρητικά τις σχέσεις μεταξύ αδύναμη ιδιότητες βάσης των ναρκωτικών, ειδικά διαπερατότητα (α) και pKa, και λυσοσωμική παγίδευση (βλέπε Εικόνα 1). Οι υπολογισμοί αυτοί αποκαλύπτοντας και πρότεινε ότι ασθενώς βασικών μορίων με χαμηλή άλφα και pKa κοντά ή πάνω από την ουδετερότητα θα έχουν βέλτιστες ιδιότητες lysosomotropic

θεωρητικές προβλέψεις μας δείχνουν ότι η παράμετρος άλφα διαπερατότητα αποτελεί σημαντικό προγνωστικό παράγοντα λυσοσωμικής μεσεγγύηση.? Ωστόσο, δεν είναι μια φυσική παράμετρος που μπορεί να είναι ορθολογικά και συστηματικά αλλάξει για να δοκιμαστεί η σχέση μεταξύ lysosomotropism και IDB εκλεκτικότητα. Έχουμε προηγουμένως προσδιοριστεί πειραματικά άλφα μετρώντας συντελεστές κατανομής οκτανόλης /νερού ως συνάρτηση του ρΗ και διαπίστωσε ότι τα μόρια είτε έτειναν να έχουν παραμέτρους άλφα κοντά στο μηδέν ή κοντά σε ένα [7]. Αν και άλφα μπορεί να ποικίλει από μηδέν έως ένα, θεωρητικές προβλέψεις μας αποκάλυψε ότι σχετικά μικρές αλλαγές στις τιμές των α κοντά στο μηδέν είχε μια βαθιά επίδραση στη σχέση μεταξύ ασθενούς βάσης pKa και το μέγεθος του λυσοσωμικού παγίδευση (Σχήμα 1). Προς το παρόν είναι ασαφές ποιο δομικά χαρακτηριστικά μπορεί να ευθύνονται για τέτοιες μικρές διαταράξεις στην παράμετρο άλφα (δηλαδή, 0.01 έναντι 0.001).

Σε αντίθεση με την παράμετρο άλφα, pKa αντιπροσωπεύει μια φυσική ιδιότητα που μπορεί να τροποποιηθεί λογικά να δοκιμαστεί η σχέση μεταξύ lysosomotropism και επιλεκτικότητα. Για να διερευνηθεί συστηματικά την επιρροή του ασθενούς βάσης pKa επί IDB επιλεκτικότητα, συνθέσαμε μια μικρή βιβλιοθήκη αναλόγων GDA παράγονται τροποποιώντας GDA εις την 17-θέση. Αυτά τα ανάλογα GDA ήταν ιδιαίτερα κατάλληλη για μια τέτοια εφαρμογή, επειδή έχουν πολλά ανάλογα που σχηματίζεται από συνθετικές τροποποιήσεις στη θέση αυτή έχει αποδειχθεί ότι διατηρούν την ικανότητά τους να συνδέονται με και αναστέλλουν Hsp90 [25]. Επιπλέον, GDA έχει μια κυτοσολική στόχο, και ως εκ τούτου, η δραστηριότητα των αναλόγων GDA πρέπει να είναι ευαίσθητη στις αλλαγές της λυσοσωματικής δέσμευση. Συνθέσαμε ασθενώς βασική ανάλογα της GDA με τιμές ρΚα που κυμαίνεται από 5,8 έως 12,4, και παρατηρήσαμε ότι όλα φάνηκε να διατηρούν κάποια ικανότητα να δεσμεύονται rHsp90 ως μη τροποποιημένο GDA (Σχήμα 2). Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι οι διαφορές στην ενδογενή συγγένεια δέσμευσης Hsp90 μεταξύ των διαφόρων παραγώγων μπορεί πράγματι να επηρεάσουν το μέγεθος ενός πειραματικά παρατηρηθεί IC

50 τιμή σε ένα κελί γραμμή? Ωστόσο, οι διαφορές αυτές δεν θα πρέπει να επηρεάζει θεωρητικά συγκρίσεις εκλεκτικότητα μας παρουσιάζονται στα Σχήματα 3 και 5. Αυτό συμβαίνει επειδή αναφέρουμε την αναλογία του IC

50 τιμές για ένα μόνο φάρμακο σε κύτταρα με χαμηλή ή αυξημένα λυσοσωματική ρΗ, παραγοντοποίηση έτσι οποιεσδήποτε διαφορές σε εγγενή δραστηριότητα που μπορεί να υπάρχουν.

Χρήση του shRNA για να δημιουργήσει παραλλαγές των κυτταρικών γραμμών MDA-MB-231 που διέφεραν σε λυσοσωμική ρΗ αντιπροσωπεύει ένα πολύτιμο εργαλείο για τη δοκιμή απευθείας IDB επιλεκτικότητα. Σε προγενέστερα δημοσιευθείσες εκτιμήσεις μας, χρησιμοποιήσαμε συγκριτική IC

50 αξιολογήσεων σε δύο διαφορετικές κυτταρικές γραμμές με χαμηλά ή αυξημένη λυσοσωματική ρΗ [12]. Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε μία φαρμακολογική διαμορφωτή του λυσοσωμικού ρΗ (δηλ, χλωριούχο αμμώνιο) για να επιτευχθεί λυσοσωματική ανύψωση ρΗ. Και οι δύο αυτές προσεγγίσεις έχουν περιορισμούς, διότι οι διαφορές στην κυτταροτοξικότητα μπορεί να αποδοθεί στις διαφορές σε κυτταρικές γραμμές ή από την προσθήκη του τροποποιητή ρΗ και όχι ειδικά στις διαφορές λυσοσωμική ρΗ.

Το ανάλογο GDA με μια μετρημένη pKa 8,1 βρέθηκε να έχει το μέγιστο βαθμό IDB επιλεκτικότητας. ανάλογα GDA με τιμές pKa πολύ πάνω ή κάτω από το 8 έδειξαν ελάχιστη επιλεκτικότητα, το οποίο είναι συνεπές με την έννοια που lysosomotropic δυναμικό συσχετίζεται με IDB επιλεκτικότητα. Για να εκτιμηθεί η συνολική εκλεκτικότητα των αναλόγων GDA, συγκρίναμε την αναλογία του IC

50 τιμές σε φυσιολογικούς ινοβλάστες έναντι σε HL-60 λευχαιμικά κύτταρα, τα οποία έχουν δειχθεί ότι έχουν αυξημένη λυσοσωμικών ρΗ [22]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η τάση στη συνολική επιλεκτικότητα των αναλόγων GDA ήταν παρόμοια σε εμφάνιση και μέγεθος με τα IDB αποτελέσματα της επιλεκτικότητας. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι η IDB επιλεκτικότητα μπορεί να αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό παράγοντα που συμβάλλει προς την κατεύθυνση συνολικής επιλεκτικότητα.

Για την περαιτέρω αξιολόγηση της επίδρασης της lysosomotropism στις ΔΤΑ επιλεκτικότητα, θα διερευνάται η συσχέτιση με τη χρήση που διατίθενται σήμερα αντικαρκινικών παραγόντων που είχαν διαφορετικές δομές, ενδοκυτταρική στόχους και μηχανισμοί δράσης από εκείνες των προηγουμένως αξιολογηθεί αναστολείς Hsp90 (Σχήμα 5). Σύμφωνα με την υπόθεσή μας, το μη lysosomotropic αντικαρκινικούς παράγοντες 5-φθοριοουρακίλη και χλωραμβουκίλη δεν παρουσίασαν αξιόλογη IDB εκλεκτικότητα. Σε αντίθεση, ασθενώς βασική αντικαρκινικούς παράγοντες με τιμές ρΚα κοντά 8 βρέθηκαν να κατέχουν IDB εκλεκτικότητα. Συγκεκριμένα, το ασθενώς βασικό μιτοξαντρόνη ναρκωτικών και η δαουνορουβικίνη, οι οποίες έχουν τιμές pKa των 8.1 και 8.4, αντίστοιχα, και οι δύο βρέθηκαν να κατέχουν σημαντικούς βαθμούς IDB επιλεκτικότητας. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι δαουνορουβικίνη είχαν σημαντικά υψηλότερο IDB εκλεκτικότητα από ό, τι μιτοξαντρόνη. Αυτό θα μπορούσε να αποδοθεί στο γεγονός ότι το ρΚα του δαουνορουβικίνης είναι ελαφρώς υψηλότερη από το pKa της μιτοξαντρόνης και ότι σχετικά μικρές αλλαγές σε ρΚα μπορεί να μεταφραστεί σε αρκετά σημαντικές αυξήσεις στην IDB εκλεκτικότητα. Είναι επίσης εύλογο ότι θα μπορούσε να υπάρχουν μικρές παραλλαγές στην παράμετρο άλφα διαπερατότητας για τις δύο αυτές ενώσεις οι οποίες θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε δραματικές μεταβολές στην lysosomotropism όπως θεωρητικά προσδιορίστηκε (Σχήμα 1). Εκτός από αυτά τα φάρμακα, πολλές άλλες κλινικώς εγκεκριμένο αντικαρκινικών παραγόντων μπορούν να ταξινομηθούν ως ασθενώς βασικών μορίων. Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχει προς το παρόν καμία κλινική απόδειξη για να υποστηρίξει την άποψη ότι ασθενώς βασικές τους ιδιότητες συμβάλλει στην παρατηρείται επιλεκτικότητα τους.

Είναι σημαντικό να τονιστεί ότι το φάρμακο στόχευση πλατφόρμας IDB που περιγράφονται εδώ δεν θα είναι γενικής εφαρμογής για όλοι οι τύποι καρκίνου. Μια προφανής προϋπόθεση για την επιτυχή εφαρμογή είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα έχουν ένα ελάττωμα λυσοσωμική οξίνιση. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι πολλά διαφορετικά είδη καρκινικών κυττάρων έχουν ελαττωματικό λυσοσωματικής ρΗ [19] – [22]? Ωστόσο, όπως έχουμε απεικονίζεται σε αυτό το χειρόγραφο, κάποια καρκινικά κύτταρα, όπως η κυτταρική γραμμή ΜΒΑ-ΜΒ-231, έχουν τιμές ρΗ λυσοσωματικής που είναι παρόμοιες με εκείνες στα φυσιολογικά κύτταρα.