Αφηρημένο

Η ανοσοθεραπεία με βάση εγχύσεις φυσικών φονικών κυττάρων (ΝΚ) είναι μια πιθανή συμπληρωματική θεραπεία για πολλούς καρκίνους. Τέτοια θεραπευτική εφαρμογή σε ανθρώπους απαιτεί μεγάλους αριθμούς λειτουργικών κυττάρων ΝΚ που έχουν επιλεγεί και επεκτάθηκαν με τη χρήση πρωτοκόλλων κλινικής ποιότητας. Ιδρύσαμε ένα εξαιρετικά αποδοτικό σύστημα καλλιέργειας κυτοκίνη βάση για

ex vivo

επέκταση των ΝΚ κυττάρων από αιμοποιητικά βλαστικά και προγονικά κύτταρα από το αίμα του ομφάλιου λώρου (UCB). Συστηματική βελτίωση αυτού του συστήματος σε δύο στάδια χρησιμοποιώντας ένα νέο μέσο κλινικό βαθμό οδήγησε σε θεραπευτικά ισχύει το πρωτόκολλο της κυτταρικής καλλιέργειας. CD56

+ CD3

– προϊόντα ΝΚ κυττάρων θα μπορούσαν να παραχθούν σαν ρουτίνα από προσφάτως επιλεγμένα CD34

+ UCB κύτταρα με ένα μέσο επέκτασης του & gt? 15.000 φορές και μια καθαρότητα σχεδόν 100%. Επιπλέον, το πρωτόκολλο μας έχει την ικανότητα να παράγει περισσότερα από 3-log επέκταση των ΝΚ κυττάρων από το κατεψυγμένο CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Αυτές

ex vivo

παραγομένης προϊόντα κυττάρων περιέχουν υποσύνολα κυττάρων ΝΚ διαφορικά εκφράζοντας NKG2A και δολοφόνος ανοσοσφαιρίνης-όπως υποδοχείς. Επιπλέον, UCB προερχόμενο CD56

+ ΝΚ κύτταρα που παράγονται από το πρωτόκολλο μας ομοιόμορφα εκφράζουν υψηλά επίπεδα ενεργοποίησης NKG2D και φυσικού κυτταροτοξικότητα υποδοχείς. Λειτουργική ανάλυση έδειξε ότι αυτά

ex vivo

παραγομένης κύτταρα ΝΚ στοχεύσετε αποτελεσματικά μυελοειδούς κυτταρικές σειρές λευχαιμίας και των όγκων μελανώματος, και μεσολαβούν κυτταρόλυση των πρωτογενών κυττάρων λευχαιμίας σε χαμηλές αναλογίες NK-στόχο. σύστημα πολιτισμός μας αποτελεί χαρακτηριστικό παράδειγμα μια σημαντική εξέλιξη στην παραγωγή αγνά προϊόντα ΝΚ κυττάρων από περιορισμένο αριθμό

+ κύτταρα CD34 για την ανοσοθεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Spanholtz J, Tordoir Μ, Eissens D, Preijers F, van der Meer Α, Joosten I, et al. (2010) Υψηλή Log-κλίμακας επέκταση των λειτουργικών κυττάρων Ανθρώπινα Φυσικών Killer από τον ομφάλιο λώρο Αίματος CD34-θετικών κυττάρων για θετή ανοσοθεραπεία καρκίνου. PLoS ONE 5 (2): e9221. doi: 10.1371 /journal.pone.0009221

Επιμέλεια: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Δημόσια de la Santé (CRP-Santé), το Λουξεμβούργο

Ελήφθη: 16, Οκτωβρίου 2009? Αποδεκτές: 21 του Γενάρη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 15 Φεβρουαρίου, 2010

Copyright: © 2010 Spanholtz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε οικονομικά από το Πανεπιστήμιο Radboud Nijmegen Medical Centre και Glycostem Therapeutics. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το έργο αφορά GBGM® μέσο για την ex-vivo γενιά των ΝΚ-κυττάρων, η οποία είναι ένα εμπορικά διαθέσιμο μέσο κυτταρικής καλλιέργειας που αναπτύχθηκε προηγουμένως από Glycostem Therapeutics. Αγορά ή /και τη χρήση του μέσου GBGM® δεν περιορίζεται από δικαιώματα ευρεσιτεχνίας. Glycostem Therapeutics έχει ενεργήσει ως χορηγός στο πλαίσιο αυτής της έρευνας. Συγγραφείς Spanholtz και Tordoir είναι υπάλληλοι της Glycostem, επιστημονικά σκηνοθεσία Dolstra. Αποζημίωση για συμμετοχή Dolstra σε αυτό το έργο καταβάλλεται από Glycostem στο συνολικό προϋπολογισμό έρευνας της RUNMC. RUNMC και Glycostem συνεργάζονται βάσει της συμφωνίας συνεργασίας έρευνα, η οποία ρυθμίζει τα παραπάνω συμφέροντα. Ούτε Dolstra ούτε RUNMC έχουν οικονομικό συμφέρον Glycostem. Όλοι οι συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι αυτό δεν μεταβάλλει την προσκόλλησή τους σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς. Οι συγγραφείς συμφωνούν να κάνουν ελεύθερα διαθέσιμο οποιοδήποτε υλικό και πληροφορίες που σχετίζονται με τη δημοσίευσή τους, που εύλογα ζητείται από τους άλλους για το σκοπό της ακαδημαϊκής, μη εμπορική έρευνα.

Εισαγωγή

Φυσικό Killer (NK) κύτταρα CD56

+ CD3

– μεγάλα κοκκιώδη λεμφοκύτταρα που ασκούν έμφυτη ανοσία κατά των ιογενών λοιμώξεων και του καρκίνου [1]. ΝΚ κύτταρα αναγνωρίζουν και στη συνέχεια να αντιδράσει σε κύτταρα μολυσμένα με ιό και μετασχηματίστηκε χωρίς προηγούμενη ανοσοποίηση, κυρίως μέσω του υπολοίπου των σημάτων από τις ανασταλτικές και ενεργοποιώντας τους υποδοχείς [2]. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα ΝΚ έχουν προηγουμένως περιγραφεί ως πολλά υποσχόμενη τελεστές για υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία κατά του καρκίνου [3]. Το δυναμικό κατά των όγκων των κυττάρων ΝΚ έχει καταδεικνύεται καλύτερα κατά τη διάρκεια της θεραπείας των ασθενών λευχαιμία με αλλογενή μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων (SCT). Ruggeri et al. απέδειξαν ότι αλλοαντιδραστικότητας κυττάρων ΝΚ μπορεί να ελέγχει υποτροπή της οξείας μυελοειδούς λευχαιμίας (AML), χωρίς να προκαλεί μοσχεύματος έναντι ξενιστή (GVHD) στη ρύθμιση του HLA-αντιστοιχία στη haploidentical αλλογενή SCT [4]. Επιπλέον, haploidentical εγχύσεις κυττάρων ΝΚ μαζί με IL-2 σε ένα περιβάλλον μη-μεταμόσχευση έχουν συσχετιστεί με πλήρη αιματολογική ύφεση σε κακή πρόγνωση ασθενών με AML [5]. Αυτά τα ενθαρρυντικά αποτελέσματα επισημαίνουν ότι αλλογενή με βάση τα κύτταρα NK ανοσοθεραπεία μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για AML τόσο το μη-μεταμόσχευση και η ρύθμιση μετά τη μεταμόσχευση [5], [6].

Μέχρι σήμερα, οι περισσότερες κλινικές οι μελέτες που εκμεταλλεύονται αλλογενή κύτταρα ΝΚ για υιοθετούμενη ανοσοθεραπεία έχουν διεξαχθεί με κύτταρα ΝΚ που επιλέγεται από προϊόντα λευκαφαίρεσης με ανοσομαγνητικά σφαιρίδια τα πρωτόκολλα επιλογής [7] – [12]. Προκειμένου να παρακάμψουν τους περιορισμούς στον αριθμό των κυττάρων, την καθαρότητα και την κατάσταση της ενεργοποίησης του εν λόγω αίματος προερχόμενα κύτταρα ΝΚ,

ex vivo

επέκταση των κυττάρων ΝΚ με υψηλότερη καθαρότητα θα διευκολύνει την έγχυση ενός μεγαλύτερου αριθμού ενεργοποιημένων κυττάρων ΝΚ ασθενείς με σχετικά μεγάλο φορτίο όγκου ή επιτρέπει πολλαπλές εγχύσεις κυττάρων ΝΚ [8], [13], [14]. Ως εκ τούτου, η ανάπτυξη καινοτόμων στρατηγικών που επιτρέπουν την παραγωγή κλινικά σχετικών προϊόντων ΝΚ κυττάρων με υψηλό αριθμό κυττάρων, υψηλής καθαρότητας και λειτουργικότητα υπόσχεται μια σημαντική εξέλιξη στο κελί ανοσοθεραπείας με βάση τα ΝΚ.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια κυτοκίνη με βάση τη μέθοδο για τη μεγάλης κλίμακας επέκταση των λειτουργικών CD56

+ ΝΚ κυττάρων από αιμοποιητικά βλαστικά και προγονικά κύτταρα. Παρόμοιες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί στο παρελθόν εστιάζοντας είτε CD34

+ αιμοποιητικών προγονικών κυττάρων (ΚΕΚ) από το μυελό των οστών (ΒΜ) ή το αίμα του ομφάλιου λώρου (UCB) [15] – [17]. Ωστόσο, τα περισσότερα από αυτά τα συστήματα καλλιέργειας είναι ακατάλληλα για κλινική εφαρμογή, λόγω της χρήσης των ορών των ζώων, των ζώων που προέρχονται από πρωτεΐνες και υποστηρικτική τροφοδότη κυτταρικές σειρές. Επιπλέον, οι περισσότερες από αυτές τις μεθόδους απέδωσε μόνο περιορισμένο αριθμό των κυττάρων ΝΚ για την επιτυχή ανοσοθεραπεία σε καρκινοπαθείς. Για να ξεπεραστούν αυτά τα προβλήματα, έχουμε δημιουργήσει ένα σύστημα καλλιέργειας δύο σταδίων στην οποία χρησιμοποιήσαμε ένα νέο μέσο κλινικό βαθμό να παράγουν περισσότερο από 3-4-log πτυσσόμενο επεκταθεί λειτουργική CD56

+ ΝΚ κύτταρα από φρέσκα επιλεγμένα ή κρυοσυντηρημένα CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος, αντίστοιχα. Το CD56

προϊόντα κυττάρων ΝΚ + που δημιουργούνται με τη μέθοδο αυτή έχουν πολύ υψηλή καθαρότητα, περιέχει διάφορα NKG2A και δολοφόνος υποδοχέα μοιάζουν με ανοσοσφαιρίνη (KIR) που εκφράζουν ώριμη υποσύνολα και λύουν αποτελεσματικά AML και στερεού όγκου κύτταρα. Τα ευρήματα αυτά εξηγούν ότι αυτό το σύστημα καλλιέργειας θα μπορούσε να υπόσχονται πολλά για το

ex vivo

γενιά των κλινικών ποιότητας προϊόντων ΝΚ κυττάρων για την κυτταρική ανοσοθεραπεία κατά του καρκίνου.

Αποτελέσματα

ex vivo

προγονικών κυττάρων επέκταση και ΝΚ κυττάρων διαφοροποίηση

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να αναπτυχθεί ένα αποτελεσματικό κυτοκίνη βάση

ex vivo

σύστημα καλλιέργειας για την επέκταση των CD34

+ κύτταρα που ακολουθείται από την επόμενη γενιά log-κλίμακας των CD56

+ CD3

– ΝΚ κυττάρων. Για να προσδιορίσει ένα κατάλληλο μέσο για την κλινική εφαρμόζονται επέκταση και διαφοροποίηση των κυττάρων ΝΚ, ελέγξαμε διαφορετικά βασικά μέσα χρησιμοποιώντας ένα δύο σταδίων

in vitro

σύστημα διαφοροποίησης (Σχήμα 1). Αρχικά, συγκρίναμε τις H3000 μέσα μαζικής ενημέρωσης, Stemline Ι και ΙΙ Stemline σπορά 1 × 10

4 CD34 + κυττάρων

με χρήση της μεθόδου Ι Διαπιστώσαμε μια ισχυρή αύξηση των CD34

+ αριθμούς κυττάρων σε όλα τα τρία μέσα μαζικής ενημέρωσης, με αποτέλεσμα σε ένα μέσο ποσοστό διαστολής για όλα τα πειράματα (η = 15), 48 ± 7 φορές και 78 ± 27 φορές μετά από 1 και 2 εβδομάδες καλλιέργειας, αντίστοιχα. Η συνολική επέκταση κυττάρων σχετίζεται με μια σταδιακή μείωση της συχνότητας των

+ κύτταρα CD34 από 84% ± 16% κατά την ημέρα 0 έως 47% ± 14% κατά την 1η εβδομάδα και 17% ± 9% την εβδομάδα 2 (Σχήμα S1a και S1b).

στην μέθοδο Ι-ΙΙΙ διαφορετικούς συνδυασμούς κυτοκινών δοκιμάστηκαν όπως περιγράφεται λεπτομερώς στο Υλικά και Μέθοδοι αρχίζοντας με διαφορετικούς αριθμούς αρχικά σπάρθηκαν CD34 + κυττάρων

. Στην Μέθοδο Ι και ΙΙ, τα κύτταρα ΝΚ παρήχθησαν από προσφάτως επιλεγμένα δότες UCB και η διάρκεια καλλιέργειας ήταν 5 εβδομάδες. Στη Μέθοδο III, CD34

+ κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν από κρυοσυντηρημένα δωρητές UCB και η περίοδος πολιτισμού ήταν 6 εβδομάδες. Τέλος, το διάγραμμα απεικονίζει ποια προϊόντα ΝΚ χρησιμοποιήθηκαν και εμφανίζονται ως αποτελέσματα αριθμητικά και συμπληρωματικό υλικό.

Η

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε εάν η διευρυμένη UCB που προέρχονται από CD34

+ κυττάρων ήταν σε θέση να διαφοροποιηθούν σε CD56

+ ΝΚ κυττάρων. Το στάδιο της διαφοροποίησης παρακολουθήθηκε με την ανάλυση των κυτταρικής επιφάνειας μόρια CD34, CD117, CD56, CD94 και CD161, που έχουν περιγραφεί να εκφράζονται σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια των ανθρωπίνων κυττάρων ΝΚ

in vivo

[18]. Παρατηρήσαμε μετά από 3 εβδομάδες διάρκεια συνολικό πολιτισμό που το ποσοστό των CD34

+ κύτταρα μειώθηκαν περαιτέρω, ενώ το CD56

+ CD161

+ CD94

+ πληθυσμό κυττάρων ΝΚ αυξήθηκε σε 10-18% (π.χ. Εικόνα 2α). Στη συνέχεια, ο πληθυσμός των CD56

+ CD161

+ CD94

+ κυττάρων γρήγορα αυξάνεται σε 60-77% μετά από 4 εβδομάδες και 80-96% μετά από 5 εβδομάδες καλλιέργειας (π.χ. Σχήμα 2α).

CD34-εμπλουτισμένα κύτταρα UCB επεκτάθηκαν για δύο εβδομάδες χρησιμοποιώντας τρία διαφορετικά μέσα (H3000, Stemline Ι και Stemline II) και στη συνέχεια διαφοροποιούνται σε κύτταρα ΝΚ για τρεις επιπλέον εβδομάδες στο ίδιο βασικό μέσο χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Ι (βλέπε σχήμα 1). κυτταρικές καλλιέργειες εβδομαδιαία αναλύθηκαν για τους αριθμούς των κυττάρων και φαινότυπο χρησιμοποιώντας FCM. (Α) Αντιπροσωπευτικό παράδειγμα της έκφρασης του αντιγόνου κατά τη διάρκεια της περιόδου καλλιέργειας δύο σταδίων με μέσο H3000. Μία εβδομάδα μετά την έναρξη της ΝΚ βήμα διαφοροποίηση των κυττάρων 2 (δηλαδή μετά από 3 εβδομάδες συνολική διάρκεια της καλλιέργειας) το CD56

+ CD161

+ CD94

+ ΝΚ κυτταρικού πληθυσμού αυξάνεται και φτάνει υψηλής καθαρότητας μετά από 3 εβδομάδες διαφοροποίησης (δηλαδή εβδομάδα 5). (Β) Μέση CD56

+ συχνότητα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της περιόδου καλλιέργειας 5 εβδομάδα για τρία διαφορετικά μέσα, τα οποία έχουν δοκιμαστεί σε παράλληλα πειράματα χρησιμοποιώντας 3-6 UCB δότες. (Γ) Οι μέσες συνολικές CD56

+ ΝΚ αριθμοί κυττάρων μετά την αρχική σπορά του 1 × 10

4 CD34

+ UCB κύτταρα κατά τη διάρκεια 5 εβδομάδες καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τη Μέθοδο I. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα θεωρητικό υπολογισμό με βάση την πραγματική επέκταση ποσοστά

+ κύτταρα CD56. Η συνολική απόδοση του CD56

+ κύτταρα σε κάθε εβδομάδα υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας το ρυθμό διαστολής ανά εβδομάδα με τον αριθμό των καλλιεργημένων κυττάρων. (Δ) Η μέση φορές αύξηση των συνολικών κυττάρων μετά την αρχική σπορά του 1 × 10

4 CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος κατά τη διάρκεια 5 εβδομάδες καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τη Μέθοδο I. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα θεωρητικό υπολογισμό με βάση τα πραγματικά ποσοστά επέκτασης του συνόλου των κυττάρων .

η

Αν και δεν θα μπορούσε να ανιχνεύει τις σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων βασικών μέσων μαζικής ενημέρωσης, η καθαρότητα του CD56

+ κυτταρικού προϊόντος εμφανίστηκε ελαφρώς υψηλότερη με μέσο H3000 (77% ± 24%? n = 3 μέσο) και Stemline Ι (75% ± 21%? n = 6), σε σύγκριση με μέσο Stemline II (66% ± 17%? n = 6) (Σχήμα 2β). Επιπλέον, μια τάση που παρατηρήθηκε προς υψηλότερα CD56

+ αριθμούς κυττάρων με μέσο Stemline Ι (εύρος 4 × 10

6 – 1,1 × 10

8 CD56

+ κύτταρα? N = 6) που ακολουθείται από H3000 (5.2 × 10

6 – 5,4 × 10

7 CD56

+ κύτταρα? n = 3) και μέσο Stemline II (εύρος 1 × 10

6-2 × 10

7 CD56

+ κύτταρα? n = 6) (Σχήμα 2c). Η μέση συνολική επέκταση κυττάρων μετά από 5 εβδομάδες καλλιέργειας με μέσο Stemline ήμουν ~4,400 φορές και με μέσο H3000 ~3,200 φορές, αλλά μόνο ~850 φορές επέκταση με Stemline II (Σχήμα 2d). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι συνθήκες καλλιέργειας υποστηρίζουν μια αποτελεσματική απόφυση του CD56

+ ΝΚ κυττάρων με μία υψηλή καθαρότητα του τελικού προϊόντος των ΝΚ κυττάρων μετά από μία περίοδο καλλιέργειας 5 εβδομάδων με τη χρήση διαφόρων βασικών μέσων.

Superior Επέκταση εξαιρετικά καθαρό ΝΚ κυττάρων Προϊόντα επιτεύχθηκε χρησιμοποιώντας μια νέα Κλινική Βαθμολογία Medium

Παρά το γεγονός ότι θα μπορούσαν να επιτευχθούν υψηλοί ρυθμοί επέκτασης και καθαρότητα με την τρέχουσα εμπορικά διαθέσιμη βασικά μέσα ενημέρωσης, δεν ήμασταν ικανοποιημένοι με την καθαρότητα του CD56

+ ΝΚ κύτταρο προϊόντος μετά 5 εβδομάδες καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Ι (Σχήμα 1). Για την περαιτέρω αύξηση της αποτελεσματικότητας της μεθόδου καλλιέργειας μας, εξετάσαμε ένα πρόσφατα διατυπώθηκε μέσο χωρίς ορό, που ορίζεται Glycostem Basal Growth Medium (GBGM®), η οποία παράγεται κάτω από συνθήκες GMP και κατάλληλες για κλινικές εφαρμογές. Επιπλέον, είμαστε ελαφρώς ρύθμισε τους όρους κυτοκινών κατά το στάδιο της επέκτασης, αφού παρατήρησε ότι η επέκταση των CD34

+ κύτταρα καθώς και της συνολικής κύτταρα ήταν περισσότερο εμφανής κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας του πολιτισμού (Σχήμα S1a και S1c). Επιπλέον, για να αυξηθεί η ισορροπία προς την κατεύθυνση επέκτασης των προγόνων κυττάρων ΝΚ προσθέσαμε IL-15 αντί του ΤΡΟ στο μέσο εκτόνωσης από την ημέρα 9 της καλλιέργειας, και άφησε έξω Flt3L στο μέσο διαφοροποίησης (Σχήμα 1). Χρησιμοποιώντας αυτήν την τροποποιημένη μέθοδο II, καλλιέργεια σε GBGM® είχε ως αποτέλεσμα την υψηλότερη συνολική επέκταση κυττάρων κατά τη διάρκεια της πρώτης εβδομάδας και την επακόλουθη διαφοροποίηση σε CD56

+ ΝΚ κύτταρα (Σχήμα 3 και Σχήμα S1E). Το συνολικό ποσοστό κυτταρική επέκταση σε GBGM® αυξήθηκε σε & gt? 15.000 φορές (εύρος 16,991-73,666? N = 3) (Σχήμα 3α). Το πιο σημαντικό,

ex vivo

γενιά CD56

+ ΝΚ κύτταρα σε GBGM® απέδωσε μια σημαντική υψηλότερη καθαρότητα από 99% ± 1% (n = 3) σε σύγκριση με H3000 με 88% ± 3% (η = 3? ρ & lt? 0,05) και Stemline Ι με 63% ± 24% (n = 3? ρ & lt? 0,05), αντίστοιχα (σχήμα 3β). Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι η εφευρετική σύστημα τροποποιημένο καλλιέργειας χρησιμοποιώντας τις πρόσφατα διατυπώθηκε GBGM® μέσο αποτελέσματα σε πάνω από 4-log επέκταση των καθαρών ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ από προσφάτως επιλεγμένα CD34

+ UCB κύτταρα.

Το νέο GBGM® μέσον συγκρίθηκε με δύο προηγουμένως δοκιμαστεί media στο σύστημα παραγωγής των ΝΚ κυττάρων σύμφωνα με τη μέθοδο II (βλέπε Εικόνα 1). κυτταρικές καλλιέργειες εβδομαδιαία αναλύθηκαν για τους αριθμούς των κυττάρων και φαινότυπο χρησιμοποιώντας FCM. (Α) Διπλώστε την επέκταση του συνόλου των κυττάρων μετά την αρχική σπορά του 1 × 10

4 CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος καθορίστηκε κατά τη διάρκεια 5 εβδομάδων πολιτισμού. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τον υπολογισμό με βάση τα πραγματικά ποσοστά επέκταση των συνολικών κυττάρων και εμφανίζονται ως μέση τιμή ± SD από τρία διαφορετικά πειράματα. (Β) τη συχνότητα CD56

+ κυττάρων κατά τη διάρκεια του σταδίου διαφοροποίησης για τρία διαφορετικά μέσα, τα οποία έχουν δοκιμαστεί σε παράλληλα πειράματα χρησιμοποιώντας τρεις δότες UCB. Τα δεδομένα απεικονίζονται ως μέσος όρος ± SD. * Αντιπροσωπεύει μια τιμή p & lt? 0,05

Η

Η φαινοτυπική Προφίλ του CD56

+ ΝΚ κύτταρα που προέρχονται από Expanded

+ κύτταρα CD34

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής έδειξε ότι. τα κύτταρα

ex vivo

παραγομένης NK μετά από 5 εβδομάδες καλλιέργειας περιείχε ένα ομοιογενή πληθυσμό κυττάρων που παρουσιάζει υψηλή έκφραση του CD56 σε απουσία CD3 (Σχήμα 4α). Μια υψηλή συχνότητα αυτής της CD56

+ CD3

– πληθυσμό κυττάρων ΝΚ εμφανίζεται η έκφραση του CD94, ενώ μόνο ένα περιορισμένο υποσύνολο ήταν θετικό για CD16. Επιπλέον, τα προϊόντα των κυττάρων ΝΚ εμφανίζεται ομοιογενής και σχετικά υψηλή έκφραση του NKG2D και των φυσικών υποδοχέων κυτταροτοξικότητα (NCR) NKp30, NKp44 και NKp46, ενώ NKG2A ήταν πιο διαφορικά εκφρασμένων (Σχήμα 4β και Εικόνα S2a). Επιπλέον με αυτά τα ευρήματα θα ανιχνευθεί υψηλή έκφραση του 2Β4 (CD244) και NKR-P1 (CD161) ως τυπικό υποδοχείς κυττάρων ΝΚ, ενώ NKG2C και NKp80 απουσίαζαν ή εκφράζονται σε σχετικά χαμηλά επίπεδα. Επιπλέον, παρατηρήσαμε υψηλή έκφραση του MHC τάξης Ι (HLA-ABC) και αλυσίδες υποδοχέα κυτοκίνης για την IL-2 και IL-15 (CD122? IL-2 /IL-15Rβ) και SCF (CD117? C-kit-R) , τα οποία είναι σημαντικά για τη διαφοροποίηση των κυττάρων ΝΚ, διαστολή και ενεργοποίηση.

(α) ανάλυση κυτταρομετρίας ροής ενός αντιπροσωπευτικού προϊόντος κυττάρων ΝΚ που προέρχονται από CD34

+ UCB προγονικά κύτταρα. Τα κύτταρα σε 5 εβδομάδες καλλιέργειας αναλύθηκαν για την έκφραση του CD56, CD3, CD94 και CD16. (Β) Η έκφραση ενός ρεπερτορίου υποδοχέων σημαντικές για τη ρύθμιση της δραστηριότητας των κυττάρων ΝΚ, συμπεριλαμβανομένων των υποδοχέων λεκτίνης τύπου C, υποδοχείς φυσικών κυτταροτοξικότητα και υποδοχείς κυτοκινών. Ιστογράμματα δείχνουν έκφραση του αντιγόνου του ενδιαφέροντος (μαύρο ιστόγραμμα) σε σύγκριση με το ειδικό ισοτυπικού ελέγχου (γκρι ιστόγραμμα). (Γ) Απόκτηση της KIR

+ ΝΚ υποσύνολα των κυττάρων κατά τη διάρκεια της

ex vivo

γενιά των ΝΚ κυττάρων από διογκωμένη CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος. ΚΥΡ έκφραση προσδιορίστηκε κατά την εβδομάδα 4 και 5 κατά τη διάρκεια του σταδίου διαφοροποίησης από FCM. Ανάλυση

Η

ΚΥΡ ρεπερτόριο έδειξαν σημαντικές ατομικές διαφορές στη συχνότητα της ΚΥΡ-εκφράζουν υποσύνολα ΝΚ κυττάρων μεταξύ των διαφόρων UCB δωρητών. ΚΥΡ

+ ΝΚ κυττάρων υποσύνολα θα μπορούσε ήδη να ανιχνευθεί κατά την εβδομάδα 4 του πολιτισμού και παρέμεινε σχετικά σταθερή έως το τέλος της περιόδου καλλιέργειας κατά την εβδομάδα 5 (Σχήμα 4γ και Εικόνα S2B). Ενώ μερικοί CD56

+ ΝΚ κυττάρων προϊόντα που περιέχονται θετικά κύτταρα και για τις τέσσερις ΚΥΡ φαινοτύπους που αναλύθηκαν (Σχήμα 4γ), άλλοι δεν είχαν συγκεκριμένα το KIR2DL1 /DS1

+ υποσύνολο (Σχήμα S2B). Σε γενικές γραμμές, η KIR2DL2 /DL3 /DS2

+ υποσύνολο ήταν παρούσα σε ένα υψηλότερο ποσοστό σε όλα τα προϊόντα των κυττάρων ΝΚ αναλυθεί μέχρι στιγμής, η οποία βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις ότι η ανάκτηση του /DL3 /DS2

+ ΝΚ κυττάρων KIR2DL2 είναι γρηγορότερα σε σύγκριση με το KIR2DL1 /DS1

+ υποσύνολο παρακάτω μεταμόσχευση αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων [19].

στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η UCB που προέρχονται από τα κύτταρα ΝΚ που παράγεται με βελτιστοποιημένο σύστημα πολιτισμό μας περιέχει αναπτυξιακά ώριμη πληθυσμούς κυττάρων ΝΚ που εκφράζουν NKG2A , KIR και διάφορα υποδοχείς ενεργοποιώντας.

Ex vivo

παραγομένης CD56

+ ΚΥΡ

+ και CD56

+ NKG2A

+ ΝΚ κύτταρα είναι λειτουργικά Ρυθμίζεται από MHC κατηγορίας Ι Έκφραση

η φαινοτυπική ανάλυση έδειξε ότι μας

ex vivo

παραγομένης προϊόντα ΝΚ κυττάρων που περιέχονται μέχρι 10% CD56

+

+ κύτταρα ΚΥΡ και ένα υψηλό ποσοστό (40 -60%) CD56

+ NKG2A

+ κύτταρα. Για τον προσδιορισμό κυτταρολυτική δραστικότητα αυτών των υποσυνόλων και διερευνηθεί εάν αυτή η δραστηριότητα ρυθμίζεται από τις εκφρασμένες ανασταλτικοί υποδοχείς, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς αποκοκκίωση CD107a-based χρησιμοποιώντας HLA-αρνητικά κύτταρα Κ562 και κυττάρων KG1a εκφράζουν σχετικά υψηλά επίπεδα του HLA-ABC και -Ε (βλέπε Πίνακα 1). Για αυτά τα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε δύο

ex vivo

παραγομένης προϊόντα κυττάρων ΝΚ που περιείχε περίπου 15-30% CD56

+ CD107a

+ κύτταρα κατά συν-καλλιέργεια με Κ562 (Σχήμα 5 και το Σχήμα S3 ). Σε αντίθεση, τα κύτταρα KG1a δύσκολα διεγείρονται αποκοκκίωση των προϊόντων αυτών των κυττάρων ΝΚ, υποδηλώνοντας ότι η κυτταρολυτική δραστηριότητα αναστέλλεται από την έκφραση HLA. Ομοίως, περίπου το 35% του CD56

+ KIR2DL2 /DL3

+ υποσύνολο αποκοκκιωμένα μετά την ενεργοποίηση από Κ562, ενώ μόνο ένα μικρό ποσοστό (& lt? 5%) εξέφρασε CD107a παρακάτω συγκαλλιέργεια με KG1a (Σχήμα 5α και Εικόνα S3). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, αποκοκκίωση από το CD56

+ KIR2DL2 /DL3

υποσύνολο + θα μπορούσε να ανασταλεί ειδικά από Κ562 κύτταρα επιμολυσμένα με την ομάδα HLA-C 1 αλληλόμορφο HLA-Cw3, ενώ επιμόλυνση της ομάδας HLA-C 2 αλληλόμορφο HLA-Cw4 αλληλόμορφο δεν είχε αποτέλεσμα (Σχήμα S4). Τέλος, παρατηρήθηκε ότι επίσης το κυρίαρχο CD56

+ NKG2A

+ υποσύνολο ήταν σε θέση να αποκοκκιώνονται αποτελεσματικά σε απόκριση σε Κ562 (28% CD107a

+ κύτταρα), ενώ αποκοκκίωση προς KG1a ήταν χαμηλή πιθανώς λόγω της σχετικής υψηλής έκφραση των μορίων HLA-E (Σχήμα 5β και Πίνακας 1). Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η KIR

+ και NKG2A

+ υποσύνολα εντός των UCB-παράγωγα προϊόντα των κυττάρων ΝΚ είναι πλήρως ανταποκρίνεται μεσολαβούν έντονη δραστηριότητα αποκοκκοποιητικού, η οποία ρυθμίζεται από την έκφραση των μορίων MHC τάξης Ι για τα ασχολούνται κύτταρα-στόχους.

Ex vivo

παραγομένης ΝΚ κύτταρα χρησιμοποιώντας τη μέθοδο II με GBGM επωάστηκαν μόνο, ή 18 ώρες με MHC κατηγορίας Ι-αρνητικών Κ562 ή MHC τάξης Ι-κύτταρα που εκφράζουν KG1a σε E:T αναλογία 1:01. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν για CD56, CD3, KIR ή NKG2A, και το CD107a αντιγόνο αποκοκκιοποίηση. (Α) αποκοκκίωση των συνολικών CD56

+ CD3

– ΝΚ κυττάρων και KIR2DL2 /DL3

+ ΝΚ υποσύνολο κυττάρων επεκταθεί για 5 εβδομάδες από CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Τα οικόπεδα της πυκνότητας με περίφραξη σε CD56

+ CD3

– ΝΚ κύτταρα και τα οικόπεδα ιστόγραμμα δείχνουν την CD107a αποκοκκίωση του /DL3

+ ΝΚ κυττάρων KIR2DL2. (Β) αποκοκκίωση των συνολικών CD56

+ CD3

– ΝΚ κυττάρων και NKG2A

+ υποσύνολο κυττάρων ΝΚ επεκταθεί για 6 εβδομάδες από CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος. Τα οικόπεδα της πυκνότητας με περίφραξη σε CD56

+ CD3

-. ΝΚ κύτταρα και τα οικόπεδα ιστόγραμμα δείχνουν την CD107a αποκοκκίωση του NKG2A

+ ΝΚ κυττάρων

Η

ex vivo

παραγομένης NK Cells αποτελεσματικά Target λευχαιμία και κύτταρα στερεού όγκου

Για να προσδιοριστεί η κυτταροτοξική δυναμικό του

ex vivo

παραγομένης προϊόντα ΝΚ κυττάρων, εκτελέσαμε κυτταρομετρία ροής με βάση κυτταροτοξικότητα αναλύσεις χρησιμοποιώντας διάφορες μυελοειδή λευχαιμία κυττάρων σειρές (Κ562, Λάμα, Kasumi και KG1a), πρωτογενή κύτταρα AML και δύο κυτταρικές σειρές μελανώματος (BLM και FM3).

Ex vivo

παραγομένης ΝΚ κυττάρων σε GBGM® μεσολάβηση αποτελεσματική λύση των κυττάρων Κ562 (~ 40% και -90% μετά από 4 και 24 ώρες, αντίστοιχα) σε πολύ χαμηλή αναλογία E:T του 2:01 ( Σχήμα 6α). Επιπλέον, βαθιά λύση θα μπορούσε να παρατηρηθεί έναντι κυττάρων MHC τάξης Ι που εκφράζουν KG1a (~ 20% και -40% μετά από 4 και 24 ώρες, αντίστοιχα). Είναι ενδιαφέρον ότι, τα κύτταρα ΝΚ καλλιεργήθηκαν σε GBGM® έδειξαν υψηλότερη κυτταροτοξική και αποκοκκοποιήσεως δραστικότητα σε σύγκριση με τα κύτταρα ΝΚ καλλιεργήθηκαν σε μέσο H3000 από τον ίδιο δότη UCB (Σχήμα S5A-c). Επιπλέον, βρήκαμε ότι GBGM που προέρχονται από τα κύτταρα ΝΚ έδειξε υψηλότερη έκφραση των ενεργοποιώντας τους υποδοχείς NKG2D, NKp30, NKp44 και NKp46 (Σχήμα S5d).

(α) Ειδική κυτταροτοξικότητα του CD56

+ προϊόν ΝΚ κυττάρων (καθαρότητα 98%) έναντι των μυελοειδούς λευχαιμίας κυτταρικές γραμμές Κ562 και KG1a. Η ειδική λύση προσδιορίστηκε μετά από 4 και 24 ώρες συν-καλλιέργειας σε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας FCM που βασίζεται σε μια αναλογία E:T του 2:01. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέση τιμή ± SD από φρεάτια εις τριπλούν. (Β) αποκοκκίωση των CD56

+ ΝΚ κυττάρων προσδιορίστηκε με FCM ως το ποσοστό του CD107a

+ κύτταρα. Τα αποτελέσματα απεικονίζονται ως μέση τιμή ± SD από φρεάτια εις τριπλούν. (Γ) παραγωγή ΙΡΝγ προσδιορίστηκε με ELISA και απεικονίζονται ως μέση τιμή ± SD τριπλών μετρήσεων. (Δ) Ειδική κυτταροτοξικότητα άλλης CD56

+ προϊόν των κυττάρων ΝΚ (καθαρότητα 95%) έναντι των μυελοειδούς λευχαιμικές κυτταρικές σειρές Κ562, Lama, Kasumi και KG1a, και οι κυτταρικές σειρές μελανώματος BLM και FM3. Η ειδική λύση προσδιορίστηκε μετά από 18 ώρες συν-καλλιέργειας σε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας FCM που βασίζεται σε μια αναλογία E:T του 1:01. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέση τιμή ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. (Ε) αποκοκκίωση των CD56

+ ΝΚ κυττάρων προσδιορίστηκε με FCM ως το ποσοστό του CD107a

+ κυττάρων μετά από ολονύκτια διέγερση με διαφορετικούς στόχους. Τα δεδομένα απεικονίζονται ως μέση τιμή ± SD δειγμάτων εις τριπλούν. παραγωγής (στ) ΙΡΝγ προσδιορίστηκε με ELISA και απεικονίζονται ως μέση τιμή ± SD τριπλών μετρήσεων. (Ζ) Ειδική κυτταροτοξικότητα της τρίτης CD56

κυτταρικού προϊόντος + ΝΚ (καθαρότητα 97%) έναντι πρωτογενών κυττάρων AML από 5 διαφορετικούς ασθενείς. Η ειδική λύση προσδιορίστηκε μετά από 24, 48 και 72 ώρες συν-καλλιέργειας σε μια δοκιμασία κυτταροτοξικότητας FCM που βασίζεται σε μια αναλογία E:T του 3:01. Τα δεδομένα εμφανίζονται σαν μέση τιμή ± SD τριπλών δειγμάτων.

Η

Επιπλέον αποτελεσματική λύση των Κ562, επίσης και οι κυτταρικές σειρές λευχαιμίας Λάμα και Kasumi καθώς και τα κύτταρα μελανώματος BLM και FM3 ήταν αποτελεσματικά σε λύση με την ΝΚ κύτταρα (Σχήμα 6δ). Είναι ενδιαφέρον ότι, μια μονοστοιβάδα κυττάρων μελανώματος FM3 καταστράφηκε εντελώς μέσα σε μία ώρα από συν-καλλιέργεια με κύτταρα ΝΚ (Ταινία S1). Υψηλής ΝΚ κυττάρων με τη μεσολάβηση κυτταρολυτική δραστικότητα έναντι κυτταρικών γραμμών λευχαιμίας και μελανώματος σχετίστηκε με υψηλό ποσοστό CD107a

+ ΝΚ κύτταρα (Σχήμα 6β και 6e) και σημαντική παραγωγή ΙΡΝγ (Σχήμα 6c και 6f).

Τέλος, διερευνήσαμε αν πρωτογενή λευχαιμικά κύτταρα είναι ευαίσθητα στην θανάτωση από τις

ex vivo

παραγομένης ΝΚ κυττάρων. Ως εκ τούτου, εκτελέσαμε προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας με κύτταρα AML από πέντε διαφορετικούς ασθενείς. Πρωτογενή κύτταρα AML από τρεις ασθενείς (Pt 2, 4 και 5) έχουν ουσιαστικά θανατώθηκαν εντός 3 ημερών από την συν-καλλιέργεια σε ένα χαμηλό λόγο E:T του 3:01 αν και λιγότερο ισχυρά από κύτταρα Κ562 (Σχήμα 6g). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η UCB που προέρχονται από τα κύτταρα ΝΚ που παράγεται από αποτελεσματική μέθοδος πολιτισμό μας έχουν την ικανότητα να σκοτώνουν μυελογενούς λευχαιμίας και στερεών καρκινικών κυττάρων.

Ex vivo

γενιά των ΝΚ κυττάρων Προϊόντα από Κατεψυγμένα CD34

+ UCB κύτταρα

για να διερευνηθεί αν ΝΚ πρωτόκολλο επέκτασης των κυττάρων μας, θα μπορούσε να προσαρμοστεί σε κλινικά ισχύουσα διαδικασία, έχουμε πραγματοποιήσει πειράματα χρησιμοποιώντας μέσο GBGM® στο οποίο αφήσαμε έξω LIF και ΜΙΡ-1α στις χαμηλές δόσης κυτοκίνης μίγμα επειδή αυτές οι κυτοκίνες δεν είναι διαθέσιμα κλινικά βαθμού. Επιπλέον, εκτελέσαμε αυτά πειράματα χρησιμοποιώντας CD34

+ κύτταρα επιλέγονται από αποψυχθούν UCB σύμφωνα με τη Μέθοδο III απεικονίζεται στο Σχήμα 1. Απόψυξη και CD34 επιλογή

+ κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα τη λήψη 1.30 ± 0.61 × 10

6 (εύρος 0,84 -2,50 × 10

6) CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος από έξι δότες (Πίνακας 2).

Ex vivo

γενιά χρησιμοποιώντας τη Μέθοδο III οδήγησε σε μια υπολογιζόμενη απόδοση των ΝΚ κυττάρων των 4.6 ± 2.4 × 10

9 (περιοχή 1.9 – 7.8 × 10

9) ΝΚ κυττάρων με καθαρότητα & gt? 95 % μετά από 6 εβδομάδες καλλιέργειας (Πίνακας 2). Ο ρυθμός επέκτασης κυμαινόταν μεταξύ 1.500 και 6.500 φορές ξεκινώντας με CD34

+ κύτταρα από κρυοσυντηρημένα UCB. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι η μεταφορά της περιγραφόμενης διαδικασίας μας με την κλινική ισχύοντες όροι είναι εφικτό, και παράγει αγνά προϊόντα ΝΚ κυττάρων με δυνατότητα επέκτασης περισσότερο από 3-log.

Η

Συζήτηση

Εδώ , αναφέρουμε μία νέα και πολύ ισχυρός μέθοδος καλλιέργειας δύο σταδίων για την

ex vivo

παραγωγή λειτουργικών κυττάρων ΝΚ για κλινική εφαρμογή στη θεραπεία των ασθενών με AML και άλλες κακοήθειες. Έχουμε θέσει σε εφαρμογή μια νέα κλινική βαθμό βασικού μέσου, που ορίζεται GBGM®, η οποία διευκολύνει την αποτελεσματική

ex vivo

HPC και ΝΚ κυττάρων επεκτάσεις. Η μέθοδος μας επιτρέπει τη δημιουργία των λειτουργικών ανθρώπινων κυττάρων ΝΚ περισσότερα από 4-logs από CD34

+ κύτταρα εμπλουτίστηκαν από φρέσκα συλλέγονται μονάδες ομφαλοπλακουντιακού αίματος και περισσότερες από 3-log από κατεψυγμένα UCB. Για το καλύτερο της γνώσης μας, αυτή είναι η πρώτη απόδειξη ότι η ανθρώπινη CD56

+ ΝΚ κύτταρα μπορούν να παραχθούν αποτελεσματικά

ex vivo

σε τόσο υψηλές log-κλίμακας μεγέθους.

Παρόμοιες μελέτες έχουν έχουν αναφερθεί προηγουμένως χρησιμοποιώντας διαφορετικούς συνδυασμούς κυτοκινών με ή χωρίς κυτταρικές γραμμές τροφοδοσίας και τη χρήση των ζωικών και ανθρώπινων ορών [15] – [17], [20] – [24]. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη από Kao et al. έδειξε ότι

+ κυττάρων χωρίς ορό επεκταθεί CD34 θα μπορούσαν να διαφοροποιηθούν σε ένα προϊόν των κυττάρων ΝΚ με μέση καθαρότητα 40% -60% μετά από 5-7 εβδομάδες καλλιέργειας. Έφθασαν ένα υπολογισμένο μέσο ρυθμό διαστολής του 300 φορές, αλλά χρησιμοποίησε ορό εμβρύου μόσχου κατά τη διάρκεια της φάσης παραγωγής των ΝΚ κυττάρων [16]. Σε σύγκριση με αυτά τα πρόσφατα δημοσιευμένα στοιχεία, τα νέα μας σύστημα καλλιέργειας υπόσχεται πολλά, με αποτέλεσμα σε περισσότερα από 3-log-κλίμακας

ex vivo

γενιά προϊόντων ΝΚ κυττάρων με καθαρότητα σχεδόν 100% με τη χρήση μέσου κλινικής ποιότητας, ανθρώπινου ορού, και κυτοκίνες. Οι μόνες κυτοκίνες που είναι επί του παρόντος ή στο εγγύς μέλλον δεν θα είναι διαθέσιμα αντιδραστήρια κλινικής ποιότητας είναι LIF και ΜΙΡ-1α, οι οποίες αποτελούν μέρος της χαμηλής δόσης που υποστηρίζουν κοκτέιλ κυτοκίνης. Ωστόσο, πειράματα που χρησιμοποιούν CD34

+ επιλεγμένων κυττάρων από κρυοσυντηρημένα UCB αποκάλυψε ότι αυτοί οι δύο παράγοντες μπορούν να απορριφθούν χωρίς την απώλεια του δυναμικού διαφοροποιήσεως των κυττάρων ΝΚ εξευγενισμένου μας πρωτόκολλο (Πίνακας 2). Λαμβάνοντας το υψηλό δυναμικό ανάπτυξης, το σύστημά μας επιτρέπει την παραγωγή ενός μέσου αριθμού 4.6 × 10

9 υψηλής καθαρότητας κύτταρα ΝΚ από κατεψυγμένα κύτταρα CD34

+ κυττάρων ομφαλοπλακουντιακού αίματος (Πίνακας 2). Επιπλέον, προκαταρκτικά πειράματα κλιμάκωσης σε σακούλες καλλιέργειας κυττάρων αποκάλυψε ότι η διαδικασία που θεσπίστηκε καλλιέργεια παράγει έως 2 × 10

9 ΝΚ κυττάρων με τον ίδιο φαινότυπο και τη λειτουργία, όπως φαίνεται για τους πληθυσμούς κυττάρων ΝΚ που παράγεται σε πλάκες καλλιέργειας ιστού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται) . Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι μας εξευγενισμένα

ex vivo

πρωτόκολλο επέκτασης έχει τη δυνατότητα να παράγει περισσότερα κύτταρα ΝΚ (δηλαδή & gt? 2 χ 10

9 με μια καθαρότητα μεταξύ 95-99%) σε σύγκριση με τον καθαρισμό του ώριμου ΝΚ κύτταρα από μια διαδικασία lymphapheresis 15 λίτρων, που αποδίδει 0,25 × 10

9 ± 0,14 × 10

9 (εύρος 0,01 – 0,47 × 10

9) ΝΚ κυττάρων, σύμφωνα με τα δημοσιευμένα στοιχεία της McKenna et al. το 2007 [7] – [12]

Το προϊόν των κυττάρων ΝΚ που παράγεται με τη μέθοδο μας εμφανίζεται αναπαραγώγιμο φαινότυπο ενός ενεργοποιημένου με υψηλή έκφραση του CD56 και διαφόρων υποδοχέων ενεργοποίησης, όπως NKG2D, NKp30, NKp44 και NKp46.. Σε συμφωνία με προηγούμενες παρατηρήσεις, μας

ex vivo

παραγομένης κύτταρα ΝΚ καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-2 και IL-15 έδειξε μία CD56

φωτεινά φαινότυπο των οποίων μόνο ένα υποσύνολο εκφράζεται CD16 [20], [21], [25], [26]. Τα προκύπτοντα προϊόντα ΝΚ κυττάρων που περιέχονται 40-60% CD56

+ NKG2A

+ ΝΚ κύτταρα και μέχρι 10% του CD56

+ πληθυσμού που εκφράζονται διάφορες ΚΙΚ, αν και υπήρξε σημαντική μεταβολή στη συχνότητα των KIR

+ ΝΚ υποσύνολα των κυττάρων μεταξύ των διαφόρων χορηγών UCB. Σύμφωνα με το μοντέλο διαφοροποίηση των κυττάρων ΝΚ του Φρόυντ και Caligiuri, μας

ex vivo

παραγομένης προϊόντα ΝΚ κυττάρων περιέχουν κυρίως αναπτυξιακά ώριμα κύτταρα ΝΚ εκφράζουν υψηλά CD94 /NKG2A, CD117 ή /και ΚΥΡ διαμεσολάβηση ισχυρή κυτταρολυτική δράση έναντι κυττάρων Κ562 [27]. Μια μειοψηφία του CD56

+ ΝΚ κυττάρων στα προϊόντα μας είναι φαινοτυπικά ανώριμα λείπει NKG2A και ΚΥΡ. Ωστόσο, αυτά τα ανώριμα κύτταρα ΝΚ μπορούν να έχουν τη δυνατότητα να ωριμάζουν

in vivo

εξής υιοθετούμενη μεταφορά. Είναι ενδιαφέρον, Cooley et al. έχουν δείξει ότι CD56

+ NKG2A

-KIR

– ΝΚ κυττάρων είναι σε θέση να ωριμάσουν

in vitro

κατά την καλλιέργεια με IL-15 και στρωματικών τροφοδότη κυτταρική γραμμή [28]. Φαινοτυπική ανάλυση έχουν αποκαλύψει ότι UCB προερχόμενα κύτταρα ΝΚ που παράγεται με έκφραση απεικόνιση του πρωτοκόλλου μας υποδοχέων κυτοκίνης περιλαμβανομένων των IL-2 /IL-15Rβ (CD122), η οποία μπορεί να προάγει

in vivo

επιβίωση, την επέκταση και την ωρίμανση μετά τη μεταφορά εξής ανοσοκατασταλτική θεραπεία.

Η ισχυρή κυτταροτοξική δράση του UCB προερχόμενα κύτταρα ΝΚ μας ενάντια σε διάφορες κυτταρικές σειρές όγκων, καθώς και την κυτταρόλυση των πρωτογενών κυττάρων AML εκτέθηκαν με ειδική λύση, CD107a μεσολάβηση αποκοκκίωση και την παραγωγή ΙΡΝγ. Τα περισσότερα πειράματα έγιναν με κυτταρικές σειρές ΑΜΙ και πρωτογενή κύτταρα AML, η οποία έχει αποδειχθεί ότι είναι ένας ελκυστικός στόχος για ΝΚ μεσολάβηση κυττάρων ανοσοθεραπεία [5], [6]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε επίσης αποτελεσματική λύση των κυτταρικών γραμμών μελανώματος, η οποία ενισχύει το θεραπευτικό δυναμικό του προϊόντος ΝΚ κυττάρων μας, επίσης προς μη αιματολογικών καρκίνων. Πιο πρόσφατα, αρκετές μελέτες έδειξαν, ότι ΝΚ κύτταρα κυτταροτοξικότητα και η χρήση της κυτταρικής ανοσοθεραπείας με βάση τα ΝΚ μπορούσε να είναι μια αποτελεσματική προσέγγιση για τη θεραπεία του μελανώματος, η οποία επίσης καταδειχθεί σε μια δοκιμή φάσης Ι χρησιμοποιώντας την κυτταρική γραμμή ΝΚ-92 [ ,,,0],29] – [31]

εν κατακλείδι, η μέθοδος που παρουσιάζεται εδώ παρέχει μια σημαντική πρόοδο για την παραγωγή κλινικά σχετική προϊόντα κυττάρων ΝΚ από αιμοποιητικά βλαστικά και των προγονικών κυττάρων με υψηλό αριθμό κυττάρων, υψηλή καθαρότητα και λειτουργικότητα για χρήση σε ΝΚ. που βασίζονται σε κύτταρα ανοσοθεραπεία.