Αφηρημένο

Ιστορικό

MLL3 είναι ένα ιστονών 3- λυσίνη 4 μεθυλοτρανσφεράση με ιδιότητες καταστολής όγκων που ανήκει σε μια οικογένεια γονιδίων ρυθμιστή χρωματίνης ενδεχομένως μεταβληθεί σε νεοπλασία. Μεταλλάξεις σε MLL3 βρέθηκαν σε μια ολόκληρη ανάλυση του γονιδιώματος του καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά δεν έχουν επιβεβαιωθεί από μια ξεχωριστή μελέτη.

Μέθοδοι και Αποτελέσματα

Αναλύσαμε τις μεταλλάξεις της περιοχής κωδικοποίησης και μεθυλίωση προαγωγού σε MLL3 χρησιμοποιώντας 126 περιπτώσεις ορθοκολικού καρκίνου. Βρήκαμε δύο ισομορφές του MLL3 και προσδιορισμού αλληλουχίας DNA αποκάλυψε μετατόπισης πλαισίου και άλλες μεταλλάξεις που επηρεάζουν και τις δύο ισομορφές της MLL3 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και 19 134 (14%) πρωτογενούς ορθοκολικού δείγματα που αναλύθηκαν. Επιπλέον, μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου ήταν πιο συχνή σε περιπτώσεις με μικροδορυφόρων αστάθεια (31%) και σε κυτταρικές σειρές CRC και πρωτογενείς όγκους. Το μεγαλύτερο ισομορφή MLL3 μεταγράφεται από ένα CpG νησί σχετίζεται με προαγωγέα που έχει εξαιρετικά ομολογία με ένα ψευδο-γονίδιο στο χρωμόσωμα 22 (psiTPTE22). Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία η οποία μετράται τόσο τόπους ταυτόχρονα βρήκαμε εξέχουσα μεθυλίωσης που σχετίζονται με την ηλικία στην κανονική του παχέος εντέρου (από 21% σε άτομα ηλικίας κάτω των 25 ετών στο 56% σε άτομα ηλικίας άνω των 70, R = 0,88, p & lt? 0.001) και συχνές υπερμεθυλίωση (83 %) και στις δύο κυτταρικές σειρές CRC και πρωτογενείς όγκους. Είμαστε δίπλα μελέτησαν τις δύο τόπους ξεχωριστά και διαπιστώθηκε ότι η ηλικία και ο καρκίνος σχετίζονται με μεθυλίωση ήταν απλώς μια ιδιότητα του ψευδογονιδίου νησί CpG και ότι η loci MLL3 ήταν μη μεθυλιωμένα.

Συμπεράσματα

Βρήκαμε ότι μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου της MLL3 τόσο κύτταρα CRC και πρωτοπαθούς όγκου που ήταν πιο συχνή σε περιπτώσεις με μικροδορυφόρων αστάθεια. Επιπλέον, έχουμε δείξει CpG νησιού σχετιζόμενη υποκινητή του γονιδίου MLL3 δεν έχει μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα CRC αλλά επίσης πρωτογενή όγκο και φυσιολογικό κόλον, και αυτή η περιοχή έχει ένα εξαιρετικά ομόλογες του γονιδίου ψευδο (psiTPTE22) η οποία ήταν ηλικίας σχετίζονται μεθυλίωσης του DNA.

Παράθεση: Watanabe Υ, Castoro RJ, Kim HS, Βόρεια Β, Oikawa R, Hiraishi T, et al. (2011) Η συχνή αλλοίωση των MLL3 μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην Μικροδορυφορικοί Ελλιπή του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (8): e23320. doi: 10.1371 /journal.pone.0023320

Επιμέλεια: Esteban Ballestar, Bellvitge Ινστιτούτο Βιοϊατρικών Ερευνών (IDIBELL), Ισπανία

Ελήφθη: 10 Φλεβάρη, 2011? Αποδεκτές: 15 του Ιουλίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Watanabe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας επιχορηγήσεις # CA098006 και CA105346. J-PJI είναι μια αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία Κλινικής Έρευνας καθηγητής υποστηρίζεται από μια γενναιόδωρη δωρεά από το Ίδρυμα F. Μ Kirby. αλληλουχίας DNA σε μονάδα αλληλούχισης Πυρήνα στο M. D. Anderson Cancer Κέντρο υποστηρίζεται από Πυρήνας Grant # CA16672 από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση που έλαβε για την παρούσα μελέτη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC), η συστηματική ανάλυση των 13,023 καλά σχολιασμένο ανθρώπινα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες αποκάλυψε μεταλλάξεις σε 69 υποψήφια γονίδια [1]. Μεταξύ αυτών, το γονίδιο μεθυλοτρανσφεράση των ιστονών μικτή καταγωγή λευχαιμία 3 (MLL3) μεταλλάχθηκε σε 6 περιπτώσεις. MLL3 είναι μέλος της οικογένειας γονιδίων TRX /MLL και χάρτες στο χρωμόσωμα 7q36.1. Είναι κωδικοποιεί μια προβλεπόμενη πρωτεΐνη των 4911 αμινοξέων που περιέχει δύο homeodomains φυτών (PHD), ένα ΑΤΡ alpha /beta υπογραφή, μια ομάδα υψηλής κινητικότητας, μια σειρά (καταστολείς της πολυχρωμία, Enhancer της Zeste, Trithorax) και δύο FY (φαινυλαλανίνη τυροσίνη) πλούσιοι domains. PHD και SET τομείς πρωτεΐνες είναι χρωματίνης ρυθμιστικές αρχές και αρκετά από αυτά έχουν μεταβληθεί σε καρκίνο [2]. Η απενεργοποίηση του MLL3 σε ποντικούς οδηγεί σε σχηματισμό επιθηλιακών όγκων, γεγονός που υποδηλώνει ότι λειτουργεί ως ένα ογκο-κατασταλτικό γονίδιο [3]. Επίσης, MLL3 έχει αναφερθεί να διαγραφεί συχνά σε μυελοειδή λευχαιμία [4], [5]. Επιπλέον, άλλες αναφορές υποδεικνύουν σωματικές μεταλλάξεις στο γονίδιο MLL3 σε γλοιοβλάστωμα και αδενοκαρκίνωμα του παγκρέατος πόρου [6]. Ωστόσο, τις επόμενες εκθέσεις δεν έχουν ακόμη επιβεβαιωθεί μεταλλάξεις MLL3 στον καρκίνο του παχέος εντέρου [7]. Έτσι, ο ρόλος του MLL3 στην παθογένεση του παχέος νεοπλασίας παραμένει ατελώς καθορισμένη.

Σε αυτή την εργασία, ερευνήσαμε MLL3 μεταβολές στην καρκίνο του παχέος εντέρου και βρήκε ένα δύο ισομορφή MLL3 του οποίου ο μακρύτερος ισομορφή έχει ένα προηγουμένως μη αναγνωρισμένο CpG νησί επικάλυψη του υποκινητή. Επιπλέον, βρήκαμε νέες γενετικές μεταβολές σε κυτταρικές σειρές CRC, αλλά και πρωτογενείς όγκους.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Cancer λήφθηκε κέντρο και το Διοικητικό συμβούλιο Yonsei University Wonju Christian Νοσοκομείο Institutional Review, και γραπτή συγκατάθεση.

γραμμές κυττάρων και δείγματα

Οκτώ καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές (DLD1, SW48, RKO, HCT116, CaCo2, SW620, LoVo και SW480) λήφθηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε κατάλληλα μέσα που περιέχουν 10% ορό εμβρύου μόσχου σε πλαστικές πλάκες καλλιέργειας. DNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο φαινόλης χλωροφορμίου, και το σύνολο των RNAs εξήχθησαν από τα συλλεγμένα κύτταρα με τη χρήση της ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA) [8]. Μελετήσαμε 72 δείγματα πρωτογενών όγκων του παχέος εντέρου προέρχονται από Yonsei University Wonju Christian Νοσοκομείο (Wonju, Κορέα) και 54 δείγματα πρωτογενών όγκων του παχέως εντέρου και 8 γειτονικά κανονικοποιημένο εμφανίζονται ιστών από ασθενείς με M. D. Anderson Cancer Center (Χιούστον, Τέξας). Μελετήσαμε επίσης παχέος δείγματα βιοψίας από 21 άτομα χωρίς οικογενειακό ιστορικό καρκίνου του παχέος εντέρου και δεν παχέος βλάβες στην εξέταση Σύνολο κολονοσκόπησης.

Μετάλλαξη και μεθυλίωσης του DNA Ανάλυση

DNA που απομονώθηκε από κατάφωρα μικροτομή καρκίνους αναλύθηκε για να προσδιοριστεί η σωματική μετάλλαξη του MLL3 χρησιμοποιώντας απευθείας αλληλούχιση, και τόσο κατάσταση μεθυλίωσης του γονιδίου MLL3 και ψευδο psiTPTE22 (ψευδο-γονιδίου του διαμεμβρανικού φωσφατάσης με tensin ομολογία επί του χρωμοσώματος 22) χρησιμοποιώντας διθειώδους Pyrosequencing [9]. ανάλυση Απευθείας αλληλούχιση διεξήχθη για τον προσδιορισμό μεταλλάξεων σε όλους τους 59 MLL3 εξώνια χρησιμοποιώντας τόσο γονιδιωματικό DNA και cDNA οκτώ ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, και να επιβεβαιώσει αυτές τις αλληλουχίες των περιοχών μετάλλαξης χρησιμοποιώντας γενωμικό DNA από δύο διαφορετικά σύνολα πρωτογενών CRCs (Πίνακας 1). Primer αλληλουχίες που περιγράφονται στον Πίνακα S1. Όλοι οι εκκινητές συντέθηκαν από την Invitrogen (San Diego, CA). PCR διεξήχθη σε 22.5 μΙ Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, San Diego, CA), 5 μΜ εμπρός και 5 μΜ αντίστροφης εκκινητών και 10 ng γενωμικού DNA. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν σε 96 καλά thermocyclers MJ (MJ Research, Waltham, ΜΑ) χρησιμοποιώντας 30 κύκλους ενίσχυσης PCR πρωτόκολλο (μετουσίωση 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα? Ανόπτηση 55C για 30 δευτερόλεπτα? Εκτείνονται 68c για 60 δευτερόλεπτα). Τα προϊόντα της PCR αλληλουχία απευθείας στο Μηχανισμό MD Anderson πυρήνα αλληλουχίας.

Η

Ξεχωριστή ανάλυση μεθυλίωσης του DNA μεταξύ MLL3 και psiTPTE22 γονίδιο νησιά CpG επιβεβαιώθηκαν με όξινο θειικό απευθείας αλληλούχιση μετά ΤΟΡΟ-ΤΑ κλωνοποίηση τόσο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές και πρωτογενείς CRCs. Πληροφορίες σχετικά με την αναντιστοιχία επισκευή (MMR) ανεπάρκεια σε κυτταρικές σειρές συλλέχθηκαν από δημοσιευμένες εργασίες [10], [11] και η βάση δεδομένων του Sanger Institute Cancer Genome Έργου (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/MSI /msi_page.shtml). Στην πρωτογενή ορθοκολικό καρκίνο δείγματα, προσδιορίσαμε αναντιστοιχία ανεπάρκεια επισκευής με ανάλυση μικροδορυφορική αστάθεια (MSI), όπως έχει ήδη αναφερθεί [12]. Όλες οι αλληλουχίες εκκινητών και PCR συνθήκες που περιγράφονται στον Πίνακα S1.

Αντίστροφη Μεταγραφή-Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

πρώτου κλώνου cDNA παρασκευάστηκε με ανάστροφη μεταγραφή 1 μα δείγματα ολικού RNA χρησιμοποιώντας αντίστροφη Superscript III μεταγραφάσης (Invitrogen, Carlsbad, CA). Πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-ΡΟΚ διεξήχθη χρησιμοποιώντας Taqman Gene Expression Δοκιμασίες [MLL3 εξώνιο όριο 1 -2, Hs01005501_m1 (Probe Α)? MLL3 εξόνιο όριο 38 -39, Hs01005520_m1 (Probe B)? MLL3 εξόνιο σύνορο 58 -59, Hs01005539_m1 (Probe C) και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής, Hs_00266705_gl (Applied Biosystems)] σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές. (Φιγούρα 1). cDNA ανθρώπινου κόλον (BioChain, Hayward, CA) χρησιμοποιήθηκαν ως φυσιολογικοί μάρτυρες? είχαν παρασκευαστεί από φυσιολογικό κόλον βλεννογόνων συγκεντρώθηκαν από υγιή άτομα.

MLL3 μεταγράφεται από δύο ξεχωριστούς προαγωγείς (βέλη), και τον προαγωγό για το μεγαλύτερο μεταγράφημα περιέχει ένα CpG νησίδα ενώ υπάρχει κανένας στην συντετμημένη μορφή. Οι θέσεις των μεταλλάξεων που βρέθηκαν σε αυτή και τις προηγούμενες εκθέσεις υποδεικνύονται με βέλη. Κάθε βέλος αντιστοιχεί σε μία μόνο περίπτωση με μια μετάλλαξη, εκτός από την μία περιοχή με πολλαπλές βέλη, το οποίο αντιστοιχεί στο πολυΑ οδό. MLL3 γονίδιο κωδικοποιεί μια προβλεπόμενη πρωτεΐνη των 4911 αμινοξέων που περιέχει δύο homeodomains φυτών (PHD), ένα ΑΤΡ alpha /beta υπογραφή, μια ομάδα υψηλής κινητικότητας, μια σειρά (καταστολείς της πολυχρωμία, Enhancer της Zeste, Trithorax) και δύο FY (φαινυλαλανίνη τυροσίνη) πλούσια domains. Κάθε μία από τις μεταλλάξεις σε πρωτογενή δείγματα εμφανίζονται στο σχήμα δομή του γονιδιώματος στην εικόνα 1.

Η

Western Blotting

κουνελιού πολυκλωνικό αντι-MLL3 αντίσωμα (SAB1300328 Sigma-Aldrich, St. Louis , ΜΟ)) χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκηλίδωση. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν με απόξεση μονοστιβάδων κυττάρων σε ρυθμιστικό ανάλυσης χωρίς SDS [που περιέχει 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l Tris-HCl (ρΗ 7,2), 1% δεσοξυχολικό οξύ, 1% Triton Χ-100, 0,25 mmol /l EDTA (ρΗ 8.0), αναστολείς πρωτεάσης και φωσφατάσης, 5 μg /ml λευπεπτίνη, 5 μg /ml απρωτινίνη, 1 μg /ml πεπστατίνη Α, 1 mmol /l φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο, 5 mmol /l NaF, και 100 μmol /l ορθοβαναδικό νάτριο ], και οι συγκεντρώσεις πρωτείνης προσδιορίστηκαν (αντιδραστήριο Lowry, Bio-Rad, Hercules, CA). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Στατιστική Ανάλυση

επίπεδα μεθυλίωσης που λαμβάνεται με Pyrosequencing (%) αναλύθηκαν ως συνεχής μεταβλητή για τη σύγκριση των γονιδίων μεθυλίωσης MLL3 με κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά? σημαίνει και υπολογίστηκαν 95% εμπιστευτικά διαστήματα (ΠΙ). Δύο όψεων

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση PRISM 4 λογισμικού (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA).

Αποτελέσματα

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε συχνή απενεργοποίηση των MLL3 από ένα μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου στην μικροδορυφορικού ανεπάρκεια CRCs και δεν μεθυλίωση του DNA στους τόπους MLL3 σε οποιαδήποτε δείγματα του παχέος εντέρου.

Για την ανάλυση μετάλλαξης, θα προβληθεί 8 κυτταρικές σειρές CRC χρησιμοποιώντας PCR και αλληλούχιση του συνόλου των 59 κωδικοποίησης εξώνια. Βρήκαμε μεταλλάξεις σε 5 από τις κυτταρικές σειρές 8 (63,0%). MLL3 έχει ένα πολυ-Α (Α)

9 οδού εντός της ακολουθίας κωδικοποίησης του εξονίου 38 που περιλαμβάνεται στο μεταποιημένο μεταγραφή? ομόζυγα μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου βρέθηκαν σε RKO και HCT116, ενώ ετερόζυγες μεταλλάξεις βρέθηκαν στα μικροδορυφορικών ασταθή κυτταρικές γραμμές SW48 και LoVo. Αυτά είναι όλα μικροδορυφόρων ασταθή κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, βρήκαμε ότι SW48 και DLD1 έχουν ξεχωριστές σωματικές μεταλλάξεις σε άλλες περιοχές κωδικοποίησης του MLL3 (Σχήμα 1, 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα της ανάλυσης μετάλλαξης μπορούσε να επιβεβαιώσει χρησιμοποιώντας cDNA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια, αναλύονται τα 3 σωματικών περιοχές μετάλλαξη (c.8382delA (πλαισίου), c.10313G & gt? Α (p.G3438D), c.13630C & gt? T (p.R4544W)) σε ένα αρχικό σύνολο 72 πρωτοβάθμια CRCs και βρήκε πλαισίου μεταλλάξεις εντός του (Α)

9 οδού σε 10 δείγματα (MSI-η, 22,9% (8/35)? MSS, 5.4% (2/37)) (Πίνακας 1). Στη συνέχεια αναλύονται 9 σωματικές περιοχές μετάλλαξη συμπεριλαμβανομένων και των 3 χώρων βρήκαμε και 6 sites που βρέθηκαν από Sjoblom et al. [1] σε ένα ξεχωριστό σύνολο 54 πρωτοβάθμια CRCs και 21 δείγματα υγιών ασθενών (Πίνακας 1). Βρήκαμε συχνές μεταλλάξεις εντός του (Α)

9 οδού σε μικροδορυφορικών ασταθής CRCs (28,6%, 4/14, βλέπε παραδείγματα στο Σχήμα 2Β), αλλά όχι άλλες μεταλλάξεις σε αυτά τα δείγματα. Έτσι, συνολικά, βρήκαμε μεταλλάξεις σε 19/134 περιπτώσεις που αναλύθηκαν (14%). Αυτές οι μεταλλάξεις μπορούν να ανιχνευθούν σε ένα ευρύ φάσμα της αλληλουχίας κωδικοποίησης, με ομαδοποίηση του πολυ (Α) οδό, η οποία επιβεβαιώθηκε με ανάλυση μας μικροδορυφορικών ασταθής όγκων.

(Α) MLL3 έχει μια πολυ-Α (Α)

9 οδού εντός της ακολουθίας κωδικοποίησης του εξονίου 38. τα ομόζυγα μεταλλάξεις μετατόπισης πλαισίου βρέθηκαν σε RKO και HCT116, ενώ ετερόζυγες μεταλλάξεις βρέθηκαν στα μικροδορυφορικών ασταθή κυτταρικές γραμμές SW48 και LoVo. Ξεχωριστή σωματικές μεταλλάξεις βρέθηκαν στο SW48 και DLD1 c.10313G & gt? Α (p.G3438D), c.13630C & gt? T (p.R4544W). (Β) ετερόζυγες μεταλλάξεις βρέθηκαν στο ίδιο πολυ-Α (Α)

9 οδού εντός της ακολουθίας κωδικοποίησης του εξονίου 38.

Η

Για να μελετηθεί μεθυλίωσης του DNA, πρέπει πρώτα σημειωθεί ότι MLL3 μεταγράφεται από δύο χωριστές υποκινητές, μία από τις οποίες καταλήγει σε μία κολοβωμένη εκδοχή της πρωτεΐνης (Σχήμα 1). Ο υποκινητής για το μεγαλύτερο μεταγράφημα περιέχει ένα προηγουμένως μη αναγνωρισμένο νησί CpG, αλλά κάποιος δεν είναι παρούσα στο κολοβωμένη μορφή. Αναλύσαμε τη μεθυλίωση του νησιού CpG χρήση ποσοτικών bisulfite- Pyrosequencing (παραδείγματα στο Σχήμα 3Α). Ωστόσο, βρήκαμε ότι το νησί CpG περιοχής MLL3 είναι εξαιρετικά ομόλογος (~92%) σε ένα νησί CpG που επικαλύπτει τον υποκινητή ενός ψευδο-γονίδιο στο χρωμόσωμα 22 (psiTPTE22, ψευδο-γονιδίου του διαμεμβρανικού φωσφατάσης με tensin ομολογία στο χρωμόσωμα 22 : NR_001591). Πράγματι, η διθειώδες δοκιμασία Pyrosequencing ήταν σε θέση να ενισχυθεί αυτή η περιοχή, καθώς υποδεικνύει την πιθανότητα ψευδών θετικών. Βρήκαμε πυκνή μεθυλίωση σε όλες τις 8 κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν από Pyrosequencing (HCT116, 74%: RKO, 66%: LoVo, 77%: SW48, 50%: CaCo2, 79%: SW480, 65%: DLD1, 72%: SW620, 74%), και ένας υψηλός βαθμός μεθυλίωσης σε πρωτογενείς CRCs (45 από τις 54 που εξετάστηκαν ή 83,3%, Εικόνα 3Α). Η μεθυλίωση του νησιού CpG στον καρκίνο δεν συσχετίστηκε με κοινά κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο, την τοποθεσία και το κλινικό στάδιο. Ένα μετρήσιμο βαθμό μεθυλίωσης ήταν παρόν στο γειτονικό φυσιολογικό εμφανίζεται βλεννογόνο των περισσοτέρων ασθενών που αναλύθηκαν, υποδηλώνοντας ότι αυτή η θέση θα μπορούσε να είναι ένας στόχος της ηλικιακής εκφύλισης της μεθυλίωσης [13]. Πράγματι, σε υγιείς εμφανίζονται φυσιολογικά δείγματα βλεννογόνου του παχέος εντέρου, βρήκαμε μια ισχυρή σχέση με την ηλικία μεθυλίωση του νησιού CpG (

r

= 0.88,

σ

= 0,0001).

(Α) Παράδειγμα αποτελεσμάτων πυρόγραμμα χρησιμοποιώντας CpG νησίδα (περιοχή εκκινητή για Pyrosequencing δείχθηκε στο Σχήμα 1), με πολυμορφική θέση C /T επισημανθεί. Ακολουθία διαβάζει TC /TGTC /TGGAGGAGGATAAGAG, πυρόγραμμα στο αριστερό κόλον πλευρά shows.normal και πρωτογενείς CRC (δεξιά πλευρά). (Β) Αποτέλεσμα της σχετικής έκφρασης σε φυσιολογικές κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου και του καρκίνου του παχέος εντέρου αναλύθηκαν με qPCR για το πλήρους μήκους μεταγράφημα (Probe Α: Hs01005501_m1) και ένα μίγμα του πλήρους μήκους και αποκομμένες μεταγραφές (Probe Β και Γ: Hs01005520_m1, Hs01005539_m1) . Σχετική έκφραση σε ανιχνευτή Α κάτω-ρυθμίζονται σε 5 από τις 6 κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν. Και οι άλλες δύο ανιχνευτές (Probe B και C) δείχνουν ελάχιστη ρύθμιση προς τα κάτω (ή ακόμα και up-ρύθμιση) σε αυτές τις κυτταρικές σειρές.

Η

Είμαστε δίπλα προσπάθησαν να κατανοήσουν καλύτερα τη μεθυλίωση του DNA των δύο ομόλογων τόποι εκτελώντας θειώδους δοκιμασίες άμεσης αλληλουχίας που θα μπορούσε να εισάγει διακρίσεις εις βάρος των δύο τόπων. Λόγω του γονιδίου psiTPTE22 είναι 10 ζεύγη βάσεων μικρότερο από το γονίδιο MLL3 στην εν λόγω περιοχή (Σχήμα 4Α). Είναι ενδιαφέρον ότι, η μεθυλίωση του γονιδίου MLL3 κυμαινόταν από 0-5% σε φυσιολογικό βλεννογόνο και γραμμές κυττάρων CRC, εκτός από RKO (14,7%). Ωστόσο, η, psiTPTE22 γονίδιο ήταν ιδιαίτερα μετουσιωμένο σε δείγματα του παχέος εντέρου, τόσο σε κυτταρικές σειρές CRC και πρωτογενείς όγκους. Επιπροσθέτως, η μεθυλίωση των τόπων psiTPTE22 συνδέθηκε με σχετιζόμενη με την ηλικία μεθυλίωση σε φυσιολογικό βλεννογόνο του παχέος εντέρου (Σχήμα 4J).

(Α-Ι) Bisulfite απευθείας αλληλούχιση διεξήχθη χρησιμοποιώντας εκκινητές που καλύπτουν την περιοχή προαγωγού και των δύο MLL3 ( μεγαλύτερη μορφή) και psiTPTE22 χρησιμοποιώντας διαφορετικές ηλικία των κανονικών epitheliums κόλου (ηλικία: 24, 31, 38 41, 48, 52, 68 και 82 ετών). (J) Dots συνωμοτούν δείχνει συσχέτιση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA σε psiTPTE22 και κάθε ηλικία του δείγματος. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι psiTPTE22 μεθυλίωση συσχετίστηκε με τη γήρανση, αλλά δεν MLL3 (

r

= 0.830,

σ

= 0,015).

Η

Για να εξετάσει το προφίλ έκφρασης των MLL3 , χρησιμοποιήσαμε qPCR (ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) και τρεις διαφορετικές ανιχνευτές Taqman να καλύψει το πλήρες κείμενο μήκος (NM 170.606) και την κομμένη μεταγραφή (NM 021.230) (Σχήμα 1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, το μήκος μεταγραφήματος πλήρους (Probe Α) είναι ουσιαστικά κάτω-ρυθμίζονται σε 5 από τις 6 κυτταρικές σειρές που εξετάστηκαν, γεγονός που υποδηλώνει μια γενετική αιτιολογία γι ‘αυτή την σίγηση (Σχήμα 3Β). Αντιθέτως, οι δύο άλλες ανιχνευτές (Probe Β και Γ), οι οποίες ανιχνεύουν τόσο κολοβωμένη και πλήρους μήκους μεταγραφές, δείχνουν ελάχιστη ρύθμιση προς τα κάτω (ή ακόμη και προς τα πάνω ρύθμιση) σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές. Συλλογικά, τα στοιχεία δείχνουν ότι οι σωματικές μεταλλάξεις ιδιαίτερα πλαισίου μεταλλάξεις στον καρκίνο σιωπές του πλήρους μήκους μεταγραφή αφήνοντας ανέπαφη την ακρωτηριασμένη μεταγραφή.

επόμενο αναλύονται δύο διαφορετικού μεγέθους της πρωτεΐνης MLL3 στα κύτταρα (τόσο άγριου τύπου /μετατόπιση πλαισίου μετάλλαξη). Ανάλυση πρωτεΐνης διεξήχθη με κηλίδα western για να καθοριστεί εάν αυτά τα κύτταρα μπορούν να παράγουν το κατάλληλη πρωτεΐνη MLL3 (Σχήμα 3C). MLL3 έχει μια κολοβωμένη μορφή στην 3 ‘άκρο. Έτσι, αναλύσαμε το επίπεδο πρωτεΐνης MLL3 χρησιμοποιώντας αντισώματα (το αντίσωμα αυτό σχεδιάστηκε από το κέντρο του ορίου MLL3 (Sigma-Aldrich, Cat. # SAB1300328 (St. Louis, ΜΟ)). Θα ανιχνεύσει μόνο μακριά ισομορφή του προϊόντος πρωτεΐνης MLL3.

Βρήκαμε το κατάλληλο συγκρότημα το CaCo2 και SW480, άγριου τύπου του MLL3, και LoVo και SW48, ετερόζυγο για τη μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου, με MLL3 αντίσωμα. σε αντίθεση, δεν υπήρχε ανιχνεύσιμη ζώνη σε RKO και HCT116, και τα δύο ομόζυγα για την μετάλλαξη μετατόπισης πλαισίου. τα αποτελέσματα αυτά συσχετίζονται με τα επίπεδα έκφρασης γονιδίου και ανάλυσης πρωτεϊνών του MLL3 (Σχήμα 3Β, C).

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε συχνή αδρανοποίηση MLL3 με πλαισίου μεταλλάξεις οι οποίες δεν είχαν αναφερθεί προηγουμένως.

Έχουμε δείξει ότι τα (Α)

9 οδού σε MLL3 μεταλλάσσεται σε αναντιστοιχία με ανεπάρκεια όγκους επισκευής. Μια προηγούμενη μελέτη [1] ανεπάρκεια όγκους και αποκλείονται επισκευή ασυμφωνία ακόμα βρέθηκαν μεταλλάξεις στο 2,2% των περιπτώσεων (6/37). σε πρωτοπαθείς όγκους, όμως, ελέγχονται για μεταλλάξεις στα προηγούμενα αναφερθεί πληγείσες περιοχές και διαπίστωσαν μόνο μεταλλάξεις polyA οδού. Έχουμε υποτιμήσει έτσι την ακριβή ρυθμό μετάλλαξης του γονιδίου, δεδομένου ότι δεν είχαμε ακολουθία όλων των 59 εξώνια σε όλους τους όγκους. Παρ ‘όλα αυτά, είναι σαφές ότι MLL3 μεταλλάξεις μοιάζουν με εκείνες άλλων σημαντικών γονιδίων καταστολής όγκων στο CRC – TGFBRII. Και για τα δύο γονίδια, οι περισσότερες μεταλλάξεις εμφανίζονται σε CRC είναι μεταλλάξεις οδού πολυΑ σε ανεπάρκεια αναντιστοιχία επισκευή περιπτώσεις [14], αλλά μερικές από τις μεταλλάξεις βρίσκονται επίσης έξω από το πολυΑ οδού, συμπεριλαμβανομένων των περιπτώσεων χωρίς αναντιστοιχία ανεπάρκεια επισκευής. Βελτιώσεις σε τεχνολογίες και το κόστος αλληλούχιση θα επιτρέψει την ακριβή εκτίμηση του MLL3 μεταλλάξεων σε πρωτογενή CRCs στο εγγύς μέλλον.

Συνδυασμός των επιγενετικών και γενετικών σίγηση χαρακτηρίζει αρκετές ογκο-κατασταλτικά γονίδια και καρκίνο προδιαθέσεως όπως Ρ16, MLH1, VHL και άλλα. MLL3 έδειξε απατηλά DNA υπερμεθυλίωση στα κύτταρα CRC, αλλά και σε πρωτογενείς όγκους από ποσοτική θειώδους ανάλυση Pyrosequencing. Για την ανίχνευση αυτή αναλύεται μεθυλίωσης του DNA των CpG χώρων 224 bp από το TSS που αναφέρεται μεθυλίωση σε κυτταρικές σειρές CRC, πρωτογενείς όγκους και φυσιολογικό κόλον. Ωστόσο, βρήκαμε ότι γύρω από το TSS του MLL3 υπάρχει ένα υψηλά ομόλογη (~92.0%) σε ένα γονίδιο στο χρωμόσωμα ψευδο 22 το οποίο ονομάζεται psiTPTE22 (ψευδο-γονιδίου του διαμεμβρανικού φωσφατάσης με tensin ομολογία επί του χρωμοσώματος 22). TPTE (διαμεμβρανική φωσφατάση με tensin ομολογία) βρίσκεται στο ανθρώπινο χρωμόσωμα 21 και έχει πολλά ομόλογα αντίγραφα /ψευδογονίδια στο χρωμόσωμα 13, 15, 21, 22 και Υ [15].

επόμενο αναλύονται αυτά τα CpG ιστοσελίδα χρησιμοποιώντας όξινο θειικό άμεση αλληλούχιση μετά ΤΟΡΟ-ΤΑ κλωνοποίηση σε κυτταρικές γραμμές CRC (Σχήμα S1A-Ι)) και του πρωτογενούς φυσιολογικά δείγματα κόλου (Σχήμα 4Α-J)). Bisulfite δοκιμασία άμεση αλληλούχιση ήταν σε θέση να διακρίνει το psiTPTE22 από MLL3 μετά αλληλούχιση, επειδή η περιοχή του υποκινητή του γονιδίου psiTPTE είναι 10 bp μικρότερο από γονίδιο MLL3 (Σχήμα 4Α). Βρήκαμε ότι MLL3 έδειξε μόνο 0-5% μεθυλίωση εκτός από την RKO που υπέστη μεθυλίωση σε 13,0%. Από την άλλη πλευρά, psiTPTE22 μεθυλιώθηκε μεταξύ 65-90% σε όλες τις κυτταρικές σειρές CRC (Σχήμα 4Β-I). Addtionally, psiTPTE22 είχαν επίπεδα μεθυλίωσης σε φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου είναι παρόμοια με αυτά που παρατηρήθηκαν προηγουμένως για διάφορα γονίδια [16].

ψευδογονίδια είναι defunct συγγενείς των γνωστών γονιδίων που έχουν χάσει την ικανότητα που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη ή άλλως να μην εκφράζονται πλέον στο κύτταρο [17]. Παρά το γεγονός ότι μερικοί δεν έχουν εσώνια ή υποστηρικτές, οι περισσότεροι έχουν κάποια γονίδιο-όπως χαρακτηριστικά (όπως υποκινητές, νησίδες CpG, και θέσεις ματίσματος), είναι παρ ‘όλα αυτά θεωρείται μη λειτουργικό, λόγω της έλλειψης της ικανότητας που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη που προκύπτει από διάφορες γενετικές Αναπηρίες ( κωδικόνια τερματισμού, μετατοπίσεις πλαισίου, ή έλλειψη μεταγραφής) ή την αδυναμία τους να κωδικοποιούν RNA. Οι ψευδογονίδια που χαρακτηρίζεται από ένα συνδυασμό ομολογία με ένα γνωστό γονίδιο και nonfunctionality. Δηλαδή, αν και κάθε ψευδογονίδιο έχει μια αλληλουχία DNA που είναι παρόμοια με κάποιο λειτουργικό γονίδιο, εξακολουθούν να είναι σε θέση να παράγουν λειτουργικά τελικών προϊόντων [18].

Είναι ενδιαφέρον, Liang et al περιέγραψαν ότι psiTPTE22-HERV έχει σιγήσει μεθυλίωσης του DNA δεν είναι μόνο καρκίνους GI, αλλά και νεφρική, ηπατική και καρκίνο του πνεύμονα [19]. Και αλληλουχίες HERV που σχετίζονται με psiTPTE22-HERV ως επί το πλείστον συγκολλημένα ως εσώνια από τις μεταγραφές, και η αλληλουχία αμινοξέων της πρωτεΐνης 15 kDa δεν είναι ένα ομόλογο σε οποιοδήποτε ρετροϊικές πρωτεΐνες. Αυτοί κάνουν το HERV που σχετίζονται με psiTPTE22-HERV γονίδιο μια συνηθισμένη σωματική γονιδιακή.

Συνοπτικά, αναφέρουμε ότι MLL3 αδρανοποιείται στο CRC με γενετική τροποποίηση. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι μικροδορυφόρων ασταθή κυττάρων CRC liness έχουν συχνές μεταλλάξεις πλαισίου μέσα σε ένα (Α)

9 οδού περιοχή κωδικοποίησης της MLL3 προκαλώντας απώλεια της λειτουργίας της πρωτεΐνης, και μια προηγούμενη μελέτη που αναφέρθηκε σε μεταλλάξεις έξω από το σωλήνα στο μικροδορυφορικού σταθερή καρκίνους . Επιπλέον, ο προαγωγός MLL3 νησί CpG είναι εξαιρετικά ομόλογο προς ένα νησί CpG στην περιοχή προαγωγού ενός psiTPTE22 ψευδογονιδίου. psiTPTE22 ήταν πυκνά μεθυλίωση τόσο στην πρωτοβάθμια όσο CRCs και συσχετίζεται με τη γήρανση σε φυσιολογικό επιθήλιο αλλά όχι MLL3 (Εικόνα 4Α-J). απώλεια MLL3 της λειτουργίας μπορεί να είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό της πρώιμης ογκογένεσης CRC.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

Bisulfite άμεση ανάλυση αλληλουχίας των δύο MLL3 και psiTPTE22 κατάσταση μεθυλίωσης σε 6 κυτταρικές σειρές CRC. (Α-Ι) Βρήκαμε 0-5% μεθυλίωση MLL3 σε όλες τις κυτταρικές σειρές. Αντίθετα, η ψευδο-γονίδιο (psiTPTE22) μεθυλιώθηκε μεταξύ 65-90% σε όλες τις κυτταρικές σειρές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023320.s001

(EPS)

Πίνακα S1.

Αστάρια ακολουθίες που χρησιμοποιούνται για θειώδους-Pyrosequencing και άμεση ανάλυση αλληλουχίας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0023320.s002

(DOC)