Abstract

Η τελομεράση παίζει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των κακοήθων όγκων, και η δραστικότητα του καθορίζεται κυρίως από μεταγραφική ρύθμιση της ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT). Αρκετές mRNA εναλλακτικές παραλλαγές ματίσματος (ASVs) για hTERT έχουν εντοπιστεί, αλλά παραμένει ασαφές εάν η δραστηριότητα της τελομεράσης συνδέεται άμεσα με μεταγραφές hTERT μάτισμα. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει νέες πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας πρωτόκολλα μοριακών φάρων και εφαρμόστηκε σε κυτταρικές σειρές καρκινώματος του πνεύμονα και καρκινικούς ιστούς για ποσοτικοποίηση της δράσης της τελομεράσης και τρία ουσιώδη μεταγραφές διαγραφή hTERT αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κυτταρικές γραμμές καρκινώματος πνεύμονα καταδειχθεί με συνέπεια τη δράση της τελομεράσης (14,22 – 31,43 TPG μονάδες ανά 100 κύτταρα) και διάφορες εναλλακτικές μεταγραφές hTERT μάτισμα. Για 165 περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα, η δραστηριότητα της τελομεράσης έδειξε σημαντική συσχέτιση με τη διαφοροποίηση του όγκου (poorly- & gt? Μετρίου & gt? Καλά διαφοροποιημένο, P & lt? 0,01) και με histotypes (σε συνδυασμό μικρό κελί και πλακώδες καρκίνωμα & gt? Πλακώδες καρκίνωμα & gt? Αδενοχοληδωτό καρκίνωμα & gt? αδενοκαρκίνωμα, P & lt? 0,05). Αν και οι συνολικές μεταγραφές hTERT ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα, δεν συνδέθηκαν με τη δράση της τελομεράσης (r = 0.092, p = 0.24). δραστικότητα τελομεράσης συσχετίστηκε σημαντικά με το μεταγραφικό συστατικό αναλογία α-διαγραφής (r = -0.267, P = 0,026), β-διαγραφή (r = -0.693, p = 0,0001) και γ-διαγραφή (r = -0.614, P = 0.001). Ο θετικός ρυθμός και η μέση αναλογία συστατικών των μεταγραφών β-διαγραφή (92,12%, 0,23) ήταν υψηλότερες από αυτές του α-διαγραφής (41,82%, 0,12) ή γ-διαγραφή (16,36%, 0,18) μεταγραφές. Η συνδυασμένη μικρών κυττάρων και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων εκφράζεται λιγότερο μεταγραφές διαγραφή, ειδικά β-διαγραφή, από ό, τι άλλες histotypes, η οποία μπορεί να εξηγήσει υψηλότερη δραστικότητα τελομεράσης τους. Συμπερασματικά, οι ραδιοφάρων πραγματικού χρόνου PCR πρωτόκολλα μοριακής ταχείες, ευαίσθητες και ειδικές μεθόδους για την ποσοτικοποίηση δραστικότητα τελομεράσης και ASVs hTERT. Η δραστικότητα τελομεράσης μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα αξιόπιστο και αποτελεσματικό μοριακό δείκτη να βοηθήσει στην αξιολόγηση των ιστολογικών υποτύπου και της διαφοροποίησης των καρκινωμάτων των πνευμόνων. Περαιτέρω μελέτες για μεταγραφές μάτισμα διαγραφή hTERT, παρά τα συνολικά μεταγραφές hTERT, μπορεί να βελτιώσει την κατανόησή μας της ρύθμισης της τελομεράσης

Παράθεση:. Liu Υ, Wu Bq, Zhong Hh, Tian xx, Fang Wg (2012) Ποσοτικοποίηση εναλλακτικό μάτισμα Παραλλαγές της ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης και συσχετισμοί με την τελομεράση δραστηριότητα στον καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 7 (6): e38868. doi: 10.1371 /journal.pone.0038868

Επιμέλεια: Chi Zhang, του Πανεπιστημίου του Τέξας Southwestern Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 11 Φεβ. 2012? Αποδεκτές: 15η Μάη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 18 Ιουνίου του 2012

Copyright: © 2012 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις σε WG Fang από το Πρόγραμμα 973 (2010CB529402) από το Υπουργείο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Κίνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Κανονική σωματικά κύτταρα υφίστανται τη διαδικασία της κυτταρικής γήρανσης, λόγω της προοδευτικής βράχυνση των τελομερών μετά από κάθε κυτταρική διαίρεση. Η ενεργοποίηση της τελομεράσης πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνος για τη διατήρηση επαρκούς μήκους τελομερούς σε κύτταρα όγκου ή στέλεχος. Αυτά τα κύτταρα έχουν ξεπεραστεί αυτό πολλαπλασιαστική μπλοκ με την έκφραση του ενζύμου τελομεράση, η οποία παρέχει τα κύτταρα με την ικανότητα να διαιρούνται συνεχώς. Έτσι, η ρύθμιση της δράσης της τελομεράσης έχει σημαντικές επιπτώσεις για πολλές αναπτυξιακές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της γήρανσης, καθώς και ογκογένεση. Η δραστικότητα τελομεράσης έχει ανιχνευθεί σε σχεδόν το 90% όλων των ανθρώπινων κακοηθειών, καθιστώντας μια προφανής στόχος για τον καρκίνο διαγνωστικές και θεραπευτικές στρατηγικές.

Ο ανθρώπινης τελομεράσης ανάστροφης μεταγραφάσης (hTERT) είναι ένα βασικό συστατικό του συμπλέγματος ολοενζύμου που προσθέτει τελομερείς επαναλήψεις στα άκρα των χρωμοσωμάτων. Η έκφραση της κανονικής πλήρους μήκους hTERT συσχετίζεται καλά με τη δράση της τελομεράσης και φαίνεται να είναι ο παράγοντας περιορισμού του ρυθμού για δραστικότητα τελομεράσης σε ανθρώπινα κύτταρα. Το γονίδιο hTERT αποτελείται από 16 εξώνια και εκτείνεται σε ~37 kb γονιδιακού DNA, εκ των οποίων ~ 33 kb είναι ιντρονικές αλληλουχίες και τα υπόλοιπα ~ 4 kb αντιστοιχεί στη μεταγραφή του hTERT mRNA. Πρόσφατα, τρεις κύριες εναλλακτικές παραλλαγές ματίσματος (ASVs) στην αντίστροφη μεταγραφάση μοτίβα του hTERT βρέθηκαν να εμπλέκεται στον έλεγχο της δράσης της τελομεράσης: i) α-διαγραφή: λείπουν 36 bp από το εξώνιο 6 συμπεριλαμβανομένου μοτίβο Α? ii) β-εξάλειψη: στερείται 182 bp από τα εξόνια 7 και 8, οδηγώντας σε μια νοηματική μετάλλαξη και περικοπή της πρωτεΐνης πριν από τα συντηρημένα μοτίβα RT? iii) γ-διαγραφή: έλλειψη 189 bp από το εξώνιο 11 μέσα σε μοτίβα Δ και Ε [1]. Υπάρχουν αρκετές πιθανές συνδυασμοί αυτών των εναλλακτικών θέσεων ματίσματος, οι οποίες οδηγούν σε ένα μεγάλο αριθμό πιθανών προϊόντων μετεγγραφής ματίσματος, αλλά εκείνοι με περισσότερες από δύο θέσεις ματίσματος είναι ασταθείς και αποικοδομούνται πολύ γρήγορα για να ανιχνευθούν. Επειδή α, β και διαγραφή γ μεταγραφές ως αποτέλεσμα αποκοπές ή μεταλλάξεις στην περιοχή της αντίστροφης μεταγραφάσης ουσιώδης για την καταλυτική δραστηριότητα, είναι είτε μη λειτουργικά (β-εξάλειψη ή γ-διαγραφή) ή ακόμη και να έχουν κυρίαρχο-αρνητικό εφέ (α-διαγραφή) [1 ] – [4]. Ως εκ τούτου, ο συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης του γονιδίου hTERT και δράση της τελομεράσης είναι πολύπλοκη.

δραστικότητα τελομεράσης και έκφραση hTERT βρέθηκαν στο 67-85% και 48-95% των όγκων του πνεύμονα, αντίστοιχα [5], [6], και και οι δύο ήταν σημαντικά σχετίζονται με την κακή συνολική επιβίωση και την ελεύθερη νόσου επιβίωση σε ασθενείς με μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) [6], [7]. Ωστόσο, οι σχέσεις μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης ή hTERT και κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητές ήταν αμφιλεγόμενη. Lantuejoul S και συνεργάτες ανέφεραν ότι η έκφραση της hTERT ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε αδενοκαρκίνωμα (Adc) από ό, τι σε καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (SCC), Βασικοκυτταρικό καρκίνωμα και μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, και τη δράση της τελομεράσης ήταν χαμηλότερη σε καρκινώματα του πνεύμονα σταδίου Ι από ό, τι σε άλλα στάδια (ΙΙ- IV) [5]. Wu TC και συνεργάτες απέδειξαν ότι ούτε δραστικότητα τελομεράσης ούτε έκφραση hTERT σε NSCLCs συσχετίστηκε με κλινικοπαθολογικά χαρακτηριστικά όπως είναι ο βαθμός, τα στάδια του όγκου, τύπους όγκων ή τις τιμές ΤΝΜ [8]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η πλειοψηφία των προηγούμενων μελετών δοκιμαστεί μόνο τελομεράσης δραστηριότητα ή συνολικά μεταγραφές hTERT, και δεν διακρίνουν τις διαφορετικές μεταγραφές παραλλαγή ματίσματος. Στην παρούσα μελέτη, ένα πρωτόκολλο τελομερούς επανάληψης ενίσχυση σε πραγματικό χρόνο (TRAP) με ένα αντίστροφο εκκινητή-συνδεδεμένο ανιχνευτή (RPP), ένα είδος ανιχνευτή μοριακού φάρου κτένισμα το αντίστροφο εκκινητή και ανιχνευτή φθορισμού σημασμένο σε ένα μόριο, το οποίο αναπτύχθηκε για τελομεράση ποσοτικοποίηση δραστικότητα σε κυτταρικές γραμμές όγκου του πνεύμονα και τους ιστούς. Μια άλλη πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία με μοριακών φάρων αναπτύχθηκε για να αναλυθούν τα επίπεδα έκφρασης των hTERT ASVs στα ίδια δείγματα. Έτσι, ερευνήσαμε τον χαρακτηρισμό της δραστηριότητας της τελομεράσης και hTERT μεταγραφή διαγραφή μάτισμα σε καρκίνωμα των πνευμόνων, η οποία μπορεί να παρέχει σημαντικές πληροφορίες για την κατανόηση της ρύθμισης της τελομεράσης στην ογκογένεση.

Μέθοδοι

όγκων Υλικό και κυτταρικές σειρές

δείγματα όγκων ελήφθησαν από 165 ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα (115 άνδρες, 50 γυναίκες? διάμεση ηλικία, 60 ετών? εύρος, 31 έως 79 ετών). Μέσα σε 10 λεπτά μετά από τη χειρουργική επέμβαση, οι ιστοί χωρίς νέκρωση και αιμορραγία αποκόπηκαν από τον όγκο, που ακολουθείται από flash-κατεψυγμένα σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -70 ° C. Ένα μέρος του κάθε δείγματος υποβλήθηκε σε συμβατική ιστολογική εξέταση για να εξασφαλιστεί ότι τα δείγματα περιείχαν τουλάχιστον 80% των κυττάρων του όγκου. Διάγνωση, ταξινόμηση και παθολογικές ΤΝΜ (όγκος, όζος, μετάσταση) στάσης προσδιορίστηκαν ανεξάρτητα από δύο έμπειρους παθολόγους, σύμφωνα με τον ΠΟΥ και UICC ταξινόμησης.

Το ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών Α549, Η1299, SPC-Α1 και ΡΑΑ χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί μάρτυρες για τη δράση της τελομεράσης και την έκφραση του γονιδίου hTERT. ΡΑΑ καθορίστηκε από μια κινεζική ασθενή με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και διατηρήθηκε στο εργαστήριο μας, ενώ άλλες κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο Dulbecco τροποποιημένο Eagle (ϋΜΕΜ), συμπληρωμένο με 100 mL /L θερμικά απενεργοποιημένο ορό εμβρύου μόσχου (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ, USA), στους 37 ° C υπό 5% CO

2. Κύτταρα σε 80-90% συρροής συλλέχθηκαν με 0.25% θρυψίνη-ΕϋΤΑ και πλύθηκαν με παγωμένο φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS, ρΗ 7.4). Μετά την καταμέτρηση των κυττάρων, κατά προσέγγιση 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στα 2000 g για 5 λεπτά στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια του κυττάρου φυλάχθηκαν στους -70 ° C για τον προσδιορισμό της τελομεράσης εντός έξι μηνών.

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review Πανεπιστήμιο του Πεκίνου με την έγκριση Νο IRB00001052- 10004. Όλοι οι συμμετέχοντες σε αυτή τη μελέτη έχουν δώσει έγγραφη συγκατάθεση, η οποία υπήρξε η διαδικασία επανεξέτασης της επιτροπής δεοντολογίας.

Αστάρια και Probe Σχεδιασμός

Το παραδοσιακό TRAP είναι μία δοκιμασία δύο βημάτων στην οποία τελομεράση προσθέτει τελομερείς επαναλήψεις επάνω στο 3′-άκρο του ολιγονουκλεοτιδίου υποστρώματος, και στη συνέχεια τα εκτεταμένα προϊόντα ενισχύονται με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) χρησιμοποιώντας TS και ένα αντίστροφο έναυσμα συμπληρωματικό των τελομερών επαναλήψεων. Σε αυτή τη μελέτη, ένας προσδιορισμός TRAP πραγματικό χρόνο αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας αντίστροφο έναυσμα-συνδεδεμένη ανιχνευτή (RPP), η οποία συνδύαζε την ανάστροφο εκκινητή και ανιχνευτή φθορισμού σημασμένο σε ένα μόριο. Η αρχή αυτής της δοκιμασίας TRAP πραγματικό χρόνο RPP που βασίζεται διαγραμματικά στο Σχ. 1. Ο αντίστροφος εκκινητής ανιχνευτής-συνδεδεμένη συνετέθη με Biosearch Technologies (Novato, CA, USA). Ποσοτικοποίηση της δραστηριότητας της τελομεράσης επιτεύχθηκε με την παρακολούθηση των σημάτων φθορισμού που εκπέμπεται από το ΠΠΠ που είχαν ενσωματωθεί στα προϊόντα TRAP (σχήμα S1). Μοριακή φάροι για ποσοτικοποίηση των hTERT συνολική ή διαγραφή μεταγραφές διευρυμένοι τα εξώνια χωρίς μάτισμα ή τις θέσεις διαγραφή αντίστοιχα, σύμφωνα με την GenBank με NM_198253 (Εικόνα S2). Οι εκκινητές και ανιχνευτές σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer PREMIER 5.0 και OLIGO 6.0 αντίστοιχα. Οι αλληλουχίες τους παρουσιάζονται στον Πίνακα S1. Το δέλτα εντροπία της δεύτερης δομής σε κάθε ανιχνευτή υπολογίστηκε από το λογισμικό Mfold (https://www.idtdna.com/Scitools/Applications/mFold/) για να ελέγξετε τη σταθερότητα του στελέχους-βρόχου. ανιχνευτές Beacon για hTERT και Taqman ανιχνευτή για το γονίδιο ελέγχου GAPDH (γονίδιο αφυδρογονάσης γλυκεραλδεΰδες 3-φωσφορικής) συνετέθησαν από τη Sigma-Aldrich (Saint Louis, ΜΟ, USA). Όλα τα σύνολα εκκινητών συντέθηκαν και καθαρίστηκαν με AuGCT Βιοτεχνολογίας (Πεκίνο, Κίνα). Η εξειδίκευση της PCR ενισχύσεις αξιολογήθηκε με 10% μη-μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου.

Εκχυλίσματα κυττάρων ισοδύναμα με τις υποδεικνυόμενες αριθμοί κυττάρων Α549 ελέγχθηκαν για δραστικότητα τελομεράσης. Αποτελέσματα σε ηλεκτροφόρηση πηκτής (αριστερά), οικόπεδο ενίσχυσης (παραπάνω) και πρότυπες καμπύλες (παρακάτω) έδειξε με συνέπεια τη γραμμική σχέση μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης και του αριθμού των κυττάρων Α549, ενώ το 5 αντιπροσώπευε ένα αρνητικό έλεγχο.

Η

Πραγματικό -Time Ποσοτικοποίηση Δοκιμασία τελομεράσης δραστηριότητας

Το ρυθμιστικό λύσης CHAPS παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (5000 κύτταρα /μL) και επωάστηκαν για 30 λεπτά επί πάγου. Μετά από φυγοκέντρηση (12 000 g, 30 min, 4 ° C), τα υπερκείμενα συλλέγονται προσεκτικά και ταχέως καταψύχθηκαν στους -70 ° C. Τα αποθηκευμένα δείγματα ιστού αποψύχθηκαν και μερικώς περίπου 30 mg ιστός τεμαχίστηκε υπό στείρες συνθήκες έως ότου λήφθηκε ένα λείο συνοχή. Το δείγμα στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε ένα αποστειρωμένο σωλήνα μικρο-φυγοκέντρησης 1,5 mL, και αναμίχθηκε με 200 μι CHAPS ρυθμιστικό λύσης. αναστολέα RNase (Takara Biotechnology, Dalian, Κίνα, 100 μονάδες /mL) προστέθηκε στο CHAPS ρυθμιστικό λύσης πριν από την εκχύλιση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε με την μέθοδο Bradford [10]. Τα τελικά εκχυλίσματα αραιώθηκαν σε συγκέντρωση 2 μg /μL πρωτεΐνης με ρυθμιστικό λύσης και αποθηκεύεται αμέσως σε κλάσματα στους -70 ° C.

Ο συνολικός όγκος του μίγματος της αντίδρασης ήταν 20 μί και περιείχε 1 χ ρυθμιστικό GoTaq flexi , 1,8 mM ΜαΟΙ

2, 50 μΜ καθενός από dNTP, 160 ηΜ τροποποιημένο ολιγονουκλεοτίδιο υπόστρωμα εκκινητή (MTS), 140 ηΜ ανάστροφου ανιχνευτή εκκινητή-συνδεδεμένη, 1unit του GoTaq DNA πολυμεράσης (Promega Corporation, Madison, WI, USA), και 1 μί εκχυλίσματα τελομεράσης. PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ΑΒΙ StepOne Real-Time Cycler (Applied Biosystems, Framingham, ΜΑ, USA). Μετά από 30 λεπτά επώασης στους 30 ° C για την επιμήκυνση της τελομεράσης, το μίγμα της αντίδρασης θερμάνθηκε στους 95 ° C για 3 λεπτά για την αδρανοποίηση της τελομεράσης, που ακολουθείται από μια ενίσχυση 40-κύκλος (94 ° C για 15 sec και 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα συμπεριλαμβανομένης της ανάγνωσης πλάκας 10- sec). Δέκα μικρολίτρα από κάθε εκχύλισμα δείγμα επωάστηκε στους 95 ° C για 10 λεπτά και στη συνέχεια ένα-δέκατο όγκου του προστέθηκε σε ένα άλλο παράλληλο αντίδραση ως έλεγχος θερμο-απενεργοποίηση. Σε κάθε πείραμα, 1 μι CHAPS ρυθμιστικού λύσης υποκατασταθεί πρωτεϊνικό εκχύλισμα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος.

TSR8 είναι ένα ολιγονουκλεοτίδιο πανομοιότυπο με το αρχικό τεμάχιο επεκτείνεται MTS με οκτώ τελομερών επαναλήψεων AG (GGTTAG)

7, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως πρότυπο για την εκτίμηση του ποσού της MTS εκκινητές με τελομερείς επαναλήψεις παραταθεί κατά της τελομεράσης σε ένα δεδομένο εκχύλισμα. Επιπλέον, η ανίχνευση της TSR8 υποδεικνύει ότι το στάδιο ενισχύσεως του ποσοτικού προσδιορισμού TRAP εκτελέστηκε αποτελεσματικά [11]. Για να εκτελεστεί ο προσδιορισμός TRAP, 1 μL από κάθε αραίωση TSR8 (0,2 amol /μL, 0,04 amol /μL, 0,008 amol /μL και 0,0016 amol /μL, αντίστοιχα) χρησιμοποιήθηκε για να ληφθεί η πρότυπη καμπύλη στην οποία 0,001 amol TSR8 αντιστοιχεί σε κάθε μονάδα TPG (που δημιουργούνται συνολικά Παραγωγή). Για να είναι έγκυρη ανάλυση, οι κατάλληλοι έλεγχοι έχουν συμπεριληφθεί σε κάθε δοκιμασία:

i) τον έλεγχο της θερμότητας-αδρανοποίηση: το δείγμα εκχύλισμα θερμαίνεται στους 95 ° C για 10 λεπτά? ii) αρνητικός μάρτυρας: ρυθμιστικού λύσης υποκατασταθεί εκχύλισμα πρωτεΐνης και iii) θετικός έλεγχος: εκχυλίσματα κυττάρων θετικών σε τελομεράση. Μερικές φορές, η θετική δράση της τελομεράσης μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο στο αραιωμένο εκχύλισμα και δεν μπορεί να ανιχνευθεί σε περισσότερες συμπυκνωμένα εκχυλίσματα, επειδή το εκχύλισμα ιστού μπορεί να περιέχει αναστολείς της πολυμεράσης Taq. Έτσι, για κάθε δείγμα ιστού, τουλάχιστον τρεις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης (2 μg /μL, 0.2 μg /μL, 0,02 μg /μL) ελέγχθηκαν εις διπλούν, στην οποία η υψηλότερη τιμή TPG θεωρήθηκε ως το τελικό δραστικότητα τελομεράσης.

RNA Εκχύλιση και σε πραγματικό χρόνο RT-PCR Ανάλυση των ASVs hTERT

Ολικό κυτταρικό RNA εκχυλίστηκε από τα κατεψυγμένα δείγματα με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση σε αποδιατακτικό πήκτωμα αγαρόζης. Μόνο δείγματα με αιχμηρές 18 S και 28 S rRNA ζωνών και χωρίς υποβάθμιση χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση. Δύο μικρογραμμάρια RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή cDNA χρησιμοποιώντας την ανάστροφη μεταγραφάση Μ-ΜΕν και τυχαία εξαμερή (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Το αραιωμένο cDNA (1:10 αραίωση) χρησιμοποιήθηκε για την ενίσχυση του GAPDH ελέγχου για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας αντίστροφης μεταγραφής καθώς και της ακεραιότητας του RNA.

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα συνολικό όγκο 15 μL που περιέχει 1 × GoTaq ρυθμιστικό Flexi, 5 mM MgCl

2, 200 μΜ εκάστου των dNTP, 1 μονάδα GoTaq DNA πολυμεράση, 800 ηΜ εκκινητές (εμπρός και πίσω), 400 ανιχνευτές ηΜ και 1 μL αραιωμένου cDNA (1:10 αραίωση). Η θερμοκρασία ανόπτησης ήταν διαφορετική για διαφορετικά ASV. Το πρωτόκολλο ποδηλασίας αποτελείτο από 3 λεπτά αρχική μετουσίωση στους 95 ° C και μία ενίσχυση 40 κύκλων (94 ° C για 15 δευτερόλεπτα, θερμοκρασία ανασύνδεσης για 60 δευτερόλεπτα συμπεριλαμβανομένης της ανάγνωσης πλάκας). Κατά τη δοκιμή κάθε μεταγράφημα ASV με τη συγκεκριμένη ομάδα εκκινητών, δύο μεταγραφικές προϊόντων, με ή χωρίς διαγραφή, θα ενισχύονται ταυτόχρονα, αλλά ο ανιχνευτής υβριδοποιήθηκε μόνο Beacon με την απαλοιφή μεταγραφικό προϊόν και εκπεμπόμενος φθορισμός [12]. Η τιμή Ct κάθε παραλλαγή hTERT μάτισμα ομαλοποιήθηκε με την Ct τιμή του GAPDH αφαιρώντας το CT-τιμής GAPDH από την τιμή-στόχο Ct. Το σχετικό επίπεδο έκφρασης για κάθε στόχο PCR υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την εξίσωση [13]: Σχετική έκφραση = 2

– [Ct (στόχος) -Ct (GAPDH)] × 10.000. Η συστατική αναλογία hTERT ASV (υπολογίζεται διαιρώντας τη σχετική αξία έκφραση των συνολικών μεταγραφές από εκείνη του ASVs) επίσης προσδιορίστηκε για κάθε δείγμα ιστού.

Στατιστική Ανάλυση

Βασικά περιγραφικά στατιστικά στοιχεία ήταν λαμβάνονται με τη χρήση του λογισμικού SPSS 11.0. συντελεστές συσχέτισης Spearman (rs) υπολογίστηκαν για την αξιολόγηση των ενώσεων μεταξύ τελομεράση δραστηριότητα, hTERT ASV έκφρασης και κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων. Διαφορές στη δράση της τελομεράσης ή ποσοτική έκφραση hTERT μεταξύ των αναλύονται υποομάδες αξιολογήθηκαν από το μη συζευγμένο t-test ή μονόδρομη ANOVA. Μια τιμή p & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Ποσοτικοποίηση τελομεράσης Δραστηριότητα και hTERT ASVs σε γραμμές όγκου κυττάρων

Η ευαισθησία και η γραμμικότητα του RPP με βάση το πραγματικό. δοκιμασία -Time TRAP αξιολογήθηκαν με μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα Α549 καρκινικής κυτταρικής γραμμής. Τα σφαιρίδια κυττάρου που περιέχουν περίπου 10

6 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 200 μι CHAPS ρυθμιστικό λύσης, ώστε τα εκχυλίσματα αντιστοιχούσαν σε δραστικότητα τελομεράσης 5000 κυττάρων ανά μικρολίτρο. Τα εκχυλίσματα τελομεράσης ήταν σειριακό αραιωμένο από 1000 έως 1 κύτταρο ανά μικρολίτρο, και 1 εκχύλισμα μL χρησιμοποιήθηκε στην ποσοτικοποίηση της δράσης της τελομεράσης εις τριπλούν. Η τελομεράσης σε εκχυλίσματα θα πρόσθετε τελομερείς επαναλήψεις επάνω στο 3′-άκρο του ολιγονουκλεοτιδίου υποστρώματος (MTS) στο πρώτο στάδιο της επώασης και τα προϊόντα ενισχύθηκαν σαν εκμαγείο στην επακόλουθη διαδικασία PCR. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, χρησιμοποιώντας το ηλεκτροφόρηση γέλης TRAP-πολυακρυλαμιδίου (TRAP-PAGE) δοκιμασία, η δραστικότητα τελομεράσης μπορεί να ανιχνευθεί σε τουλάχιστον δέκα κύτταρα Α549, που υποδεικνύεται από την παρουσία ενός ορατού εξανουκλεοτιδίου σκάλα των προϊόντων της PCR στο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου. Ωστόσο, η χρήση ποσοτικού προσδιορισμού TRAP πραγματικό χρόνο RPP που βασίζονται τελομεράσης δραστηριότητα θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε τόσο λίγα όσο ένα κύτταρο Α549. Μία γραμμική σχέση παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης και του λογαρίθμου του αριθμού των κυττάρων που κυμαίνεται από 1 έως 1000 κύτταρα. Ο συντελεστής συσχέτισης υπολογίζεται από το μοντέλο γραμμικής παλινδρόμησης ήταν μέχρι 96,4%. Συμπεριλαμβανομένης της εξόρυξης τελομεράση, η δοκιμασία TRAP σε πραγματικό χρόνο RPP που βασίζεται μπορούσε να ολοκληρωθεί μέσα σε τρεις ώρες, ενώ η TRAP-PAGE θα χρειαστούν τουλάχιστον 5 ώρες. Είναι σημαντικό ότι η δοκιμασία TRAP πραγματικό χρόνο RPP που βασίζονται ήταν ακρίβεια ποσοτική και αναπαραγώγιμη. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, κυτταρικές γραμμές Α549, Η1299, SPC-Α1 και ΡΑΑ απέδειξαν με συνέπεια τη δράση της τελομεράσης από 14,22 να 31,43 μονάδες TPG ανά 100 κύτταρα.

μοριακών φάρων είναι ευαίσθητη και ειδική, επειδή οι ανιχνευτές δεν υδρολύονται σε η ενίσχυση και αναγνωρίζουν μόνο τα απολύτως συμπληρωματικούς στόχους. Στην ποσοτικοποίηση των hTERT ASVs, ο ανιχνευτής μοριακών φάρων επανατήκεται προς τις αντίστοιχες μεταγραφές και παρακολουθεί την σύνθεση των ειδικών νουκλεϊκών οξέων σε πραγματικό χρόνο. Για παράδειγμα, ο ανιχνευτής H1810 είναι συμπληρωματική προς την αλληλουχία DNA στην διασταύρωση του εξονίου 3 και του εξονίου 4 του γονιδίου hTERT, και θα υβριδοποιούνται σε όλα τα μεταγραφές hTERT και ως εκ τούτου την ανίχνευση συνολική μεταγραφές hTERT, συμπεριλαμβανομένων φυσιολογικών και παραλλαγή μεταγραφές ματίσματος. Ωστόσο, η A2173 ανιχνευτή, B2331 και R2699 ανιχνεύει μόνο τα α, β ή γ διαγραφή μεταγραφές αντίστοιχα. Με τη χρήση του πρόσφατα αναπτυγμένο πρωτόκολλο ποσοτικού προσδιορισμού, σε κύτταρα SPC-Α1, το σύνολο των τριών μεταγραφών ματίσματος διαγραφή ανιχνεύθηκαν, με την αναλογία 0,21, 0,26 και 0,04 για α, β ή διαγραφή γ μεταγραφές αντίστοιχα (Πίνακας 1 και Σχήμα 2), η οποία θα προκαλέσουν μερική μη λειτουργικές μεταγραφές και μπορεί να εξηγήσει τη χαμηλή δραστηριότητα της τελομεράσης του. Σε άλλες κυτταρικές γραμμές, η μεταγραφή γ-διαγραφή δεν ανιχνεύθηκε και τα επίπεδα έκφρασης των μεταγραφών α-διαγραφή (εύρος, 0,25 – 0,44) ήταν υψηλότερες από ό, τι β μεταγραφές διαγραφή (Πίνακας 1).

Η

Αντιπρόσωπος καμπύλες γραμμική ενίσχυση δείχθηκαν για ποσοτική ανίχνευση του συνολικού hTERT (Α), α-διαγραφή (Β), β-διαγραφή (C) και γ-διαγραφή (D) μεταγραφές αντίστοιχα. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος. NC:. Αρνητικός έλεγχος

Η

Ποσοτικοποίηση τελομεράσης Δραστηριότητα και hTERT ASVs στον πνεύμονα δείγματα όγκων

Στον προσδιορισμό TRAP του δείγματος ιστού του όγκου, τα αποτελέσματα των δύο πολυακρυλαμιδίου και καμπύλες ενίσχυσης του RPP που βασίζονται σε πραγματικό χρόνο TRAP έδειξε τη γραμμική σχέση μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης και λογάριθμος της συγκέντρωσης πρωτεΐνης (Σχήμα 3). Σε μία περίπτωση καρκινώματος πλακωδών κυττάρων, δραστικότητα τελομεράσης θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε μια συγκέντρωση πρωτεΐνης στο χαμηλότερο σχεδόν 0.002 μg /μL. Για να πάρετε αξιόπιστα ποσοτικό αποτέλεσμα TRAP, τουλάχιστον τρεις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης (0,02, 0,2 και 2 μg /μL) εις διπλούν για κάθε δείγμα όγκου αναλύθηκαν με δύο ξεχωριστά πειράματα.

Serial αραιωμένο πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από 2 μg έως 0.0002 μg δοκιμάστηκαν για δραστικότητα τελομεράσης σε μία περίπτωση καρκινώματος πλακωδών κυττάρων. Αποτελέσματα σε ηλεκτροφόρηση πηκτής (αριστερά), οικόπεδο ενίσχυσης (παραπάνω) και πρότυπες καμπύλες (παρακάτω) έδειξε με συνέπεια τη γραμμική σχέση μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης και η συγκέντρωση πρωτεΐνης, ενώ 6 αντιπροσώπευε ένα αρνητικό έλεγχο.

Η

Σε όλες 165 δείγματα ιστών όγκου πνεύμονα, τη δράση της τελομεράσης κυμαίνεται από 0.39-482.46 μονάδες TPG (Πίνακας 2). Η μέση δραστικότητα τελομεράσης σε άνδρες ασθενείς ήταν σημαντικά υψηλότερο από εκείνο σε γυναίκες ασθενείς (Ρ = 0,006). δράση της τελομεράσης αρνητικά που συνδέονται με τη διαφοροποίηση του όγκου (r = 0.022, p = 0,005), στην οποία οι πτωχά διαφοροποιημένα καρκινώματα έδειξε την υψηλότερη δραστικότητα τελομεράσης. Η δραστικότητα τελομεράσης ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των τεσσάρων κύριων ιστολογικών φαινοτύπων καρκινωμάτων πνεύμονα (Ρ = 0,001), η οποία αξιολογήθηκε επίσης σε ζεύγη. Η συνδυασμένη μικρών κυττάρων και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (CSS) έδειξαν την υψηλότερη δράση της τελομεράσης (vs. άλλα τρία histotypes, Ρ = 0,001), ακολουθούμενη από την SCC και αδενοχοληδωτό καρκίνωμα (ASC) (έναντι τριών άλλων histotypes, Ρ = 0,025 αντιστοίχως), ενώ Adc έδειξε τη χαμηλότερη δραστηριότητα της τελομεράσης (έναντι τριών άλλων histotypes, P = 0,001). Καμία συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης και το στάδιο TNM βρέθηκε στη μελέτη αυτή (P & gt? 0,05)

Η

Η ποσοτικοποίηση των συνολικών και διαγραφή μάτισμα μεταγραφές hTERT πραγματοποιήθηκαν σε όλα τα δείγματα όγκων.. Στην ανάλυση του Spearman, δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης hTERT συνολικής μεταγραφές και τη δράση της τελομεράσης (r = 0.092, p = 0,241), και μεταξύ της έκφρασης hTERT συνολικής μεταγραφές και κάθε κλινικοπαθολογική παράμετρο (Ρ & gt? 0,05). Οι μεταγραφές α, β και γ διαγραφή ανιχνεύθηκαν σε 41,82%, 92,12% και 16,36% των ασθενών, και η μέση αναλογία συστατικών τους ήταν 0,12, 0,23 και 0,18 αντίστοιχα. Μόνο 16 ασθενείς εξέφρασαν όλες από τις τρεις μεταγραφές διαγραφή ταυτόχρονα. Ήταν αξιοσημείωτο ότι το σύνολο των συστατικών αναλογίες τριών μεταγραφών διαγραφή »συσχετίζονταν σημαντικά με τη δράση της τελομεράσης, ενώ ο συντελεστής συσχέτισης ήταν -0,267 για α-διαγραφή μεταγραφής (Ρ = 0,026), -0,693 για β-διαγραφή μεταγραφής (Ρ = 0.0001) και -0,614 για γ-διαγραφή μεταγραφής (Ρ = 0,001), αντιστοίχως. Σε άρρενες ασθενείς, οι μέσες αναλογίες συστατικών των τριών διαγραφών ήταν χαμηλότερες από εκείνες σε γυναίκες ασθενείς, σύμφωνα με την υψηλότερη δραστικότητα τελομεράσης μεταξύ τους. Ωστόσο, μόνο β-εξάλειψη και γ-διαγραφή έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ ανδρών και γυναικών ασθενών (Ρ = 0,006, Ρ = 0.027, αντίστοιχα). Όσο για κατά ζεύγη συγκρίσεις μεταξύ ιστολογικούς υποτύπους και τρία διαγραφή μεταγραφική συστατικό αναλογίες, το CSS έδειξε σημαντικά χαμηλότερη συστατικό αναλογία σε β-διαγραφή (Ρ = 0,011) και γ-διαγραφή (Ρ = 0,015) από ό, Adc. Το SCC παρουσίασε μόνο κάτω συστατικό αναλογία γ-διαγραφή (P = 0,006) από ό, τι Adc. Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ οποιουδήποτε διαγραφή μεταγραφικό συστατικό αναλογία και η διαφοροποίηση του όγκου, το στάδιο ή μετάσταση λεμφαδένα. Επιπλέον, οι ασθενείς με υπεζωκοτική μετάσταση έδειξε σημαντικά υψηλότερο μεταγραφική συστατικό αναλογία σε β-διαγραφή (Ρ = 0.041), αλλά όχι σε άλλες δύο διαγραφές (Ρ = 0,227 και Ρ = 0,735 αντιστοίχως).

Συζήτηση

από τελομεράσης εκφράζεται σε σχεδόν το 90% όλων των καρκίνων του ανθρώπου, υπήρξε μεγάλο ενδιαφέρον για την ανάπτυξη ενός προσδιορισμού τελομεράσης κατάλληλη για κλινικές δοκιμές [14]. Ως τελικό σημείο και ημι-ποσοτική ανάλυση, η παραδοσιακή παγίδα χαμηλής απόδοσης, περιορισμένη σε ακριβή ποσοτικοποίηση και πιθανόν να είναι ψευδώς αρνητικό, επειδή η αποδοτικότητα ενίσχυσης PCR μπορεί να ανασταλεί από την πρωτεΐνη σε κυτταρικό εκχύλισμα. Ποσοτικοποίηση της δραστηριότητας της τελομεράσης, χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο ανάλυση είναι πιο ακριβής, επειδή στηρίζεται σε τιμές Ct προσδιορίζονται κατά τη διάρκεια της εκθετικής φάσης της PCR σε σχετικά χαμηλές συγκεντρώσεις του προϊόντος PCR πριν τον κορεσμό ή οροπέδιο. Προηγούμενο πραγματικό χρόνο ποσοτική TRAP με φθορίζουσες χρωστικές ή καθετήρα Taqman είναι λιγότερο συγκεκριμένη και πιο περιορισμένη σε ποσοτικούς δυναμικό της εξαιτίας της μη ένα-προς-ένα αντιστοιχία μεταξύ φθορισμού και το προϊόν της PCR [15], [16]. Εδώ, περιγράφεται μία νέα δοκιμασία ποσοτική TRAP με τη χρήση ενός ανάστροφου εκκινητή ανιχνευτή-συνδεδεμένη (RPP). RPP είναι ένας μοριακός διακόπτης για την ανίχνευση ενίσχυση του DNA με τη χρήση της μεταφοράς ενέργειας μεταξύ φθοροφόρου (FAM) και σβέσης (DABSYL). Η OFF για μετάβαση ON εμφανίζεται όταν η διαμόρφωση του RPP αλλάζει από ένα «κλειστό» ενδομοριακή δομή στελέχους-βρόχου σε μια εκτεταμένη δομή «ανοίξει». Αυτή η δομική αλλαγή επιτυγχάνεται όταν το ένα RPP ενσωματώνεται σε ένα μόριο δίκλωνου DNA με PCR. Η ενίσχυση μπορεί να παρακολουθείται με απ ‘ευθείας μέτρηση του φθορισμού του μίγματος της αντίδρασης. Σε αυτή τη μελέτη, τη δράση της τελομεράσης κατέδειξε ικανοποιητική γραμμικές σχέσεις με το λογάριθμο του αριθμού καλλιεργημένων κυττάρων ή συγκέντρωση πρωτεΐνης σε σωστή σειρά. Η δραστικότητα τελομεράσης μπορεί να ανιχνευθεί σε τόσο λίγα όσο το ένα καλλιεργημένο κύτταρο όγκου ή στο χαμηλότερο 0.002 μg πρωτεΐνης από τον ιστό του όγκου. Σε συμφωνία με προηγούμενη έκθεση, η δοκιμασία TRAP σε πραγματικό χρόνο με φλουορεσκεΐνη ιχνηλάτη με βάση έδωσε περισσότερο ταχεία, ακριβή αποτελέσματα για τον ποσοτικό προσδιορισμό δραστικότητας τελομεράσης από τα παραδοσιακά TRAP με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα [17]. Σε προηγούμενη μελέτη μας, εξετάσαμε τη δράση της τελομεράσης 60 ιστούς καρκίνου του πνεύμονα χρησιμοποιώντας SYBR Green σε πραγματικό χρόνο TRAP, μία σχετική ποσοτική ανάλυση, και βρήκε μόνο τη διαφορά στη δράση της τελομεράσης μεταξύ NSCLC και CSS [9]. Σε αυτή τη μελέτη, εφαρμόσαμε το RPP που βασίζεται σε πραγματικό χρόνο TRAP σε μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων όγκου πνεύμονα ιστού (165 περιπτώσεις) και χρησιμοποιήθηκε πρότυπο ανάλυση καμπύλης. Μια σημαντική διαφορά στη δράση της τελομεράσης μεταξύ των τεσσάρων ιστολογικών τύπων βρέθηκε: CSS & gt? SCC & gt? Asc & gt? ADC, η οποία ήταν σύμφωνη με την έκθεση Fujiwara του [18]. Ohmura και Maniwa ανέφεραν υψηλότερη δραστικότητα τελομεράσης σε NSCLC (42,3 και 75,24 μονάδες TPG αντίστοιχα), στο οποίο εξετάστηκαν 60 και 40 περιπτώσεις αντίστοιχα, και χρησιμοποίησαν ημι-ποσοτικές μεθόδους [19], [20]. Θεωρούμε ότι τέτοιες αντιφάσεις μπορούσε να αποδοθεί σε διαφορετικούς πληθυσμούς και το μέγεθος του δείγματος, και ιδιαίτερα για τις διαφορετικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση δραστικότητα τελομεράσης. Ήταν επίσης αντικρουόμενες σε λογοτεχνίες κατά πόσον το επίπεδο της δραστηριότητας της τελομεράσης συσχετίστηκε με τις επιθετικές κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά, όπως η διαφοροποίηση του όγκου και το στάδιο TNM [6], [19] – [21]. Χρησιμοποιώντας το RPP που βασίζεται σε πραγματικό χρόνο TRAP, παρατηρήσαμε μια ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας της τελομεράσης και διαφοροποίησης του όγκου. Ήταν ενδιαφέρον το γεγονός ότι η διαφορά στη δράση της τελομεράσης μεταξύ ανδρών και γυναικών ασθενών παρατηρήθηκε σε αυτήν την μελέτη. Ότι οι γυναίκες ασθενείς υπέφεραν κυρίως από Adc, η οποία είχε μικρότερη δράση της τελομεράσης σε σχέση με άλλους υποτύπους, μπορεί να συμβάλει στη χαμηλότερη δραστηριότητα της τελομεράσης τους από τους άνδρες ασθενείς. Έτσι, η δραστηριότητα της τελομεράσης φαίνεται να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για τον προσδιορισμό ιστολογικό τύπο και τη διαφοροποίηση σε καρκινώματα του πνεύμονα.

Μερικοί συγγραφείς ισχυρίστηκαν ότι η ανίχνευση του hTERT mRNA με RT-PCR ή in situ υβριδισμού θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την αξιολόγηση της τελομεράσης δραστηριότητα [5]. Ωστόσο, η μεταγραφική και μετα- μεταγραφική ρύθμιση της hTERT ήταν πολύπλοκη και δεν είναι πλήρως διαλευκανθεί. Προηγουμένως, εκκινητή σετ ή καθετήρας Taqman που καλύπτει την θέση διαγραφής χρησιμοποιήθηκε στις περισσότερες μελέτες για την παραλλαγή ματίσματος εξετάσεις [22] – [26]. Ωστόσο, αυτές οι ομάδες εκκινητών ή ιχνηλατών θα μπορούσε να ενισχύσει τόσο τις μεταγραφές πλήρους μήκους και διαγραφή μεταγραφές λόγω της κλιμακωτής ανόπτησης με μικτά πρότυπα. Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια ποσοτική δοκιμασία με τη χρήση μοριακών φάρων και ανιχνεύονται όλοι τριών μεταγραφών διαγραφή σε κύτταρα SPC-Α1. Βρήκαμε μια σχετική υψηλή αναλογία συστατικού (εύρος, 0,21 – 0,44) για τις μεταγραφές α-διαγραφή στις κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα τέσσερα, πράγμα που δεν είναι σύμφωνο με τα δεδομένα δείχνουν χαμηλότερα συστατικό αναλογία (εύρος, 0,06-0,15) προηγουμένως [1] , [25], [27]. Αυτό μπορεί να αποδοθεί με τη χρήση των πιο συγκεκριμένων μοριακών φάρων, παρά τις ημι-ποσοτική ένθετη PCR δοκιμασίες. Τα πρότυπα ASVs hTERT δείχθηκαν να μεταβάλλεται σε μαστού, του ήπατος, του στομάχου, του παχέος εντέρου, του θυρεοειδούς και του πνεύμονα όγκους, όπου οι θετικές τιμές του hTERT ASVs πιθανώς υπερεκτιμηθεί με ενίσχυση μιας περιοχής που εκτείνεται δύο θέσεις διαγραφή [1], [11] [21] – [24], [26], [28]. ποσοτική δοκιμασία μας για κάθε μεταγραφή διαγραφή παρέχει μια λύση για να ποσοτικοποιήσει με ακρίβεια την έκφραση ASV και να αξιολογήσουν τη σχέση της με την κλινική-παθολογική παραμέτρους.

Σε αυτή τη μελέτη, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση μεταξύ της συνολικής μεταγραφές hTERT έκφρασης και της τελομεράσης δραστηριότητα, συνεπής με προηγούμενες αναφορές σε άλλους όγκους [29], [30], η οποία έδειξε ότι δεν ήταν λογικό να υποκαταστήσει τη συνολική ανίχνευση mRNA hTERT για αξιολόγηση δραστικότητας τελομεράσης. Βρήκαμε ότι περισσότερο από το 92% των ασθενών που εκφράζονται τουλάχιστον μία μεταγραφή διαγραφή, αλλά μόνο 9,7% εκφρασμένο όλες τις τρεις μεταγραφές διαγραφή. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι αναλογίες συστατικών των τριών μεταγραφών διαγραφή συσχετίζονταν σημαντικά με τη δράση της τελομεράσης. Οι μεταγραφές β-διαγραφή ήταν οι πιο κοινές παραλλαγές ματίσματος στα περισσότερα καρκινώματα του πνεύμονα και έδειξε την ισχυρότερη συσχέτιση με δραστικότητα τελομεράσης. Αυτό είναι παρόμοιο με τα προηγούμενα ευρήματα σε άλλους τύπους όγκων [11], [22] – [24], [26].