Αφηρημένο

Ιστορικό

Η διακοπή του πυρηνίσκου συχνά οδηγεί στην ενεργοποίηση των η ρ53 ογκοκατασταλτικό οδός μέσω της αναστολής της MDM2 που διαμεσολαβείται από ένα περιορισμένο σύνολο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένων RPL11 και RPL5. Τα αποτελέσματα της ριβοσωμικής απώλεια πρωτεΐνης σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών δεν έχουν ερευνηθεί πλήρως. Εδώ χαρακτηρίζουν την ανταπόκριση κυτταρικό στρες που προκαλείται από την εξάντληση της ριβοσωμικής πρωτεΐνης S9 (RPS9).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Η εξάντληση των RPS9 εξασθενημένη παραγωγή 18S ριβοσωμικού RNA και προκάλεσε δραστηριότητα p53. Προώθησε ρ53-εξαρτώμενη μορφολογική διαφοροποίηση των U343MGa Cl2: 6 κύτταρα γλοιώματος, όπως αποδεικνύεται από την έκφραση του εντατικοποίηση γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη και βαθιές αλλαγές στο σχήμα των κυττάρων. κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS εμφανίζεται περιορισμένη απόκριση γήρανση με αυξημένη έκφραση των δεικτών απόκριση βλάβης DNA, ενώ τα κύτταρα τραχηλικού καρκινώματος HeLa υποβλήθηκαν σε κυτταρικό θάνατο με απόπτωση. Εξόντωση RPL11 εξασθενημένη ρ53-εξαρτώμενη φαινοτύπων στα διάφορα RPS9 εξαντλημένο κυτταρικές καλλιέργειες. Σημαντικά, knockdown του RPS9 ή RPL11 επίσης αξιόλογα ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω μηχανισμών ρ53-ανεξάρτητη. RPL11 σύνδεση με MDM2 διατηρήθηκε παρά τα μειωμένα επίπεδα της πρωτεΐνης RPL11 παρακάτω πυρηνισκικός στρες. Σε αυτές τις ρυθμίσεις, RPL11 ήταν κρίσιμη για τη διατήρηση της σταθερότητας της πρωτεΐνης p53, αλλά δεν ήταν απολύτως απαραίτητες για τη σύνθεση πρωτεϊνών ρ53.

Συμπεράσματα

ρ53 παίζει σημαντικό ρόλο στην αρχική περιορισμό του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που συμβαίνει σε απάντηση σε μειωμένο επίπεδο RPS9. Τα αποτελέσματά μας δεν αποκλείουν την πιθανότητα ότι άλλοι πυρηνισκικός άγχος αίσθηση μόρια δρουν ανάντη ή παράλληλα με RPL11 να ενεργοποιήσετε την p53. Την αναστολή της έκφρασης ορισμένων ριβοσωμικές πρωτεΐνες, όπως RPS9, θα μπορούσε να είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος για να ξαναρχίσει διαδικασίες διαφοροποίησης ή να επάγει γήρανση ή απόπτωση σε ταχέως πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα του όγκου

Παράθεση:. Lindström MS, Nister Μ (2010) κατασιγάσει της Ριβοσωματιακής πρωτεΐνης S9 αποσπά ένα πλήθος κυτταρικών αντιδράσεων αναστέλλοντας την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων Μετά την p53 ενεργοποίησης. PLoS ONE 5 (3): e9578. doi: 10.1371 /journal.pone.0009578

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 28η Ιανουαρίου του 2010? Αποδεκτές: 11 του Φεβρουαρίου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 8 Μαρτίου 2010

Copyright: © 2010 Lindström, Nister. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη κατέστη δυνατή με την οικονομική στήριξη προς ML από την ίδρυση Åke Wiberg της, τα κεφάλαια του Ινστιτούτου Καρολίνσκα και το θεμέλιο του Magnus Bergvall του. ML είναι αποδέκτης βραβείο υποτροφία από το Σουηδικό Αντικαρκινική Εταιρεία (Cancerfonden). Εργασία πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριο του ΜΝ, υποστηριζόμενη από τη Σουηδική Αντικαρκινική Εταιρεία, Εταιρεία Καρκίνου στη Στοκχόλμη, το Σουηδικό Συμβούλιο Έρευνας, το Σουηδικό Ίδρυμα Παιδικού Καρκίνου και το Πανεπιστήμιο Karolinska Hospital FoUU. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ριβοσώματος βιογένεση είναι μια εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία στην οποία εκατοντάδες διαφορετικές πρωτεΐνες συνεργάζονται στη ριβοσωμιακή σύνθεση του RNA (rRNA), τη μεταποίηση, τη συναρμολόγηση ριβόσωμα υπομονάδα και των μεταφορών [1]. Πυρηνίσκους είναι οι πραγματικές θέσεις για ριβοσωμάτων βιογένεση αλλά αυτές οι δομές έχουν επίσης ενοχοποιηθεί σε άλλες κυτταρικές διαδικασίες όπως είναι ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου, την αντιγραφή του ιού, μιτογονικής σηματοδότησης, πυρηνική εξαγωγή της ρ53, και βλαστικών κυτταρική διαφοροποίηση, επανεξετάζονται στις αναφορές [1] – [4]. Κατά την τελευταία δεκαετία, η σύνδεση μεταξύ του ρ53 καταστολέα του όγκου πρωτεΐνης, πυρηνίσκο και ριβοσωμάτων βιογένεση έχει εδραιωθεί καλά. Έκφραση των κυρίαρχων αρνητικών μεταλλαγμάτων του πυρηνισκική πρωτεΐνης Bop1 οδήγησε σε ελαττώματα επεξεργασίας rRNA ενεργοποίηση που επάγεται ρ53 διακοπή του κυτταρικού κύκλου [5]. p53 καθίσταται συχνά ενεργοποιείται μετά την φίμωση του πυρηνισκικός ή ριβοσωμικές πρωτεΐνες (r-πρωτεΐνες), και τα παραδείγματα περιλαμβάνουν RPL23 [6], rpS6 [7], nucleostemin, [8] και TIF1A [9]. Επιπλέον, οι αναστολείς της σύνθεσης ή επεξεργασίας rRNA όπως ακτινομυκίνη D και 5-φθοριοουρακίλη ενεργοποιούν επίσης p53 [10]. Συλλογικά οι όροι αυτοί αναφέρονται ως πυρηνισκικός ή ριβοσωμικό στρες. Τοποθέτηση στοιχεία από έναν αριθμό μοντέλων ποντικών αποδεικνύει την ύπαρξη αυτής της p53-εξαρτώμενη οδοφράγματος

in vivo

. Ένα μοντέλο ποντικού αποκάλυψε ότι ριβοσωμάτων βιογένεση απομειώνεται μετά τη διαγραφή εξαρτάται από ένα αλληλόμορφο

rpS6

[11]. Είναι ενδιαφέρον ότι η εμβρυϊκή θνησιμότητα που συνέβησαν κατά τη διάρκεια της γαστριδίωσης σε αυτά

rpS6

+/-

εμβρύων προκλήθηκε από p53-εξαρτώμενη σημείο ελέγχου παρά μια γενική μείωση της μεταφραστικής ικανότητας [11]. ανεπάρκεια Rpl22 επιλεκτικά συνελήφθησαν ανάπτυξη του άλφα /βήτα-συγγενικής Τ κύτταρα, μία απόκριση που διαμεσολαβείται από την ενεργοποίηση της ρ53 [12]. Με τη σειρά του, απώλεια ρ53 αποκατέστησε την ανάπτυξη των ελλειμματικών Rpl22 θυμοκυττάρων.

Οι μεταλλάξεις έχουν βρεθεί σε διάφορα r-πρωτεϊνών σε ασθενείς που πάσχουν από σύνδρομο γνωστό ως Diamond-Blackfan αναιμία (DBA, MIM # 105650), που χαρακτηρίζεται από από ελαττωματικά ερυθροποίηση, συγγενείς ανωμαλίες και αυξημένο κίνδυνο καρκίνου [13], [14]. Το γονίδιο

RPS19

συχνά μεταλλάσσεται σε DBA [15], αλλά μεταλλάξεις έχουν βρεθεί επίσης στο

RPS24

,

RPS17

,

RPL35A

,

RPL5

,

RPL11

, και

RPS7

[16], [17]. Οι μοντέλα ζώων της DBA έχουν δημιουργηθεί σε ποντίκια και zebrafish [18], [19]. Διαπιστώθηκε ότι η απώλεια του

Rps19

είναι εμβρυϊκή θανατηφόρο [20].

Rps19

ανεπάρκεια εξασθενίζει ριβοσωμικού βιογένεση και ενεργοποιεί p53 στο zebrafish, και η καταστολή της p53 και deltaNp63 μπορεί να ανακουφίσει την Rps19 ανεπάρκεια φαινότυπο σε αυτό το μοντέλο [18]. Απώλεια άλλων r-πρωτεϊνών σε ψάρι zebra, όπως Rps8, Rps11, και Rps18 προκάλεσε επίσης μια απόκριση της ρ53 [18]. Ο ρόλος του p53 στον DBA παραμένει ασαφής, αλλά είναι αξιοσημείωτο ότι τα ποντίκια που φέρουν μεταλλάξεις στο

RpS19

και

Rps20

έχουν χαμηλά επίπεδα ερυθροκυττάρων που μπορεί να αποκατασταθεί με ανεπάρκεια p53 [21].

Πώς p53 ενεργοποιείται ακολουθεί πυρηνισκικός το στρες; Διάφορες ομάδες έχουν δείξει ότι το r-πρωτεΐνες (RPL11, RPL5, RPL23 και RPS7) απελευθερώνονται από τον πυρηνίσκο κατά τη διάρκεια του στρες και, στη συνέχεια, προσδένονται ΜϋΜ2 ενεργοποιώντας έτσι p53 [6], [22] – [29]. Στη συνέχεια διαπιστώθηκε ότι η αυξημένη μετάφραση του 5 ‘τερματικού ολιγοπυριμιδίνης (TOP) mRNAs, συμπεριλαμβανομένου του

RPL11

, εμφανίζεται ως απάντηση στην διαταράσσεται 40S ριβοσωμική βιογένεση υπομονάδα οδηγώντας έτσι σε αύξηση της παραγωγής RPL11 [30]. Πράγματι, μετά την απώλεια του rpS6 ή RPL24 το ογκοκατασταλτικό ρ53 ενεργοποιείται με τρόπο που εξαρτάται από την RPL11 [30], [31]. Ενώ μειωμένη έκφραση κάποιων r-πρωτεΐνες μπορούν να ενεργοποιήσουν ρ53 ως μέρος μιας κυτταρικής απόκρισης στρες, είναι επίσης προφανές ότι ορισμένοι άλλοι r-πρωτεΐνες έχουν άμεση και πιο συγκεκριμένοι ρόλοι σε

p53

μετάφραση mRNA. Απλοανεπάρκεια ενός υποσυνόλου r-πρωτεϊνών σε ψάρι zebra συνδέεται με την ανάπτυξη των κακοήθων όγκων περιφερικών νεύρων θηκάρι [32]. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτοί οι όγκοι νευρικού ελύτρου δεν παράγουν πρωτεΐνη ρ53, παρά την παρουσία του

p53

mRNA [33]. Επιπλέον, RPL26 παίζει ένα ρόλο στην ενίσχυση της

p53

mRNA μετάφραση κατά την απόκριση βλάβης DNA με άμεσες αλληλεπιδράσεις με τόσο MDM2 πρωτεΐνη και

p53

mRNA [34]. Ως εκ τούτου, r-πρωτεΐνες έχουν πιο δυναμική ρόλους στη ρύθμιση της ρ53 ογκοκατασταλτικό μονοπάτι από ό, τι πιστεύαμε, αναθεωρούνται στο [35] – [37].

Πρόσφατα, RPS9 αναγνωρίστηκε ως νέο Β23 (NPM /nucleophosmin ) αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη [38]. Μειωμένα επίπεδα RPS9 συσχετίστηκαν με συσσώρευση κυττάρων σε G

1 /(G

0) και επαγωγή ρ21 σε κύτταρα οστεοσαρκώματος U2OS [38]. Εδώ προσπαθούμε να διερευνήσει περαιτέρω τις διαφορετικές απαντήσεις κυτταρικό στρες που προκαλείται από την απώλεια της RPS9. Η εξάντληση των RPS9 προκάλεσε ταχεία απώλεια της πυρηνισκικός πισίνα πρωτεΐνης, εξασθενημένη παραγωγή ώριμων 18S ριβοσωμικού RNA και ενεργοποίηση του καταστολέα όγκου ρ53 μονοπάτι. Βρήκαμε ότι ο συνδυασμός ενός ελαττωματικού ενεργοποίησης ριβοσώματος βιογένεση οδού και p53 οδήγησε σε απροσδόκητα ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική αποκρίσεις σε ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές όγκου κατά το ότι υποβλήθηκαν σε γήρανση, η διαφοροποίηση, ή απόπτωση μετά την εξάντληση των RPS9.

Αποτελέσματα

ταχεία εξάντληση των Nucleolar RPS9 Μετά siRNA η επιμόλυνση

για να συγχωνεύονται r-πρωτεϊνών με GFP έχει αποδειχθεί ένα χρήσιμο εργαλείο για να απεικονίσει καλύτερα τον εντοπισμό και τον κύκλο εργασιών του r-πρωτεϊνών σε ανθρώπινα κύτταρα [39], [ ,,,0],40]. κύτταρα U2OS εκφράζουν RPS9-GFP είχαν καθιερωθεί στο παρελθόν [38]. Σε αυτά τα κύτταρα η πρωτεΐνη σύντηξης RPS9-GFP εντοπίστηκε στο πυρηνίσκο και στο κυτταρόπλασμα. Για την καλύτερη κατανόηση της δυναμικής των RPS9 σε σχέση με νοκ ντάουν φαινοτύπων, χρησιμοποιήσαμε RPS9-GFP U2OS κύτταρα σε συνδυασμό με παρεμβολή RNA να απεικονίσει νοκ ντάουν της RPS9 σε ζωντανά κύτταρα (Εικόνα 1Α). Επιμόλυνση των κυττάρων U2OS με RPS9 siRNA έδειξε μια γρήγορη εναλλαγή των πυρηνισκικός RPS9-GFP. Ήδη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, η πλειονότης των κυττάρων έδειξε μια εντυπωσιακή απώλεια πυρηνισκικός RPS9-GFP (Σχήμα 1Β). Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα περισσότερα κύτταρα είχαν ένα σήμα GFP ανιχνεύσιμο μόνο στο κυτταρόπλασμα. Χρησιμοποιώντας ανοσοκηλίδωση RPS9-GFP ανιχνεύθηκε σαν μία απλή λωρίδα του αναμενόμενου μεγέθους η οποία μειώθηκε κατά siRNA διαμόλυνση με δύο διαφορετικά siRNAs RPS9 # 1 και # 2, ενώ knockdown με ολίγο # 0 ήταν αναποτελεσματική σε σύγκριση με τον έλεγχο siRNA, siCtrl (Εικόνα 1C). Η πισίνα του κυτταροπλασματική πρωτεΐνη RPS9-GFP παρέμεινε για αρκετές ημέρες, σε συμφωνία με τη γνωστή σταθερότητα κυτταροπλασματικών ριβοσώματα θηλαστικών. Έχουμε ήταν σε θέση να καταστρέφουν εντελώς κύτταρα κυτταροπλασματικών αντιδραστικότητας GFP που θα μπορούσε να οφείλεται στο γεγονός ότι η φίμωση με siRNA δεν είναι 100%, ή ότι μια συνολική απώλεια RPS9 δεν είναι συμβατό με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατεταμένη. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η κυτταρική κατανομή της RPS9, τα κύτταρα U2OS βάφτηκαν με ένα αντίσωμα που εγείρεται κατά της ανθρώπινης RPS9, όπως περιγράφεται [38], και παρατηρήθηκε μια όμοια πυρηνισκικός και κυτταροπλασματική χρώση. Η πυρηνισκικό πισίνα του ενδογενούς RPS9 μπορούσε να γρήγορα και αποτελεσματικά σιγήσει σε κύτταρα U2OS παρόμοια με εκείνη του RPS9-GFP (Σχήμα S1A), και αυτό επιβεβαιώθηκε με ανοσοστύπωμα (Σχήμα S1B). Εν ολίγοις, έχουμε αποκτήσει πλήρη και ειδική εξάντληση των πυρηνισκικός RPS9 χρήση siRNA.

(Α) Αποτελεσματικότητα της RPS9-GFP νοκ ντάουν στον U2OS κύτταρα που εκφράζουν σταθερά RPS9-GFP όταν χρησιμοποιούν τρία διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν ανθρώπινη RPS9. Φωτογραφίες των κυττάρων που εκφράζουν RPS9-GFP ελήφθησαν μετά από 48 ώρες. (Β) Ποσοστό κυττάρων που εκφράζουν ανιχνεύσιμα U2OS RPS9-GFP στον πυρηνίσκο σε διάφορα χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση του RPS9-1 siRNA ή siCtrl. (C) ίσο αριθμό κυττάρων από το πείραμα στο (Α) συλλέχθηκε και ολόκληρα κυτταρικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 2% SDS. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα ειδικά για EGFP, PCNA, β-ακτίνη, και RPL11 όπως υποδεικνύεται στην εικόνα.

Η

Επαγωγή Περιορισμένης Γήρανση Response σε U2OS Κύτταρα

η διακοπή της πυρηνίσκος θεωρείται συχνά μετά από έκθεση των κυττάρων σε μία ποικιλία χημικών και φυσικών παραγόντων που αναστέλλουν την μεταγραφή ή rRNA επεξεργασία [10]. Μια στενή επιθεώρηση πυρηνίσκοι αποκάλυψε ότι παρέμεινε άθικτο στην ανταπόκριση στη θεραπεία με siRPS9, σε συμφωνία με μελέτες για rpS6 [11], [30]. Όμως, διαπιστώσαμε ότι πυρηνίσκοι σε RPS9 εξαντληθεί U2OS κύτταρα πιο αντίθεση, γύρο, και φάση-πυκνά από ό, τι στο siCtrl επεξεργασμένα κύτταρα δείχνουν μια αναδιάταξη του πυρηνισκικός δομής (Σχήμα S2A). Πυρηνικός πυκνά κέντρα fibrillar βρίσκονταν σε μερικά κύτταρα εκ νέου εντοπίζεται στην περιφέρεια του πυρηνίσκου όπως αποκαλύφθηκε με χρώση για fibrillarin, έναν δείκτη του πυκνού διαμερίσματος ινιδικό του πυρηνίσκο. Αυτά τα πυρήνια έμοιαζε με τα διευρυμένη πυρηνίσκους που παρατηρούνται σε κύτταρα U2OS εξαντλημένο από nucleostemin [8], ένα πυρηνίσκου πρωτεΐνη που εμπλέκεται στην βιογένεση ριβοσωμάτων [41].

εξόντωση RPS9 επαγόμενη συσσώρευση κυττάρων σε G

1 και αυξήθηκε η επίπεδα ρ21 σε κύτταρα U2OS [38]. Μια πιο προσεκτική εξέταση των κυττάρων αποκάλυψε ότι ένα κλάσμα εμφανίζεται ένα μάλλον «σοβαρή» φαινότυπο που μοιάζει με τη γήρανση με κατάφωρα επέκταση κυτταρόπλασμα μας οδηγεί να διερευνήσει περαιτέρω τη συγκεκριμένη απάντηση (Εικόνα 2Α). Η εξάντληση των RPS9 προκάλεσε αύξηση του αριθμού των γ-H2A.X θετικών κυττάρων και κυττάρων με πυρηνική εστίες πρωτεΐνες υποστρώματος φωσφο-ATM /ATR (Σχήμα 2Β και C). Η ανάλυση αποκάλυψε μια αύξηση που σχετίζεται γήρανση β-γαλακτοσιδάση-θετικό (SA-β-gal) U2OS κύτταρα από 0,4% θετικά κύτταρα σε κύτταρα siCtrl, σε 7% το siRPS9 επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2D).

(Α ) εικόνες αντίθεσης φάσης αποκαλύπτει μορφολογία των ανθρώπινων κυττάρων οστεοσαρκώματος U2OS επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει RPS9 ή ρ53. (Β-Ο) Αυξημένη έκφραση της βλάβης του DNA και των δεικτών στρες αντιγραφή σε κύτταρα U2OS εξαντλημένο από RPS9 και αναλύθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. κύτταρα U2OS μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι γ-Η2ΑΧ και ένα αντίσωμα υπόστρωμα φωσφο-ATM /ATR. (Δ) Ποσοτικοποίηση των ΑΕ-β-gal κύτταρα θετικά U2OS σε καλλιέργειες εξαντλημένο της RPS9. Παρίσταται ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από δύο. (Ε) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν με siCtrl, RPS9, RPL11, ρ53, ρ21 ή siRNA όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα επωάστηκαν με BrdU στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση για άλλες 24 ώρες και τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση με αντι-BrdU αντισώματα και ο μέσος όρος των BrdU-θετικών κυττάρων δείχνεται (%). (F) Συν-εξάντληση του RPL11, ρ53 ή ρ21 μερικώς εξασθενημένη RPS9 knockdown μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. κύτταρα U2OS επιμολύνονται με siCtrl, siRPS9, sip53, sip21 ή siRPL11 σε συνδυασμούς όπως υποδεικνύεται. Η τελική συγκέντρωση των siRNA ήταν 100 nM σε κάθε περίπτωση και αποζημίωσης έγινε με siCtrl. Τα κύτταρα μετρήθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και δείχνονται είναι μέση τιμή και SEM από τρία διαφορετικά πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν σε ανεξάρτητες περιπτώσεις και ομαλοποιήθηκε ως προς siCtrl ρυθμιστεί στο 100%. (G) Co-νοκ ντάουν της RPL11 εξασθενημένη επαγωγή της p21 και πρωτεΐνες MDM2 που προκαλείται από νοκ ντάουν της RPS9. κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με συνδυασμούς siRNA όπως υποδεικνύεται. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση και η έκφραση της ρ53, MDM2, ρ21, RPL11, RPL5 και RPS9 προσδιορίσθηκε όπως υποδεικνύεται. Το λύμα πρωτεΐνη από κάθε δείγμα χωρίστηκε για τρία διαφορετικά στυπώματα και κάθε ανιχνεύθηκαν με ακτίνη ως έλεγχο φόρτισης. (H) U2OS κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRPS9-1 ή siRPL11-2 για 48 ώρες ή επεξεργασία με 5 ηΜ ακτινομυκίνη D για 18 ώρες μετά τις οποίες τα κύτταρα συλλέχθηκαν απευθείας σε 2% SDS που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση χρησιμοποιώντας αντισώματα προς RPL11 ή RPS9 (w.c.e = εκχύλισμα ολικού κυττάρου). (Ι) Συν-ανοσοκαταβύθιση MDM2 και RPL11 στα κύτταρα U2OS επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει RPS9. MDM2 ανοσοκατακρημνίστηκε με αντίσωμα Ν20 που ακολουθείται από ανίχνευση με SMP14 μονοκλωνικά ή ενός μονοκλωνικού προς RPL11. Σημειώστε, ότι διαφορετικούς χρόνους έκθεσης χρησιμοποιήθηκαν για RPL11 IP και κηλίδες εισόδου. (J) κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με siRPS9-1 μόνο του ή σε συνδυασμό με siRPL5-2 για 72 ώρες, μετά τις οποίες συλλέχθηκαν τα κύτταρα και το επίπεδο της ρ21 ως διάβασμα προς τα έξω για δραστικότητα ρ53 αναλύθηκε με ανοσοκηλίδωση.

Για να αποδειχθεί επισήμως ο ρόλος της ρ53 στην μεσολάβηση αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού U2OS έχουμε συν-εξαντλημένο ρ53 και RPS9 αποτέλεσμα μια αναστροφή του φαινοτύπου γήρανση (Σχήμα 2Α και D). Επιπλέον, RPL11, ρ53 ή ρ21 συν-εξάντληση στο siRPS9-επεξεργασμένα κύτταρα αυξημένη ενσωμάτωση BrdU σε αυτές τις καλλιέργειες σε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 2Ε), σε συνδυασμό με μια διάσωση του γηρασμού που μοιάζει μορφολογία (Σχήμα S3). Θέλαμε να γνωρίζουμε πώς αυτή η «ξεφύγει» από το G

1 σύλληψης που σχετίζονται με την κυτταρική ανάπτυξη, μακροπρόθεσμα, έτσι ώστε να διερευνηθεί επίσης τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε μεταγενέστερο χρονικό σημείο. Βρήκαμε ότι siRPS9 επεξεργασμένες καλλιέργειες είχε αυξηθεί κατά 36% (± 9,2), ενώ siRPS9 + sip53 κύτταρα επεξεργασμένα είχαν αυξηθεί 52% (± 6,5) σε σύγκριση με siCtrl όπως αξιολογείται 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (Σχήμα 2F). Αποσιώπηση του RPL11 αποκατασταθεί αριθμού των κυττάρων στο επίπεδο που παρατηρείται στα κύτταρα συν-επιμολυσμένα με siRPS9 και sip53, αλλά δεν μπορούσε να αποκαταστήσει τον αριθμό των κυττάρων με αυτό που παρατηρείται σε siCtrl καλλιέργειες, ως εκ τούτου, siRPS9 + siRPL11 κατεργασμένων κυττάρων είχε αυξηθεί 56% (± 4,4) σε σύγκριση να siCtrl (Σχήμα 2F). Αυτό έδειξε ότι αποσιώπηση RPS9 ή RPL11 προκάλεσε επίσης καταστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ένα ρ53-ανεξάρτητο τρόπο. Αυτό επιβεβαιώθηκε από εξάντληση RPS9 σε συμφωνημένα WI38 και WI38-E6 ινοβλάστες, καθώς και σε κύτταρα οστεοσαρκώματος SAOS2 έλλειψη ρ53 (Σχήμα S1D).

Κανονισμός της απόκρισης ρ53 σκανδαλισμό από την απώλεια RPS9 σε U2OS κύτταρα

Η μειωμένη έκφραση του RPS9 σε κύτταρα U2OS δεν άλλαξε σημαντικά τα επίπεδα του ρ53 όπως φαίνεται πριν από τις [38], αλλά προκάλεσε μια αύξηση στην πρωτεΐνη ρ21 που εξαρτιόταν από ρ53 (Σχήμα 2G). Η επαγωγή του ρ21 ήταν σημαντικά μειωμένη με συν-επιμόλυνση κυττάρων με RPL11 siRNA (Σχήμα 2G). Εξόντωση RPL11 χρησιμοποιώντας siRPL11-1 οδήγησε σε χαμηλότερα επίπεδα ρ53, MDM2, και ιδίως το ρ21, επίσης υπό κανονικές συνθήκες σε κύτταρα U2OS (Σχήμα 2G, λωρίδα 6). Είναι ενδιαφέρον ότι, η εξάντληση των RPS9 οδήγησε σε χαμηλότερα επίπεδα ΝΡ40-διαλυτό RPL11 (Σχήμα 2G, λωρίδα 2), αλλά το κλάσμα του RPL11 δεσμεύεται να MDM2 παρέμεινε η ίδια και δεν μειώθηκε (Σχήμα 2Θ). Θέλαμε να γνωρίζουμε αν η μείωση RPL11 επίσης, θα μπορούσε να δει σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων και ως εκ τούτου U2OS κύτταρα επιμολυσμένα με siRPS9 ή επωάζονται σε 5 nM ακτινομυκίνη D για 18 ώρες. Αυτή η συγκέντρωση της ακτινομυκίνης D αποκλείει εκλεκτικά τους δραστηριότητα RNA Pol Ι και αποτρέπει ριβοσωμάτων βιογένεση. Θα μπορούσαμε να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα που λαμβάνονται κατά τη χρήση της πιο ήπιες ρυθμιστικό λύσης επίσης σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων δείχνοντας έτσι μειωμένα συνολικά επίπεδα RPL11 (Σχήμα 2Η). Οι περισσότερες από τις μελέτες στον τομέα έχουν επίκληση φίμωση RPL11 χρησιμοποιώντας ένα συγκεκριμένο siRNA έτσι βρήκαμε σημασία να συγκρίνουν RPL11 με RPL5. Βρήκαμε ότι η εξάντληση των RPL5 θα μπορούσε να μπλοκάρει την επαγωγή ρ21 ταυτόσημη με RPL11 στο RPS9 εξαντλημένα κύτταρα (Σχήμα 2J). Φίμωση της RPL11 με μορφολινο προκαλεί ρ53-εξαρτώμενη απόκριση απόπτωσης στο zebrafish [42], και γι ‘αυτό δεν θέλουμε να αποκλείσουμε ότι RPL11 και RPL5 απώλεια μπορεί σε κάποιο βαθμό επάγουν τη δράση του p53 ή να συμμετέχουν οδούς που σχετίζονται p53

in vivo

. Κάναμε επίσης μια άλλη παρατήρηση από το πείραμα στο σχήμα 2G. Πρώτον, η knockdown του RPL11 προκάλεσε πτώση του επιπέδου της πρωτεΐνης RPL5 στον ίδιο βαθμό όπως και για RPL11 (Σχήμα 2G, λωρίδα 6). Αυτό είναι προφανώς επειδή 28S rRNA δεν είναι αποτελεσματικά σε επεξεργασία σε RPL11 ή RPL5 ελλειμματικά κύτταρα [43] που οδηγεί σε πλεόνασμα μεγάλης υπομονάδας r-πρωτεΐνες που αποικοδομούνται ταχέως [44]. Έχει πρόσφατα δειχθεί από άλλες ομάδες ατόμων που εξάντληση ενός ατόμου r-πρωτεΐνης από ένα ριβόσωμα υπομονάδα αποτελέσματα σε ρύθμιση προς τα κάτω άλλων πρωτεϊνών από την ίδια υπομονάδα [45]. Το εύρημα αυτό θα μπορούσε να έχει ορισμένες επιπτώσεις ως προς το γιατί η ρύθμιση των MDM2 από διάφορους ριβοσωμικές πρωτεΐνες φαίνεται να συμβαίνουν σε μη πλεονάζοντα τρόπο, αλλά αυτό δεν μπορεί να είναι η μόνη εξήγηση, γιατί τότε θα διαπιστώσετε ότι η εξουδετέρωση της σχεδόν κάθε r-πρωτεΐνης μπορεί να μπλοκάρει p53 σταθεροποίηση που δεν βλέπουμε. Συνοψίζοντας, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι RPL11 απαιτείται για την αποτελεσματική επαγωγή της p53-εξαρτώμενη απαντήσεις σε RPS9 εξαντλημένο U2OS κύτταρα.

Είναι RPL11 Απαραίτητο για μετάφραση mRNA p53 Μετά Nucleolar άγχος;

Πώς RPL11 p53 έλεγχο; Η δέσμευση του RPL11 και RPL5 άμεσα με MDM2 πρωτεΐνη οδηγεί σε σταθεροποίηση της ρ53 μέσω αναστολής της MDM2 Ε3 ουμπικουϊτίνης δραστηριότητα λιγάσης [46]. Ωστόσο, άλλες αναφορές δείχνουν επίσης κρίσιμο ρόλο για την Ε-πρωτεϊνών σε

p53

mRNA μετάφρασης [33], [47]. Επιπλέον, η σημασία της αλληλεπίδρασης μεταξύ MDM2 και RPL11 /RPL5 από την άποψη των πιθανών επιπτώσεων στην

p53

μετάφραση του mRNA παρέμεινε κάπως ασαφής. Αυτό θα μπορούσε να είναι σχετικά με τη διερεύνηση από το MDM2 μπορεί να ενισχύσει

p53

μετάφραση mRNA όπως έχει περιγραφεί να συμβεί σε ορισμένες ρυθμίσεις [48], [49]. Πράγματι, προτάθηκε ότι οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ RPL11 /RPL5 και ΜϋΜ2 μπορεί να εξυπηρετεί ένα διττό σκοπό να αναστέλλουν τη δράση λιγάσης MDM2 Ε3, και να προωθήσει

p53

mRNA μετάφραση ταυτόχρονα [48], [49]. Από την άλλη πλευρά, MDM2 συνδέεται με RPL26 και αναστέλλει διαμεσολαβούμενη RPL26 διέγερση της μετάφρασης του mRNA p53 [15]. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να ξαναπάτε p53 ημίσειας ζωής και της υποβάθμισης και να διερευνήσει

p53

μετάφραση mRNA μετά πυρηνισκικός στρες στα κύτταρα U2OS με και χωρίς RPL11. Αρχικά πραγματοποιείται μία δοκιμασία ημίσειας ζωής της πρωτεΐνης ρ53 για να επιβεβαιωθεί η αυξημένη σταθερότητα της ρ53 μετά από μια χαμηλή δόση ακτινομυκίνη D έκθεση για την επαγωγή πυρηνισκικού στρες. Πράγματι, μια ισχυρή αύξηση στην ποσότητα και τη σταθερότητα της πρωτεΐνης p53 παρατηρήθηκε, και ουσιαστικά πολύ μικρή, αν υπάρχει, αποικοδόμηση της ρ53 εμφανίστηκαν σε ακτινομυκίνη D επεξεργασμένα κύτταρα κατά την διάρκεια τον επί τέσσερις ώρες εκδίωξης (Σχήμα 3Α). Αντίθετα, το μεγαλύτερο μέρος της πρωτεΐνης ρ53 σε DMSO επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου αποικοδομήθηκε μετά από λιγότερο από μία ώρα μέσα κυκλοεξιμίδιο (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια επιμολυσμένα U2OS κυττάρων με έλεγχο ή siRPL11 για 24 ώρες και την επόμενη επεξεργασία όλων των επιμολύνσεων με 5 ηΜ ακτινομυκίνη D όλη τη νύκτα ακολουθούμενο από ένα Chase CHX. Φόρτωση ρυθμίστηκε για να δώσει μία συγκρίσιμη ποσότητα εκκίνησης της ρ53 να διευκολυνθεί η άμεση σύγκριση. p53 ήταν σαφώς πιο ασταθής σε RPL11 εξαντλημένα κύτταρα U2OS (Σχήμα 3Β). Υπολειμματική σταθερή p53 σε δείγματα siRPL11 σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία προέρχεται πιθανότατα από ένα πληθυσμό κυττάρων που ανταποκρίθηκαν στην ακτινομυκίνη D, αλλά που δεν έχουν επιμολυνθεί με siRPL11. Είμαστε δίπλα αιτιολογημένη ότι τα μικρά μόρια που διασπούν την δέσμευση p53-MDM2, μπλοκάρουν τη μεταγραφή MDM2 ή την πρόληψη της υποβάθμισης της ρ53 από το πρωτεάσωμα προκαλώντας έτσι τη συσσώρευση p53 από το «default» θα δρουν ανεξάρτητα από οποιαδήποτε ριβοσωμικής αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-MDM2. Ως εκ τούτου, τα επεξεργασμένα κύτταρα U2OS με νουτλίνη-3. Η ένωση νουτλίνη-3 διαταράσσει την αλληλεπίδραση p53-MDM2, αλλά δεν εμποδίζει την πρόσδεση του MDM2 σε mRNA p53 [48], [49]. Εμείς επιμολυσμένα κύτταρα με δύο διαφορετικούς oligos RPL5 siRNA επί μία νύκτα ακολουθούμενη από επεξεργασία των κυττάρων με 5 ηΜ ακτινομυκίνη D ή 10 μΜ νουτλίνη-3 για επιπλέον 18 ώρες (Εικόνα 3C). Κάθε μία από τις δύο RPL5 siRNAs μπορούσε αποτελεσματικά να αναστέλλουν την συσσώρευση ρ53 ακόλουθες 5 ηΜ ακτινομυκίνη D, και ιδίως η επαγωγή της ρ21 μειώθηκε (Σχήμα 3C, λωρίδα 3 και 4). Σε αντίθεση, η επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης ρ53 και ρ21 όταν εξαντληθεί RPL5 παρουσία νουτλίνη-3 ήταν περιθωριακή όταν εξομαλύνεται σε ακτίνη. Επομένως RPL5 δεν απαιτείτο για τη σταθεροποίηση της ρ53, όπως επίσης και την επαγωγή της MDM2 και ρ21 πρωτεΐνες, σε κύτταρα κατεργασμένα νουτλίνη-3. Είμαστε δίπλα ήθελε να δει αν οι άλλοι r-πρωτεΐνες μικρή υπομονάδα συμπεριλαμβανομένων RPS9 που απαιτούνται για τη σταθεροποίηση p53 μετά ακτινομυκίνη θεραπεία Δ. Έχουμε εξαντληθεί κύτταρα rpS6, RPS9, RPS17 και RPS24 αλλά σίγηση των πρωτεϊνών αυτών δεν εμποδίζουν τη σταθεροποίηση των πρωτεϊνών ρ53 προκαλείται από ακτινομυκίνη D (Σχήμα 3D). Αυτό δείχνει ότι RPL11 αλλά δεν RPS9 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανταπόκριση ρ53 εξής ακτινομυκίνη D θεραπεία.

(Α) U2OS κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 ηΜ ακτινομυκίνη D για 18 ώρες ή DMSO ακολουθούμενη μόνο από καταδίωξη κυκλοεξιμίδιο ( CHX) για να εκτιμηθεί ρυθμούς αποικοδόμησης πρωτεΐνης ρ53. Κυτταρολύματα από κάθε χρονικό σημείο υποβλήθηκαν σε ανοσοστύπωση και η έκφραση της ρ53 καθορίζεται σε σχέση με ακτίνη επίπεδα. (Β) κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με siCtrl ή siRPL11 την διάρκεια της νύχτας ακολουθούμενη από κατεργασία με ακτινομυκίνη D για επιπλέον 18 ώρες. Αυτό ακολουθήθηκε από CHX Chase όπως παραπάνω για προκαθορισμένο χρόνο. Στην περίπτωση αυτή, η φόρτωση ρυθμίστηκε για να δώσει συγκρίσιμες ποσότητες εκκίνησης της ανάλυσης διευκολυντικό ρ53 αποδόμησης που είναι πιο γρήγορη στην RPL11 επιμολυσμένα κύτταρα. (C) κύτταρα U2OS είχαν επιμολυνθεί με τα siRNA RPL5 στόχευσης ή με siCtrl. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με νουτλίνη-3 (10 μΜ) ή ακτινομυκίνη D (5 ηΜ) για 18 ώρες. Η κηλίδωση μεμβράνη ανιχνεύθηκε για RPL5, MDM2, ρ53 και ρ21. (Δ) Μείωση των ριβοσωμικών πρωτεϊνών rpS6, RPS9, RPS17 και RPS24 δεν εμποδίζει τη συσσώρευση ρ53 και ρ21 επαγωγή παρακάτω ακτινομυσίνη θεραπείας D, αλλά εξάντληση των RPL11 έκανε. κύτταρα U2OS επιμολύνθηκαν με υποδεικνυόμενη siRNA για 18 ώρες ακολουθούμενη από κατεργασία με ακτινομυκίνη D (5 nm) για άλλες 18 ώρες και τα επίπεδα έκφρασης της ρ53 και ρ21 μετρήθηκαν με ανοσοκηλίδωση. (Ε) σύνθεση ρ53 σε ακτινομυκίνη D κατεργασμένα κύτταρα με ή χωρίς siRPL11. Σύνολο ρ53 και RPL11 δείχνεται με ανοσοκηλίδωση και νεοσυντιθέμενες p53 ανοσοκαταβυθίστηκε με DO1 αντίσωμα και οπτικοποιήθηκαν με αυτοραδιογραφία. Το πείραμα διεξήχθη 36 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA. (F) Αξιολόγηση της μετάφρασης του mRNA p53 σε κύτταρα U2OS εξαντλημένο από RPL11, RPS9, RPS9 + RPL11, ή σε κύτταρα επεξεργασμένα με ακτινομυκίνη D (5 ηΜ) παρουσία ή απουσία RPL11 siRNA. Ορατή είναι η ποσότητα νεοσυντιθέμενη ρ53 διάστημα 15 λεπτών σε σχέση με το συνολικό ποσό της ρ53, και σε σύγκριση με το συνολικό επίπεδο πρωτεΐνης όπως ανιχνεύεται με Ponceau S. Το πείραμα διεξήχθη 36 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA.

Η

Τέλος, θελήσαμε να διερευνήσουμε τη σύνθεση νέων πρωτεϊνών ρ53 υπό συνθήκες έκθεσης ακτινομυκίνη D ή μετά την φίμωση του RPS9, παρουσία ή απουσία siRPL11. Εμείς σημασμένα κύτταρα U2OS για 15 λεπτά και χρησιμοποιήθηκε p53 ανοσοκαθίζηση για την παρακολούθηση σύνολο και νεοσυντιθέμενες p53 αλλά βρήκε καμία ένδειξη ότι RPL11 απαιτείται για τη σύνθεση της πρωτεΐνης ρ53 σε αυτό το πειραματικό ρύθμιση (Σχήμα 3Ε και F). Μια οριακή αύξηση σε νέα πρωτεΐνη ρ53 θα μπορούσε να θεωρηθεί σε ακτινομυκίνη D επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 3Ε), αλλά η ερμηνεία αυτού είναι δύσκολη, επειδή ακτινομυκίνη D μπορεί επίσης να σταθεροποιήσει την πισίνα του πρόσφατα συντεθεί ρ53, και τα συνολικά επίπεδα της μετάφρασης ήταν ελαφρώς υψηλότερη σε Αυτό το δείγμα. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται όλα μαζί υποστηρίζουν την ιδέα ότι RPL11 ελέγχει κυρίως p53 σε ένα μετα-μεταφραστικό επίπεδο και ότι RPL11 δεν είναι απολύτως απαραίτητο για τη σύνθεση του p53 στη συγκεκριμένη πειραματική ρύθμιση, αλλά μια επιπλέον μικρή επίδραση στην παραγωγή ρ53 δεν αποκλείεται.

RPS9 κατασιγάσει εξασθενίζει Παραγωγή 18S rRNA και επάγει ρ53 σε κύτταρα γλοιώματος

μέχρι στιγμής, οι περισσότερες μελέτες για ριβοσωμικής σηματοδότηση πρωτεΐνη-p53 έχουν διεξαχθεί σε κύτταρα U2OS και παραμένει ασαφές αν, ή σε ό, τι έκταση, αυτό το ρυθμιστικό μηχανισμός λειτουργεί σε άλλους τύπους κυττάρων. Βρήκαμε ότι η ενδογενής RPS9 μπορούσε να σιγήσει αποτελεσματικά σε U343MG και σε κύτταρα γλοιώματος U87MG ενώ καμία αλλαγή στην έκφραση RPS9 παρατηρήθηκε σε U1242MG κύτταρα κατά siRPS9 διαμόλυνση (Σχήμα 4Α). Αξίζει να σημειωθεί, είναι το ήδη χαμηλό επίπεδο RPS9 στα μη επεξεργασμένα κύτταρα U1242MG. Μια σαφής μείωση του αριθμού των κυττάρων σε καλλιέργειες που κατεργάζονται με siRPS9 σχέση με siCtrl επεξεργασμένες καλλιέργειες παρατηρήθηκε για U87MG, U343MG, και U343MGa Cl2: 6 κύτταρα αλλά όχι για U1242MG (Σχήμα 4Β). Ως περαιτέρω έλεγχο εξειδίκευσης, διαπιστώσαμε ότι το ολιγονουκλεοτίδιο RPS9 siRNA δεν είχε καμία επίδραση επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ποντικού ΝΙΗ3Τ3 ενώ ένας rps9 ποντίκι siRNA ολιγο ανέστειλε αποτελεσματικά τον πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων (Σχήμα S1c). Για να αξιολογηθεί η επίδραση της RPS9 knockdown επί της σύνθεσης ώριμου 28S και 18S rRNA εμείς επισημασμένο knockdown και ελέγχουν U343MGa Cl2: 6 κυττάρων με [

3Η] ουριδίνη για 2 ώρες και εξετάζεται το σημασμένο και απομονωμένες rRNA μετά την ηλεκτροφόρηση γέλης και κηλίδωση σε μεμβράνη νάιλον. Βρήκαμε ότι σε καλλιέργειες knockdown RPS9 πολύ λίγο ώριμη 18S rRNA παράχθηκε κατά τη διάρκεια της περιόδου σήμανσης (Σχήμα 4C), εν τούτοις η ολική σύνθεση κυτταρικού RNA συνέχισε (Εικόνα 4D). Ακτινομυκίνη D (5 ηΜ) μπλοκάρει αποτελεσματικά την σύνθεση και την επισήμανση των rRNA (Σχήμα 4C και D). Σε ένα πείραμα με τη χρήση [

3Η] -L-μεθυλο μεθειονίνη για μία ετικέτα νεοσυντιθέμενες rRNA ανακαλύψαμε ότι η παραγωγή του 18S rRNA ήταν σαφώς μειωμένη (Σχήμα 4Ε). Υπήρξε μια οριακή μείωση στη νέα σύνθεση του 28S rRNA. Επιπλέον, η εξάντληση των RPS9 σε U343MGa Cl2: 6 κύτταρα μείωσε την ολική ενσωμάτωση της [

35S] -μεθειονίνη σε εν τη γενέσει πρωτεΐνη κατά 30-50% (Σχήμα 4F). Ο μηχανισμός της διατήρησης σύνθεσης rRNA σε υψηλά επίπεδα, παρά την ενεργοποίηση της ρ53 παραμένει να προσδιοριστεί. Όπως προτείνεται από τους άλλους, αυτό μπορεί να είναι μια γενική αντισταθμιστικό μηχανισμό σε απάντηση σε μια ανεπάρκεια σε ριβοσώματα [50].

(Α) RPS9 νοκ ντάουν απόδοσης σε κυτταρικές σειρές γλοιώματος U87MG, U343MG και U1242MG όπως προσδιορίζεται με ανοσοαποτύπωση για RPS9 σε σχέση με την ακτίνη. (Β), κυτταρικές σειρές από το πείραμα πραγματοποιήθηκε στο (Α), και U343MGa Cl2: 6 κύτταρα, μορφομετατράπηκαν με siCtrl ή siRPS9-1 και μετά από 72 ώρες ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων σε σχέση με siCtrl επεξεργασμένα κύτταρα ρυθμιστεί στο 100% προσδιορίσθηκε για κάθε κυτταρική γραμμή. Για την ανίχνευση αυτή, ίσοι αριθμοί κυττάρων απλώθηκαν εις τριπλούν την ημέρα 0, και οι καλλιέργειες επιμολυσμένα την ημέρα 1, και στη συνέχεια επεξεργασία με θρυψίνη και μετρήθηκαν 72 ώρες αργότερα. (C) Ολικό RNA από το πείραμα στο (C) διαχωρίστηκε σε μια γέλη 1% αγαρόζης-φορμαλδεϋδης, μεταφέρθηκε πάνω σε νάιλον μεμβράνες και υποβλήθηκε σε αυτοραδιογραφία. Πρόσφατα συντέθηκε 18S rRNA υποδεικνύεται, ενώ το συνολικό επίπεδο του 18S rRNA μεταφέρονται στην μεμβράνη οπτικοποιήθηκε με κυανή χρώση μεθυλενίου. Η ακτινομυκίνη D σε μια τελική συγκέντρωση 5 ηΜ προστέθηκε 3 ώρες πριν από την επισήμανση και χρησίμευσε ως έλεγχος για την αναστολή της rRNA μεταγραφής. (D) U343MGa Cl2: 6 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNAs όπως υποδεικνύεται και μετά από 72 ώρες τα κύτταρα επισημάνθηκαν με [

3Η] ουριδίνη για άλλες 2 ώρες. Η ενσωμάτωση ραδιενέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση υγρού σπινθηρισμού και εκφράζεται ως cpm /μg ολικού RNA και έπειτα ομαλοποιήθηκε ως προς το επίπεδο στο siCtrl επιμολυσμένα κύτταρα ρυθμιστεί στο 100%. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσοι όροι και SEM αντιπροσωπεύουν τρία διαφορετικά πειράματα. (Ε) U343MGa Cl2: 6 κύτταρα επιμολυσμένα με siRPS9-1 ή siCtrl για 72 ώρες επωάστηκαν με [μεθυλ-

3Η] -L-μεθειονίνη επί 2 ώρες για να ονομάσει τα νεοσυντιθέμενες πρόδρομοι rRNA που ακολουθείται από απομόνωση του συνολικού RNA. Ίσες ποσότητες ολικού RNA δίπλα διαχωρίστηκαν επί πηκτής 1% αγαρόζης-φορμαλδεΰδης, μεταφέρθηκαν πάνω σε νάιλον μεμβράνες και υποβλήθηκε σε αυτοραδιογραφία. Πρόσφατα συντέθηκε 18S rRNA υποδεικνύεται (αριστερό πάνελ) και η συνολική 28S και 18S rRNA μεταφέρονται στην μεμβράνη οπτικοποιήθηκε με μπλε του μεθυλενίου χρώσης (δεξί πάνελ). Ένας αστερίσκος υποδηλώνει εμφανής συσσώρευση ενός ενδιάμεσου προδρόμου rRNA. (F) U343MGa Cl2: 6 κύτταρα επιμολυσμένα με τα siRNA για 72 ώρες όπως υποδεικνύεται σημάνθηκαν με [

35S] -μεθειονίνη. Τα κύτταρα στερήθηκαν μεθειονίνης και κυστεΐνης για 30 λεπτά πριν από την προσθήκη του [

35S] -μεθειονίνη. Μετά από την επισήμανση για 2 ώρες τα πρωτεϊνικά εκχυλίσματα ήταν έτοιμοι. Η ενσωμάτωση ραδιενέργειας μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μέτρηση υγρού σπινθηρισμού και εκφράζεται ως cpm /μg ολικής πρωτεΐνης και στη συνέχεια κανονικοποιούνται με κύτταρα ελέγχου ορίζεται ως 100%. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσοι όροι και SEM αντιπροσωπεύουν τρία διαφορετικά πειράματα.