Αφηρημένο

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν σημαντικές ρυθμιστικές λειτουργίες σε κυτταρικές διεργασίες και έχουν δείξει το δυναμικό που υπόσχεται ως προγνωστικοί δείκτες για την έκβαση της νόσου σε ασθενείς με καρκίνο. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να βρεθεί προφίλ έκφρασης των miRNAs σε όλο το αίμα που ήταν προγνωστικό για τη συνολική επιβίωση (OS) σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC) που έλαβαν θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη.

Μέθοδοι

από 138 ασθενείς με mCRC σε 3

γραμμή θεραπείας ος με cetuximab και ιρινοτεκάνη σε μια προοπτική μελέτη φάσης ΙΙ, 738 miRNAs προεπεξεργασίας απομονώθηκαν και προφίλ από πλήρες αίμα χρησιμοποιώντας το Array v2.0 TaqMan microRNA. κατάσταση μετάλλαξης του

KRAS, BRAF, και PI3KCA

ήταν γνωστό

Αποτελέσματα

Μετά τη ρύθμιση Bonferroni, 6 miRNAs:. (miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886-3p και miR-324-3p), βρέθηκαν σχετίζονται με κοντό OS. miR-345 ήταν ο ισχυρότερος προγνωστικός miRNA, σημαντική για την πλήρη ομάδα και στη μη

KRAS

μεταλλαγμένο πληθυσμό. miR-345, ως συνεχή μεταβλητή στην πλήρη ομάδα, οδήγησε σε αναλογία κινδύνου (HR) των 2,38 ανά IQR (CI 95%: 01.08 – 03.01,

P

-τιμή = 2.86e-07, Bonferroni αναπροσαρμοσμένη, μονοπαραγοντική ανάλυση) και HR = 1,75 ανά IQR (95% CI: 1,24 – 2,48,

P

-Wald = 1.45e-03) στην πολυπαραγοντική ανάλυση προσαρμοσμένη για το φύλο, την ηλικία, το KRAS, PI3KCA και κατάσταση απόδοσης. miR-345 ήταν προγνωστικό στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS) με HR = 1,63 ανά IQR (95% CI: 1,25 – 2,114,

P

-Wald = 2.92e-4) στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Επιπλέον, η υψηλή έκφραση του miR-345 συνδέθηκε με την έλλειψη ανταπόκρισης στη θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη.

Συμπέρασμα

Εντοπίσαμε miR-345 στο ολικό αίμα ως πιθανή βιοδείκτη για την κλινική έκβαση. MiR-345 ήταν ένα μόνο προγνωστικό βιοδείκτη τόσο για OS και PFS σε όλους τους ασθενείς, αλλά και στη μη

KRAS

μεταλλαγμένο πληθυσμό

Παράθεση:. Schou JV, Rossi S, Jensen BV, Nielsen DL, Pfeiffer P, Høgdall E, et al. (2014) miR-345 στο μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου: μια μη επεμβατική βιοδεικτών για την κλινική έκβαση σε μη KRAS Mutant ασθενείς που έλαβαν 3

ου Γραμμή cetuximab και ιρινοτεκάνη. PLoS ONE 9 (6): e99886. doi: 10.1371 /journal.pone.0099886

Επιμέλεια: Pierre Busson, Gustave Roussy, Γαλλία

Ελήφθη: 3 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 18 του Ιούνη 2014

Copyright: © 2014 Schou et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Συμβούλιο Έρευνας στις Χέρλεβ Νοσοκομείο, το Υπουργείο Εσωτερικών και Υγείας, η Merck Serono-Δανία /Σουηδία δανική, και το έβδομο πρόγραμμα-πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης [ΠΠ7 /2007-2013] στο πλαίσιο της συμφωνίας επιχορήγησης δεν 222.916 (δίνεται σε ΜΚ). ST είναι ανώτερος κλινική ερευνητής του Ταμείου Επιστημονικής Έρευνας της Φλάνδρας και υποστηρίζεται από το βελγικό Εθνικό Σχέδιο Καρκίνου. ST και SR υποστηρίζεται επίσης από το Ίδρυμα Fournier-Majoie, FFMI, Βέλγιο. MD υποστηρίζεται εν μέρει από το Ελβετικό Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (SNF? https://www.snf.ch/E/? Grant Νο 320030_135421)? Krebsforschung Schweiz (KFS? https://www.krebsforschung.ch/? Grant Νο 02697-08-2010)? και από το Fondation Medic. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. MK απασχολούνται στο AROS Εφαρμοσμένη Βιοτεχνολογία. Η εταιρεία δεν έχει οποιοδήποτε οικονομικό συμφέρον και των διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας που εμπλέκονται σε αυτή την δημοσίευση. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η 3

ου πιο κοινή μορφή καρκίνου σε όλο τον κόσμο. Είκοσι τοις εκατό των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με CRC έχουν μεταστατική νόσο και ένα επιπρόσθετο 30-35% θα αναπτύξει μεταστάσεις αργότερα κατά την πορεία της νόσου τους [1], [2].

Cetuximab, ένα IgG1 μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον ο υποδοχέα επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), έχει δείξει αποτελεσματικότητα σε συνδυασμό με χημειοθεραπεία σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC), αν και όχι σε ασθενείς με

KRAS

μεταλλάξεις, [3], [4], που θεωρούνται σε περίπου 40% των ασθενών με CRC. Ωστόσο, μόνο ένα υποσύνολο των ασθενών με

KRAS

άγριου τύπου (wt) θα επωφεληθούν από το cetuximab. Έτσι, υπάρχει μεγάλη ανάγκη να προσδιοριστούν νέα βιοδείκτες της ανταπόκρισης στη θεραπεία με cetuximab στην υποομάδα των ασθενών με mCRC και

KRAS

.

Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών, υπήρξε μια ραγδαία αναπτυσσόμενη ενδιαφέρον microRNAs (miRNAs) ως πιθανούς νέους βιοδείκτες σε ασθενείς με καρκίνο. MiRNAs είναι μικρά ενδογενή μη-κωδικοποίησης RNA με 19-22 νουκλεοτίδια που ρυθμίζουν την γονιδιακή έκφραση στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Μέχρι σήμερα, περισσότεροι από 2.000 ανθρώπινες αλληλουχίες miRNA έχουν ταυτοποιηθεί, και ο αριθμός αυξάνεται [5]. MiRNAs έχουν σημαντικές ρυθμιστικές λειτουργίες σε βασικές κυτταρικές διεργασίες και να ενεργεί ως ογκογονίδια και τα γονίδια καταστολής όγκων [6]. Τα miRNAs που εμπλέκονται στον καρκίνο προδιάθεση, την ανάπτυξη και την πρόοδο μέσω του γονιδίου απορρύθμισης ή /και μονά-νουκλεοτιδίων πολυμορφισμό. MiRNAs σε ένα σκηνικό καρκίνο μπορούν να ταξινομηθούν με βάση τις κύριες λειτουργίες τους:. Oncomir, metastamir, apoptomir, hypoxamir και angiomir

Κυκλοφορούν miRNAs μπορούν εύκολα να συλλέγονται και να

φαίνεται πολύ σταθερό κάτω από σκληρές συνθήκες, οι μεγάλες χρόνος αποθήκευσης και μετά από πολλαπλούς κύκλους ψύξης-απόψυξης.

[7]

,

[8]

Επιπλέον,

ένα δείγμα αίματος είναι πιο βολικό και λιγότερο επεμβατική για τους ασθενείς από μια βιοψία.

Πέραν του ότι έχει ένα διαγνωστικό δυναμικό, [9], [10], [11] ορισμένων miRNAs έχει αποδειχθεί ότι είναι προγνωστική. Ορός miR-141 προτάθηκε ως προγνωστικός βιοδείκτη για ασθενείς με CRC [12] και τον ορό miR-21 ως διαγνωστικό και προγνωστικό βιοδείκτη σε CRC. [13]

Ο σκοπός της παρούσας προοπτικής μελέτης βιοδείκτη ήταν να αξιολογηθεί κατά πόσον τα προφίλ της

miRNA σε ολικό αίμα ήταν προγνωστικό για τη συνολική επιβίωση και την κλινική έκβαση σε ασθενείς με mCRC πριν από 3

ης γραμμής θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη.

Μέθοδοι

ασθενείς και θεραπεία

σε μια προοπτική μελέτη φάσης ΙΙ σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει την αποτελεσματικότητα του cetuximab και ιρινοτεκάνη ως 3

γραμμή θεραπείας rd σε ασθενείς με mCRC, προεπεξεργασία εκφράσεις miRNA ολικού αίματος μετρήθηκαν σε 143 ασθενείς. Όλοι οι ασθενείς ήταν ανθεκτικά σε 5-FU, οξαλιπλατίνη και ιρινοτεκάνη και αντιμετωπίζονται με ιρινοτεκάνη (180 mg /m

2) και cetuximab (500 mg /m

2) κάθε δεύτερη εβδομάδα [14]. Οι ασθενείς που είχαν συμπεριληφθεί από τρία δανικά νοσοκομεία από Οκτώβριος 2006 – Οκτώβριος 2008 και σε θεραπεία μέχρι την εξέλιξη της νόσου και ακολούθησε μέχρι το θάνατο ή την 1η Σεπτεμβρίου 2012.

Ηθική Δήλωση

Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση γραπτή συγκατάθεση, και η μελέτη εγκρίθηκε από την περιφερειακή επιτροπή δεοντολογίας στο πλαίσιο της Εθνικής Επιτροπής της Δανίας για την Υγεία Έρευνας Ηθικής (VEK διαιτητή. KA-20060094, www.cvk.sum.dk).

KRAS

,

BRAF

και

PI3KCA

Μετάλλαξη Κατάσταση

Από όλους τους ασθενείς, επιλέχθηκαν φορμόλη σταθερά ενσωματωμένα σε παραφίνη μπλοκ (FFPE) ιστό που αντιπροσωπεύει τον όγκο. Οι ιστοί FFPE κόπηκαν σε 3-4 μικρόμετρα τομές και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η &? Ε) για την αξιολόγηση και να επιβεβαιώσει καρκινικού ιστού στον επιλεγμένο μπλοκ ιστού. Εν συντομία, τρία τμήματα του ιστού υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μία φορά με ξυλόλιο, που ακολουθείται με μια έκπλυση σε αιθανόλη. Ο σβώλος επαναιωρήθηκε σε ATL (ρυθμιστικό λύσης ιστού) ρυθμιστικό διάλυμα και υποβάλλεται σε επεξεργασία με πρωτεϊνάση-K διάρκεια της νύχτας στους 56 ° C. Μετά την απενεργοποίηση του Πρωτεϊνάση-K με θέρμανση του DNA εκχυλίζεται με τη χρήση του QIAamp DNA Mini Kit.

KRAS

μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 και 13 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το TheraScreen

KRAS

κιτ μετάλλαξης (DxS Ltd, Manchester, Ηνωμένο Βασίλειο) τα οποία προσδιορίζουν 7 σωματικών

KRAS

μεταλλάξεις. Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν ανάλογα με το αν μια μετάλλαξη ήταν παρούσα (

KRAS

μεταλλαγμένο, mt) ή όχι (

KRAS

άγριου τύπου, κβ). [15], [16] V600

BRAF

μετάλλαξη αναλύει με ευαισθησία σε βάρος 5% έγιναν από Pyrosequencing (Pyromark Ε24) χρησιμοποιώντας τους εκκινητές όπως περιγράφεται από Richman et al [17].

PIK3CA

μεταλλάξεις ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας το TheraScreen

PI3KCA

κιτ μετάλλαξης (διαγνωστικά DXS), δοκιμές για τέσσερις σωματικές μεταλλάξεις στο εξώνιο 9 και στο εξόνιο 20 του

PI3KCA

ογκογονίδιο ( p.H104R, p.E542K, p.E545K /D). Η p.H104R μεταλλάξεις, p.E542K, p.E545K ανιχνεύθηκαν με ευαισθησία 1% και p.E545D ανιχνεύθηκε με ευαισθησία 2%.

Εξαγωγή του RNA από PAXgene Blood RNA Σωλήνες

δείγματα αίματος Προεπεξεργασία συλλέχθηκαν σε PAXgene Blood RNA σωλήνες (Qiagen) και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μικρές RNAs εκχυλίσθηκαν από τους σωλήνες PAXgene Blood RNA σε δύο κλάσματα. [18] Αυτοί οι σωλήνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την BiorobotMDx (Qiagen, Hilden, Germany) χρησιμοποιώντας ένα προσαρμοσμένο πρωτόκολλο που δεσμεύει μεγάλο RNA και διασώζει το run-διαμέσου από την πλάκα πρόσδεσης RNA . Η κατάσταση δεσμευτικός ως προς την πορεία μέσω τροποποιήθηκε στη συνέχεια επιτρέποντας την miRNA να καθαρίζεται σε μια πλάκα RNeasy-96. Η συγκέντρωση των μικρών κλασμάτων RNA εκτιμήθηκε με φασματομετρία απορρόφησης σε ένα DTX 880 (Beckman Coulter).

miRNA έκφραση σε ολικό αίμα

Το προφίλ miRNA διεξήχθη σε TaqMan Array Ανθρωπίνων microRNA κάρτες Α και Β v2.0 (Applied Biosystems) χρησιμοποιώντας τα αντιδραστήρια και κατασκευάζει τις οδηγίες. RNA μεταγράφηκε σε cDNA σε δύο πολλαπλές αντιδράσεις που το καθένα περιέχει 3 μΐ του παρασκευάσματος μικρό RNA και είτε Megaplex RT Primer μια πισίνα ή στην πισίνα πισίνα Β και χρησιμοποιώντας το TaqMan microRNA Reverse Transcription Kit σε ένα συνολικό όγκο 14 μΙ. Πριν από τη φόρτωση των συστοιχιών μια αντίδραση προενίσχυση 12 κύκλου εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας 2,5 μΐ cDNA σε μία αντίδραση 25 μλ. Κάθε μία από τις συστοιχίες φορτώθηκε με 800 μl Οικουμενική PCR δοκιμασία βασικού μείγματος που περιέχει 1/40 της αντίδρασης προενίσχυση και να τρέξει για το 7900 HT Fast Real-Time PCR System.

Mirna Ανάλυση Έκφρασης

Ποιότητα αξιολόγηση.

τα δείγματα με απορρόφηση κάτω του 1,8 απορρίφθηκαν και τις αξίες με ανίχνευση σημαίνει κύκλους μεγαλύτερη από 29,5 κρίθηκαν ελλιπείς τιμές. Εμείς υπολογίζονται, για την αξιολόγηση της ποιότητας των στοιχείων, τον αριθμό των εντοπισμένων miRNAs ανά δείγμα (Σχήμα S1 στο αρχείο S1) και η μέση έκφραση miRNAs ανά δείγμα (Σχήμα S2 σε S1 αρχείο). Εσωτερικών ελέγχων αναλύθηκαν για την εκτίμηση της αναπαραγωγιμότητας

Κανονικοποίηση και το φιλτράρισμα

Τα δεδομένα ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας η παγκόσμια μέση κανονικοποίηση [19] και οι αλλαγές στην έκφραση υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την 2

.. – μέθοδο ΔCt. Τα δεδομένα τυποποιηθεί πριν από την ανάλυση. [20] Μόνο τα 138 δείγματα με διατηρήθηκαν τουλάχιστον το 51% εξέφρασε miRNAs. MiRNAs με περισσότερο από 21% (το κατώφλι είναι το εκτιμώμενο επίπεδο στο οποίο το ποσοστό των διατηρούμενων miRNAs φτάνει σε ένα οροπέδιο) τοις εκατό τιμές που λείπουν απορρίφθηκαν: 402 από 768 διατηρήθηκαν (372 miRNAs: μόνο ένα μέρος από αυτά CRC συγκεκριμένες και 30 ανιχνευτές ελέγχου :. επαναλήψεις του U6, RNU24, RNU43, RNU44, RNU48 και RNU6B)

από τα δείγματα που προέρχονταν από τρία διαφορετικά νοσοκομεία, πραγματοποιήσαμε Principal Component Analysis για να ελέγξετε για μεροληψία από το νοσοκομείο. Εικόνα S3 στο αρχείο S1 παρουσιάζει κάποιες διαφορές από το κέντρο. Τα δεδομένα προσαρμόστηκαν από το κέντρο, χρησιμοποιώντας την παρτίδα-διόρθωσης αλγόριθμο μάχης, [21] από την SVA βιβλιοθήκη Bioconductor, [22] βλέπε Εικόνα S4 στο S1 αρχείο.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν με R έκδοση 3.0.1. Mann-Whitney (εάν 2 ομάδες) ή Kruskal-Wallis (εάν υπάρχουν περισσότερες από 2 ομάδες) δοκιμές ακολουθούμενο από

P

-τιμές ρύθμισης από το Benjamini & amp? μεθόδου Hochberg (FDR & lt? 5%) έγιναν για να προσδιοριστεί διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μεταξύ των τάξεων των δειγμάτων (

KRAS, BRAF, PI3KCA

, διπλό βάρος, κλινικό όφελος, κατάσταση απόδοσης)

μονοπαραγοντική και. πολυπαραγοντική επιβίωση αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του αναλογικού κινδύνου του Cox παλινδρόμησης (πακέτο «επιβίωσης» στην Ε). Έχουμε αναφερθεί μόνο-τεστ και Bonferroni προσαρμοσμένο

P

-τιμές με βάση τον αριθμό των miRNAs δοκιμαστεί στην μονοπαραγοντική συνολική επιβίωση (OS) και η επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS) μοντέλα παλινδρόμησης. Μια εκκίνησης διαδικασίας (150 δολώματά όπως από προεπιλογή για αυτήν την διαδικασία) από τη στρατηγική μοντελοποίηση παλινδρόμησης έγινε για να επικυρώσει τις εντοιχισμένες miRNAs με βάση τα μοντέλα επιβίωσης Cox (R rms βιβλιοθήκη), πιθανότητες συμφωνία υπολογίστηκαν από επεξεργασία των τυπικών σφαλμάτων (μεταξύ των άλλων διαθέσιμων στατιστικές) μεταξύ του νέου δείγματος εντοιχισμένη μοντέλο και το αρχικό μοντέλο σε κάθε bootstrap βήμα. Το μέτρο συμφωνία αντιπροσωπεύει μια πιθανότητα, αυτό μετρά πόσο καλά το μοντέλο μας κάνει διακρίσεις μεταξύ των διαφορετικών απαντήσεων, όπου C = 0,5 υπονοείται καμία προβλεπτική ικανότητα. . Στην περίπτωσή μας, η C & gt? 0.5 σημαίνει ότι ο ειδικός miRNAs είναι ένας καλός προγνωστικός δείκτης

ανάλυση πολυμεταβλητών επιβίωσης διεξήχθη με τις ακόλουθες μεταβλητές: miRNAs (ως συνεχείς μεταβλητές), το φύλο,

KRAS

,

PI3KCA

και την ηλικία (διχοτομήθηκε με μέση τιμή = 63 χρόνια).

BRAF

αποκλείστηκε από πολυπαραγοντική ανάλυση, λόγω του μικρού αριθμού των μεταλλαγμένων ασθενείς με εκδηλώσεις (n = 2). Οι εκφράσεις των συνεχών miRNAs διαχωρίστηκαν μεταξύ τους σε υψηλής και χαμηλής επικινδυνότητας από την μέση τιμή των τιμών έκφρασης για την οπτικοποίηση των οικοπέδων Kaplan-Meier. στοιχεία Kaplan-Meier αναφέρθηκαν για κάθε εντοιχισμένη μοντέλο επιβίωσης με τουλάχιστον μία στατιστικά σημαντική miRNA. Τα στοιχεία Kaplan-Meier δείχνουν επίσης Δείκτες κινδύνου (HR), διαστήματα εμπιστοσύνης (CI) και αδιόρθωτη Wald

P

-τιμές από μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox για συγκεκριμένες συγκρίσεις κατά ζεύγη των τόκων. Οι αναλογίες κινδύνου των συνεχών μεταβλητών που παρουσιάζονται στο διατεταρτημοριακό εύρος μονάδες (ΙΟΚ).

Target και Pathway Ανάλυση

Για τον προσδιορισμό μοριακών οδών που ενδεχομένως μεταβληθεί από την έκφραση των μονών ή πολλαπλών miRNAs, χρησιμοποιήσαμε την Diana -mirPath λογισμικού, [23] μια web-based υπολογιστικό εργαλείο. Το λογισμικό εκτελεί μια ανάλυση εμπλουτισμό των γονιδίων-στόχων των πολλαπλών miRNAs συγκρίνοντας τους σε όλες τις οδούς KEGG.

Οι βάσεις δεδομένων που χρησιμοποιήθηκαν ήταν TarBase (www.microrna.gr/tarbase) ή μΤ-CDS (www.microrna. gr /μΤ-CDS).

Αποτελέσματα

Κλινικά Χαρακτηριστικά και Μετάλλαξη κατάσταση των ασθενών

Μετά την αξιολόγηση της ποιότητας, δείγματα από πέντε ασθενείς απορρίφθηκαν. Baseline κλινικά χαρακτηριστικά και τη διανομή των

KRAS, BRAF,

και

PI3KCA

κατάσταση μετάλλαξης των υπολοίπων 138 ασθενείς με mCRC που περιλαμβάνονται στην παρούσα μελέτη βιοδεικτών δίνονται στον Πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία, χωρίς γνώση της κατάστασης μεταλλάξεων τους.

Η

miR-345 ήταν Προγνωστικοί για τη συνολική επιβίωση

εκατόν τριάντα δύο (95%) ασθενείς ήταν νεκρός κατά τη στιγμή της παρακολούθησης (το Σεπτέμβριο 2012). Διάμεση συνολική επιβίωση των ασθενών ήταν 10,6 μήνες (95% CI: 2,1 έως 38,2 μήνες). Δεν παρατηρήθηκε διαφορά στην OS μεταξύ των 3 κέντρων

Μετά την προσαρμογή με τη μέθοδο Bonferroni, βρήκαμε έξι προγνωστικούς miRNAs:. υψηλή έκφραση του miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628- 5ρ, miR-886-3p και χαμηλή έκφραση του miR-324-3p συνδέθηκαν με μικρή OS (Πίνακας 2). Τα οικόπεδα Kaplan-Meier για τους έξι προγνωστικούς miRNAs φαίνεται στο Σχήμα 1.

Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους από τη μέση τιμή έκφρασης για miR-345. έκφραση χαμηλή miRNA (κόκκινο) και υψηλή έκφραση των miRNAs (μπλε). Η

P

-τιμή αναφέρεται σε δοκιμασία Wald

Η

Ένας πλήρης κατάλογος των miRNAs προγνωστικών για το OS πριν από τη διόρθωση Bonferroni παρέχεται στον Πίνακα S1 στο αρχείο S1? – Α. συνολικά 64 miRNAs από 372 ήταν προγνωστικών, 50 με την υψηλότερη έκφραση που σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση και 14 με χαμηλότερη έκφραση που σχετίζεται με χειρότερη πρόγνωση, κανένας από τους μάρτυρες (U6, RNU24, RNU43, RNU44, RNU48 και RNU6B) ήταν προγνωστική. Ένα οικόπεδο ηφαίστειο, δείχνει Ζ βαθμολογίας όπως υπολογίζεται με ανάλυση παλινδρόμησης Cox και αδιόρθωτη p αξία, φαίνεται στο Σχήμα S5 στο S1 αρχείο

ανάλυση πολυμεταβλητών επιβίωσης διεξήχθη με τις ακόλουθες μεταβλητές:. MiR-345, ΜΙΚ 143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886-3p, miR-324-3p, το φύλο,

KRAS, PI3KCA

και την ηλικία (διχοτομήθηκε με μέση τιμή = 63 χρόνια). Τα αποτελέσματα αναφέρονται στον Πίνακα 3.

Η

Σε OS, miR-345 και miR-324-3p ήταν τα μόνα δύο miRNAs που ήταν στατιστικά σημαντική τόσο στην πολυπαραγοντική ανάλυση και την μονοπαραγοντική ανάλυση. κατάσταση απόδοσης και

KRAS

ήταν επίσης σημαντικοί παράγοντες στην πολυμεταβλητή ανάλυση, αν και

KRAS

ήταν οριακά σημαντική ως μονοπαραγοντική παράγοντα (HR = 1,36, 95% CI: 0,94 – 1,97).

miR-345 ως μια ενιαία miRNA δείκτης για την κλινική έκβαση

miR-345 ήταν επίσης προγνωστικά για το PFS, HR από IQR = 1,7, (95% CI: 01.31 – 02.02, ρυθμίζεται Bonferroni

P

-τιμή = 0,021). Πέραν του ότι είναι σημαντική για το OS σε ολόκληρη την ομάδα, miR-345 ήταν στατιστικά σημαντική σε όλα τα μοντέλα επιβίωσης για υποομάδες ασθενών με κατά βάρος

KRAS

,

BRAF

,

PI3KCA

και το διπλό βάρος για τους συνδυασμούς,

KRAS

+

BRAF

και

KRAS

+

PI3KCA,

βλέπε πίνακες S2-6 στο S1 αρχείο. miR-345 ήταν προγνωστικό για το OS στο

BRAF

+

PI3KCA

βάρος της ομάδας και στην τριπλή κ.β. ομάδα (

BRAF

κβ +

KRAS

κ.β. +

PI3KCA

κ.β.), αλλά όχι στην στην PFS αναλύσεις. Συγκρίναμε τις διαθέσιμες κατάστασης μεταλλάξεων σε συνδυασμό με την έκφραση του miR-345 σε σχέση με OS (Σχήμα 2) και PFS (Σχήμα 3).

(Α) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με

KRAS

μετάλλαξη καθεστώς και miR-345. (Β) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με

BRAF

κ.β. μεταλλάξεις κατάσταση και miR-345. (C) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με

PI3KCA

κατάσταση μετάλλαξης και miR-345. (Δ) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με διπλό βάρος κατάσταση μετάλλαξης και miR-345. Η

P

-τιμή αναφέρεται σε δοκιμασία Wald.

Η

Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με χαμηλό miR-345 έκφρασης (κόκκινο) και υψηλό miR-345 έκφρασης (μπλε). (Α) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους από την διάμεση τιμή έκφρασης για miR-345. (Β) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με

KRAS

κατάσταση μεταλλάξεων και miR-345. (C) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με

BRAF

WT μεταλλάξεις κατάσταση και miR-345. (Δ) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με

PI3KCA

κατάσταση μεταλλάξεων και miR-345. (Ε) Οι ασθενείς διαχωρίστηκαν μεταξύ τους με διπλό βάρος κατάσταση μετάλλαξης και miR-345. Η

P

-τιμή αναφέρεται σε δοκιμασία Wald.

Η

Οι εξοπλισμένα μοντέλα Cox επικυρώθηκαν από τη διαδικασία αναδειγματοληψία. Το μοντέλο που τοποθετούνται σε miR-345 και OS έδειξε καλή συμφωνία, υψηλότερο από κάθε άλλη αναλύονται miRNAs στο λειτουργικό σύστημα (Σχήμα S6 στο αρχείο S1).

Θα ελέγχεται επίσης εάν miR-345 έκφρασης συνδέθηκε με την ανταπόκριση στη θεραπεία και κλινικό όφελος. Θα μπορούσαμε να δούμε ότι υψηλότερη έκφραση συσχετίστηκε με έλλειψη απόκρισης (Σχήμα 4). Για να αναλυθεί περαιτέρω το θέμα, μπορούμε περιορισμένο σύνολο των ασθενών μας σε εκείνους με μερική ανταπόκριση (n = 24) και προοδευτική ασθένεια (n = 37) σε καλύτερη συνολική απόκριση. Στη συνέχεια, σε σύγκριση με τον αριθμό των ασθενών με χαμηλότερη και υψηλότερη έκφραση του miR-345 σύμφωνα με τη μέση έκφραση του miR-345 και έλαβε μια σημαντική σχέση μεταξύ miR-345 έκφρασης και την ανταπόκριση στη θεραπεία με μια αναλογία πιθανοτήτων 5,37 (

P

-τιμή = 0,004? 95% CI: 1,56 – 20,94)

Αν έχουμε περιορίσει σύνολο των ασθενών μας σε εκείνους με μερική ανταπόκριση (n = 24) και προοδευτική νόσο (n = 37), ένα. σημαντική σχέση μεταξύ της έκφρασης του miR-345 και την ανταπόκριση στη θεραπεία ελήφθη με λόγο πιθανοτήτων 5,37, (

P

-τιμή = 0,004 και 95% CI: 1,56 – 20,94).

η

Pathway και Ανάλυση Target

για τον προσδιορισμό μοριακών οδών που σχετίζονται με την έκφραση των έξι miRNAs προγνωστικό για το OS (miR-345, miR-143, miR-34a *, miR-628-5p, miR-886- 3ρ, miR-324-3p), ελέγξαμε μονοπάτια KEGG. Μεταξύ των στατιστικώς σημαντικές, ορθοκολικό καρκίνο (KEGG μονοπάτι hsa05210) ήταν παρούσα λόγω της προβλεπόμενης αλληλεπιδράσεις μεταξύ αυτών των miRNAs και τα ακόλουθα γονίδια-στόχους:. TCF4, APC, Smad4, MAPK8, PIK3CG, PIK3CD, DCC, PIK3CG, PIK3CA και MAPK1

Συζήτηση

στην πρώτη και αργότερα γραμμές της θεραπείας των ασθενών με mCRC η προσθήκη του cetuximab στη χημειοθεραπεία μπορεί να είναι ευεργετική σε ασθενείς χωρίς μεταλλάξεις στο

KRAS

και

BRAF

[24], [25], [26]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες που διερευνούν το cetuximab στην πρώτη γραμμή mCRC, δεν μπορούσε να επιβεβαιώσει όφελος στο PFS και OS στο

KRAS

βάρος των ασθενών. [27], [28]. Υπάρχει ανάγκη για πιο ακριβή βιοδείκτες ή πάνελ βιοδεικτών. Η παρούσα προοπτική μελέτη βιοδείκτη διεξήχθη για τον προσδιορισμό προγνωστικών miRNAs σε ολικό αίμα από ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με 3

cetuximab γραμμή rd και ιρινοτεκάνη.

Η μελέτη μας υποδηλώνει μια πιθανή ρόλο των κυκλοφορούντων miRNAs να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για την κλινική έκβαση σε ασθενείς με mCRC. Βρήκαμε ότι το miR-345 ήταν προγνωστικό για το OS σε όλους τους ασθενείς μας με mCRC και στο

KRAS

βάρος των ασθενών, με υψηλή έκφραση που σχετίζεται με μικρότερη επιβίωση. Πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το miR-345 ήταν ένας ισχυρός παράγοντας που προστίθεται προγνωστικές πληροφορίες στα άλλα διαθέσιμα κλινικοπαθολογική και μετάλλαξης μεταβλητές. Tumor βάρος είναι ένας συνδυασμός του μεγέθους του όγκου και τον αριθμό των μεταστατικών τόπων. Τα δεδομένα όσον αφορά το μέγεθος του όγκου δεν ήταν στη διάθεσή μας, και ως εκ τούτου το φορτίο του όγκου δεν θα μπορούσαν να συμπεριληφθούν στην πολυπαραγοντική ανάλυση. Κάναμε, ωστόσο, να περιλαμβάνει μια αντιπροσωπευτική λίστα των συμπαράγοντες που θεωρούνται ως προγνωστικοί παράγοντες για τους ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με cetuximab.

miR-345 ήταν στατιστικά σημαντική για όλους τους κ.β. υποομάδες που αναλύθηκαν. Δεδομένου ότι όλοι οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με cetuximab, δεν μπορούμε να συμπεράνουμε αν miR-345 ήταν ένα προγνωστικό βιοδείκτη (ανεξάρτητα της θεραπευτικής αγωγής οι ασθενείς έλαβαν) ή ενός βιοδείκτη πρόβλεψη της ευαισθησίας στη θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη, αλλά βρήκαμε ότι υψηλότερη έκφραση του συνδέθηκε με έλλειψη της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Στην απομονωμένη ομάδα των διασωστών έναντι μη-ανταποκρίθηκαν, μια υψηλή έκφραση του miR-345 σχετίζεται σημαντικά με 5 φορές τον κίνδυνο της προοδευτικής νόσου ως καλύτερη συνολική ανταπόκριση. Τα αποτελέσματα αυτά είναι νέα ευρήματα και υποδηλώνουν ότι αυτή η miRNA είναι προγνωστικό και μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για την ανταπόκριση σε ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη.

Κυκλοφορία του miR-345 έχει τις γνώσεις μας, δεν έχουν προηγουμένως περιγραφεί σε σύνδεση με CRC, αλλά Tang και συνεργάτες ανέφεραν ότι ένα χαμηλό επίπεδο του miR-345 σε CRC ιστού σχετίζεται με μεταστάσεις στους λεμφαδένες, χειρότερα ιστολογικός τύπος και ρυθμίζεται προς τα πάνω σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές μετά από θεραπεία με 5-αζα-dc [29 ]. Επιπλέον, τα επίπεδα του DNA-μεθυλίωση στην περιοχή προαγωγού του miR-345 είναι υψηλότερες στην CRC ιστό σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό κόλου και αντίστοιχα μη καρκινικό ιστό, υποδηλώνοντας ότι αυτό το miRNA είναι ένας καταστολέας όγκων ευαίσθητος μεθυλίωση [29].

σε δείγματα ιστού, miR-345 είναι προγνωστικό σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού [30]. Παρά το γεγονός ότι η επικύρωση στις εξωτερικές ομάδες δεν ήταν στατιστικά σημαντική, miR-345 ήταν η μόνη miRNA να παραμείνει προγνωστική σε ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο, που αντιπροσωπεύουν βασικές κλινικές παραμέτρους [30].

Δεν είναι γνωστό γιατί υπάρχει διαφορά μεταξύ έκφραση miRNA σε ιστό και αίμα από ασθενείς με CRC. Λίγες μελέτες έχουν σχέση με την έκφραση των miRNAs σε αντίστοιχα δείγματα ιστών και αίματος. Μικρή επικάλυψη παρατηρείται μεταξύ miRNAs διαφοροποιώντας δείγματα καρκίνου του πνεύμονα από φυσιολογικά δείγματα πνευμονικού ιστού και miRNAs πλάσμα διαφοροποίηση ασθενείς με επιθετική έναντι μη επιθετικό καρκίνο του πνεύμονα. [31] miR-345 βρέθηκε μειωμένη σε CRC ιστού σε μια σχετικά μικρή μελέτη της 26ης CRC δείγματα ιστού στην οποία μόνο 5 ασθενείς είχαν μεταστατική νόσο. [29] Μια χαμηλή συγκέντρωση miR-345 στο κυρίως εντοπισμένη CRC ιστού μπορεί να μην είναι συγκρίσιμα με υψηλή συγκέντρωση των κυκλοφορούντων miR-345 στο μεταστατικό CRC. Το ίδιο μπορεί να είναι miRNA όγκων που σχετίζονται με διαφορετικούς τρόπους, ανάλογα με, εάν διαπιστωθεί στον όγκο ή ως ένα κυκλοφορούν miRNA.

miR-143 είναι μεταγενέστερος ρυθμίζεται σε δείγματα όγκων CRC σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό . [32], [33], [34]

KRAS

μπορεί να είναι ένας στόχος για miR-143 [35] και τα επίπεδα του miR-143 έκφρασης σε δείγματα όγκων CRC είναι ένα προγνωστικό βιοδείκτη σε

KRAS

βάρος των ασθενών, αλλά όχι μια έξυπνη δείκτης για αντι-EGFR θεραπείας. [36] Κυκλοφορούν miR-143 έχει δοκιμαστεί ως διαγνωστικό δείκτη σε ασθενείς με CRC, αλλά δεν είναι σημαντικά απορρύθμιση σε σύγκριση με φυσιολογικούς μάρτυρες. [37] miR-324- 3ρ δεν έχει περιγραφεί σε CRC, αλλά με διαφορετικό τρόπο εκφράζεται σε πλάσμα από ασθενείς με καρκίνο του μαστού σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες. [38].

η ισχύς της μελέτης μας ήταν η σχετικά μεγάλο μέγεθος του δείγματος, bootstrap διαδικασία (αναδειγματοληψία επικύρωση του μοντέλου παλινδρόμησης Cox), και μια αυστηρή στατιστική προσέγγιση χρησιμοποιώντας μόνο miRNAs προσαρμόζεται σύμφωνα με τη διόρθωση Bonferroni. Το επόμενο βήμα θα είναι να επικυρώσει αυτές τις σημαντικές miRNAs σε όλο το αίμα από μια άλλη ομάδα ασθενών με mCRC που έλαβαν θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη. Προς το παρόν δεν υπάρχουν τέτοια δείγματα είναι διαθέσιμα από τις μελέτες που ολοκληρώθηκαν φάσης ΙΙΙ.

Δεν υπάρχουν μελέτες έχουν διερευνήσει κατά πόσον miRNA εκφράσεις στο ολικό αίμα έχουν ένα δυναμικό ως προγνωστικό ή προγνωστική βιολογικών δεικτών σε ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με cetuximab και ιρινοτεκάνη. Οι περισσότερες μελέτες που διερευνούν κυκλοφορούν miRNAs έχουν χρησιμοποιήσει το πλάσμα ή τον ορό. [39], έχουν [40] προφίλ έκφρασης miRNA σε πλήρες αίμα συλλέγεται σε PAXgene RNA σωλήνες έχουν περιγραφεί σε ασθενείς με αιματολογικές ασθένειες, του παγκρέατος και καρκίνο του πνεύμονα [41], [42] και έχουν πλεονεκτήματα σε σύγκριση με miRNA στον ορό /πλάσμα λόγω της υψηλότερης απόδοσης [43] των miRNAs και λιγότερα μεθοδολογικά προβλήματα [44]. MiRNAs βρέθηκαν στο περιφερικό ολικό αίμα μπορεί να προέρχεται από τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και από μη καρκινικών κυττάρων όπως λευκοκυττάρων, αιμοπεταλίων και των μονοκυττάρων. Μπορούν να είναι στην κυκλοφορία του αίματος συνδέεται με τις πρωτεΐνες όπως πριν [45] και της HDL [46] ή έχουν συσκευασθεί σε εξωσώματα. [47] Η προγνωστική miRNAs, βρέθηκε στην ομάδα μας από τους ασθενείς, μπορεί να οφείλεται σε εξέλιξη του όγκου, μία φλεγμονώδης απόκριση ή ως απάντηση σε ανεπάρκεια οργάνων.

Πρόσφατα, Shen και συνεργάτες ανέφεραν ότι EGFR συμμετείχε στην καταστολή των ειδικών ωρίμανση miRNA σε απόκριση σε υποξικό στρες. [48] Ο προτεινόμενος μηχανισμός ήταν ότι ένας EGFR μέσω φωσφορυλίωσης του ago2, προκάλεσε μείωση του Dicer /πρόσδεσης ago2 [48] αποφασίζει την αναστολή της ωρίμανσης των προ-miRNAs με διαμόρφωση μακράς βρόχου. Η αναστολή του EGFR μπορεί επίσης να προκαλέσει ενδοκυτταρική ρύθμιση miRNA και να μεταφέρει μερικές από τις αλλαγμένες miRNAs στην κυκλοφορία του αίματος, με αποτέλεσμα να ενεργεί ως κυκλοφορούν απάντηση στις ενέργειες του EGFR.

Συμπέρασμα

Εμείς εντόπισε έξι κυκλοφορούν miRNAs στην ολικού αίματος ως προγνωστικοί δείκτες για το OS. miR-345 ήταν μια ενιαία βιοδείκτη για OS σε όλους τους ασθενείς και σε υποομάδες ασθενών με

KRAS

κβ και

KRAS + BRAF

διπλό βάρος. Επιπλέον, miR-345 ήταν σημαντικά σχετίζεται με PFS και καλύτερη συνολική ανταπόκριση και μπορεί να είναι ένας πιθανός βιολογικός δείκτης για την κλινική έκβαση σε ασθενείς με mCRC που έλαβαν θεραπεία με 3

cetuximab γραμμή rd και ιρινοτεκάνη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείο.

περιέχει τα ακόλουθα αρχεία:. Σχήμα S1, S2 σχήμα, το σχήμα S3, S4 σχήμα, πίνακα S1, S2 πίνακα, τον πίνακα S3, S4 πίνακας, πίνακας S5, S6 πίνακα, Σχήμα S5, S6 Σχήμα

doi: 10.1371 /journal.pone.0099886.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Νίνα Dahl Kjersgaard και Beata Gregersen, Χέρλεβ Νοσοκομείο για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια. Birgitte Christiansen, Trine Σ Rasmussen και οι νοσηλευτές και τεχνικοί στην Κλινική Μονάδα Έρευνας και η Μονάδα πειραματική θεραπεία σε Χέρλεβ Νοσοκομείο, Odense Νοσοκομείο και Aalborg Νοσοκομείο είναι ευχαρίστησε για την εξαιρετική βοήθεια. Δανική Βιοτράπεζας Καρκίνου στο Χέρλεβ Νοσοκομείου ευχαρίστησε για το χειρισμό των δειγμάτων ιστού.