Οι

Abstract

Εμβόλια καρκίνου που αποσκοπούν στην επέκταση του όγκου αντιγόνου-ειδικά Τ κύτταρα με λειτουργία δράστη. Ωστόσο, μπορούν επίσης να επεκτείνουν ακούσια ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg), που θα μπορούσαν να παρεμποδίσουν σοβαρά την κλινική αποτελεσματικότητα. Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, έχουμε αναπτύξει μια νέα δοκιμασία για την ανίχνευση ειδικών για το αντιγόνο Treg βασίζονται σε ρύθμιση προς τα κάτω της επιφάνειας του CD3 μετά την εμπλοκή TCR, και να χρησιμοποιηθεί αυτή η προσέγγιση για τη διαλογή Treg ειδικά για το αντιγόνο του όγκου NY-ESO-1 σε ασθενείς με μελάνωμα έλαβαν με τον /ISCOMATRIX

εμβόλιο κατά του καρκίνου TM NY-ESO-1. Όλοι οι ασθενείς που εξετάστηκαν είχαν Treg (CD25

φωτεινό FoxP3

+ CD127

αρνητικά) ειδικά για τουλάχιστον ένα NY-ESO-1 επιτόπου στο αίμα. Εντυπωσιακά, η σύγκριση με τα δείγματα προ της θεραπείας αποκάλυψε ότι πολλές από αυτές τις αποκρίσεις προκλήθηκαν ή ενισχύθηκαν με εμβολιασμό. Η πιο συχνά ανιχνεύεται απόκριση ήταν προς το HLA-DP4-περιορισμένο NY-ESO-1

157-170 επίτοπο, η οποία αναγνωρίζεται επίσης από δραστικά Τ κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, λειτουργικά ειδικές Treg για ένα HLA-DR-περιορισμένο επίτοπο εντός της NY-ESO-1

115-132 πεπτίδιο ταυτοποιήθηκαν επίσης σε υψηλή συχνότητα σε καρκινικό ιστό, γεγονός που υποδηλώνει ότι NY-ESO-1-ειδικά Treg μπορεί να καταστείλει την τοπική αντικαρκινικές ανοσοαπαντήσεις. Μαζί, τα στοιχεία μας παρέχουν πειστικές αποδείξεις για την ικανότητα ενός εμβολίου καρκίνου για την επέκταση του όγκου αντιγόνου-ειδική Treg στη ρύθμιση του προχωρημένου καρκίνου, ένα εύρημα το οποίο θα πρέπει να ληφθεί σοβαρά υπόψη στο σχεδιασμό των μελλοντικών κλινικών δοκιμών εμβόλιο κατά του καρκίνου.

Παράθεση: Ebert LM, MacRaild SE, Zanker D, Davis ID, CEBON J, Chen W (2012) Ένας Καρκίνος εμβόλιο επάγει Επέκταση των NY-ESO-1-ειδικά ρυθμιστικά Τ κύτταρα σε ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα. PLoS ONE 7 (10): e48424. doi: 10.1371 /journal.pone.0048424

Επιμέλεια: Derya Unutmaz, του Πανεπιστημίου της Νέας Υόρκης, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25 Ιουν 2012? Αποδεκτές: 25 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Οκτωβρίου 2012

Copyright: © 2012 Ebert et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις Αντικαρκινικού Συμβουλίου Βικτώριας να LE (603103, 433626), ένα Εθνικό Σύστημα Υγείας και του Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας (NHMRC) επιχορήγηση του έργου με WC (433608) και Λειτουργικής υποστήριξης Υποδομών της βικτωριανής Πολιτειακή κυβέρνηση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εμβόλια Καρκίνος υπόσχονται πολλά στη θεραπεία των συμπαγών όγκων, όπως το μελάνωμα, και έχουν αποτελέσει το επίκεντρο της εκτεταμένης προ-κλινικές και κλινικές δοκιμές κατά τα τελευταία χρόνια. Λόγω της εξαιρετικής ανοσογονικότητα του, NY-ESO-1 έχει αναδειχθεί ως ένας από τους πιο υποσχόμενους στόχους σε τέτοιες προσεγγίσεις [1]. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων αρκετών ετών, έχουμε διεξάγει μια σειρά από κλινικές δοκιμές σε ασθενείς με μελάνωμα χρησιμοποιώντας ένα εμβόλιο κατά του καρκίνου που αποτελείται από πλήρους μήκους ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη NY-ESO-1 διατυπωθεί με ISCOMATRIX

TM ανοσοενισχυτικό (CSL Limited, Αυστραλία). Παρά το γεγονός ότι αυτό το εμβόλιο είχε ισχυρή δράση κατά των όγκων σε μελέτες σε ζώα προ-κλινικές [2] και έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα στην αρχική φάση Ι μελέτη [3], δεν κατάφερε να βελτιώσει σημαντικά την κλινική έκβαση σε ασθενείς με μελάνωμα σε επόμενες μελέτες [4] και χειρογράφου σε προετοιμασία). Επιπλέον, ενώ οι ασθενείς με πλήρη εκτομή (πρώιμο στάδιο) ασθένεια αναπτύχθηκε ισχυρή δραστικών Τ κυττάρων (Teff) απαντήσεις σε NY-ESO-1 μετά τον εμβολιασμό [3], [5], ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα είχαν πολύ λιγότερο ισχυρή αποκρίσεις [4] .

Παρόμοια με την εμπειρία μας με το NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

εμβόλιο TM, και πολλά άλλα αντικαρκινικά εμβόλια έχουν αποτύχει επίσης να προκαλέσει σημαντικά κλινικά οφέλη, συχνά παρά την επαγωγή της φαινομενικά ισχυρή όγκου ειδικών για το αντιγόνο ανταποκρίσεις teff [6], [7]. Υπάρχουν πολλές πιθανές εξηγήσεις για αυτό, αλλά εκείνο που έχει λάβει ιδιαίτερη προσοχή τα τελευταία χρόνια επικεντρώνεται γύρω από το ρόλο των CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ ρυθμιστικά Τ κύτταρα (Treg). Treg είναι απαραίτητες για την πρόληψη της αυτοανοσίας [8]. Ωστόσο, ένα αυξανόμενο σώμα αποδείξεων υποστηρίζει την ιδέα ότι Treg μπορεί επίσης να εμποδίσει τη δημιουργία αποτελεσματικής αντικαρκινικής ανοσίας [9]. Είναι, επομένως, επιτακτική ανάγκη να προσεγγίσεις εμβόλιο κατά του καρκίνου αποφεύγουν την επέκταση αυτών των κυττάρων.

Μέχρι πρόσφατα, τα στοιχεία για την αναγνώριση των αντιγόνων όγκου με Treg ήταν σπάνια, και δεν ήταν σαφές κατά πόσον ή όχι Treg θα ενεργοποιηθεί και να επεκταθεί σε απάντηση για τον εμβολιασμό κατά καρκινικά αντιγόνα. Τα τελευταία χρόνια, ωστόσο, ένας αριθμός αναφορών έχουν εντοπίσει Treg ειδική για ένα φάσμα αντιγόνων όγκου σε ανθρώπινο καρκίνο, συμπεριλαμβανομένης της NY-ESO-1, survivin, ΤΚΡ-1, gp100, MAGE-A3, Melan-A, καρκινοεμβρυονικού Ag ( CEA), τελομεράση, HER2 /neu, WT-1, MUC-1 και του ιού του θηλώματος αντιγόνα Ε6 και Ε7 [10] – [16]. Η παρουσία αυτών των κυττάρων σε ασθενείς με καρκίνο εγείρει σοβαρές ανησυχίες για τη δυνατότητα των εμβολίων για τον καρκίνο για να επεκταθεί όχι μόνο Teff αλλά και Treg. Ο βαθμός στον οποίο αυτό συμβαίνει στην πραγματικότητα, ωστόσο, είναι ελάχιστα κατανοητή.

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε αξιολογήσει την επίδραση του εμβολιασμού με ΝΥ-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM για τη συχνότητα των NY- ESO-1-ειδικά Treg στους ασθενείς με τελικού σταδίου μελάνωμα. Δεδομένου ότι οι περισσότερες Treg δεν παράγουν κυτοκίνες κατά την ενεργοποίηση [17] – [19], δεν υπάρχει σήμερα κατάλληλη δοκιμασία διαθέσιμα στην οθόνη για το αντιγόνο-ειδική Treg. Ως εκ τούτου, έχουμε αναπτύξει μια νέα, συστηματική προσέγγιση στην οποία το αντιγόνο-ειδικό Treg ανιχνεύονται από τα κάτω ρύθμιση των υποδοχέων επιφανείας Τ κυττάρου (TCR) /CD3 σύμπλοκα εξής

in vitro

διέγερση με μια βιβλιοθήκη σύντομων αντιγονικών πεπτιδίων. Η βελτιστοποίηση αυτής της μεθόδου έχει περιγραφεί προσφάτως [20]. Εδώ, έχουμε χρησιμοποιήσει αυτή την προσέγγιση για τη διαλογή ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά Treg σε ασθενείς με μελάνωμα, πριν και μετά τον εμβολιασμό με το NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

εμβόλιο ΤΜ. Η μελέτη αυτή μας έδωσε τη δυνατότητα να αποκτήσουν μια πρωτοφανή κατανόηση του όγκου αντιγόνου-ειδικά Treg στη ρύθμιση του προχωρημένου καρκίνου, συμπεριλαμβανομένης της λειτουργίας τους, τη θέση, το φάσμα των επιτόπων που αναγνωρίζονται και πως η συχνότητά τους επηρεάζεται από τον εμβολιασμό.

Αποτελέσματα

Μια νέα προσέγγιση που βασίζεται σε ρύθμιση προς τα κάτω της επιφάνειας του CD3 ανιχνεύει Teff και Treg ειδικά για NY-ESO-1 πεπτίδια

για να ελέγξουν για NY-ESO-1-ειδικά Treg σε ένα αμερόληπτο τρόπο, έχουμε αναπτύξει μία δοκιμασία που βασίζεται στην αρχή ότι τα Τ κύτταρα τα κάτω ρυθμίζουν τον αριθμό των CD3 /TCR σύμπλοκα στην κυτταρική επιφάνεια εξής η πρόσδεση του συγγενές αντιγόνο [21], [22]. Αυτό μπορεί να ανιχνευθεί ως ένα μειωμένο επίπεδο χρώσης CD3 κυτταρική επιφάνεια με κυτταρομετρία ροής. Λόγω της σπανιότητας τους, NY-ESO-1-ειδικά ποτέ δεν μπορεί σχεδόν να ανιχνευθεί Teff άμεσα

ex vivo

σε δείγματα αίματος με τη χρήση τυποποιημένων (ενδοκυτταρική χρώση κυτοκίνης IFN-γ) τη μεθοδολογία, αλλά αντ ‘αυτού απαιτείται προηγούμενη επέκτασης

στο vitro

. Προκαταρκτικές μελέτες αποκάλυψαν ότι αυτό ήταν επίσης η περίπτωση για NY-ESO-1-ειδικά Treg ανιχνεύεται με τη χρήση του CD3 μειορύθμιση μέθοδο (αδημοσίευτες παρατηρήσεις). Συνεπώς, ασθενής PBMC καλλιεργήθηκαν με ένα πάνελ 28 μερικώς επικαλυπτόμενα πεπτίδια 18 αμινοξέων που καλύπτουν συλλογικά ολόκληρη την αλληλουχία του ΝΥ-ΕδΟ-1 [23], για να επιτρέψει την επέκταση του ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά Teff και Treg σε ανιχνεύσιμα συχνότητες . Συνθήκες, συμπεριλαμβανομένου του χρόνου καλλιέργειας, συγκέντρωση IL-2 και η πηγή του ορού, έχουν βελτιστοποιηθεί για την επέκταση Treg [20]. Μετά 21δ επέκταση, οι καλλιέργειες επανα-διεγέρθηκαν με ξεχωριστά πεπτίδια 18μερές και το επίπεδο της επιφάνειας CD3 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής, σε συνδυασμό με χρώση για δείκτες Treg.

Ένα παράδειγμα των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται παρουσιάζεται στο Σχήμα 1. Αυτά τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι μια σαφής πληθυσμός των θεωρούμενων Treg μπορούσε να ανιχνευθεί εντός του CD4

+ κυτταρικό πληθυσμό Τ με συν-χρώση για CD25 και FoxP3 (Σχήμα 1Α, αριστερά). Μέσα σε αυτό το υποσύνολο Treg, μια ξεχωριστή υπο-πληθυσμός των κυττάρων CD3-χαμηλό (αντιγόνο-ειδική) ήταν εμφανής μετά από εκ νέου διέγερση με πεπτίδιο NY-ESO-1

157-174 αλλά δεν NY-ESO-1

127 -144 ή απουσία επαναδιέγερση (Σχήμα 1Α, το άνω πάνελ). Αντίθετα, ένα CD3-χαμηλό υπο-πληθυσμού θα μπορούσε να ανιχνευθεί εντός του υποσυνόλου Teff ακόλουθη εκ νέου διέγερση με πεπτίδιο NY-ESO-1

127-144, αλλά δεν NY-ESO-1

157-174 (Σχήμα 1Α, κάτω πάνελ). Μια σύνοψη των αποτελεσμάτων για αυτόν τον ασθενή χρησιμοποιώντας όλα τα 28 πεπτίδια αποδεικνύει δύο διακριτές αποκρίσεις Treg, εντός των περιοχών NY-ESO-1

37-60 και ΝΥ-ΕδΟ-1

157 – 180 (Σχήμα 1Β), και ένα κύριο απάντηση teff, στην περιοχή NY-ESO-1

127-144 (Σχήμα 1C).

CD3

. PBMC από τον ασθενή 113 καλλιεργήθηκαν με ομαδοποιημένα NY-ESO-1 18μερές πεπτίδια όπως περιγράφεται στο

Methods

, ακολουθούμενη από εκ νέου διέγερση με τα υποδεικνυόμενα μεμονωμένα πεπτίδια κατά τη διάρκεια της ολονύκτιας καλλιέργειας για να επιτρέψει CD3 κάτω ρύθμιση. Τα κύτταρα βάφτηκαν με αντισώματα για CD4, CD25, FoxP3 και CD3 και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. (

A

): ένα παράδειγμα από τα σχέδια χρώσης που παρατηρήθηκε, που απεικονίζει την περίφραξη των Treg και Teff (σε περιφραγμένη βιώσιμα CD4

+ Τ κύτταρα) και το κάτω-ρύθμιση των CD3 μέσα σε κάθε πληθυσμό. (

Β

–

C

): Μια περίληψη των απαντήσεων ανιχνεύεται εντός του Treg (Β) και Teff (C) πληθυσμούς. Διακεκομμένες γραμμές δείχνουν το επίπεδο αναφοράς της CD3-χαμηλό κύτταρα (μηδέν πεπτίδιο κατάσταση).

Η

Θα επιδιωχθεί επίσης να αναλύσουμε το προφίλ παραγωγής κυτταροκινών της NY-ESO-1-ειδικά Treg σε τέσσερις ασθενείς των οποίων Treg κάτω -regulated CD3 σε απόκριση προς NY-ESO-1 πεπτίδια, χρησιμοποιώντας χρώση ενδοκυτταρικής κυτοκίνης. CD3-χαμηλό Treg παράγονται χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα επίπεδα IL-4, IL-10 και IL-17 σε όλους τους ασθενείς. Ωστόσο, η παραγωγή ΙΡΝ-γ και ΤΝΡ-α ήταν μεταβλητή, με δύο ασθενείς που δείχνει αμελητέα παραγωγή από το CD3-χαμηλό Treg, και δύο ασθενείς παρουσιάζουν υψηλά επίπεδα παραγωγής (Σχήμα S1). Η έκκριση των προ-φλεγμονωδών κυτοκινών όπως IFN-γ με Treg έχει περιγραφεί προηγουμένως [16], [24] – [26], και φαίνεται να είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό της Treg ταυτοποιηθεί σε ασθενείς με καρκίνο. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι αυτό το χαρακτηριστικό είναι σποραδική και δεν μπορεί να γίνει επίκληση για αναγνώριση Treg.

Κύτταρα που προσδιορίζονται από το CD25

+ FoxP3

+ φαινότυπο έχουν φαινοτυπικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά των Treg

Τόσο CD25 και FoxP3 είναι γνωστό ότι προκαλείται από παροδικά σε Teff μετά την ενεργοποίηση, πράγμα που σημαίνει ότι ενεργοποιείται Teff μπορεί ενδεχομένως να είναι λάθος για Treg [27] – [30]. Δεδομένης της εκτεταμένης περιόδου καλλιέργειας που χρησιμοποιείται (21δ), είναι απίθανο ότι τα κύτταρα που προσδιορίζονται ως CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ στο σύστημα πολιτισμό μας αντιπροσωπεύουν ενεργοποιηθεί Teff, αφού η έκφραση της FoxP3, και σε μικρότερο βαθμό CD25, επιστρέφει στην αρχική τιμή μετά από περίπου 10 ημέρες [12], [27], [28], [30]. Ωστόσο, για να αποδειχθεί περαιτέρω ότι αυτά τα κύτταρα είναι πράγματι Treg, οι καλλιέργειες συν-χρώση με ένα αντίσωμα προς CD127, η οποία εκφράζεται σε σημαντικά μειωμένα επίπεδα σε σύγκριση με Treg Teff [31], [32]. Σχήμα 2Α δείχνει ότι τα κύτταρα που προσδιορίζονται ως Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) εξέφρασε μόλις ανιχνεύσιμα επίπεδα του CD127, ενώ τα κύτταρα προσδιορίζονται ως Teff (CD4

+ FoxP3

-) εκφράζεται ομοιόμορφα υψηλά επίπεδα. Επιπλέον, όταν χύμα Treg ήταν FACS-διαλέγεται από 21d καλλιέργειες (σύμφωνα με CD4

+ CD25

+ CD127

– /low φαινότυπο), αυτά τα κύτταρα προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη μείωση στον πολλαπλασιασμό CD8

+ Τ κύτταρα (Σχήμα 2Β)

Patient PBMC καλλιεργήθηκαν για 21d με ΝΥ-ΕδΟ-1 πεπτίδιο (-α) 18μερές γνωστό από προκαταρκτικές μελέτες για να διεγείρει απόκριση Treg και στη συνέχεια:. (

A

) αναλύθηκαν για έκφραση CD127 με κυτταρομετρία ροής, μέσω πύλης για Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) ή Teff (CD4

+ FoxP3

-) όπως υποδεικνύεται. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα? ή (

Β

): Treg καθαρίστηκαν με διαλογή CD4

+ CD25

+ CD127

χαμηλή κύτταρα και ελέγχθηκαν για την ικανότητά τους να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των CFSE επισημασμένου CD8

+ Τ κύτταρα προ-διεγερμένα επί 16 ώρες με δεσμευμένο στην πλάκα αντι-CD3. Το γράφημα παρουσιάζει το ποσοστό% καταστολή σε σχέση με καλλιέργειες διεξάγεται απουσία του Tregs, ενώ κυτταρομετρία ροής ιστογράμματα παρακάτω απεικονίζουν προφίλ CFSE που ελήφθησαν για μόνη (αριστερά) ή σε 1:02 αναλογία με Treg (δεξιά) αποκριτικά Τ κύτταρα. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων χρησιμοποιώντας δείγματα από τρία διαφορετικά άτομα. Στο (C), καλλιεργημένα PBMC επαναδιεγέρθηκαν με το σχετικό πεπτίδιο και την έκφραση του LAP επί της επιφανείας των Tregs ή Teffs προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής εντός του CD3-χαμηλό (πεπτίδιο αποκρίνεται) πληθυσμού για τρεις ασθενείς.

Τέλος, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν το αντιγόνο-ειδική ενεργοποίηση των Treg οδήγησε στην επαγόμενη έκφραση του συνδέεται με λανθάνουσα κατάσταση πεπτίδιο ΤΟΡ-β (LAP) στην επιφάνεια των κυττάρων. Η επαγωγή της έκφρασης LAP μετά την ενεργοποίηση είναι ένα μοναδικό χαρακτηριστικό Treg, και αυτό το μόριο δεν εκφράζεται σε κύτταρα Teff, ακόμη και μετά την ενεργοποίηση [18], [33]. Για να συγκριθούν άμεσα προκαλείται από ενεργοποίηση έκφραση LAP επί Treg και Teff, εντοπίσαμε τρεις ασθενείς στους οποίους οι πληθυσμοί Treg και Teff αμφότερα ρυθμισμένα προς τα κάτω CD3 σε απόκριση προς το ίδιο πεπτίδιο. PBMC από αυτούς τους ασθενείς καλλιεργήθηκαν για 21δ με πεπτίδιο, επαναδιεγέρθηκαν τη διάρκεια της νύχτας και να αξιολογηθούν για CD3 κάτω ρύθμιση και την επιφάνεια LAP έκφρασης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2C, LAP ήταν σαφώς επάγεται σε ένα υπο-πληθυσμό των Treg αντιμετώπιση NY-ESO-1 πεπτίδιο, όπως προσδιορίζονται από την CD3-χαμηλό φαινότυπο. Σε αντίθεση, CD3-χαμηλό Teff ανταποκρίνεται στον ίδιο πεπτίδιο απέτυχε να ρυθμίζουν LAP.

Μαζί, η έκφραση του CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ CD127

-. φαινότυπος συνδυάζεται με

in vitro

κατασταλτική ικανότητα και την ικανότητα να επάγει την έκφραση LAP υποδεικνύουν έντονα ότι τα κύτταρα που αναλύθηκαν εδώ είναι λειτουργικά Treg παρά ενεργοποιηθεί Teff που έχουν προσωρινά επάνω ρυθμισμένη έκφραση FoxP3

κάτω ρύθμιση των CD3 με Treg εξαρτάται από τη συγκέντρωση του πεπτιδίου

σε αυτή τη μελέτη, κάτω-ρύθμιση της επιφάνειας CD3 χρησιμοποιείται ως δείκτης αντιγόνου-ειδική ενεργοποίηση των Tregs μέσω του TCR. Έτσι, η έκταση του CD3 ρύθμιση προς τα κάτω θα πρέπει να αναμένεται ότι εξαρτάται αυστηρά από την συγκέντρωση πεπτιδίου. Για να επιβεβαιωθεί αυτό, το πεπτίδιο μελέτες τιτλοποίησης πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση PBMC από 4 διαφορετικούς ασθενείς. Για κάθε ασθενή, δύο πεπτίδια ελέγχθηκαν, οι οποίες επελέγησαν με βάση τα πειράματα προκαταρκτική διαλογή όπως είναι σε θέση να επάγουν μια απόκριση CD3 ρύθμιση προς τα κάτω κατά 1 × 10

-4M. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, υπήρχε μία σαφής σχέση δόσης-εξαρτώμενη μεταξύ του ποσοστού των CD3-χαμηλό Treg και τη συγκέντρωση του πεπτιδίου που χρησιμοποιήθηκε για την εκ νέου διέγερση. Ένας αριθμός αυτών των απαντήσεων θα μπορούσε να τιτλοποιηθεί προς τα κάτω σε 1 × 10

-7M πεπτίδιο, το οποίο είναι συγκρίσιμο με αρκετές περιγράφηκε προηγουμένως CD4

+ απαντήσεις Teff να NY-ESO-1 πεπτίδια [5], [34]. Είναι επίσης σημαντικό να σημειωθεί ότι τα πεπτίδια 18μερές που χρησιμοποιούνται εδώ πιθανό δεν συνιστούν τη βέλτιστη επίτοπο για αναγνώριση Τ κυττάρων, στην οποία περίπτωση ανιχνεύθηκε η απόκριση όταν η συγκέντρωση του πεπτιδίου καθίσταται περιοριστικό μπορεί να είναι μια σημαντική υποεκτίμηση.

PBMC από τέσσερα ασθενείς καλλιεργήθηκαν για 21d με ΝΥ-ΕδΟ-1 18μερές πεπτιδίων και στη συνέχεια εκ νέου διεγείρονται όλη τη νύκτα με ξεχωριστά πεπτίδια στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Το ποσοστό των Treg τα κάτω ρύθμιση CD3 σε απόκριση πεπτιδίου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής.

Η

NY-ESO-1-ειδικά Treg συχνά ανιχνεύονται στο αίμα ασθενών με μελάνωμα προχωρημένου σταδίου και μπορεί να είναι επεκτάθηκε από το NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

εμβόλιο TM

Μια ομάδα από εννέα ασθενείς με προχωρημένο μελάνωμα σαρώθηκε για ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά Treg, τόσο πριν όσο και 42 ημέρες μετά τον εμβολιασμό με ΝΥ -ESO-1 /ISCOMATRIX

TM. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο Σχήμα 4Α. Μετά τον εμβολιασμό, όλοι οι ασθενείς είχαν Treg αποκρίσεις ειδικές για τουλάχιστον μία περιοχή της πρωτεΐνης ΝΥ-ΕδΟ-1? αρκετές έπρεπε αποκρίσεις σε δύο ή τρεις διακριτές περιοχές. Εντυπωσιακά, η σύγκριση με τα δείγματα πριν τον εμβολιασμό αποκάλυψαν ότι πολλές από αυτές τις αποκρίσεις που επάγονται από το εμβόλιο, όπως ήταν μη ανιχνεύσιμα πριν από τον εμβολιασμό. Ένα παράδειγμα μίας τέτοιας απόκρισης δείχνεται στο Σχήμα 4Β. Επιπλέον, ορισμένες αντιδράσεις που ήταν ανιχνεύσιμα πριν τον εμβολιασμό φαίνεται να ενισχύεται από το εμβόλιο (που ορίζεται ως & gt? Αύξηση κατά 2-φορές σε αποκριτικά κύτταρα μετά από τον εμβολιασμό, όταν τα δύο δείγματα συγκρίθηκαν παράλληλα υπό τις ίδιες συνθήκες). Για παράδειγμα, στη ασθενούς 120, η συχνότητα των Treg ειδικών στο πεπτίδιο NY-ESO-1

37-54 ήταν 4,4% πριν από τον εμβολιασμό, αλλά 18,3% μετά τον εμβολιασμό, και η συχνότητα των Treg ειδικών στο πεπτίδιο NY-ESO-1

79-96 ήταν 3,3% πριν από τον εμβολιασμό και 16,3% μετά τον εμβολιασμό

(

A

):. για κάθε ασθενή μέσα στην ομάδα, κάθε επικυρωμένη απάντηση Treg συνοψίζεται με ένα κουτί. Οι απαντήσεις θεωρούνται επικυρώνονται εάν παρατηρήθηκαν σε τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες καλλιέργειες, χρησιμοποιώντας δύο ανεξάρτητα συντίθενται παρτίδες πεπτιδίου. Η θέση του κουτιού υποδεικνύει όπου στην αλληλουχία πεπτιδίου ΝΥ-ΕδΟ-1 ήταν εντοπισμένη η απόκριση. Σε περίπτωση που αποκρίσεις ανιχνεύθηκαν σε δύο πεπτίδια γειτονικά στη σειρά, αυτό φαίνεται ως ένα ενιαίο απάντηση που χωρίζει αυτές τις δύο πεπτίδια. Σκίαση πλαίσια δείχνουν ότι το μέγεθος της απόκρισης αυξήθηκε τουλάχιστον κατά 2 φορές σε δείγματα μετά τον εμβολιασμό σε σύγκριση με τα δείγματα προ του εμβολιασμού όταν και οι δύο δείγματα ελέγχθηκαν παραλλήλως υπό τις ίδιες συνθήκες. Στερεά κουτιά υποδεικνύουν ότι η απόκριση ήταν ανιχνεύσιμη μόνο σε δείγματα που συλλέχθηκαν μετά τον εμβολιασμό. Ανοίξτε κουτιά υποδεικνύουν ότι το μέγεθος της ανταπόκρισης ήταν παρόμοια πριν και μετά τον εμβολιασμό. (

B

): Ένα παράδειγμα μιας απόκρισης που προκλήθηκε με τον εμβολιασμό (Ασθενής 124) παρουσιάζεται. Treg ήταν περιφραγμένη με βάση την έκφραση CD25 και FoxP3, και CD3 κάτω ρύθμιση αξιολογήθηκε μετά από εκ νέου διέγερση είτε με το πεπτίδιο ελέγχου ή το ίδιο πεπτίδιο που χρησιμοποιείται για την επέκταση (NY-ESO-1

85-102).

Treg και Teff ανταποκριθεί σε μια πανομοιότυπη επιτόπου στην περιοχή NY-ESO-1

157-170

Εικόνα 4Α δείχνει ότι Treg αντιδράσεις ήταν πιο συχνά εμφανίζονται προς το πεπτίδιο NY- ESO-1

157-174, με Tregs ειδικά για αυτό το πεπτίδιο 18 μερές ανιχνεύσιμη στο 5/9 των ασθενών που εξετάστηκαν. Η περιοχή αυτή περιέχει ένα επίτοπο (NY-ESO-1

157-170) που έχει προηγουμένως χαρακτηριστεί για Teff [35], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι θα μπορούσε να Treg ανταποκρίνεται προς τον ίδιο επίτοπο. Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, δύο ασθενείς (102 και 103) ταυτοποιήθηκαν οι οποίοι είχαν απαντήσεις στην NY-ESO-1

157-174 πεπτιδίου σε αμφότερες τις υποομάδες Treg και Teff, και η ικανότητα αυτών των κυττάρων να ανταποκρίνονται προς την δημοσιευθείσα επίτοπο (NY-ESO-1

157-170) ή διάφορες παραλλαγές κολοβώσεως ή επέκταση, αξιολογήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, αμφότερα Treg (αριστερά πάνελ) και Teff (δεξιά πάνελ) ανταποκρίθηκαν στο ΝΥ-ESO-1

157-170 πεπτίδιο. Η αποκοπή του είτε 1 ή 2 ΑΑ από το Ν-άκρο, ή 1 αα από το C-τελικό άκρο, είχε μικρή επίδραση σε αυτές τις αντιδράσεις. Ωστόσο, και οι δύο πληθυσμοί έδειξαν πολύ μειωμένη ανταπόκριση ακόλουθη περικοπή του 2 ΑΑ από το Ο-άκρο (πεπτίδιο NY-ESO-1

157-168). Ομοίως, η επέκταση της κεντρικής αλληλουχίας με 1 αα είτε στο C ή Ν άκρο μείωσε επίσης την ανταπόκριση εντός δύο πληθυσμούς.

PBMC των ασθενών καλλιεργήθηκαν για 21δ με το πεπτίδιο 18μερές NY-ESO-1

157- 174 και, στη συνέχεια, επαναδιεγείρονται με τις υποδεικνυόμενες σύντομο HPLC-καθαρισμένα πεπτίδια είτε με την προσθήκη απ ‘ευθείας στην καλλιέργεια ως συνήθως (

A-D

) ή με παλμική επάνω σε BCL που ακολουθείται από έκπλυση (

Ε-Ρ

). Μετά από ολονύκτια επώαση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, μέσω πύλης για Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+?

Α, C και Ε

) ή Teff (CD4

+ FoxP3

-?

Β, D και F

). Τα πεπτίδια που χρησιμοποιούνται για την εκ νέου διέγερση έγιναν με βάση την δημοσιευμένη επίτοπο NY-ESO-1

157-170, είτε με κολόβωση (

Α-Β

) ή επέκταση (

C-D

) σε κάθε άκρο. Γραφήματα σε

A-D

δείχνουν τα αποτελέσματα που λαμβάνονται για τον Ασθενή 102? παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για Ασθενών 103. Γραφικά στο

E-F

show σημαίνει + SEM από ασθενείς 102 και 113? αστερίσκος υποδηλώνει τιμή AP & lt?. 0.05 (t-test)

Η

Η περιγράφηκε προηγουμένως NY-ESO-1

157-170 επιτόπου έχει αποδειχθεί να περιορίζεται από την κλάση HLA-DP4 II αλληλόμορφο [35], και μοριακή τυποποίηση αποκάλυψε ότι οι ασθενείς που ελέγχθηκαν στο Σχήμα 5 εξέφρασε την HLA-DPB1 * 0401 μόριο. Για να επιβεβαιωθεί ότι Tregs ανταποκρίθηκε επίσης σε αυτό τον επίτοπο όταν παρουσιάστηκε στο HLA-DP4, ένα πάνελ ΕΒν μετασχηματισμένα Β κυτταρικές γραμμές (BCL) δονήθηκε με το NY-ESO-1

157-170 πεπτίδιο, πλύθηκαν και δοκιμάστηκαν για την ικανότητα να επάγουν CD3 κάτω ρύθμιση σε Treg και Teff κύτταρα (Σχ 5Ε-F). Μια έκφραση που στερούνται DP4 BCL (9902) απέτυχε να προκαλέσει CD3 κάτω ρύθμιση είτε του πληθυσμού, ενώ ένα BCL που εκφράζουν HLA-DPB 1 * 0401 (γραμμή 9004) προκάλεσε σημαντική ανταπόκριση και στους δύο πληθυσμούς. Έτσι, το NY-ESO-1

157-170 πεπτίδιο παρουσιάζεται τόσο Treg και Teff επί HLA-ϋΡ4.

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η ελάχιστη αλληλουχία του περιγράφηκε προηγουμένως NY-ESO- 1

157-170 επιτόπου [35] θα μπορούσε να αναθεωρηθεί προς NY-ESO-1

159-170, ή ενδεχομένως ακόμα και να NY-ESO-1

159-169, αν και αυτό ακριβώς το πεπτίδιο δεν ελέγχθηκε σε δοκιμασίες μας. Το πιο σημαντικό, ωστόσο, τα δεδομένα καταδεικνύουν ότι Treg και Teff ανταποκρίνονται ακριβώς στο ίδιο επιτόπιο, και στις δύο περιπτώσεις, αυτή η απόκριση περιορίζεται από HLA-ϋΡ4.

NY-ESO-1-ειδικά Treg επικρατούν εντός καρκινικό ιστό

Για να προσδιοριστεί εάν NY-ESO-1-ειδικά Treg μπορεί να ανιχνευθεί εντός του όγκου, καθώς και το αίμα, φρέσκο ​​ιστό του όγκου ελήφθη από ασθενής 126 μετά από τρεις γύρους του εμβολιασμού με ΝΥ-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM και ένα εναιώρημα απλού κυττάρου που δημιουργούνται. Το προκύπτον μίγμα των καρκινικών κυττάρων και στρωματικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των TIL, καλλιεργήθηκε με την παρουσία του υψηλής δόσης IL-2, αλλά χωρίς την προσθήκη οποιουδήποτε εξωγενούς πεπτιδίου, αντιγόνου ή μιτογόνο. Διευρυμένη TIL διεγέρθηκαν όλη τη νύκτα με πεπτίδια NY-ESO-1

85-102 και ΝΥ-ΕδΟ-1

115-132 (δύο εκ των οποίων επάγεται αποκρίσεων στο περιφερικό αίμα Treg από αυτόν τον ασθενή) και αξιολογήθηκαν για CD3 κατάντη κανονισμός. Επιπλέον, ένα δείγμα του όγκου πέψης αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής πριν την καλλιέργεια, η οποία αποκάλυψε ότι 41,1% των CD4

+ Τ κύτταρα εντός του όγκου είχε ένα φαινότυπο Treg, αντιπροσωπεύοντας περίπου το 10-πλάσιο εμπλουτισμό σε συχνότητες στην αίματος (δεν φαίνεται).

Peptide NY-ESO-1

85-102 απέτυχε να διεγείρει οποιαδήποτε αναπαραγώγιμα αποκρίσεις είτε Treg ή Teff εντός TIL. Από την άλλη πλευρά, το πεπτίδιο NY-ESO-1

115 έως 132 διήγειρε ευκόλως ανιχνεύσιμη απόκριση από κύτταρα Teff εντός της διευρυμένης TIL (Σχήμα 6Α). Εντυπωσιακά, το μέγεθος της ανταπόκρισης στην ίδια πεπτιδίου ήταν ~ 4-φορές υψηλότερη στον πληθυσμό Treg, με & gt? Το 40% των Treg τα κάτω ρύθμιση CD3 σε απόκριση σε αυτό το πεπτίδιο. Για να αποδειχθεί η αναπαραγωγιμότητα της διαφοράς αυτής, τρεις ανεξάρτητες γραμμές TIL δημιουργήθηκαν από παγωμένα υποπολλαπλάσια των ίδιων δείγμα όγκου, και κάθε γραμμή δοκιμάστηκε 1-3 φορές. Σε κάθε ανάλυση, η αναλογία των κυττάρων που ανταποκρίνονται στο ΝΥ-ESO-1

115 – 132 πεπτιδίου ήταν πάντοτε υψηλότερη εντός του πληθυσμού Treg από τον πληθυσμό Teff, με μέση φορές διαφορά του 3,1 (Σχ 6Β). Η προ-επώαση με ένα αντίσωμα μπλοκαρίσματος σε HLA-DR σχεδόν πλήρως ανέστειλε τόσο το Treg και Teff αποκρίσεις σε αυτό το πεπτίδιο, ενώ αντισώματα αποκλεισμού σε HLA-DP ή HLA-DQ δεν είχε καμία επίδραση, υποδεικνύοντας ότι η απάντηση εντός δύο πληθυσμούς ήταν περιορισμένη από HLA -DR (Σχήμα 6C).

όγκου ιστός ελήφθη από ασθενούς 126 και TIL σειρές που δημιουργούνται όπως περιγράφεται στο

Μέθοδοι

. (

Α-Β

): Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί μία νύκτα με πεπτίδιο NY-ESO-1

115 – 132 ή τον έλεγχο του πεπτιδίου, και στη συνέχεια χρωματίζονται και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής, μέσω πύλης επί Treg (CD4

+ CD25

+ FoxP3

+) ή Teff (CD4

+ FoxP3

-) όπως υποδεικνύεται. Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής οικόπεδα τελεία (Α) δείχνουν την περίφραξη των Treg και Teff, καθώς και την απάντηση CD3 κάτω ρύθμιση που παρατηρείται σε κάθε πληθυσμό μετά από εκ νέου διέγερση, ενώ η (Β) δείχνει μια σύνοψη των αποτελεσμάτων που λαμβάνονται σε πέντε πειράματα, το καθένα χρησιμοποιώντας μία από οι τρεις διαφορετικές γραμμές ΤΙΤ δημιουργείται. (

C

): Η επίδραση των δεσμευτικών αντισωμάτων σε HLA-DR, HLA-DP ή HLA-DQ στην απόκριση προς το πεπτίδιο NY-ESO-1

115-132 μέσα Treg (αριστερά) και Teff (δεξιά) πληθυσμούς. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ένα δεύτερο πείραμα. (

C

): ΤΙΤ διεγείρονται όλη τη νύκτα με NY-ESO-1

115-132 πεπτίδιο και στη συνέχεια το πεπτίδιο συγκεκριμένο (CD3

lo) και μη-ειδικά (CD3

hi) Treg (CD4

+ CD127

lo CD25

hi) καθαρίστηκαν με διαλογή κυττάρων και εξετάστηκαν για την ικανότητά τους να καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των CFSE-επισημασμένου CD8

+ Τ κύτταρα προ-διεγερμένα για 4 ώρες με αντι- CD3 στο υποδεικνύεται Treg: αναλογίες ανταπόκρισης. Ως σύγκριση, Treg επίσης διαλέγεται από προηγουμένως κατεψυγμένου PBMC που λαμβάνονται από ένα υγιή δότη. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν σε ένα δεύτερο πείραμα, αν και υψηλότερες Treg:. Αναλογίες ανταπόκρισης ήταν υποχρεωμένοι να δούμε την καταστολή

Η

Στο Σχήμα 2, αποδείξαμε ότι χύμα Treg απομονώθηκε από καλλιέργειες 21 ημερών κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό CD8

+ Τ κύτταρα. Ωστόσο, ήταν επίσης ενδιαφέρον να επιβεβαιώσει ότι NY-ESO-1-ειδικά Treg είχε μια παρόμοια δραστηριότητα. Διευρυμένη TIL από Ασθενής 126 διεγέρθηκαν με ΝΥ-ΕδΟ-1

115-132 πεπτίδιο τη διάρκεια της νύχτας για να επάγει CD3 κάτω ρύθμιση και του πεπτιδίου-ειδική Treg στη συνέχεια ταξινομούνται βάσει ενός CD4

+ CD25

+ CD127

– CD3

χαμηλό φαινότυπο και δοκιμάζονται σε μία δοκιμασία καταστολής. Αυτά τα κύτταρα κατέστειλαν πολλαπλασιασμό των αντι-CD3 διεγερμένα

+ Τ κύτταρα CD8 από υγιή δότη σε παρόμοια έκταση, όπως χύμα Treg απομονώθηκε από ένα υγιή δότη (Σχήμα 6D). Είναι ενδιαφέρον, CD3

hi Tregs ταξινομημένο από τη γραμμή TIL (δηλαδή, Treg που είχε αποτύχει να ανταποκριθεί στο πεπτίδιο διέγερσης) και κατέστειλε CD8

+ Τ κυτταρικού πολλαπλασιασμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα τελευταία διέγερση με αντιγόνο δεν ήταν απαραίτητη για την απόκτηση των κατασταλτικών λειτουργία με αυτά τα κύτταρα. Ενδεχομένως, η παρουσία των κυττάρων όγκου κατά την διάρκεια εγκατάστασης της γραμμής TIL ενεργοποιείται Tregs ειδικά για μια ευρεία ποικιλία όγκων αντιγονικών επιτόπων, και αυτή η ενεργοποιημένη κατάσταση διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της επέκτασης, επιτρέποντας έτσι Treg με μια ποικιλία από ειδικότητες αντιγόνου να ασκούν κατασταλτική δραστηριότητα.

Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι ο ιστός του όγκου από τον ασθενή 126 περιλαμβάνει μια εξέχουσα πληθυσμό Treg ειδικό για ένα HLA-DR-περιορισμένο επίτοπο εντός της NY-ESO-1

115-132 πεπτίδιο. Επιπλέον, Treg ειδικά για αυτό το επιτόπιο μπορεί να καταστείλει CD8

πολλαπλασιασμός + Τ κυττάρων και είναι επομένως πλήρως λειτουργικά. χρώση Ανοσοϊστοχημεία του καρκινικού ιστού αποκάλυψε ότι κύτταρα όγκου ακόμη εξέφρασαν υψηλά επίπεδα του ΝΥ-ΕδΟ-1 σε αυτό το χρονικό διάστημα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), υποδεικνύοντας ότι ο ιστός-κάτοικος NY-ESO-1-ειδικά Treg μπορούν να ενεργοποιούνται τοπικά.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, έχουν χρησιμοποιήσει μια νέα προσέγγιση που επιτρέπει την αμερόληπτη ταυτοποίηση των Treg ειδικά για κάθε επιτόπιο μέσα σε ένα δεδομένο αντιγόνο όγκου. Έχουμε αποδείξει ότι η ΝΥ-ΕδΟ-1-ειδικά Treg είναι πολύ συχνές στο αίμα των ασθενών με τελικού σταδίου μελάνωμα, όπως ήταν ανιχνεύσιμα σε 9/9 ασθενείς που εξετάστηκαν. Επιπλέον, σε έξι από αυτούς τους εννέα ασθενείς, το NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

εμβόλιο TM, είτε προκαλείται από τουλάχιστον μια νέα απάντηση που δεν ήταν ανιχνεύσιμη πριν από τον εμβολιασμό ή ενίσχυσε τις προϋπάρχουσες απαντήσεις.

Λόγω της σπανιότητας του όγκου αντιγόνου-ειδικών Τ κυττάρων (συμπεριλαμβανομένων των Treg) στο αίμα, ήταν απαραίτητο να επεκταθεί αυτά τα κύτταρα in vitro με αντιγόνο. Αυτό το στάδιο της καλλιέργειας μπορεί να προκάλεσε μια προσωρινή ανιούσα ρύθμιση των CD25 και FoxP3 σε κύτταρα Teff, όπως έχει αναφερθεί προηγουμένως [27] – [30], και αυτά τα κύτταρα θα μπορούσε θεωρητικά να ήταν λάθος για Treg. Ωστόσο, αρκετές σειρές αποδείξεων υποδεικνύουν έντονα ότι αυτό δεν είναι η περίπτωση. Πρώτον, αυτά τα κύτταρα κατέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των CD8

+ Τ κύτταρα, όταν αξιολογούνται ως είτε χύδην πληθυσμού (Σχήμα 2) ή απομονώνεται σύμφωνα με ΝΥ-ΕδΟ-1 ειδικότητα (Σχήμα 6). Δεύτερον, εξέφρασαν χαμηλά έως μη ανιχνεύσιμα επίπεδα έκφρασης CD127. Τρίτον, up-ρυθμιζόμενη LAP μετά την ενεργοποίηση με το συγγενές πεπτίδιο. Τέλος, οι πληθυσμοί Treg και Teff σε μεμονωμένους ασθενείς μερικές φορές αναγνωρίζονται διακριτά επιτόπια (όπως στο παράδειγμα που φαίνεται στο Σχήμα 1), παρέχοντας απόδειξη ότι αυτά είναι διακριτές πληθυσμούς, και το Treg δεν ήταν απλώς παράγεται από μετατροπή από Teff αναγνωρίζοντας τον ίδιο επίτοπο. Το συμπέρασμά μας ότι CD4

+ CD25

+ FoxP3

+ κύτταρα που υπάρχουν σε καλλιέργειες 21 ημερών είναι Treg και δεν ενεργοποιείται Teff είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που δείχνουν ότι η απόκτηση αυτών των δεικτών με Teff είναι προσωρινή, και έκφραση είναι σε μεγάλο βαθμό χάνεται κατά την ημέρα 10 της καλλιέργειας [12], [27], [28], [30]. Αξίζει να σημειωθεί ότι δύο προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης εντοπιστεί NY-ESO-1-ειδικά Treg στο αίμα των ασθενών με μελάνωμα χρήση εναλλακτικών προσεγγίσεων, υποστηρίζοντας περαιτέρω τα ευρήματά μας [12], [24].

Οι απαντήσεις Treg ανιχνεύθηκαν σε μελέτη μας καλύπτουν ένα μεγάλο τμήμα της πρωτεΐνης ΝΥ-ΕδΟ-1. Αν και λεπτομερή χαρακτηρισμό του καθενός από αυτά τα επίτοπα είναι πέρα ​​από το πεδίο εφαρμογής της παρούσας μελέτης, θα μπορούσαμε να επιβεβαιώσει ότι η συχνά ανιχνεύεται απόκριση Treg στο πεπτίδιο 18μερές NY-ESO-1

157-174 οφειλόταν στην αναγνώριση του προηγουμένως περιγράφεται DP4- περιορίζεται ανοσοκυρίαρχο NY-ESO-1

157-170 επίτοπο. Έτσι, έχουμε δείξει σαφώς ότι Treg και Teff μπορεί να αναγνωρίσει την ίδια ακριβώς ελάχιστο επιτόπιο που παρουσιάζονται στο ίδιο αλληλόμορφο HLA. Αυτό με τη σειρά του υποδηλώνει ότι η ανθρώπινη Treg και Teff μοιράζονται τουλάχιστον εν μέρει επικαλυπτόμενες ρεπερτόρια TCR, η οποία είναι σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες σε ανθρώπους [36] και ποντίκια [37]. Από την άλλη πλευρά, μια από τις απαντήσεις Treg ανιχνεύεται εδώ (εντός της περιοχής NY-ESO-1

49-72) δεν περιέχει οποιοδήποτε περιγράφηκε προηγουμένως επίτοπα Teff (βλέπε https://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase) και αυτή η απόκριση δεν ανιχνεύθηκε εντός του πληθυσμού Teff σε αυτόν τον ασθενή (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Έτσι, αυτή η ειδικότητα μπορεί να είναι μοναδική για τον πληθυσμό Treg.

Είναι ακόμα ένα θέμα συζήτησης το αν Treg μεσολαβούν κατασταλτικές επιδράσεις τους κυρίως στη δευτερογενή λεμφικά όργανα, σε τοπικούς χώρους στην περιφέρεια (όπως καρκινικού ιστού) ή, πιο πιθανό, ένας συνδυασμός και των δύο. Για πρακτικούς λόγους, αξιολογήσαμε NY-ESO-1-ειδικών αποκρίσεων Treg κυρίως στο αίμα, η οποία θα πρέπει να αντανακλά τα κύτταρα που κυκλοφορεί μέσω δευτερογενών λεμφοειδών οργάνων. Ωστόσο, για Ασθενών 126, θα μπορούσαμε να αποκτήσει επιπλέον φρέσκο ​​ιστό όγκου και αποδεικνύουν ότι Treg ειδικό για ένα HLA-DR-περιορισμένο επίτοπο εντός πεπτιδίου ΝΥ-ΕδΟ-1

115-132 δεν ήταν παρούσες μόνο εντός του αίματος αλλά ήταν επίσης παρόντες σε υψηλή συχνότητα εντός του όγκου. Αυτά NY-ESO-1

115 – 132-ειδικό Treg ήταν πλήρως λειτουργικά, καθώς κατέστειλε CD8

+ Τ κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Λαμβάνοντας υπόψη ότι Ασθενής 126 εκφράζει το HLA-DRB1 * 04 αλληλόμορφο, αυτή η απόκριση είναι πιθανόν να κατευθύνεται προς την προηγουμένως περιγραφείσα DR4-περιορισμένο NY-ESO-1

121-130 επίτοπο [34].