Αφηρημένο

Επιγενετική ρύθμιση των γονιδίων περιλαμβάνει το συντονισμό της μεθυλίωσης του DNA και των ιστονών τροποποιήσεις για τη διατήρηση της μεταγραφής κατάσταση. Αυτά τα δύο χαρακτηριστικά είναι συχνά διαταράσσεται σε κακοήθεια, έτσι ώστε κρίσιμα γονίδια υποκύψει σε αδρανοποίηση. 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) είναι ένας παράγοντας που αναστέλλει την DNA μεθυλοτρανσφεράση, και κατέχει μεγάλες δυνατότητες ως θεραπεία για τον καρκίνο, αλλά ο βαθμός της αποτελεσματικότητας της ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των διαφόρων τύπων όγκου. Προηγούμενο στοιχεία δείχνουν την κατάσταση έκφρασης μετά από έκθεση 5-αζα-DC δεν μπορεί να εξηγηθεί από την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA και μόνο. ​​

Στόχος

Εμείς προσπάθησε να εντοπίσει τις αλλαγές της χρωματίνης που ασχολούνται με βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα γονίδιο επανενεργοποίηση παρακάτω 5-αζα-dC έκθεση. Δύο ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, HCT116 και SW480, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-DC και στη συνέχεια αναπτύσσονται σε μέσα χωρίς φάρμακο για να επιτρέψει την εκ νέου DNA μεθυλίωση. μεθυλίωσης του DNA και της χρωματίνης τροποποιήσεις αξιολογήθηκαν με όξινο θειώδες αλληλούχιση και ανάλυση χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση.

Αποτελέσματα

Αυξημένη Η3 ακετυλίωση, H3K4 τρι-μεθυλίωση και απώλεια H3K27 τρι-μεθυλίωση συνδέθηκαν με επανενεργοποίηση. Υπερμεθυλίωση γονίδια που δεν δείχνουν αυξημένη ακετυλίωση εκφράστηκαν παροδικά με 5-αζα-dC επεξεργασία πριν επανέλθει σε μια ανενεργή κατάσταση. Τρεις επανενεργοποιηθεί γονίδια, CDO1, HSPC105 και MAGEA3, εξακολουθούσαν να εκφράζεται 10 ημέρες μετά την 5-αζα-dC θεραπεία και εμφανίζεται εντοπισμένο υπομεθυλίωση στη θέση έναρξης της μεταγραφής, καθώς και αυξημένο εμπλουτισμό των ιστονών Η3 ακετυλίωση.

Συμπεράσματα

αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η υπομεθυλίωση μόνη της δεν επαρκεί για να ενεργοποιήσετε σιγήσει γονίδια και ότι η αυξημένη ακετυλίωση της ιστόνης Η3 σε αρμονία με την τοπική υπομεθυλίωση επιτρέπει μακροχρόνια αναστροφή αυτών των επιγενετικώς σιγήσει γονίδια. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι το συνδυασμένο αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης DNA και αποακετυλασών των ιστονών μπορεί να βοηθήσει μακροπρόθεσμα την επανενεργοποίηση της σιγήσει γονιδίων

Παράθεση:. Mossman D, Scott RJ (2011) Long Term Μεταγραφική επανενεργοποίηση επιγενετικώς κατασιγασμένου γονιδίων στα κύτταρα του καρκίνου του παχέος Απαιτεί DNA υπομεθυλίωση και ακετυλίωση ιστονών. PLoS ONE 6 (8): e23127. doi: 10.1371 /journal.pone.0023127

Επιμέλεια: Μιχαήλ Freitag, το Πανεπιστήμιο του Όρεγκον, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Δεκέμβρη 2010? Αποδεκτές: 12 του Ιούλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 4 Αυγούστου 2011

Copyright: © 2011 Mossman, Scott. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τα ταμεία της από το NBN Telethon, το Πανεπιστήμιο του Newcastle και Hunter Ιατρικό Ινστιτούτο Έρευνας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει περίπου 3 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων του DNA [1] που απαιτούν στρατηγική συσκευασία σε ένα συμπαγές, αλλά και δυναμική δομή. Η συμπύκνωση επιτυγχάνεται με την supercoiling του ~147 bp DNA γύρω από ένα οκταμερές πρωτεϊνών ιστόνης (δύο αντίγραφα κάθε Η2Α, Η2Β, Η3 και Η4) για το σχηματισμό ενός νουκλεοσώματος [2], η οποία παρεμποδίζει την τυχαία γονιδιακή έκφραση και αυξάνει την εξάρτηση των μεταγραφικών ενεργοποιητών [ ,,,0],3]. Μεταγραφική καταστολή μπορεί να διαμεσολαβείται από μεθυλίωση του DNA και υποβοηθείται από εκτεταμένες τροποποιήσεις σε άκρως συντηρημένα κατάλοιπα λυσίνης στις ουρές των πρωτεϊνών ιστόνης. Λυσίνη ακετυλίωση διευκολύνει τη μεταγραφή αποδυναμώνοντας τη σύνδεση της ιστόνης και δέσμευσης του DNA [4] και επιτρέπει μεταγραφικού παράγοντα [5]. Λυσίνη μεθυλίωση είναι πιο πολύπλοκη και μπορεί να συνδέεται με τα δύο ενεργά και καταπιεσμένη περιοχές του DNA, και μπορεί να υπάρχει σε μονο-, δι-, και τρι-μεθυλιωμένα μορφές [6]. Για παράδειγμα, trimethylation ιστόνης H3 λυσίνη 4 (H3K4me3) είναι ένα ενεργό σήμα [7], ενώ η μεθυλίωση του H3K9 και H3K27 εμφανίζεται σε μεταγραφικά σιωπηλή υποστηρικτές γονίδιο [7], [8].

Η ανώμαλη επιγενετική αποσιώπηση γονιδίων μπορεί να ξεκινήσει κακοήθεια και εμφανίζεται συχνά εκτός από γενετικές αλλοιώσεις, συμβάλλοντας στην εξέλιξη της νόσου σε διάφορες μορφές καρκίνου [9], [10], [11]. Επιπλέον, παρεκκλίνουσα υπομεθυλίωση του πρωτο-ογκογονιδίων μπορεί να οδηγήσει σε ενεργοποίηση τους [12], [13] Μειωμένη έκφραση πολλών γονιδίων λόγω επιγενετικών σίγηση συσχετίζεται με κακή πρόγνωση σε πολλές μορφές κακοήθειας όπως του πνεύμονα [14], το μελάνωμα [15] , του μαστού [16], γαστρικό [17] και του παχέος εντέρου [18]. Σπάνιες περιπτώσεις Soma-μεγάλη μονο-αλληλομόρφων μεθυλίωση του MLH1 έχει αποδειχθεί ότι προκύπτουν μέσω μετάδοσης βλαστικής γραμμής [19]. Επιπλέον, κληρονομικές παραλλαγές αριθμού αντιγράφων μπορεί να οδηγήσει σε μεταγραφική διαβάσετε και IN-

cis

μεθυλίωση όταν δίπλα σε βασικά γονίδια [20]. Οι μηχανισμοί αυτοί προσφέρουν μια εξήγηση του γιατί κάποιες οικογένειες βρίσκονται σε υψηλότερο κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου, παρά να μην μεταφέρουν μια υποκείμενη γενετική μετάλλαξη των γονιδίων ζωτικής σημασίας. Τα άτομα μέσα σε αυτές τις οικογένειες θα μπορούσαν να ωφεληθούν από την έγκαιρη ανίχνευση της ανώμαλης επιγενετικών σημάτων γονιδίων που προσδίδουν αυξημένο κίνδυνο μιας συγκεκριμένης ασθένειας. Με μια αυξανόμενη συνειδητοποίηση των επιγενετικών ανωμαλιών στη νόσο, αντιμετώπιση αυτών των αλλαγών με αναστολείς μεθυλτρανσφεράσης όπως 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC) φαίνεται να είναι ένα δυνητικά αποτελεσματική θεραπεία. Στην πραγματικότητα, αυτή η θεραπεία δεν είναι αποτελεσματική σε μια συγκεκριμένη ομάδα τύπων όγκου [21], η οποία μπορεί να οφείλεται σε επανενεργοποιηθεί γονίδια επιστροφή σε μια σιωπή κατάσταση μετά τη διακοπή της θεραπείας.

Έχουμε προσδιορίσει προηγουμένως την επανενεργοποίηση των πολυάριθμων γονιδίων σε ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές μετά από αγωγή με τον παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-άΟ [22]. Μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου και δέκα ημερών της ανάπτυξης, κάποια από αυτά τα γονίδια παρέμεινε υψηλής έκφρασης, γεγονός που υποδηλώνει μια αντιστροφή της μεταγραφικής κατάστασης αυτών των γονιδίων. Αν και μειώνεται κατά 5-αζα-dC, οι αλλαγές στο DNA μεθυλίωση δεν συσχετίζονται με τα επίπεδα της έκφρασης στην ομάδα των γονιδίων που αναλύθηκαν, υποδεικνύοντας άλλες επιγενετικές τροποποιήσεις έλεγχο της μεταγραφής. Τα γονίδια που επιλέγονται για ανάλυση εξετάστηκαν λόγω της εμπλοκής τους σε μια ποικιλία τύπων όγκου και πιθανή χρήση ως βιοδείκτες σε αυτούς τους όγκους [23], [24], [25], και /ή λόγω ισχυρών επανέκφραση και πρότυπο τους γονιδιακή έκφραση ακόλουθες 5-αζα-dC σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα [22]. CDKN2A επιλέχθηκε ειδικά δεδομένου ότι συχνά καταστέλλεται σε όγκους παχέος εντέρου καρκίνο [26]. Αυτά τα γονίδια μπορεί να αντιπροσωπεύουν σημαντικό γονίδια στο επιγενετικές ανάπτυξη ενός αριθμού τύπων όγκου. Σε αυτή τη μελέτη έχουμε χαρακτήρισε τις αλλαγές της μεθυλίωσης του DNA και της χρωματίνης κράτος που επιτρέπουν είτε για μακροχρόνια ή βραχυπρόθεσμη επανενεργοποίηση της έκφρασης μετά από έκθεση 5-αζα-DC.

Μέθοδοι

Cell Culture

τριπλότυπων καλλιεργειών HCT116 και SW480 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ μέσο συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) στους 37 ° C και 5% CO

2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Sigma-Aldrich), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. DNA και RNA εκχυλίστηκαν από μη επεξεργασμένα κύτταρα, 5-αζα-dC επεξεργασμένα κύτταρα (72 ώρες της θεραπείας), και στις 4 και 10 ημέρες μετά την διακοπή της θεραπείας (Ημέρα 4 και 10 του νέου μεθυλίωση). Τα κύτταρα αρχικά ελήφθησαν από την ATCC και επικυρώνονται χρησιμοποιώντας το κιτ Identifiler DNA αναγνώρισης (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Παγκόσμια μεθυλίωση

Παγκόσμια μεθυλίωση ήταν αξιολογείται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Εν συντομία, 50 μα ΟΝΑ ενζυματικώς πέψη με νουκλεάση Ρ1 (US Biological, Swampscott, MA, USA) που ακολουθείται από χρωματογραφικό διαχωρισμό σε ένα σταθμό εργασίας Varian αστέρι χρωματογραφία με μια στήλη Supelcosil LC-18-DB (Sigma-Aldrich). Η απορροφητικότητα μετρήθηκε στα 278 nm και τα εμβαδά των κορυφών προσδιορίστηκαν ποσοτικά με το Star Reviewer Software (Varian, ΡβΙο Alto, CA, USA). Η περιεκτικότητα 5-μεθυλκυτοσίνη εκφράστηκε ως ποσοστό της συνολικής πισίνα κυτοσίνη μετά από διόρθωση για την εξαφάνιση συν-efficients.

Bisulfite αλληλουχίας

DNA μετετράπη εις διπλούν χρησιμοποιώντας ένα κιτ μετατροπής Qiagen Epitect Bisulfite ( Qiagen, Valencia, CA, USA) χρησιμοποιώντας 2 μg φαινόλης-χλωροφορμίου καθαρισμένο DNA. Δείγματα εκλούστηκαν σε 30 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος έκλουσης και ένα δείγμα αραιώθηκε 1:03 πριν από την PCR και αποθηκεύτηκε στους 4 ° C, ενώ το υπόλοιπο κλάσμα αποθηκεύθηκε στους -20 ° C. CpG νησίδες που περιβάλλει τη θέση έναρξης της μεταγραφής των γονιδίων έγιναν στόχος σε ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Οι αντιδράσεις προσδιορισμού αλληλουχίας πραγματοποιήθηκαν εις διπλούν και αναλύθηκαν σε έναν ΑΒΙ 3730 sequencer. Η ανάλυση των δεδομένων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού του σαρωτή Sequence (Applied Biosystems). Το ποσοστό μεθυλίωσης σε κάθε CpG προσδιορίστηκε διαιρώντας την κορυφή κυτοσίνη από τις συνδυασμένες ύψη των κυτοσίνης και θυμίνης κορυφές όπως περιγράφηκε προηγουμένως [27].

Real Time PCR ανάλυση της έκφρασης του γονιδίου

RNA μετατράπηκε σε cDNA χρησιμοποιώντας Superscript II (Invitrogen) και τυχαίων εκκινητών (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν χρησιμοποιώντας εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1, 2 χ SYBR Green (Applied Biosystems) σε ένα ΑΒΙ PRISM 7500 PCR μηχάνημα (Applied Biosystems). C

αξίες Τ έγινε αυτόματα από Sequence Detection Software έκδοση 1.4 και τελικούς υπολογισμούς εκφράστηκαν ως φορές διαφορές σε σύγκριση με Β-ακτίνης χρησιμοποιώντας το ΔΔC

μέθοδο Τ. Γονίδια με απαρατήρητα έκφρασης εκχωρηθεί C

T αξίας των 40. Οι ράβδοι σφάλματος στα σχήματα έκφρασης αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) και Ανάλυση

Εν συντομία, η διασύνδεση των DNA με πρωτεΐνες και κυτταρική λύση διεξήχθη χρησιμοποιώντας το EZ-Magna ChIP ένα κιτ (Upstate /Millipore) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Υπερήχηση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας 8 × κύκλους 30 δευτερολέπτων σε κύκλο λειτουργίας 60% σε παγόλουτρο και τα δείγματα ψύχεται περαιτέρω για 30 δευτερόλεπτα μεταξύ των κύκλων υπερήχησης. Χρωματίνης Διεξήχθη ανοσοκαταβύθιση όπως περιγράφεται προηγουμένως [28] με ελαφρές τροποποιήσεις. Αντισώματα αποκτήθηκαν από την Upstate (αριθμοί καταλόγου? Α-H3Ac 06-599, α-H3K4me3 07-473, α-H3K9me3 17 έως 625, α-H3K27me3 17-622) με την εξαίρεση του κουνελιού IgG μη ειδικό αντίσωμα από την Santa Cruz Biotechnology (αριθμός καταλόγου SC2027). Αντίσωμα ποσότητες ανά αντίδραση προσδιορίστηκαν σε προκαταρκτικά πειράματα και ήταν 5 μL για α-ακετυλο Η3, 5 μL για α-H3K4me3, 4 μλ για α-H3K9me3, 4 μλ για α-H3K27me3. 5 μι κουνελιού IgG προστέθηκε σε δείγματα αρνητικού ελέγχου. Cross δεσμοί αντιστράφηκαν με την προσθήκη 20 μL Πρωτεϊνάση Κ (Promega) και επωάστηκαν στους 62 ° C για 3 ώρες με ανακίνηση. Ανακτηθεί το DNA στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα καθαρό up kit PCR (Qiagen, Valencia, CA, USA).

Real Time PCR ανάλυση των ανοσοκατακρημνίστηκε χρωματίνης

DNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας το σύστημα DNA Ποσοτικοποίηση (Promega ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, και οι μετρήσεις λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο TD 20/20 (υποδείγματα Turner, Sunnyvale, CA, USA). Οι σε πραγματικό χρόνο αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 200 pg, του προτύπου DNA με SYBR Green 2 × βασικού μείγματος (Applied Biosystems) και εκκινητές παρατίθενται στον Πίνακα S1. Οι αντιδράσεις διεξήχθησαν εις τριπλούν και διεξάγεται χρησιμοποιώντας PCR μηχανή ΑΒΙ PRISM 7500 (Applied Biosystems). C

τιμές Τ έγινε αυτόματα από Sequence Detection Software έκδοση 1.4 (Applied Biosystems) και οι τελικές τιμές εκφράστηκαν ως ποσοστό του κλάσματος εισόδου. γραμμές σφάλματος στα στοιχεία της χρωματίνης αλλαγή αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα.

Στατιστική Ανάλυση

Οι τυπικές αποκλίσεις υπολογίστηκαν και ένα T-test χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τα επίπεδα έκφρασης και τα επίπεδα τροποποίηση των ιστονών σε κύτταρα επεξεργασμένα φάρμακο κατά ανεπεξέργαστων κύτταρα.

P

-τιμές μικρότερες του 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Το γονιδιακό DNA μεθυλίωση με 5-αζα-dC θεραπεία

Παγκόσμια μεθυλίωσης επίπεδα μειώθηκαν μετά 5-αζα-άΟ θεραπεία κατά 53% και 59% στην HCT116 και κυτταρικές σειρές SW480, αντίστοιχα (Σχήμα 1). Αυτό αντιπροσωπεύει μια σημαντική μείωση σε σύγκριση με τα κύτταρα τα οποία ήταν ψευδο αγωγή και δεν έχουν υποστεί απομεθυλίωση (τιμή-ρ = 0,003 HCT116, ρ-τιμή = 0.017 SW480). Συνεχίζεται η επώαση των κυττάρων για ακόμη δέκα ημέρες μετά τη θεραπεία με το φάρμακο ελεύθερα μέσα ενημέρωσης επιτρέπεται DNA νέου μεθυλίωση και γονιδιώματος επίπεδα αυξήθηκαν, αλλά δεν επιστρέφουν στο ίδιο επίπεδο όπως παρατηρήθηκε πριν από τη θεραπεία σε αυτήν την περίοδο.

Γονιδιωματική μεθυλίωσης επίπεδα μειώθηκαν σημαντικά σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές μετά από έκθεση 5-αζα-dC. Γονιδιωματικής επίπεδα μεθυλίωσης σταδιακά αποκαταστάθηκε κατά τη διάρκεια των επόμενων δέκα ημερών της ανάπτυξης χωρίς ναρκωτικά, όπου πλησίαζαν τα επίπεδα της θεραπείας προ-φάρμακο.

Η

Gene Ειδικές μεθυλίωση και πάλι έκφρασης με 5-αζα-dC θεραπείας

Χρησιμοποιώντας γονιδίωμα συστοιχίες έκφρασης ευρύ έχουμε ήδη εντοπιστεί τα πρότυπα της γονιδιακής έκφρασης μετά από 5-αζα-dC θεραπεία [22]. Τα ίδια γονίδια πάλι εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη για να επιτρέψει τον χαρακτηρισμό των τροποποιήσεων ιστονών. Σε αυτό το πείραμα, η έκφραση προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR και γονιδίων στη συνέχεια ταξινομήθηκαν σε πέντε κατηγορίες? «Πάντα-εκφράζεται ‘(έκφραση ανιχνεύθηκε σε όλα τα χρονικά σημεία),« επάνω ρυθμισμένη »(δύο φορές σε έκφραση μετά από 5-αζα-dC θεραπεία),« μακροπρόθεσμα επανενεργοποιείται »(απαρατήρητα σε ακατέργαστα κύτταρα, αλλά εκφράζεται μετά τη θεραπεία, όπως καθώς και τέσσερα και δέκα ημέρες μετά την έκθεση στο φάρμακο (με βάση ένα C

T αξία του 40 για μη ανιχνεύσιμα μετάγραφα)), η βραχυπρόθεσμη επανενεργοποιείται »(ίδιο με το« μακροπρόθεσμη επανενεργοποιηθεί »με την εξαίρεση των τεσσάρων ημέρας ή /και δέκα έκφραση η οποία πρέπει να είναι & lt? 100 φορές πάνω από το επίπεδο των μη επεξεργασμένων κυττάρων), ή «άλλες» (οποιαδήποτε άλλη μορφή της γονιδιακής έκφρασης)

Τα τρία γονίδια που είχαν ενεργοποιηθεί εκ νέου για μικρό χρονικό διάστημα μόνο (. CXCL6 και ZFP3 στα κύτταρα HCT116 και CDKN2A στα κύτταρα SW480) ήταν όλα υπερμεθυλίωση όλη την προσδιορίστηκαν περιοχή των νησιών τους CpG. Το μοτίβο έκφρασης αυτών των γονιδίων ήταν εμφανώς διαφορετική στην άλλη από τις δύο κυτταρικές σειρές? εδώ, αυτά τα γονίδια έδειξε πολύ μικρή ή χαμηλή μεθυλίωση στη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) και είτε εκφράζονται συνεχώς ή έγινε πάνω ρυθμισμένα (σχήμα 2). Τα γονίδια τα οποία παρέμειναν υψηλά εκφράζεται μετά την επανενεργοποίηση (CDO1, HSPC105, MAGEA3) εμφανίζεται προφίλ μοναδική μεθυλίωση και χαρακτήρισε ένα υπο-μεθυλιωμένα CpG τοποθεσία γειτονική προς τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS), όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Η ειδική απομεθυλίωση νησί CpG μετά τη θεραπεία ήταν 10- 15% κατ ‘ανώτατο όριο ,, ως εκ τούτου είναι μόνο μη επεξεργασμένα προτύπων μεθυλίωσης φαίνεται στο Σχήμα 2 και 3. τα δεδομένα για τα τέσσερα χρονικά σημεία φαίνεται στο Σχήμα S1 για το γονίδιο MAGEA3 που εμφανίζεται με τη μεγαλύτερη γονίδιο που σχετίζεται μείωση της μεθυλίωσης DNA. Ένα παράδειγμα των άμεσων χρωματογραφήματα αλληλουχίας των MAGEA3 φαίνονται στο σχήμα S2

– CXCL6 CpG νησί μεθυλίωση.? βραχυπρόθεσμα κατά πάντα-εκφράζεται. (Β) – κύτταρα SW480 εμφανίζεται υπομεθυλίωση και CXCL6 εκφράστηκε σε όλα τα χρονικά σημεία. (Γ) – Ενιαίες υπερμεθυλίωση του HCT116 κυτταρική γραμμή συνδέθηκε με μια βραχυπρόθεσμη επανενεργοποίηση της έκφρασης. D, E, F – CDKN2A CpG νησί μεθυλίωση? βραχυπρόθεσμα κατά σταθερή έκφραση. SW480 κύτταρα εμφανίζουν CDKN2A υπερμεθυλίωση και προσωρινά εκ νέου εκφράζεται, ενώ στα κύτταρα HCT116 CDKN2A είναι περίπου 50% μεθυλιωμένο σε CpG θέσεις κοντά στο TSS, και εκφράστηκε σε όλα τα χρονικά σημεία. Οι αστερίσκοι υποδηλώνουν σημαντική αλλαγή σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. G, H, I – ZFP3 CpG νησί μεθυλίωση? βραχυπρόθεσμες v επάνω ρυθμισμένη έκφραση. κύτταρα SW480 έδειξε υπομεθυλίωση σε θέσεις CpG κοντά στο TSS και η έκφραση ρυθμίζεται προς τα πάνω μετά από αγωγή 5-αζα-DC. ZFP3 παραμένει υπερμεθυλιωμένων σε κύτταρα HCT116 και προσωρινά επανενεργοποιήθηκε με θεραπεία 5-αζα-DC. J – Σημαντικές αλλαγές σε τροποποιήσεις των ιστονών σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (p & lt? 0,05).

Η

Α, Β, Γ – CDO1 CpG νησί μεθυλίωση? μακροπρόθεσμα κατά βραχυπρόθεσμα εκφράζεται. Ανάλυση αλληλουχίας αποκάλυψε CpG περιοχές κοντά στο TSS στα κύτταρα SW480 έχουν χαμηλότερα μεθυλίωση και εμφανίζεται μακροπρόθεσμη έκφραση σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116 που είναι ομοιόμορφα υπερμεθυλίωση σε CDO1 και παρουσίασαν τα επάνω ρυθμισμένη μοτίβο έκφρασης. D, E, F – HSPC105 CpG νησί μεθυλίωση? πάντα-εκφράζεται κατά μακροχρόνια εκφράζεται. Η κυτταρική σειρά SW480 δείχνει εντοπισμένο υπομεθυλίωση στο TSS και μπορεί να παραμείνει εξέφρασε δέκα ημέρες μετά τη θεραπεία. Η HCT116 κυτταρική σειρά υπο-μεθυλιωμένα στον υποκινητή HSPC105 και συνεχώς εκφράζεται. G, H, I – MAGEA3 CpG νησί μεθυλίωση? πάντα-εκφράζεται κατά μακροχρόνια εκ νέου εκφράζεται. SW480 κύτταρα παρουσιάζουν εντοπισμένες υπομεθυλίωση στο TSS και εκφράζονται δέκα ημέρες μετά τη θεραπεία. κύτταρα HCT116 δείχνουν -50% μεθυλίωση στο TSS και MAGEA3 εκφράζεται σε όλα τα χρονικά σημεία. J – Σημαντικές αλλαγές σε τροποποιήσεις των ιστονών σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (p & lt? 0,05).

Η

Τα γονίδια που καθορίζεται για να είναι «πάντα-εκφράζεται» εμφανίζεται ένα ανώτατο όριο 50% μεθυλίωσης στο TSS που προτείνει μονο-αλληλομόρφων μεθυλίωση, και up-ρυθμιζόμενα γονίδια εμφανίζονται διαφορετικά μοτίβα μεθυλίωσης. Το γονίδιο MLH1 εκφράστηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και μεθυλίωση δεν ανιχνεύθηκε στη συνδεδεμένη TSS CpG νησιού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντιστρόφως, μια παραλλαγή του DICER1 δεν εκφράστηκε σε οποιαδήποτε κυτταρική γραμμή σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση μικροσυστοιχιών και η απουσία έκφρασης του επιβεβαιώθηκε με ποσοτική PCR. DICER1 δεν συνδέεται με ένα νησί CpG, επομένως ανάλυση διθειώδες αλληλούχισης δεν πραγματοποιήθηκε. CDKN2A εκφράστηκε σε HCT116 και έδειξε μερική μεθυλίωση στο TSS. Η αντίστοιχη περιοχή σε κύτταρα SW480 ήταν υπερμεθυλιωμένο και έκφραση κατηγοριοποιηθεί ως βραχυπρόθεσμη επανενεργοποιείται μετά τη θεραπεία.

Συνέχεια επώαση των κυττάρων σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου επέτρεψε την εκ νέου μεθυλίωση του DNA, η οποία επιστρέφει στην αρχική επίπεδα στα προαγωγού CpG νησίδων . Η γονιδιακή έκφραση δεν επηρεάστηκε κατ ‘ανάγκη από την επιστροφή της μεθυλίωσης υποκινητή όμως, και η έκφραση του CDO1, HSPC105 και MAGEA3 γονιδίων σε κύτταρα SW480 παρέμεινε σε υψηλά επίπεδα δέκα ημέρες μετά τη θεραπεία 5-αζα-DC. Αυτά τα γονίδια εμφανίζονται μοναδικά σχέδια νησί μεθυλίωσης CpG που διαθέτουν μεθυλιωμένος CpG θέσεις δίπλα στο TSS. Καθώς τα επίπεδα μεθυλίωσης σε υποστηρικτής CpG νησίδες δεν αντικατοπτρίζουν με ακρίβεια την έκφραση των γονιδίων που μελετήθηκαν, επιδιώξαμε να εξετάσει τα σχέδια των τροποποιήσεων ιστονών στα αντίστοιχα νησιά CpG που μπορεί να ευθύνεται για υψηλά επίπεδα έκφρασης.

χρωματίνης τροποποιήσεις μετά 5-αζα-άΟ έκθεση

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση και q-PCR αποκάλυψε ότι Histone H3Ac και H3K4me3 ήταν χαρακτηριστικά που σχετίζονται με εκφρασμένα γονίδια όπως GAPDH και MLH1 και καταστέλλεται γονίδια που σχετίζονται με H3K9me3 και λιγότερο συχνά H3K27me3 που απουσίαζαν από ιδιοσυστατικά εκφραζόμενα γονίδια .. τα αποτελέσματα ChIP συνοψίζονται στο Σχήμα 2 και 3, με ρ-τιμές που αναφέρονται στον πίνακα 1. Ειδικές αλλαγές στην χρωματίνη τροποποίηση που φαίνεται στα Σχήματα S3, S4, S5, S6.

Η

οι αλλαγές στις πρωτεΐνες χρωματίνης μετά από 72 ώρες έκθεσης ήταν εξαρτάται από την κατάσταση της γονιδιακής έκφρασης. Γονίδια με μεγαλύτερη έκφραση μετά τη θεραπεία αυξήθηκε σε H3K4me3, ενώ H3Ac συνδέθηκε μόνο με γονίδια επανενεργοποιηθεί για μεγαλύτερες περιόδους. Γενικώς τα κατασταλτικά σήματα H3K27me3 μειώθηκαν μετά τη θεραπεία, με την εξαίρεση του γονιδίου CXCL6. Μια σύγκριση των τροποποιήσεων ιστονών σε σύντομο χρονικό διάστημα επανενεργοποιηθεί γονίδια αποκάλυψε παροδική αύξηση της ιστόνης H3K4me3 και μειωμένο ή σταθερό επίπεδο τριμεθυλο-ιστόνης H3 λυσίνη 9 και 27. Παρά το γεγονός αυτό, η μεταγραφή των γονιδίων αυτών δέκα ημέρες μετά τη θεραπεία ήταν παρόμοιο με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η πιο εμφανής διαφορά μεταξύ βραχυπρόθεσμων και μακροπρόθεσμων επανενεργοποιηθεί γονίδια ήταν η τροποποίηση H3Ac. Γονίδια που θεωρούνται «μακροπρόθεσμα επανενεργοποιηθεί» αποκάλυψε μια αύξηση της τάξης του H3Ac, αν και δεν φθάνουν πάντα στατιστικής σημαντικότητας, μετά τη θεραπεία η οποία συνεχίστηκε μέχρι δέκα ημέρες μετά τη θεραπεία φαρμάκων. Υπήρχε επίσης μια τάση σε μακροπρόθεσμη γονίδια εκ νέου εξέφρασε, όπου η μείωση των H3K27me3 παρατηρήθηκε το πάνω-ρυθμιζόμενα γονίδια (CDO1 στα κύτταρα HCT116 και ZFP3 στο SW480) και γονίδια που εκφράζεται πάντοτε έδειξε μια αύξηση της ενεργού σήματα χρωματίνης και την απώλεια των κατασταλτικών τροποποιήσεις ιστονών μετά από 5-αζα-dC έκθεσης.

Συζήτηση

Η επιγενετική έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης διαμεσολαβείται από μεθυλίωση του DNA και τροποποιήσεων ιστονών. Με την αλλαγή της μεθυλίωσης του DNA και up-ρύθμιση του γονιδίου έκφρασης μπορούμε να εντοπίσουμε μοτίβα της αλλαγής σε πρωτεΐνες ιστόνης τροποποιήσεις που συνοδεύουν τη μακροπρόθεσμη και βραχυπρόθεσμη επανενεργοποίηση επιγενετικώς σιγήσει γονιδίων. Ιδιαίτερη σημασία για την παρούσα μελέτη ήταν η εμφανής μεταγραφική άνω ρύθμιση του σιγήσει γονιδίων που εμφανίζεται λιγότερο από το 15% απομεθυλίωση DNA, όπου οι τροποποιήσεις των ιστονών είναι πιθανόν να εμπλέκονται στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε αυτές τις περιπτώσεις.

Η επίδραση της μεθυλίωσης του DNA για την έκφραση του γονιδίου

Ανεξάρτητα από το πρότυπο έκφρασης κατά τη διάρκεια της θεραπείας από τα ναρκωτικά, η έκταση της μεθυλίωσης συγκεκριμένων νησιών CpG παρέμεινε σχετικά αμετάβλητη σε σύγκριση με τα επίπεδα γενωμικού μετά από έκθεση 5-αζα-dC. Αυτή η παρατήρηση έχει γίνει στο παρελθόν, με τη μεθυλίωση των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών που μπορούν να συμβάλλουν σε αυτή την ασυμφωνία [22], [29]. Μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η μεθυλίωση του DNA αυξάνεται σε προαγωγούς των μη εκφρασμένων γονιδίων όταν αναστέλλεται από δοξυκυκλίνη σε ένα σύστημα tet αποκρίνεται υποκινητή [30]. Ιδιοσυστατικά εκφραζόμενα γονίδια ήσαν υπο-μεθυλιωμένα και στα δύο αλληλόμορφα, ή έχει εκτεθεί CpG νησί μεθυλίωση του 50% που δείχνει μονο-αλληλόμορφης μεθυλίωση, όπως το γονίδιο CDKN2A σε κύτταρα HCT116 όπως φαίνεται προηγουμένως [31]. Ελαφρά απομεθυλίωση προαγωγού CpG νησίδων προκλήθηκε με 5-αζα-dC, ακόμη έκφραση δεν περιορίζονται κατ ‘ανάγκη σε ορισμένες γονιδίων όταν η μεθυλίωση επέστρεψε στο αρχικό επίπεδο. Υψηλή έκφραση της μακροχρόνιας επανενεργοποιηθεί γονίδια φάνηκε να εξαρτάται από προϋπάρχουσα υπομεθυλίωση στο TSS ανεξάρτητα από το εάν είχαν υπερμεθυλιωμένο οι παρακείμενες θέσεις CpG. Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει το μοτίβο μεθυλίωσης παρά το γενικό επίπεδο της μεθυλίωσης σε όλο το νησί CpG είναι ζωτικής σημασίας για την εκ νέου ενεργοποίηση σιγήσει γονιδίων μέσω αλληλεπιδράσεων με άλλους επιγενετικών παραγόντων. Οι θέσεις υπο-μεθυλιωμένα CpG εντός υπερμεθυλιωμένων υποκινητές έχουν ταυτοποιηθεί προηγουμένως στο γονίδιο του υποδοχέα ογκοστατίνης Μ [27], αλλά δεν εξετάστηκε η επίδραση αυτής της υπομεθυλίωσης επί της μεταγραφής. Γιατί έκφραση των μακροπρόθεσμων επανενεργοποιηθεί γονίδια δεν συμβαίνουν στα μη επεξεργασμένα κύτταρα που εμφανίζεται μια σχεδόν πανομοιότυπο μοτίβο μεθυλίωσης μπορεί να εξηγηθεί από αλλαγές στις τροποποιήσεις των πρωτεϊνών ιστόνης.

Η επίδραση των τροποποιήσεων ιστονών στην έκφραση των γονιδίων

Μια σύντομη επισκόπηση των παραγόντων που διέπουν τη γονιδιακή έκφραση επιτεύχθηκε με την κατάρτιση των CpG αλληλουχίας νησιού και χρωματίνης αποτελέσματα ανοσο-καθίζηση. Μετά την επανενεργοποίηση πολλών γονιδίων και ταξινόμηση της έκφρασης, θα μπορούσαμε να διακρίνουμε μεταξύ των γονιδίων με βάση τις μεθυλίωση και χρωματίνης αλλαγές παρόν. Πριν από τη θεραπεία, μεταγραφικώς ανενεργό γονίδια χαρακτηρίζονται από υψηλότερα επίπεδα κατασταλτικής τροποποιήσεις και χαμηλότερα επίπεδα ενεργοποίησης σημάτων. Κατά την αγωγή με 5-αζα-dC υπήρξε γενικά μια αύξηση στα επίπεδα του H3K4me3 και H3K9me3, ενώ H3Ac αυξήθηκε μόνο σε μερικά από τα γονίδια. Μειώσεις σε H3K27me3 συνέβη σε γονίδια που εμφανίζεται αρχικά αυτό το χαρακτηριστικό. Όσον αφορά την χρωματίνη τροποποιήσεις, ήταν κατά τη διάρκεια της περιόδου δωρεάν ανάπτυξης φαρμάκων που ακετυλίωση των ιστονών έγινε το πιο διακριτό χαρακτηριστικό μεταξύ βραχυπρόθεσμων και μακροπρόθεσμων επανενεργοποιηθεί γονίδια. Μακροπρόθεσμες επανενεργοποιηθεί υποκινητές γονιδίων έγινε όλο και περισσότερο συνδέεται με την ακετυλίωση της ιστόνης Η3 βοηθώντας με την ενεργοποίηση του γονιδίου έφθασε ωστόσο μόλις σε σημαντικά επίπεδα μετά από δέκα ημέρες χωρίς ναρκωτικά ανάπτυξης. Προσωρινά επανενεργοποιηθεί γονίδια δεν προσελκύουν την τροποποίηση αυτή, παρά μια σύντομη περίοδο της έκφρασης. Φαίνεται λοιπόν ότι η εισαγωγή της Η3 ακετυλίωση είναι ένας κρίσιμος παράγοντας για την αντιστροφή μεταγραφική κατάσταση μιας επιγενετικώς σιγήσει γονίδιο το οποίο επικουρείται από εντοπισμένη υπομεθυλίωσης του DNA. Με την εξαίρεση των H3K27me3 σε CDKN2A στα κύτταρα SW480, μακράς διαρκείας αλλαγές στο επιγενετικές τροποποιήσεις που δεν παρατηρήθηκαν σε προσωρινά επανενεργοποιηθεί γονίδια.

Η ρύθμιση προς τα πάνω της ταπεινός εξέφρασε γονιδίων που σχετίζονται με αυξημένη ακετυλίωση Η3 και H3K4me3, όπως το γονίδιο ZFP3 στα κύτταρα SW480. προφίλ μεθυλίωσης, όπως αυτό μπορεί να υποδεικνύει ένα ενδιάμεσο μεταξύ της πάντα-εκφρασμένων γονιδίων και των μακροπρόθεσμων επανενεργοποιηθεί γονίδια. Co-υπάρχουσες δραστικές και κατασταλτικών σήματα μπορούν να επιτρέπουν περιορισμένη επίπεδο της μεταγραφής, υποδηλώνοντας τον έλεγχο της έκφρασης αυτών των γονιδίων εξαρτάται από την ισορροπία των δύο τύπους τροποποιήσεων.

στα γονίδια που εξετάστηκαν σε αυτή τη μελέτη, οι ρόλοι των ιστονών Η3 ακετυλίωση και H3K27me3 ήταν εμφανής, όπως ενεργοποίηση και καταστολή των σημάτων αντίστοιχα, ωστόσο η επίδραση της H3K4me3 και H3K9me3 δεν φάνηκε αρκετή για να αλλάξει την έκφραση του γονιδίου σε μακροπρόθεσμη βάση. Μετά 5-αζα-dC έκθεσης, H3K9me3 ήταν συχνά αυξημένη σε εκφρασμένα γονίδια που συμπίπτει με πρόσφατα ευρήματα ότι μπορεί επίσης να συζευχθούν με ενεργοποίηση γονιδίων [29], [32], [33]. Ομοίως, H3K4me3 οποία συσχετίζει με ενεργές περιοχές του γονιδιώματος βρέθηκε σε αδρανή γονίδια, αν και σε μειωμένο επίπεδο. Παρατηρήσεις αυτού του είδους αναδείξει τη δυναμική φύση της χρωματίνης και, ενδεχομένως, να προτείνει μια ενδιάμεση μορφή καταπίεσης παρόμοια με δισθενή χρωματίνης που περιβάλλει αναπτυξιακών γονιδίων [34] ή την επίδραση της γειτονικής χρωματίνης που έχει ανιχνευθεί λόγω των μεταβολών στην διάτμηση απόδοση κατά τη διάρκεια της κατεργασίας με υπερήχους.

σύνδεση μεθυλίωσης του DNA, τροποποιήσεις χρωματίνης και την γονιδιακή έκφραση

Τα μοτίβα έκφρασης του νέου ενεργοποιούνται και up-ρυθμιζόμενα γονίδια μπορεί να εξηγηθεί σε μεγάλο βαθμό με τον συνδυασμό της ανάλυσης μεθυλίωσης υποκινητή και δοκιμασίες ανοσο-καταβύθισης χρωματίνης. Με την παρατήρηση και τη σύγκριση των μακροπρόθεσμων και βραχυπρόθεσμων επανενεργοποιηθεί γονίδια, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι τα γονίδια με εντοπισμένο υπομεθυλίωση στο TSS είναι πιο πιθανό να παρουσιάσουν αύξηση της ιστόνης Η3 ακετυλίωση και παραμένουν εκφράζεται μετά από 5-αζα-dC έκθεσης. Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι η ειδική γονιδιακή έκφραση επανενεργοποιήθηκε χωρίς σημαντική αλλαγή στην συνδεδεμένων CpG νησί μεθυλίωση και αυτό ήταν ανεξάρτητο από κοντά υπερμεθυλίωσης στο ίδιο νησί CpG.

Μια ακολουθία των γεγονότων που ασχολούνται με επιγενετικές επανενεργοποίηση έχει προταθεί από Litt

et al.

[35]. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η επανενεργοποίηση του απαιτούμενου γονιδίου HPRT ημι-απομεθυλίωση του υποκινητή, «άνοιγμα» της δομής της χρωματίνης, δεσμευτικός παράγοντας μεταγραφής και συναρμολόγηση του συμπλόκου μετεγγραφής πριν από τη σύνθεση του HPRT RNA. Με βάση τα πειράματά μας, μπορούμε να επεκτείνουμε αυτή τη γνώση με τον υπαινιγμό ότι οι μικρές απομεθυλίωση που προκαλείται από 5-αζα-DC και αυξημένη H3K4me3 επιτρέπει την έναρξη της μεταγραφής. Ο ρόλος του H3K9 trimethylation δεν είναι σαφής, αλλά μπορεί να σχετίζεται με επανενεργοποίηση σε ορισμένες περιπτώσεις. Η απώλεια των κατασταλτικών σήματα όπως H3K27me3 μπορεί επίσης να αυξήσει περαιτέρω τη μεταγραφή. Αν και δεν εξετάζονται εδώ, είναι δυνατόν MBD2 δεσμευτικό θα μπορούσαν να χαθούν σε αυτό το σημείο το οποίο θα μπορούσε να αποτρέψει πλέον ακετυλοτρανσφεράσης ιστόνης από την περιοχή [36]. Η μεταγραφή παρατείνεται σε περίπτωση που προκύψει αυξημένη ακετυλίωση της ιστόνης Η3, αλλιώς η έκφραση είναι παροδική και η έκφραση του γονιδίου είναι πιθανό να επανέλθει σε μια ανενεργή κατάσταση.

αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης στη θεραπεία των όγκων

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το γονίδια που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη υποκύπτουν σε μεθυλίωση σε άλλες κακοήθειες, όπως ορισμένες μορφές καρκίνου του μαστού [24] και [37] καρκίνο των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, η επανενεργοποίηση περιγράφονται σε αυτή τη μελέτη μπορεί να μην περιορίζεται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, αλλά και άλλους τύπους όγκων όπου αναστροφή των επιγενετικών καταστολή μπορεί να είναι θεραπευτικό όφελος. Αποτελεσματικότητα του 5-αζα-άΟ ως θεραπεία περιορίζεται σε ορισμένους τύπους όγκων, ωστόσο, αυτό που προκαλεί ένα ευνοϊκό αποτέλεσμα από 5-αζα-dC θεραπείας είναι άγνωστη. Η επιτυχία της μπορεί να βρίσκεται με το πρότυπο μεθυλίωσης στο παρόν un-εντοπισμένων γονιδίων στόχων και την ικανότητα των ναρκωτικών να επανενεργοποιήσει σιωπήσει γονίδια για μεγαλύτερο χρονικό διάστημα. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η καταπιεσμένη γονίδια που εμφανίζουν εντοπισμένο TSS υπομεθυλίωση μπορεί να επανενεργοποιηθεί με συνδυασμένη μεθυλοτρανσφεράση /ιστόνης θεραπεία αναστολέα δεακετυλάσης. Αυξημένη ακετυλίωση κατά υπερμεθυλιωμένων θέσεις έναρξης μεταγραφής που οδηγούν σε μακροπρόθεσμη επανενεργοποίηση του αντι-πολλαπλασιαστική γονίδια μπορεί να είναι ευεργετική στη θεραπεία των όγκων, όταν είναι γνωστό αυτή η πληροφορία. Ο μηχανισμός αυτός θα είναι εκτός από την αναφερόμενη συνεργική αποπτωτική δράση των αναστολέων μεθυλτρανσφεράσης και αποακετυλάσης ιστόνης [28], [38].

Συμπέρασμα

Ανάλυση της χρωματίνης στον υποκινητή των γονιδίων σε αυτή η μελέτη δείχνει ότι τα υπάρχοντα υπομεθυλίωση εξής (αλλά όχι απαραίτητα που προκαλείται από) 5-αζα-dC θεραπεία, βοηθά ιστόνης Η3 ακετυλίωση, είτε άμεσα είτε έμμεσα. Ο συνδυασμός της υπομεθυλίωσης των CpG θέσεων στο TSS και Η3 ακετυλίωση αποτέλεσμα σε σταθερή επανενεργοποίηση των γονιδίων που μελετήθηκαν εδώ. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης τονίζουν τα επιγενετικών χαρακτηριστικά τα οποία πρέπει να τροποποιηθούν όσον αφορά την αντιστροφή της μεταγραφικής κατάστασης των γονιδίων στη θεραπεία της νόσου. Μια πιο στρατηγική προσέγγιση θα οδηγήσει στην ανάπτυξη των επιγενετικών θεραπειών και όχι τη χρήση των ναρκωτικών επιγενετικής τροποποίησης ως κυτταροτοξικά θεραπείες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Μεθυλίωση MAGEA3 σε κύτταρα SW480 επεξεργάστηκε με 5-αζα-DC. Bisulfite αλληλούχιση PCR διεξήχθη σε κάθε χρονικό σημείο και σχεδιάστηκαν για να δείξει τις αλλαγές πριν και μετά από 5-αζα-dC θεραπεία, το γονίδιο MAGEA3 έδειξε τη μεγαλύτερη απομεθυλίωση όλων των γονιδίων προσδιορίστηκαν, με μια μείωση 10-15% σε διάφορες θέσεις CpG κοντά το γονίδιο TSS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0023127.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

μεθυλίωσης στο MAGEA3 Μεταγραφή Έναρξη ιστοσελίδας. Α – υποστηρικτής μεθυλίωσης σε όλο το νησί MAGEA3 CpG. Η κόκκινη γραμμή υποδεικνύει την περιοχή της αλληλουχίας που φαίνεται στο Β και C. Β – Μεθυλίωση στο MAGEA3 TSS σε κύτταρα SW480. Απευθείας αλληλούχιση διθειώδους PCR προϊόντων προκαλεί διπλή C και κορυφές Τ σε θέσεις CpG, και είναι αντιπροσωπευτικές των μεθυλιωμένων και μη-μεθυλιωμένων αλληλίων αντίστοιχα. Η περιοχή CpG δίπλα στο TSS δείχνει μια μεγαλύτερη αναλογία Τ αλληλόμορφα (που αντιπροσωπεύει μη μεθυλιωμένη κυτοσίνη) υποδεικνύοντας υπομεθυλίωση, ενώ κοντινά CpG θέσεις δείχνουν αυξημένη κορυφές κυτοσίνη και υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης. Τα βέλη υποδεικνύουν θέσεις CpG, εγκλωβιστούμε Τ δείχνουν τη θέση του μη-CpG κυτοσίνη και υπογραμμισμένη αλληλουχία αντιπροσωπεύει τη θέση έναρξης της μεταγραφής. Γ – CpG θέσεις στην HCT116 κυτταρική σειρά είναι μεγαλύτερη από 50% μετουσιωμένο

doi: 10.1371 /journal.pone.0023127.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3..