Αφηρημένο

Παρά τις πολλές προσπάθειες, το φάρμακο με βάση θεραπείες για ασθενείς που πάσχουν από καρκίνο του πνεύμονα παραμένει φτωχή. Ως εναλλακτική λύση πολλά υποσχόμενη, ερευνήσαμε το θεραπευτικό δυναμικό του BC-819 για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα σε μοντέλα όγκου ποντικού. BC-819 είναι ένα νέο πλασμίδιο DNA το οποίο κωδικοποιεί για την Α-θραύσμα της τοξίνης της διφθερίτιδας και έχει προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου επιτυχώς σε ανθρώπινες κλινικές μελέτη του καρκινώματος της ουροδόχου κύστης. Σε μία πρώτη ομάδα πειραμάτων, εξετάσαμε

in vitro

αποτελεσματικότητα του BC-819 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα ΝΟΙ-Η460, ΝΟΙ-Η358 και Α549, η οποία αποκάλυψε & gt? Μείωση κατά 90% της κυτταρικής ανάπτυξης.

In vivo

αποτελεσματικότητα εξετάστηκε σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα ξενομοσχεύματος ποντικού και σε ένα μοντέλο μετάστασης πνεύμονα χρησιμοποιώντας φωταύγειας Α549-C8-Luc κύτταρα αδενοκαρκινώματος. Αυτά τα κύτταρα οδήγησε σε περι- και ενδο-βρογχιολιδικού όγκους κατόπιν ενδοβρογχική εφαρμογή και παρεγχυματική όγκων κατά την ενδοφλέβια ένεση, αντίστοιχα. Ποντίκια που πάσχουν από αυτούς τους όγκους του πνεύμονα υποβλήθηκαν σε αγωγή με BC-819, συμπλέκεται με διακλαδισμένη πολυαιθυλενιμίνη (ΡΕΙ) και αερολυμένης στα ποντίκια μια φορά την εβδομάδα για μια περίοδο 10 εβδομάδων. Χρησιμοποιώντας αυτό το σχήμα, η αύξηση του ενδοβρογχικά επάγεται όγκων του πνεύμονα ήταν σημαντικά ανέστειλε (p = 0.01), ενώ καμία επίδραση θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε ποντίκια που πάσχουν από μετάσταση πνεύμονα. Εν ολίγοις, σας προτείνουμε μορφή αερολύματος PEI /BC-819 είναι ικανό να μειώσει την ανάπτυξη μόνο σε όγκους που προέρχονται από την πλευρά του αυλού των αεραγωγών και κατά συνέπεια είναι άμεσα προσβάσιμα για εισπνεόμενη π.Χ.-819

Παράθεση:. Hasenpusch G, Pfeifer C, Aneja ΜΚ, Wagner Κ, Reinhardt D, Gilon M, et al. (2011) αερόλυμα π.Χ.-819 Αναστέλλει Πρωτοβάθμια αλλά όχι Δευτεροβάθμια πνεύμονα ανάπτυξης του καρκίνου. PLoS ONE 6 (6): e20760. doi: 10.1371 /journal.pone.0020760

Επιμέλεια: Dominik Hartl, Ludwig-Maximilians-Universität München, Γερμανία

Ελήφθη: 1, Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 9, Μαΐου 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 του Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Hasenpusch et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το πρόγραμμα BMBF BioFuture (FKZ0311898), η 13N9182 πρόγραμμα, LMUexcellent (Investitionsfonds), DFG RU 911 /9-1 και Emma Ίδρυμα Thaler. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σύμφωνα με επιδημιολογικές μελέτες, ο καρκίνος του πνεύμονα παραμένει η κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους παγκοσμίως με μόνο το 15 τοις εκατό του συνόλου των ασθενών στις ΗΠΑ και το 10 τοις εκατό του συνόλου των ασθενών στην Ευρώπη που επιβιώνουν πάνω από πέντε χρόνια μετά τη διάγνωση της νόσου [ ,,,0],1]. Η κατάσταση αυτή οφείλεται κυρίως στην καθυστερημένη διάγνωση των όγκων του πνεύμονα και την έλλειψη θεραπευτικής αποτελεσματικότητας των διαθέσιμων αντικαρκινικών φαρμάκων, ιδιαίτερα σε προχωρημένα στάδια της νόσου, όταν η χειρουργική εκτομή δεν είναι εφικτή ή όγκους επανεμφανιστούν μετά τη χειρουργική επέμβαση.

Για να κλείσετε αυτό το θεραπευτικό κενό, η γονιδιακή θεραπεία έχει προταθεί ως πολλά υποσχόμενη ευκαιρία για να παρεμβαίνει με κρίσιμες μοριακά μονοπάτια των καρκινικών κυττάρων [2]. Πρόσφατες στρατηγικές απόπειρα σε κλινικές μελέτες περιελάμβαναν διέγερση των κυττάρων του όγκου απόπτωση μέσω της αντικατάστασης των μεταλλαγμένων ρ53 ογκοκατασταλτικό γονίδιο, κύτταρο όγκου αυτοκτονία μέσω επαγωγής των γονιδίων που κωδικοποιούν για ειδικά ένζυμα τα οποία είναι ευαίσθητα σε διαφορετικά καλοήθεις παράγοντες και την ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος με γονίδια που κωδικοποιούν για κυτοκίνες [3]. Η πλειονότητα των θεραπευτικών προσεγγίσεων γονιδίου βασίζονται σε φορείς ιών οι οποίοι είναι πολύ αποδοτικό αλλά λόγω ανάπτυξης εξουδετερωτικών αντισωμάτων, δυσμενής για επανειλημμένη εφαρμογή. Μη ιικοί φορείς, αν και κατάλληλα για επανειλημμένη εφαρμογή είναι σχετικά λιγότερο αποδοτική, ειδικά στους αεραγωγούς [4].

Λόγω ζητήματα ασφάλειας, γονιδιακών θεραπευτικών παραγόντων κατά προτίμηση χορηγούνται τοπικά σε τρέχουσες κλινικές μελέτες. Πράγματι τοπική εφαρμογή φαρμάκων έχει δειχθεί ότι είναι πλεονεκτικό σε διάφορες ασθένειες των πνευμόνων, όπως το άσθμα, COPD και πρόσφατα στον καρκίνο του πνεύμονα [5]. Σε περίπτωση του καρκίνου του πνεύμονα, για παράδειγμα, η εφαρμογή των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων που προβλέπονται υψηλότερα επίπεδα πνευμονική φάρμακο και επιπλέον μειώνεται συστηματικές παρενέργειες [6]. Λόγω αυτών των ευνοϊκών ιδιοτήτων της διανομής, έχουν αερολύματα εξετασθεί για την εφαρμογή των γονιδιακών θεραπευτικών παραγόντων. Το πλασμιδιακό DNA, συμπλεγμένο με κατιονικά πολυμερή, είχε ως αποτέλεσμα την επιτυχή επιμόλυνση των βρογχικών και κυψελιδικό επιθήλιο με γονίδια αναφοράς [7], [8] και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου όταν ένα θεραπευτικό πλασμίδιο που κωδικοποιεί ρ53 εφαρμόστηκε σε πνεύμονες ποντικών που φέρουν όγκο [9].

Επιπλέον, θα ήταν επιθυμητό να περιοριστεί η δραστηριότητα της εφαρμοζόμενης πλασμιδιακού DNA μόνο στα κύτταρα του όγκου πνεύμονος, αφήνοντας έτσι τον υγιή ιστό ανεπηρέαστο. Στο πλαίσιο αυτό, το πλασμίδιο BC-819 (επίσης γνωστή ως DTA-Η19) θα μπορούσε να είναι ένας ιδανικός υποψήφιος. Το πλασμίδιο BC-819 κωδικοποιεί την τοξίνη διφθερίτιδας Μια θραύσμα υπό τον έλεγχο του Η19-υποκινητή. Έκφραση της τοξίνης διφθερίτιδας Ένα θραύσμα καταστρέφει αναπόφευκτα κύτταρα από την άμεση διακοπή της πρωτεϊνικής σύνθεσης και ο υποκινητής Η19 περιορίζει την έκφρασή του σε κύτταρα όγκου [10]. Η19 είναι ένα πατρικά αποτυπωμένα, μητρικά εκφράζεται ογκοεμβρυϊκά γονίδιο που δεν έχει καμία πρωτεΐνη προϊόν [11]. Εκφράζεται σε ουσιώδη επίπεδα σε αρκετούς διαφορετικούς τύπους ανθρώπινου όγκου, αλλά μόνο οριακά εκφράζεται ή εντελώς απούσα σε φυσιολογικούς ενήλικες ιστούς [12]. Πρόσφατα δεδομένα πρότειναν ένα ρόλο για Η19 στην προώθηση της εξέλιξης του καρκίνου, αγγειογένεση και μετάσταση [13].

Ακόμα κι αν αερολυμένης γονιδιακή θεραπεία έχει αποδειχθεί ότι είναι αποτελεσματική σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του πνεύμονα, έχουμε το ερώτημα κατά πόσον ο εντοπισμός των όγκων μπορεί να έχει επίδραση επί της αποτελεσματικότητας του συγκεκριμένου όγκου πλασμίδιο BC-819. Για το λόγο αυτό, το πλασμίδιο BC-819 εφαρμόστηκε ως αερόλυμα σε δύο ομάδες ποντικών που πάσχουν από όγκους του πνεύμονα, είτε επάγεται από ενδοβρογχική ή ενδοφλέβια ένεση ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Να πληρούν τις προϋποθέσεις και να ποσοτικοποιηθούν ανάπτυξη του όγκου

in vivo

, τα κύτταρα φωταύγειας χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία όγκων του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Χημικά

διακλαδισμένης πολυαιθυλενιμίνη (ΡΕΙ , μέσο μοριακό βάρος 25 kDa) ελήφθη από την Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Γερμανία). ΡΕΙ αραιώθηκε σε αποσταγμένο νερό (νερό για ένεση, Β Braun Melsungen AG, Melsungen, Germany) και ρυθμίστηκε σε ρΗ 7 με HCI. D-λουσιφερίνης λήφθηκε από Synchem (Felsberg /Άλτενμπουργκ, Γερμανία).

πλασμίδια

Τα πλασμίδια pCluc και pUC21 λήφθηκαν από πλασμίδιο Factory (Bielefeld, Γερμανία). Οι κωδικοί πλασμίδιο pCluc για το ένζυμο ανταποκριτή λουσιφεράσης που προέρχονται από

Photinus pyralis

. Το πλασμίδιο pUC21 χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Το πλασμίδιο BC-819 κωδικοποιεί για την Α θραύσμα της τοξίνης της διφθερίτιδας (DT-Α) υπό τον έλεγχο του υποκινητή Η19 και έχει ήδη περιγραφεί αλλού [10].

Οι κυτταρικές σειρές

Το κύτταρο γραμμή Α549 προέρχεται από ένα ανθρώπινο όγκο πνεύμονα και ιστολογικά κατατάσσεται ως αδενοκαρκίνωμα [14]. Οι κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η460 και ΝΟΙ-Η358 απομονώθηκαν από ανθρώπινο δείγμα, καθώς και ιστολογικά ταξινομούνται ως αδιαφοροποίητο καρκίνωμα μεγάλου κυττάρου (NCI-Η460), και καρκίνωμα βρογχιολοκυψελιδικό κυττάρου (NCI-Η358). Α549-C8-Luc κύτταρα είναι κύτταρα Α549, σταθερά επιμολυσμένα με το γονίδιο που κωδικοποιεί για το ένζυμο ανταποκριτή λουσιφεράσης. Όλες οι κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την DSMZ (Γερμανική Συλλογή Μικροοργανισμών και Κυτταρικών Καλλιεργειών, Braunschweig, Γερμανία) με την εξαίρεση για Α549-C8-Luc το οποίο αγοράστηκε από την δαγκάνα Βιοεπιστημών (Alameda, California).

Ζώα

Λόγω των διαφορών στην ευαισθησία του όγκου των ζώων, διάφορα στελέχη ποντικού έπρεπε να χρησιμοποιηθούν για την επαγωγή πρωτογενών και δευτερογενών όγκων του πνεύμονα, ανάλογα με την οδό εφαρμογή των καρκινικών κυττάρων. Τ-κυττάρων με ανεπάρκεια γυμνά ποντίκια περιγράφονται ως καλή δότες για ενδοβρογχικά εφαρμόζεται κύτταρα όγκου πρόσφατα [15] και ως εκ τούτου επιλέγεται για την επαγωγή πρωτογενών όγκων του πνεύμονα. Η επιτυχής παραγωγή των όγκων του πνεύμονα, μέσω συστημικής χορήγησης των κυττάρων του όγκου, ωστόσο έχει αναφερθεί να απαιτεί ζώα δότες με ένα υψηλό επίπεδο ανοσολογικής ανεπάρκειας. Για το λόγο αυτό Τ-, Β- και φυσικά κυττάρων δολοφόνων ανεπάρκεια CB17.Cg-

Prkdc

SCID

Lyst

BG-ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για το δευτερεύον μοντέλο όγκου, απλά όπως περιγράφεται από τον προηγούμενο συγγραφείς [16].

Πριν τα ζώα πειράματα εγκλιματίστηκαν για τουλάχιστον 7 ημέρες. Όλες οι περαιτέρω διαδικασίες αυτές είχαν εγκριθεί και ελέγχονται από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας (Regierung von Oberbayern) με βασικό αριθμό έγκρισης 16-08 και διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές του γερμανικού νόμου περί της προστασίας της ζωής των ζώων.

εμφύτευση ορθοτοπική όγκου διαδικασία

ενδοβρογχική εφαρμογή.

NMRI-

Foxn1

nu

ποντίκια αναισθητοποιούνται με ενδοπεριτοναϊκή ένεση μεδετομιδίνης (11,5 μg /kg), μιδαζολάμη (115 μg /kg ) και η φαιντανύλη (1,15 μg /kg) και στη συνέχεια τοποθετείται σε μια γωνιακή σκάφους, προκειμένου να απεικονίσει την επιγλωττίδα χρησιμοποιώντας μια πηγή φωτός, ένα ωτοσκόπιο και μια τροποποιημένη σπάτουλα (Hallowell, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). 1 × 10

6 Α549-Luc-C8 κύτταρα αραιώνονται σε 100 μΙ PBS εφαρμόστηκαν orotracheally με ένα αμβλύ έληξε, λυγισμένα 27 G βελόνα από ανοξείδωτο χάλυβα η οποία προσαρμόστηκε σε 1 ml

Injekt-F

πλαστική σύριγγα (B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Γερμανία). Μετά την διαδικασία εμφύτευσης, η αναισθησία ανταγωνίστηκε μέσω της υποδόριας ένεσης ενός αντίδοτου που αποτελείται από atipamezol (50 μg /kg), φλουμαζενίλη (10 μg /kg) και της Ναλοξόνης (24 μg /kg). Τα ποντίκια που ανακτάται από την αναισθησία μέσα σε 15 λεπτά.

ενδοφλέβια εφαρμογή.

Συνειδητή CB17.Cg-

Prkdc

SCID

Lyst

bg -mice τοποθετήθηκαν σε έναν ποντικό-συγκρατητήρα (Braintree Scientific Inc, USA) και 1 × 10

6 Α549-C8-Luc κύτταρα αραιώνονται σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν απ ‘ευθείας στην ραχιαία φλέβα της ουράς χρησιμοποιώντας μια 29G U-100 σύριγγα ινσουλίνης (BD Consumer Healthcare, Le Pont de Claix, Γαλλία).

In vivo απεικόνιση

τα ζώα αναισθητοποιούνται όπως περιγράφηκε προηγουμένως. D-λουσιφερίνη υποστρώματος (3 mg /100 μΙ PBS ανά ποντικό) εφαρμόστηκε με ενδοπεριτοναϊκή ένεση στην ομάδα των ποντικιών που πάσχουν από όγκους του πνεύμονα που προκαλείται από ενδοφλέβια ένεση του Α549-C8-Luc κύτταρα. Ποντίκια που πάσχουν από όγκους που προκλήθηκαν με ενδοβρογχική εφαρμογή του Α549-C8-Luc έλαβαν την ίδια ποσότητα D-λουσιφερίνης αραιωμένο σε 50 μΐ PBS μέσω της ενδορινικής οδού [17]. Βιοφωταύγεια μετρήθηκε 10 λεπτά αργότερα, χρησιμοποιώντας ένα IVIS 100 Σύστημα Απεικόνισης (Xenogen, Alameda, USA) και τις ρυθμίσεις της κάμερας: οπτικό πεδίο 10, f1 f-stop, υψηλής ανάλυσης ενδοχείαση και την έκθεση χρόνο 5 λεπτών. Το σήμα ήταν ποσοτικά και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού Living Εικόνα 2.50 (Xenogen, Alameda, USA)

Προετοιμασία PEI-ρΡΝΑ polyplexes

διακλαδισμένης πολυαιθυλενιμίνη. (PEI? Μέσος MW = 25 kDa) ελήφθη από την Sigma-Aldrich (Deisenhofen, Γερμανία), διαλύεται σε νερό, και ρυθμίστηκε σε ρΗ 7 με τη χρήση HCI. Πολυσύμπλοκα για εφαρμογή αεροζόλ διατυπώθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. Εν συντομία: BC-819 πλασμίδιο και διακλαδισμένες ΡΕΙ χωριστά διαλύονται σε απεσταγμένο ύδωρ έως 4 ml, με αποτέλεσμα σε συγκεντρώσεις 0,25 mg /ml BC-819 και 0.33 mg /ml διακλαδισμένη ΡΕΙ, αντίστοιχα (που αντιστοιχεί σε αναλογία Ν /Ρ 10) . Το διάλυμα μεταφέρθηκε με πιπέτα ρϋΝΑ εντός του διαλύματος ΡΕΙ και αναμίχθηκε με σιφωνισμό πάνω και κάτω για να δώσει μία τελική συγκέντρωση ρϋΝΑ 0,125 mg /ml. Τα σύμπλοκα επωάστηκαν για 20 λεπτά σε θερμοκρασία περιβάλλοντος πριν από τη χρήση.

αεροζόλ εφαρμογή της ΡΕΙ-ρϋΝΑ πολυσύμπλοκα

εφαρμογή

αεροζόλ διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Εν συντομία, ένα LC STAR νεφελοποιητή (Pari, Starnberg, Γερμανία), οδηγείται από υψηλή πίεση, η οποία παράγεται από ένα συμπιεστή BOY®SX (Pari, Starnberg, Γερμανία) συνδεδεμένο με ένα διαχωριστή, που γεμίζουν με 500 g μαργαριτάρια Ξήρανση Orange (Sigma -Aldrich, Deisenhofen, Γερμανία). Ο αποστάτης με τη σειρά του συνδέεται με ένα πλαστικό κουτί με τέσσερις μικρές οπές στην απέναντι πλευρά, για να επιτρέψει τη ροή αερολύματος. Προκειμένου να διευκολυνθεί η υψηλότερη εναπόθεση αεροζόλ στον πνεύμονα, τα ζώα είχαν ενθαρρυνθεί για την επιτάχυνση της αναπνοής με την οδήγηση του συμπιεστή με συνθετικό αέρα, εμπλουτισμένο με 5% CO

2.

Ιστολογίας

Τα ζώα ήταν ευθανασία με ενδοπεριτοναϊκή ένεση πεντοβαρβιτάλης. Στη συνέχεια οι πνεύμονες απομακρύνθηκαν, διογκώθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη μέσα από την τραχεία και περαιτέρω επεξεργασία για χρώση αιματοξυλίνη-ηωσίνη σύμφωνα με ένα πρότυπο πρωτόκολλο.

In-situ υβριδισμού

-situ υβριδισμού (ISH ) διεξήχθη όπως περιγράφεται από τον Ariel κ.ά. [16], με τη χρήση του επισημασμένου με διγοξιγενίνη RNA ανιχνευτή Η19 ή με μία τροποποίηση αυτής της μεθόδου χρησιμοποιώντας Η19-LNA (κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ) Dig-σημασμένο ανιχνευτή συντεθεί σε Exiqon.

Στατιστικά

τα αποτελέσματα αναφέρονται ως μέσες τιμές και τυπικές αποκλίσεις. Η στατιστική σημαντικότητα μεταξύ δύο ομάδων προσδιορίστηκε με ένα Mann-Whitney-U-Test για

in-vitro

αποτελέσματα και με ένα Logrank-test για

in-vivo

αποτελέσματα. Πιθανότητα (P) & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 5.0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA) το πρόγραμμα StatView.

Αποτελέσματα

πλασμίδιο pBC-819 αναστέλλει

in vitro

τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

In vitro

πειράματα επιμόλυνσης πραγματοποιήθηκαν σε διαφορετικούς ανθρώπινους καρκίνου του πνεύμονα που προέρχονται κυτταρικές σειρές. Αυξανόμενες ποσότητες pBC-819 (0, 350 και 700 ng) συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng του πλασμιδίου που κωδικοποιεί λουσιφεράση. Η συνολική ποσότητα του ρϋΝΑ πληρώθηκε μέχρι 800 ng για όλα τα συγκριτικά δείγματα χρησιμοποιώντας pUC21 πλασμίδιο όπως ρϋΝΑ πλήρωσης. Ως εκ τούτου, η αποτελεσματικότητα του pBC-819 καθορίζεται έμμεσα με τη μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης, υποδεικνύοντας καταστροφή των επιμολυσμένων κυττάρων του όγκου.

Χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 ως αντιδραστηρίου επιμόλυνσης, έναν χρόνο και εξαρτώμενη από τη δόση μείωση της δραστηριότητας της λουσιφεράσης παρατηρήθηκε σε κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν. Η επίδραση του pBC-819 έγινε εμφανής ήδη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση με μείωση της λουσιφεράσης δραστικότητα μεγαλύτερη από 90%, όταν 350 ng (Εικ. 1Α) και περισσότερο από 95% (Σχ. 1 Β), όταν 700 ng του π.Χ.- 819 χρησιμοποιήθηκαν. Περισσότερο από το 98% της δραστικότητας λουσιφεράσης αναστάλθηκε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, όταν ng χρησιμοποιήθηκαν 700 BC-819. Παρόμοιο αποτέλεσμα ελήφθη επίσης με 350 ng, εκτός από την κυτταρική γραμμή NCI-H358.

ΝΟΙ-Η460, ΝΟΙ-Η358 και Α549 κύτταρα επιμολύνθηκαν, χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000, με BC-819 και συν-επιμολύνθηκαν με ένα πλασμίδιο, το οποίο κωδικοποιεί για το ένζυμο ανταποκριτή λουσιφεράσης. Ήδη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, η δράση της λουσιφεράσης (έμμεσα υποδεικνύει κυτταρικής ανάπτυξης) μειώθηκε κατά τουλάχιστον & gt? 90% όταν 350 ng BC-819 χρησιμοποιήθηκε (Α). 48 ώρες αργότερα δραστικότητα λουσιφεράσης μειώθηκε κατά περισσότερο από 98%, με εξαίρεση την κυτταρική σειρά ΝΟΙ-Η358. Ωστόσο, η μείωση της λουσιφεράσης από περισσότερο από 98% παρατηρήθηκε σε όλες τις κυτταρικές σειρές όταν η ποσότητα του BC-819 αυξήθηκε σε 700 ng (Β). Η επίδραση του BC-819 επί βιοφωταυγείς Α549-C8-Luc εξετάσθηκε επίσης και αποκάλυψε μειωμένη λουσιφεράσης και συνεπώς μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων (πάνω από 50%) ακόμη και μετά από 24 ώρες (C). Η μέγιστη αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης επιτεύχθηκε από 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, η οποία εκδηλώνεται μέσω της μείωσης άνω του 75% της δραστηριότητας της λουσιφεράσης.

Η

Οι μελέτες μας ενέπνευσε να ελέγξουν αυτό το πλασμίδιο με την κυτταρική σειρά Α549-C8- luc, το οποίο είχε σταθερά επιμολυσμένα με λουσιφεράση. Μέτρηση της λουσιφεράσης σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά την επιμόλυνση έδειξε ότι BC-819 ήταν αποτελεσματικό στην Α549-C8-Luc κύτταρα ήδη 24 ώρες μετά την επιμόλυνση (Εικ. 1 C). Η χαμηλότερη συγκέντρωση (400 ng) του BC-819 έδειξε να είναι ικανά να μειώσουν δραστικότητα λουσιφεράσης κατά περισσότερο από 50%. Χρησιμοποιώντας 800 ng BC-819, ήταν δυνατό να μειώσει την δραστικότητα λουσιφεράσης κατά περισσότερο από 75%. Λαμβανόμενες μαζί αυτές οι μελέτες αποκάλυψαν μια σαφή επίδραση του πλασμιδίου BC-819 στην κυτταρική βιωσιμότητα των ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

in vitro

.

Η ανάπτυξη των όγκων του πνεύμονα εξαρτάται από την περιοχή εφαρμογής των καρκινικών κυττάρων

Για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα της θεραπείας αερολύματος pBC-819

in vivo

, ορθοτοπική όγκων του πνεύμονα παρήχθησαν στην ανοσολογική ανεπάρκεια ποντίκια με ενδοβρογχική ή ενδοφλέβια εφαρμογή του Α549-C8-Luc κύτταρα. Βρήκαμε ότι η επιλογή της διαδρομής εφαρμογής επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό τα πρότυπα ανάπτυξης των προκυπτόντων όγκων του πνεύμονα και επηρέασε την επιβίωση των ζώων. Ενδοβρογχική εφαρμογή του Α549-C8-Luc κύτταρα δημιούργησαν φωταύγειας όγκους, αρχικά εντοπίζεται στην σφαγίτιδα περιοχή, με 10 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση και στη συνέχεια τη διάδοση ουραία προς τα αριστερά ή προς τα δεξιά των πνευμόνων κατά 66 ημέρες (σχ. 2Α). Ωστόσο, οι όγκοι που επάγονται μέσω ενδοφλέβιας ένεσης του Α549-C8-Luc κύτταρα όγκου, χαρακτηρίζονταν από διαδίδονται σήματα βιοφωταύγεια σε δύο πνεύμονες μετά από 10 ημέρες, οι οποίες στη συνέχεια συνεχώς αυξάνεται (Σχ. 2Β).

Η ανάπτυξη των πνευμόνων ορθοτοπική όγκων μετρήθηκε σε καθορισμένα χρονικά σημεία χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγεια. Ενδοβρογχικά που προκαλείται από όγκους (Α) εμφανίστηκε αρχικά στη σφαγίτιδα περιοχή και να διαδίδονται στα βαθύτερα στους πνεύμονες σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία, ενώ ενδοφλεβίως προκαλείται από όγκους (Β) που περιορίζεται στην περιοχή του πνεύμονα μόνο. ​​

Η

Η ιστοπαθολογική μετά τη σφαγή εξέταση των ενδοβρογχικά που προκαλείται από όγκους του πνεύμονα αποκαλύφθηκε πρώτα στοιχεία του ιστού του όγκου εντός της περιβρογχιολική περιοχή μετά από 10 ημέρες (Εικ. 3Α). Εξετάσεις σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία αποκάλυψε πολλαπλές οζίδια όγκου, εντοπίζεται στο παρέγχυμα, το περιβρογχιολική περιοχή και εντός του βρόγχους (Σχ. 3 Β-C). Πνεύμονες, που επηρεάζονται από ενδοφλέβια επαγόμενη όγκους, ωστόσο, χαρακτηρίζονται από διαδίδονται ιστό του όγκου μόνο στο παρέγχυμα του οργάνου (Σχ. 3 D).

Οι όγκοι ήταν ανιχνεύσιμα ήδη 10 ημέρες μετά την εμφύτευση ενδοβρογχική στο περιβρογχιολική περιοχή των πνευμόνων (Α). Τέλος τα στάδια της επαγόμενης ενδοβρογχικά όγκων πνεύμονα που χαρακτηρίζονται από πολλαπλά, περιβρογχιολική και παρεγχυματική εντοπισμένους όγκους (Β) και από τον ιστό του όγκου εντός των περιοχών του αυλού του πνεύμονα, καθώς και (C). Ενδοφλέβια ένεση του Α549-C8-Ιυο, ωστόσο, κατέληξε σε όγκους κυρίως αυξάνεται στο παρέγχυμα των πνευμόνων αλλά όχι περιβρογχιολική ή εντός των βρόγχων (D). Το Σχήμα D παρουσιάζει καρκινικού ιστού παρεγχυματική κοντά σε ένα βρόγχο, αλλά όχι περιβρογχιολική. Κυψελιδικός ιστός εντοπισμένη μεταξύ του όγκου και του βρόγχου ωστόσο συμπυκνώνεται από το παρακείμενο οζιδίου όγκου.

Η

Α549-C8-Luc βασίζεται όγκων του πνεύμονα είναι έντονα θετικό για το ογκογονίδιο Η19

Επειδή η παρουσία του μη κωδικοποιητικού RNA Η19 είναι ζωτικής σημασίας για την αποτελεσματικότητα του BC-819, εξετάσαμε ιστό του όγκου για την παρουσία μη-κωδικοποίησης Η19 RNA. In-situ υβριδοποίηση αποκάλυψε μια ισχυρή έκφραση του Η19 σε Α549-C8-Luc όγκους του πνεύμονα που βασίζεται, που υποδεικνύεται από καφετί χρωματισμού του εξεταζόμενο ιστό (Εικ. 4).

Μια ενδοβρογχικά επαγόμενη όγκου πνεύμονα χρωματίστηκαν για Η.Ε. (Α) και διαλογή για Η19-δραστικότητα χρησιμοποιώντας ISH (Β). Στο δεδομένο δείγμα μια ισχυρή έκφραση του Η19 βρέθηκε, υποδεικνύεται από ένα καφετί χρωματισμού του στον εξεταζόμενο ιστό.

Η

Η εισπνοή PEI /pBC-819 αερόλυμα αναστέλλει πρωτογενή αλλά όχι δευτερογενή ανάπτυξη του όγκου

με βάση τα αποτελέσματα από

in vitro

πειράματα, η αποτελεσματικότητα της pBC-819 ερευνήθηκε

in vivo

μέσω της εφαρμογής της αερολυμένης πλασμιδίου pBC-819 στον πνεύμονα ποντικών που φέρουν όγκο. Αυτά τα πειράματα διεξήχθησαν σε ποντίκια που πάσχουν από είτε ενδοβρογχικά ή ενδοφλεβίως επαγόμενων όγκων του πνεύμονα, ώστε να μιμούνται αντίκτυπος pBC-819 για πρωτογενείς και δευτερογενείς όγκους του πνεύμονα.

Για μεταγενέστερη αίτηση αεροζόλ pBC-819 ήταν σε σύμπλεγμα με διακλαδισμένη ΡΕΙ και να χορηγηθούν σε ένα τροποποιημένο ολόκληρο το σώμα του θαλάμου εισπνοή. Η θεραπεία των ποντικών που φέρουν όγκου πνεύμονα ξεκίνησε στις 21 ημέρες μετά τη μεταμόσχευση των κυττάρων του όγκου, μόλις η ένδειξη όγκων του πνεύμονα είχαν επαληθευθεί χρησιμοποιώντας

in vivo

bioluminescent απεικόνισης. Το πρωτόκολλο θεραπείας που περιλαμβάνεται μία διαδικασία εισπνοής την εβδομάδα για συνολικό χρονικό διάστημα των 10 εβδομάδων.

Αυτά τα πειράματα αποκάλυψαν είτε την πλήρη κατάργηση ή χειροτερεύει εξασθενημένο την εξέλιξη του όγκου σε ποντίκια που πάσχουν από ενδοβρογχικά που προκαλείται από όγκους του πνεύμονα, όταν αντιμετωπίζονται με PEI /pBC- 819 αεροζόλ (Σχ. 5Α-Β). Μια δραστηριότητα βιοφωτισμός από περισσότερο από 2 × 10

5 φωτόνια ανά δευτερόλεπτο συνδέθηκε με μια ταχεία μείωση της γενικής κατάστασης του ζώου (υποδεικνύεται με γρήγορη απώλεια βάρους και δύσπνοια) και ως εκ τούτου ορίζεται ως τελικό σημείο-κριτήρια. Με βάση αυτή τη διαδικαστική μέθοδος, μια διάμεση επιβίωση των 66 ημερών υπολογίζεται για τα ζώα της ομάδας ελέγχου άνευ αγωγής. Σε αντίθεση με αυτό, αγωγή ποντικοί επιβίωσαν περισσότερο από 200 ημέρες, ακόμη και αν αεροζόλ εφαρμογή της ΡΕΙ τερματίστηκε /pBC-819 αερολύματος πάνω από 100 ημέρες νωρίτερα, στις ημέρες 91. Εκτός από ένα ποντίκι, κάθε επεξεργασμένο ποντίκια (η = 5) επιβίωσαν περισσότερες από 200 ημέρες, που είναι είτε δωρεάν των όγκων του πνεύμονα ή παρουσιάζουν μείωση της ανάπτυξης του όγκου και καμία επιδείνωση της γενικής κατάστασης. Ένα ποντίκι δεν είχαν σημάδια απόδειξη όγκων στους πνεύμονες κατά την ημέρα 200, αλλά πράγματι μία απομακρυσμένη μετάσταση στον εγκέφαλο (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Η ανάπτυξη των όγκων του πνεύμονα σε ποντικούς χωρίς αγωγή χαρακτηρίστηκε από την αρχική εμφάνιση όγκου στο περιοχή του λαιμού και εν συνεχεία συνεχή διάχυση στους πνεύμονες (Α). Αυτό το πρότυπο ανάπτυξης διέφερε σε ποντίκια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με BC-819, όπου οι όγκοι είτε μειώθηκαν σε μέγεθος ή σε τελείως εξαφανιστεί κατά τη διάρκεια της θεραπείας.

Η

Τέλος, την ημέρα 200 εκλέχτηκε για να είναι το τελικό σημείο της μελέτης. Η στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων αποκάλυψε μια πολύ στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ = 0,01) μεταξύ της ομάδας θεραπείας και ελέγχου όσον αφορά το χρόνο που ήταν απαραίτητη για να φτάσει το τελικό σημείο της μελέτης (Εικ. 6Α).

ποντικούς φέροντες ενδοβρογχικά επαγόμενη όγκων του πνεύμονα έδειξαν σημαντικό όφελος επιβίωσης (p = 0.01), όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με BC-819 σε σύγκριση με ζώα τα οποία δεν έλαβαν αγωγή (Α). Δεν όφελος επιβίωσης παρατηρήθηκε σε ποντίκια που πάσχουν από ενδοφλέβια προκαλείται από όγκους του πνεύμονα, ανεξάρτητα από τη θεραπεία με BC-819 (Β).

Η

Η θεραπεία με PEI /pBC-819-αεροζόλ έδειξε να είναι λιγότερο αποτελεσματική σε ποντίκια που πάσχουν από όγκους του πνεύμονα, τα οποία δημιουργούνται μέσω της ενδοφλέβιας ένεσης των κυττάρων του όγκου Α549-C8-Luc. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, τα καρκινικά κύτταρα τέθηκε πνεύμονες μέσω της κυκλοφορίας του αίματος, κατά συνέπεια επηρεάζουν εντοπισμό και την ανάπτυξη μοντέλων των όγκων του πνεύμονα, με αποτέλεσμα σε όγκους που αναπτύσσονται στην παρέγχυμα, αλλά όχι στους βρόγχους. Υπό αυτή την κατάσταση, η αγωγή με ΡΕΙ /pBC-819-αεροζόλ δεν οδήγησε σε στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ζώων. Ακόμα κι αν ενδοφλεβίως προκαλείται από όγκους μεγάλωσε πιο γρήγορα, επιδείνωση της γενικής κατάστασης αναγνωρίστηκε το συντομότερο μια δραστηριότητα λουσιφεράσης ξεπέρασε το 1 × 10

6 φωτόνια ανά δευτερόλεπτο, το οποίο ως εκ τούτου, επιλέχθηκε ως ένα τελικό σημείο για τα ποντίκια που πάσχουν από ενδοφλέβια προκαλείται από όγκους του πνεύμονα. Ο διάμεσος χρόνος για την επίτευξη αυτού του τελικού σημείου ήταν 43 ημέρες για τα ζώα άνευ αγωγής και 36 ημέρες για τα ζώα που υπέστησαν αγωγή. Περαιτέρω στατιστική ανάλυση αυτών των αποτελεσμάτων δεν αποκάλυψε καμία σημαντική διαφορά (ρ = 0,3) μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ποντίκια (Σχ. 6Β).

Συνοπτικά, τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων καταδεικνύουν, αυτό αερόλυμα ΡΕΙ /pBC-819 είναι ικανές να αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου του πνεύμονα σε ποντικούς που πάσχουν από ενδοβρογχικά επαγόμενη όγκων του πνεύμονα. Επιπλέον, τα παρόντα αποτελέσματα δείχνουν ότι ένα ανάλογο αποτέλεσμα δεν θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε ποντίκια, τα οποία έπασχαν από όγκους παρεγχύματος του πνεύμονα, μετά από ενδοφλέβια εφαρμογή των καρκινικών κυττάρων.

Συζήτηση

Η γονιδιακή θεραπεία θεωρείται για να διευκολύνει ευκαιρίες θεραπεία για ανίατες πνευμονικές ασθένειες συμπεριλαμβανομένου μονογενετικές ελαττώματα όπως κυστική ίνωση, άλφα ανεπάρκεια

1-αντιθρυψίνης και πολύπλοκη ασθένεια όπως το άσθμα και ο καρκίνος του πνεύμονα [19]. Από την άποψη αυτή, η τοπική εφαρμογή της γονιδιακής θεραπευτικά φάρμακα ως αερολύματα έχει θεωρηθεί ότι είναι πλεονεκτικό για τη στόχευση των πνευμόνων επειδή i) το επιθυμητό φάρμακο θα μπορούσε να χορηγηθεί σε μεγάλη ποσότητα απ ‘ευθείας στη θέση της νόσου και ii) σοβαρές παρενέργειες οι οποίες θα μπορούσαν να προκληθούν από συστηματική εφαρμογή των νουκλεϊκών οξέων και /ή γονιδιακών θεραπευτικών φορείς θα πρέπει να ελαχιστοποιηθεί. Η έννοια της γονιδιακής θεραπείας αεροζόλ βασίζονται ερευνήθηκε περαιτέρω στην παρούσα εργασία μέσω της εφαρμογής του πλασμιδίου BC-819 σε ένα ορθοτοπικό μοντέλο ξενομοσχεύματος ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα. Από αυτή την άποψη, ερευνήσαμε εάν ειδικές κυττάρου όγκου πλασμίδια ήταν ικανά να καταστρέφουν μόνο πρωτοπαθείς όγκους του αυλού αεραγωγών ή αν ήταν επίσης ικανός να δείχνει μια επίδραση έναντι δευτερογενείς όγκους που βρίσκονται στον ιστό παρεγχυματικό. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα, οι όγκοι του πνεύμονα προκλήθηκαν χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές διαδρομές εφαρμογής του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων. Οι όγκοι που αναπτύσσονται από την πλευρά αυλού των πνευμόνων ελήφθησαν όταν τα κύτταρα εφαρμόζονται ενδοβρογχικά και οι όγκοι αυξάνονται από την πλευρά των αιμοφόρων αγγείων »είχαν ληφθεί με εφαρμογή των κυττάρων ενδοφλεβίως. Ιστολογία του ενδοβρογχικά επαγόμενων όγκων αποκάλυψε ένδειξη όγκων στο παρέγχυμα του οργάνου και στις βρογχικές τοίχους. Αυτά τα ευρήματα αντιστοιχούν με τα αποτελέσματα, τα οποία έχουν αναφερθεί από άλλους συγγραφείς [15]. Ενδοφλέβια έγχυση των κυττάρων όγκου, όμως, είχε ως αποτέλεσμα καρκινώματα μόνο αυξάνεται στο παρέγχυμα των πνευμόνων, αλλά όχι στις βρογχικές τοίχους. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολούθηση χρησιμοποιώντας απεικόνιση βιοφωταύγειας ενίσχυσαν τη επιτευχθέντα αποτελέσματα από ιστολογία, αποκαλύπτοντας διαφορετικά πρότυπα ανάπτυξης των όγκων, τα οποία επάγονται ενδοβρογχικά και ενδοφλεβίως. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι ενδοβρογχικά επάγεται όγκων του πνεύμονα προκύπτουν από την περιβρογχιολική περιοχή η οποία υποδηλώνει ότι ενδοβρογχικά εφαρμόζονται τα κύτταρα πρέπει να είναι ικανά να εισβάλει και να κατακτήσει τον βρογχικό επιθήλιο, προκειμένου να αποικίσουν τον περιβρογχιολική ιστού. Αυτό το εύρημα είναι ενθαρρυντική σε σχέση με τα αποτελέσματα των άλλων ομάδων που απέδειξαν αποικισμός του πνεύμονα επιθηλίων με σημασμένο με γενετική μηχανική μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα, όταν εφαρμόζεται μέσω της ενδοβρογχική διαδρομή [20]. Με βάση την υπόθεση ότι ενδοβρογχικά εφαρμόζονται τα καρκινικά κύτταρα εισβάλλουν αρχικά τα επιθηλιακά στρώματα στο βρογχικό περιοχή για να εξαπλωθεί στη συνέχεια περιβρογχιολική, προτείναμε ότι η θεραπεία με μορφή αερολύματος π.Χ.-819 πρέπει να είναι αποτελεσματικά στην καταστροφή των καρκινικών κυττάρων όπως και άλλοι έχουν δείξει στο παρελθόν ότι νεφελοποιημένα λουσιφεράσης κωδικοποίηση DNA πλασμιδίου transfects κυρίως των βρογχικών και φατνιακό επιθήλιο όταν συμπλέκονται με διακλαδισμένη PEI [7], [8].

για να τεκμηριώσει την υπόθεσή μας, αντιμετωπίσαμε ποντίκια που φέρουν όγκους με το πλασμίδιο BC-819 που έχει πρόσφατα δειχθεί ότι είναι θεραπευτικώς αποτελεσματική σε BCG ανθεκτικά καρκινώματα της ουροδόχου κύστης σε ασθενείς [21]. Το πλασμίδιο BC-819 κωδικούς για το θραύσμα Α της τοξίνης της διφθερίτιδας και οδηγείται από τον προαγωγό Η19. Ως υποστηρικτής Η19 είναι ενεργή μόνο σε κακοήθη κύτταρα και κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης, καρκινικός ιστός έχει καταστραφεί, ενώ υγιή ιστό μένει αλώβητος [10]. Πριν από την

in vivo πειράματα

η αποτελεσματικότητα του BC-819 προσδιορίστηκε στα καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η460, ΝΟΙ-Η358 και Α549

in vitro

, αποκαλύπτοντας ένα σημαντικά ανασταλτικό αποτέλεσμα στην κυτταρική ανάπτυξη. Έχει προηγουμένως δειχθεί ότι ο μη-κωδικοποίησης mRNA Η19 εκφράζεται έντονα, υποδεικνύοντας ενεργές υποκινητή Η19, σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα, ιδιαίτερα στον Α549 [22]. Κατά συνέπεια, οι καρκίνοι του πνεύμονα σε ποντίκια επάγονται με τη χρήση της λουσιφεράσης που εκφράζουν κυτταρική γραμμή Α549-C8-Luc το οποίο είχε επίσης φαίνεται να είναι ευαίσθητα για το πλασμίδιο BC-819. Επιπλέον, εξετάστηκαν οι πνεύμονες μετά τη σφαγή για Η19-έκφραση με In-situ υβριδισμού η οποία αποκάλυψε ισχυρή απόδειξη της έκφρασης Η19 στο Α549-C8-Luc όγκων του πνεύμονα.

Αυτό το πείραμα αποκάλυψε ότι η εβδομαδιαία θεραπεία αερολύματος με PEI /BC-819 δίνει μια σημαντική (ρ = 0.01) την επιβίωση όφελος για ποντίκια που πάσχουν από ενδοβρογχικά επαγόμενη όγκων του πνεύμονα, αλλά όχι σε ποντίκια που πάσχουν από ενδοφλέβια επαγόμενων όγκων του πνεύμονα (ρ = 0.36). Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, εικάζουν ότι θεραπεία αερολύματος ΡΕΙ /BC-819 είναι αποτελεσματικό μόνο σε πρωτογενείς όγκους του πνεύμονα τα οποία είναι προσιτά μέσω της εισπνοής, διότι η ανάπτυξη κακοηθών προκύπτει κυρίως από την πλευρά του αυλού των αεραγωγών. Σε αντίθεση με αυτό, η ανάπτυξη του όγκου του ενδοφλεβίως προκαλούμενη όγκων του πνεύμονα εξελίσσεται πρωτίστως από τα αιμοφόρα αγγεία, στη συνέχεια εισβάλλουν στην παρέγχυμα του πνεύμονα. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, αεροζόλ βασισμένο μεταφορά γονιδίων κατά κύριο λόγο περιορίζεται στο βρογχικό επιθήλιο. Σίγουρα, αυτό δεν σημαίνει ότι τα θεραπευτικά αποτελέσματα δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί για το πλήρες όργανο. Στην πραγματικότητα, πολλές μελέτες έδειξαν επιτυχώς επιδράσεις του νεφοποιημένου ρϋΝΑ στη δευτεροβάθμια μοντέλα καρκίνου του πνεύμονα [23]. Ωστόσο, άλλα κατασκευάσματα πλασμιδίου χρησιμοποιήθηκαν σε αυτές τις μελέτες, χωρίς ειδικούς προαγωγούς των καρκινικών κυττάρων και περιλαμβάνει γονίδια για τοξικές πρωτεΐνες λιγότερο κύτταρο, π.χ. ο ογκοκατασταλτικό ρ53 πρωτεΐνη. Επιπλέον, μια αποπτωτική πρωτεΐνη όπως ρ53 πιθανότατα δεν θα οδηγήσει σε άμεση καταστροφή του διαμολυνθέντος κυττάρου, ως εκ τούτου αυξάνοντας την πιθανότητα ότι η υπερβολική ρ53 θα μπορούσε να απελευθερωθεί από το διαμολυνθέν κύτταρο ή περισσότερο πιθανό, παρακρινής ή διαμεσολαβείται ιντερλευκίνη σηματοδότηση θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί στην περιβάλλουσα ιστού.

Ακόμα κι αν αεροζόλ εφαρμογή φαίνεται πολλά υποσχόμενη για το μέλλον θεραπείες σοβαρών ασθενειών των πνευμόνων, θα πρέπει να έχουμε κατά νου ότι αυτό το είδος της θεραπείας φαίνεται σαν μια βόλτα τεντωμένο σχοινί. Πράγματι, η πιθανότητα σοβαρών παρενεργειών, όπως φλεγμονή ή αλλεργικές αντιδράσεις, θα αυξηθεί με την τοξικότητα και την ευερεθιστότητα των εφαρμοζόμενων ουσίες, οι οποίες, κατά συνέπεια, περιορίζει το πλεονέκτημα της αναπνευστικής οδού. Οι ανησυχίες, όπως αυτές μπορεί να έχουν θεωρηθεί ιδιαίτερα για την εφαρμογή αερολύματος κυτταροτοξικών ουσιών, όπως paclitaxel [6] ή δοξορουβικίνη [5], αλλά μπορεί επίσης να είναι χρήσιμες για την εφαρμογή των νουκλεϊκών οξέων. Πράγματι ένας ισχυρός ανοσοποιητικό σύστημα δεν λειτουργεί μόνο σε ξένα παθογόνα, αλλά και σε μη-ιικούς φορείς και νουκλεϊκά οξέα. Ωστόσο, μόνο μια μικρή αύξηση των κυτταροκινών έχει περιγραφεί για την εφαρμογή αερολύματος της διακλαδισμένης ΡΕΙ στους πνεύμονες [24], [25], [26]. Εκτός από φλεγμονή οφείλεται σε ανοσολογικές αντιδράσεις, σοβαρές παρενέργειες θα μπορούσε να εξελιχθεί από την καταστροφή των ιστών. Σε αυτό το πλαίσιο πρέπει να εξεταστεί η ιδιαίτερη αρχιτεκτονική των πνευμόνων. Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης των αιμοφόρων αγγείων αυξάνει την ευαισθησία για αιμορραγίες πνεύμονα απειλητικές για τη ζωή (αιμόπτυση), η οποία θα μπορούσε να προκληθεί από κύτταρο τοξικών ουσιών [27]. Σύμφωνα με αυτή τη θεώρηση φαίνεται πιθανό ότι οι ειδικές πλασμίδια των καρκινικών κυττάρων, όπως BC-819 το οποίο καταστρέφει μόνο όγκου αλλά όχι τους υγιείς ιστούς θα μπορούσε να φέρει πολλά υποσχόμενη οφέλη για τη θεραπεία αερολύματος των καρκίνων του πνεύμονα.