Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών (OVCA) είναι η πέμπτη πιο κοινή αιτία θανάτου από όλες τις μορφές καρκίνου μεταξύ των γυναικών Ηνωμένων Πολιτειών και η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες. Ενώ οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται OVCA αρχικά σε χειρουργική debulking και χημειοθεραπεία, το 75% των ασθενών που αργότερα υποκύψει στην νόσο. Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για τη δοκιμή νέων θεραπευτικών παραγόντων για την αντιμετώπιση του υψηλού ποσοστού θνησιμότητας που σχετίζεται με OVCA. Σε αυτό το πλαίσιο, έχουμε αναπτύξει και μηχανικής Nanoceria (nce), νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου, που διαθέτουν αντι-οξειδωτικές ιδιότητες, για να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτικό μέσο σε OVCA. Δείχνουμε για πρώτη φορά ότι nce ανέστειλε σημαντικά την παραγωγή δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) σε κύτταρα Α2780, εξασθενημένα αυξητικού παράγοντα (SDF1, ΗΒ-ΕΟΡ, VEGF

165 και HGF) μεσολαβεί κυτταρική μετανάστευση και εισβολή κυττάρων SKOV3, χωρίς επηρεάζουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. θεραπεία nce ανέστειλε επίσης VEGF

165 επαγόμενο πολλαπλασιασμό, σχηματισμό τριχοειδούς σωλήνα, η ενεργοποίηση του VEGFR2 και ΜΜΡ2 σε ανθρώπινο ομφάλιο αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC). Nce (0,1 mg /kg σωματικού ζυγίζουν) θεραπεία του Α2780 καρκινικά κύτταρα ωοθηκών εγχέονται ενδοπεριτοναϊκώς σε γυμνά ποντίκια έδειξαν σημαντική μείωση (ρ & lt? 0.002) στην ανάπτυξη του όγκου συνοδεύεται από μειωμένη πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων όπως είναι εμφανές από τη μείωση του μεγέθους του όγκου και χρώση Κί67. Συσσώρευση nce βρέθηκε σε όγκους που απομονώνεται από ομάδα υπό αγωγή χρησιμοποιώντας μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου (ΤΕΜ) και επαγωγικά συζευγμένου φασματοσκοπία μάζας πλάσματος (ICP-MS). Μείωση της μάζας του όγκου συνοδεύθηκε από εξασθένηση της αγγειογένεσης, όπως παρατηρείται από τη μειωμένη χρώση CD31 και ειδική απόπτωση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι, με βάση οξείδιο του δημητρίου nce είναι μια νέα νανοσωματίδιο που μπορεί δυνητικά να χρησιμοποιηθεί ως αντι-αγγειογενετική θεραπευτικού παράγοντα στον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Giri S, Karakoti Α, Graham RP, Maguire JL, Reilly CM, Seal S, et al. (2013) Nanoceria: Μια Σπάνιες Γη νανοσωματιδίων ως νέα αντι-αγγειογενετική Θεραπευτικού παράγοντα στον καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (1): e54578. doi: 10.1371 /journal.pone.0054578

Επιμέλεια: Surinder Κ Batra, Πανεπιστήμιο της Νεμπράσκα Ιατρικό Κέντρο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 του Ιουλίου του 2011? Αποδεκτές: 13 του Δεκέμβρη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 31, Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Giri et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίζεται κυρίως από CA123249 και υποστήριξη από το Mayo Clinic College of Medicine στο VS και εν μέρει υποστηρίζεται από Marsh Rivkin χορηγεί στην SG και RR. Αυτή η εργασία υποστηρίζεται μερικώς από τον οργανισμό NSF CBET, 0708172 και 0930170 για να SS (για την ανάπτυξη νανοσωματιδίων σε βιοϊατρικές εφαρμογές). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Στις Ηνωμένες Πολιτείες, 27.000 γυναίκες διαγιγνώσκονται και περίπου 14, 000 γυναίκες πεθαίνουν από OVCA ετησίως [1]. Τέτοιες υψηλές τιμές θνησιμότητας οφείλεται στην πλειοψηφία των ασθενών (75%) που παρουσιάζουν με προχωρημένο (στάδιο III ή μεγαλύτερο) νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης [2]. Περισσότερο από το 90% των ασθενών έχουν καλύτερη πρόγνωση εάν ο καρκίνος ανιχνεύεται σε πρώιμα στάδια της. Θεραπεία του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών περιλαμβάνει γενικά χειρουργικό debulking ακολουθούμενη από χημειοθεραπεία με ένα συνδυασμό πλατίνας και ενός παράγοντα που περιέχει ταξάνιο. Ωστόσο, η πλειοψηφία των ασθενών επαναληφθεί και τελικά να υποκύψει σε καρκίνο τους. Κατά συνέπεια, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών που μπορεί να είναι πιο αποτελεσματική στη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών και την καθυστέρηση ή την πρόληψη υποτροπών. Νέες θεραπείες που στοχεύουν ωοθηκών καρκινογένεση εκτενώς ερευνηθεί, αλλά έχουμε ακόμη να καταλήξει σε ένα υποσχόμενο φάρμακο.

εργαλεία και τεχνικές νανοτεχνολογίας με βάση τα ταχέως αναδυόμενες στους τομείς της ιατρικής απεικόνισης και στοχευμένη χορήγηση φαρμάκων. οξείδιο του δημητρίου είναι ένα οξείδιο σπάνιας γαίας που βρίσκεται στη σειρά λανθανιδών του περιοδικού πίνακα. οξείδιο νανοκρυσταλλικά δημητρίου (nanoceria) παρουσιάζει μία κυανή μετατόπιση στο φάσμα απορρόφησης υπεριώδους, η μετατόπιση και διεύρυνση της Raman επιτρέπεται τρόπων και επέκτασης πλέγματος σε σύγκριση με το οξείδιο του δημητρίου χύδην υποδεικνύοντας τις μοναδικές του ιδιότητες. Nce έχει αναδειχθεί ως μια προσοδοφόρα υλικό στη βιοϊατρική επιστήμη λόγω της μοναδικής ικανότητάς του να στραφεί καταστάσεις οξείδωσης μεταξύ (III) και (IV) ανάλογα με το περιβάλλον. Η δυνατότητα για εναλλαγή μεταξύ μικτές καταστάσεις οξείδωσης του nanoceria είναι συγκρίσιμη με τη βιολογική αντιοξειδωτικά. Αυτό προσδίδει nanoceria με μια πολύ σημαντική βιολογική ιδιότητα των ριζών που μπορεί να συντονιστεί με βάση την κατακράτηση των κενών θέσεων οξυγόνου (ελαττώματα) και η συγκέντρωση του Ce3 + είδους στην nanoceria. Η αναστρεψιμότητα της κατάστασης οξείδωσης είναι το κλειδί ακίνητο στη λήψη nanoceria ένα ισχυρό αντιοξειδωτικό, μειώνοντας έτσι την ανάγκη για συχνή επαναλαμβανόμενη δοσολογία. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου κατέχουν εξαιρετικές αντιοξειδωτικές ιδιότητες και δρουν ως ισχυροί, αναγεννητική καθαριστές ελεύθερων ριζών στα βιολογικά συστήματα [3], [4], [5]. Αυτές οι αναγεννητικές αντιοξειδωτικές ιδιότητες οφείλονται, εν μέρει, με τη δομή σθένους του ατόμου του δημητρίου σε συνδυασμό με την εγγενή ελαττώματα στη δομή κρυσταλλικού πλέγματος, τα οποία μεγεθύνονται σε νανομετρική κλίμακα. Έχει προταθεί ότι η μοναδική δομή του τεχνητά νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου, σε σχέση με τα ελαττώματα σθένους και το οξυγόνο, προάγει κυτταρική μακροβιότητα και μειώνει τοξικές προσβολές λόγω της αντιοξειδωτική δράση της, που συμβαίνουν όταν τα νανοσωματίδια εισέλθει στα κύτταρα [6], η αποτροπή της συσσώρευσης αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) στο κύτταρο [3].

όγκων αγγειογένεση χαρακτηρίζεται από το σχηματισμό νέων αιμοφόρων αγγείων από αντικανονική ένα προϋπάρχον αγγειακό δίκτυο. Αυτή η ανώμαλη αγγειογένεση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη, την επιβίωση και τη μετάσταση των περισσοτέρων στερεών όγκων [7], [8]. Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) είναι ένας από τους πιο σημαντικούς προ-αγγειογόνοι παράγοντες, το οποίο δρα ως μιτογόνο για τα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα

in vitro

και ως αγγειογόνος παράγοντας

in vivo

[9 ]. Είναι πάνω από εκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους [10], [11], [12], [13], συμπεριλαμβανομένων OVCA. Πρόσφατα, έχει προταθεί ότι ROS παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του όγκου που επάγεται αγγειογένεση με τον έλεγχο της παραγωγής VEGF. Ενισχυμένη παραγωγή του VEGF έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με μία φτωχή έκβαση για ασθενείς με τόσο νωρίς και προηγμένες OVCA. Διάφορα αντι-αγγειογόνοι παράγοντες έχουν και υποβάλλονται αξιολογήσεων σε κλινικές δοκιμές καρκίνου των ωοθηκών. Μια μελέτη φάσης II του bevacizumab μονού παράγοντα (ένα μονοκλωνικό αντίσωμα που κατευθύνεται εναντίον VEGF) έδειξε ενθαρρυντικά αποτελέσματα [14]. Ως εκ τούτου, σηματοδότηση VEGF είναι να γίνει το επίκεντρο των αντι-αγγειογενετική στοχευμένη θεραπεία σε OVCA.

Στην παρούσα μελέτη, έχουμε δοκιμαστεί νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου ως θεραπευτικό μέσο και

στο

vitro

και

in vivo

στα κύτταρα OVCA. Τα δεδομένα μας αποδεικνύουν ότι nce ήταν ικανή να αναστείλει την ανάπτυξη παράγοντας μεσολάβηση, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων SKOV3, VEGF

165 επαγόμενο πολλαπλασιασμό, σχηματισμό τριχοειδούς σωλήνα και την ενεργοποίηση του VEGFR2 και ΜΜΡ2 σε κύτταρα HUVEC. Το πιο σημαντικό θεραπεία nce ανάπτυξη αναστάλθηκε όγκου

in vivo

με αναστολή της αγγειογένεσης, ειδικά από τη στόχευση των αγγειακών ενδοθηλιακών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Τρυπάνης Μπλε, ΜΤΤ 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλ τετραζόλιο) και ΗΒ-ΕΟΡ ήταν από την Sigma. SDF1, VEGF

165 και HGF αγοράστηκαν από την R &? D Systems (ΜΝ, USA). Ki-67 και VEGF αντισώματα ήταν από την Dako (Glostrup, Δανία) και Abcam (MA, USA) αντίστοιχα. CD31 (PECAM) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA).

Cell Culture

Ανθρώπινο κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 και HUVEC ήταν από την American Type Culture Collection. Α2780 και C200 κυτταρικές σειρές ήταν ένα είδος δώρο του Δρ Tom Hamilton (Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase). κυτταρικές γραμμές OVCA διατηρήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο RPMI που περιέχει 10% FBS, αντιβιοτικά. Κύτταρα HUVEC διατηρήθηκαν σε ΕΒΜ 2-media αγοράστηκε από την Lonza (Δανία).

νανοσωματιδίων Σύνθεση

δημήτριο Οξείδιο νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με υγρή χημική σύνθεση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15], [16], [17]. Εν συντομία, εξαένυδρο νιτρικό δημήτριο διαλύθηκε σε απιονισμένο νερό και στη συνέχεια διηθείται χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 200 nm για να απαλλαγούμε από τυχόν ελεύθερα αναστολή σωματίδια. Τα ιόντα δημητρίου διάλυμα που περιέχει στη συνέχεια οξειδώνεται χρησιμοποιώντας υπεροξείδιο του υδρογόνου και υδροξείδιο του αμμωνίου. Το ρΗ του διαλύματος ρυθμίστηκε μεταξύ 3.5-4.0 χρησιμοποιώντας νιτρικό οξύ ή υδροξείδιο του αμμωνίου. Όλα τα γυάλινα σκεύη τοποθετήθηκαν σε αυτόκλειστο πριν χρησιμοποιηθούν για τη σύνθεση. Το ρΗ και το δυναμικό ζήτα του εναιωρήματος παρακολουθείται στενά ως το διάλυμα αφέθηκε ηλικία σε θερμοκρασία δωματίου για τις επόμενες αρκετές ημέρες μέχρι το σχηματισμό των νανοσωματιδίων με κυρίως Ce

3+ συγκέντρωση παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας υπεριώδους-ορατού φασματοφωτομετρία.

νανοσωματίδια Χαρακτηρισμός

Αλλαγή στα κράτη οξείδωση των ως προετοιμασμένη νανοσωματίδια σε διάλυμα παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας UV-Visible φασματοφωτομετρία. Κλάσματα από το μητρικό δείγμα λήφθηκαν για μετρήσεις απορρόφησης χρησιμοποιώντας Perkin Elmer 750 S φασματοφωτόμετρο. Η κατανομή μορφολογία και το μέγεθος των σωματιδίων μελετήθηκε με τη χρήση υψηλής ανάλυσης ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (HRTEM). Το μέγεθος των νανοσωματιδίων σε όσο παρασκευασμένο διάλυμα πριν από τη χρήση σε

in-vitro

και

in-vivo μελέτες

παρακολουθούνταν επίσης χρησιμοποιώντας δυναμική σκέδαση φωτός (DLS). Οι καταστάσεις οξείδωσης του δημητρίου inthe σωματιδίων επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία φωτοηλεκτρονίων ακτίνων Χ (XPS). Για μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίων υψηλής διακριτικότητας (HRTEM) μια σταγόνα αναστολή των νανοσωματιδίων ήταν χυτό στο δίκτυο χαλκού καλυμμένα με άνθρακα. Οι εικόνες HRTEM των ως προετοιμασμένη σωματίδια ελήφθησαν με ένα Philips (Σειρά Tecnai) που λειτουργεί στα 300 keV. Τα δεδομένα XPS ελήφθησαν χρησιμοποιώντας 5400 ΡΗΙ ESCA (XPS) φασματόμετρο. Δείγματα ήταν σταγόνα χυτό σε μια γκοφρέτα πυριτίου και ξηραίνονται μέσα σε ένα ντουλαπάκι του αζώτου για να αποφευχθεί η οξείδωση του δημητρίου από το ατμοσφαιρικό οξυγόνο και μεταφέρονται χρησιμοποιώντας ένα θάλαμο μεταφοράς δείγματος χωρίς να εκθέτουν τα δείγματα στην ατμόσφαιρα. Μόνο ελήφθησαν περιορισμένη σαρώσεις για την αποφυγή ζημιών ακτινογραφία του δημητρίου. Μια αρχική σάρωση σώθηκε ξεχωριστά μπορεί να συγκριθεί με τις συνδυασμένες 5 αποτελέσματα σάρωσης και έδειξε καμία διαφορά στην Ce

3 + /Ce

4+ αναλογία. Η πίεση βάσης κατά την ανάλυση XPS ήταν 10

-9 Torr και Mg-K

ακτινοβολία α

ακτίνων Χ (1253.6 eV) με ισχύ 200 W χρησιμοποιήθηκε ως πηγή ακτίνων Χ. Η ενέργεια δέσμευσης του Au (4στ

7/2) σε 84,0 ± 0,1 eV χρησιμοποιήθηκε για τη βαθμονόμηση του ενέργεια δέσμευσης κλίμακα του φασματόμετρου. Κάθε στροφή φόρτιση που παράγεται στο φάσμα διορθώθηκε με αναφορά στο C (1 s) θέση στη (284,6 eV) [13]. XPS φάσματα εξομάλυνση και αφαίρεση της γραμμής βάσεως διεξήχθη χρησιμοποιώντας PEAKFIT (Έκδοση 4) λογισμικό.

Μετανάστευση και την εισβολή Αναλύσεις

κύτταρα SKOV3 αναπτύχθηκαν σε μέσα ελεύθερα ορού διάρκεια της νύχτας. μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή μετρήθηκαν όπως περιγράφεται [18] με τροποποιήσεις. Εν συντομία, κυτταρικά αιωρήματα (500 μΙ, 2,5 χ 10

4 κύτταρα) σπάρθηκαν στην κορυφή του μη επικαλυμμένου (δοκιμασία μετανάστευσης) και οι πλάκες transwell επικαλυμμένα με Matrigel (δοκιμασία εισβολής) (διάμετρος πόρων 8-μm? BD Biosciences). εναιωρήματα κυττάρων (500 μΐ) ελεύθερο ορού προστέθηκαν στην κορυφή θάλαμο του transwell. Τα χαμηλότερα θάλαμοι περιείχαν μέσο ελεύθερο ορού που περιέχει διάφορους αυξητικούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων SDF1, ΗΒ-ΕΟΡ, VEGF

165 και HGF με συγκέντρωση 25 ng /ml. Τα κύτταρα εισβάλλουν στην κάτω θάλαμο βάφτηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες (60% PBS, 40% EtOH) και μετρήθηκαν με ένα αντεστραμμένο μικροσκόπιο. Τα αποτελέσματα από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν παρουσιάζονται

Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

δοκιμασία

(i) ΜΤΤ:.

2,5-5,0 × 10

4 κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων εις τριπλούν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις nce για 72 ώρες. ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [19], για να εξακριβωθεί ο αριθμός των ζωντανών κυττάρων.

(ii) την ενσωμάτωση θυμιδίνης:

πολλαπλασιασμό των κυττάρων προσδιορίζεται επίσης από την ενσωμάτωση [

3Η] -θυμιδίνης στο DNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Εν συντομία, 2,5-5,0 × 10

4 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων εις τριπλούν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις nce για 72 ώρες. Κάθε ομάδα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μθί [

3Η] θυμιδίνης στο ίδιο μέσο για 6 ώρες. Τα προσκολλημένα κύτταρα στερεώθηκαν με 5% τριχλωροοξικό οξύ και λύονται σε ρυθμιστικό λύσης SDS /ΝαΟΗ. Η ραδιενέργεια μετρήθηκε με μετρητή υγρού σπινθηρισμού Beckman LS3801 (Καναδάς).

Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

2000 κύτταρα απλώθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες των 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις nce. Τα κύτταρα αφέθηκαν να σχηματίσουν αποικίες για μέχρι 2-4 εβδομάδες (ανάλογα με την κυτταρική γραμμή) και μέσα αντικαταστάθηκαν κάθε τέταρτη ημέρα. Οι αποικίες βάφτηκαν με ΜΤΤ και μετρήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19].

Μέτρηση της ROS

ROS προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την μεμβράνη διαπερατή φθορίζουσα χρωστική 6-καρβοξυ 2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein διοξική (DCFDA) σε μέσο χωρίς ορό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [22]. Τα καλλιεργημένα κύτταρα, με ή χωρίς επεξεργασία με nce, υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μΜ DCF βαφή σε PBS και αλλαγή σε φθορισμό καταγράφεται σε διέγερση 485 nm και εκπομπή 530 nm για διάφορα χρονικό διάστημα από 10 έως 60 λεπτά χρησιμοποιώντας ένα Pro φασματοφθοριόμετρο Soft Max ( Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως

Μετά την προβλεπόμενη ώρα επώασης με την παρουσία ή απουσία δεικνυόμενες ποσότητες του nce, ανάλυση ανοσοστυπώματος με ειδικά αντισώματα διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [19 ], [20], [21], [22]. Εν συντομία, θεραπεία και χωρίς θεραπεία κυττάρων HUVEC με VEGF

165 (25 ng /ml) ή /και σε διάφορα NCE χρονική περίοδο (5-30 λεπτά) λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, και 0,5% Nonidet Ρ-40] που περιέχει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma). 40 μα πρωτεΐνες αναλύθηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη στη συνέχεια μπλοκαρίστηκε για 1 ώρα σε 5% άπαχο ξηρό γάλα TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl και 0,1% Tween 20, ρΗ 7,5) και επωάστηκαν όλη τη νύκτα σε πρωτογενείς αντιοροί (pVEGFR (Y1175), pVEGFR (Y951), VEGFR2 ή β ακτίνη) που περιέχει 5% άπαχο ξηρό γάλα ή 5% BSA σε περίπτωση φωσφο-αντισωμάτων. Μετά την επώαση με συζευγμένο με HRP δευτερογενούς Ab, στυπώματα αναπτύχθηκαν με ένα σύστημα ανίχνευσης ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

σε vitro Αγγειακή σχηματισμός δοκιμαστικό σωλήνα

In vitro δοκιμασίες

σχηματισμός σωλήνα διεξήχθησαν όπως περιγράφεται από τους Melinda

et. al.

[23]. Εν συντομία, μήτρα matrigel ομοιόμορφα απλώθηκαν επάνω σε πλάκες 8 φρεατίων θάλαμο (0,15 ml) και επωάζονται στους 37 ° C για 30 λεπτά. 2 × 10

5 /ml κύτταρα HUVEC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με nce (25-50 μΜ) και αναμίχθηκαν με κύτταρα παρουσία ή απουσία VEGF

165 (25 ng /ml) και μεταφέρθηκε σε κάθε φρεάτιο (200 μΙ ) επικαλυμμένα με Matrigel. Οι πλάκες ή πλακίδια επωάστηκαν στους 37 ° C για 16 ώρες και απεικονίζεται κάτω από ένα αντίθεσης φάσης ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε 10Χ μεγέθυνση του αντικειμενικού φακού.

Ζυμογράφημα Δοκιμασία

Για δραστηριότητα ΜΜΡ2, τα κύτταρα HUVEC υποβλήθηκαν σε αγωγή με VEGF

165 (25 ng /ml) παρουσία ή απουσία NCE (25-50 μΜ). Δημοσίευση 18 ώρες, το υπερκείμενο των κυττάρων συλλέχθηκε, φυγοκεντρήθηκε στα 12.000 g και 25 μΐ του όγκου αναμίχθηκε με 5 χ SDS ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης χωρίς αναγωγικό παράγοντα και έτρεξε σε ζελατίνη γέλη που περιέχει τρις-γλυκίνης 10%. Πηκτή πλύθηκε δύο φορές για 1 ώρα με διάλυμα renaturating (2,5% tritonX100 σε 50 mM Tris ρΗ 7,4, 5 mM ΟαΟ, 1 mM ZnCl2) προς απομάκρυνση SDS και μετουσιώνεται MMPs. Μετά από ξέπλυμα γέλη με απιονισμένο νερό, γέλη επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 37 ° C με ρυθμιστικό διάλυμα που περιείχε 50 mM Tris ρΗ 7,4, 5 mM ΟαΟ, 1 mM ZnCl

2. Την επόμενη μέρα, γέλη χρωματίστηκε με 0,5% Coomassie G250 ακολούθησε de-χρώση για να δείτε αναλυτικά τη δραστηριότητα ΜΜΡ2 σε τζελ.

Ζώα

δήλωση Δεοντολογίας.

6-8 εβδομάδων παλιό θηλυκών γυμνών ποντικών αγοράστηκαν από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου-Frederick Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Όλα τα ποντίκια στεγάστηκαν και διατηρήθηκαν υπό ειδικές συνθήκες σε εγκαταστάσεις στο Mayo Clinic Rochester, MN. Οι εγκαταστάσεις που εγκρίνονται και επιθεωρούνται από την Αμερικανική Ένωση για τη Διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC Διαπίστευσης # 000717) και σύμφωνα με τους ισχύοντες κανονισμούς και τα πρότυπα του Υπουργείου Γεωργίας των Η.Π.Α., Αμερικάνικο Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών, και ΝΙΗ. Όλες οι μελέτες εγκρίθηκαν και εποπτεύεται από το Θεσμικό Animal Care and Use Επιτροπή Mayo Clinic (IACUC) με αριθμό πρωτοκόλλου A11309. Μετά την επαγωγή όγκου, τα ποντίκια παρακολουθούνταν καθημερινά για σημάδια οποιασδήποτε δυσφορίας. Τακτικούς ελέγχους για την υγεία πραγματοποιούνται επίσης από το προσωπικό κτηνίατρο Mayo. Τα ποντίκια είναι ανθρωπίνως θυσιάστηκαν όταν το φορτίο του όγκου έφτασε το βάρος εντολή χωρίς θεραπεία ποντικούς.

Τα ποντίκια διατηρήθηκαν σύμφωνα με Θεσμικών IACUC-εγκεκριμένο πρωτόκολλο. 2 × 10

6/200 μΐ κύτταρα αιωρούνται σε PBS εγχύθηκαν εντός του ενδο-περιτοναϊκή κοιλότητα (ημέρα 0) 6-7 εβδομάδων γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. θεραπεία nce στη δόση των 0,1 mg /kg βάρους σώματος άρχισαν 3 ημέρες μετά τον εμβολιασμό των κυττάρων και δόθηκε ενδοπεριτοναϊκά σε κάθε 3

ημέρες rd μέχρι το τέλος της μελέτης. Η ομάδα ελέγχου έλαβε ενέσεις PBS. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν σε 4 εβδομάδες και οι όγκοι σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη για την κοπή. Το αίμα συλλέχθηκε σε ηπαρίνη επικαλυμμένα σωλήνες να ληφθεί πλάσμα. Ήπαρ, τους νεφρούς, την καρδιά και σπλήνα από όλα τα ζώα σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη και υποβάλλονται σε επεξεργασία. Ένας όγκου και οργάνων διαφάνεια από κάθε ποντίκι βάφτηκε με H & amp?. Ε

δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Το αίμα συλλέχθηκε σε σωληνάρια επιστρωμένα με ηπαρίνη λίγο πριν θυσιάστηκαν ποντίκια.. Πλάσματος που απομονώνονται από το αίμα των έξι ποντικών από κάθε ομάδα υποβλήθηκε σε ανάλυση ενός πάνελ της ηπατικής λειτουργίας (ασπαρτική αμινοτρανσφεράση? Αμινοτρανσφεράσης της αλανίνης? Αλβουμίνη) και οι δοκιμές νεφρικής λειτουργίας (κρεατινίνη? Ουρία? Λευκωματίνη), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Όλες οι δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας κιτ από Βιοδοκιμασία Systems ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή (CA, USA).

Προσδιορισμός nce στους ιστούς.

Στο τέλος της μελέτης, διάφορους ιστούς συμπεριλαμβανομένων των όγκων, ήπατος , σπλήνα και τα νεφρά από ομάδα που υπέστη αγωγή nce τοποθετήθηκαν σε 70% νιτρικό οξύ επί μία νύκτα για να ξεκινήσει η διαδικασία της πέψης. Τα δείγματα στη συνέχεια μικροκυμάτων πέψη. Η θερμοκρασία ανέβηκε στους 200 ° C επί 20 λεπτά και διατηρήθηκε εκεί για άλλα 20 λεπτά. Τα δείγματα στη συνέχεια βρασμένο κάτω σε λιγότερο από 1 ml το καθένα και σε ανασύσταση σε νερό για να αποκτηθεί όγκος 10 ml. επίπεδα δημήτριο αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας επαγωγικά συζευγμένου φασματοσκοπία μάζας πλάσματος (ICP-MS) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25].

Για την ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης (ΤΕΜ), του όγκου των ωοθηκών έχει απομονωθεί από nce ποντίκια με αγωγή μονιμοποιήθηκαν σε στερεωτικό Trump (1 % γλουταραλδεΰδη και 4% φορμαλδεΰδη σε φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα 0,1 Μ, ρΗ 7,2). Όγκου ενσωματωμένα σε ρητίνη Spurr και λεπτή (90 nm) τομές κόπηκαν σε υπερμικροτόμο Reichert Ultracut Ε, τοποθετούνται σε 200 mesh πλέγματα χαλκού και χρωματίζονται με κιτρικό μόλυβδο. Οι μικροφωτογραφίες ελήφθησαν σε Tecnai 12 που λειτουργεί σε 120kV.

IHC.

Σταθερό όγκοι αποκόπηκαν από ποντικούς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημεία για CD31, Ki-67 και TUNEL (Millipore) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24 ]. Η &? Χρώση Ε διεξήχθη με Mayo εγκαταστάσεις ανοσοϊστοχημική Core. Ki-67 και Η &? Ε τομές εξετάστηκαν υπό μικροσκόπιο φωτός και αντιπροσωπευτικές εικονογράμματα ελήφθησαν από 5 διαφορετικές διαφάνειες από κάθε ομάδα. Για τη χρώση CD31, TRITC-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε και ορατή χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φθορισμού. Για διπλή χρώση, τα πλακίδια πρώτα σε επεξεργασία για χρώση CD31 που ακολουθείται από χρώση ανοσοφθορισμού TUNEL, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

μετρήσεις Ζωντανά όγκου.

Η μέγιστη διάμετρος των βιώσιμων όγκου υπολογίστηκε με RPG αθροίζοντας η μεγαλύτερη μονοδιάστατο διάμετρος της κάθε κομμάτι του όγκου χρησιμοποιώντας το Olympus ΒΧ-41 μικροσκόπιο και ένα μικρόμετρο. Ομοίως, νεκρωτικές περιοχές μετρήθηκαν και το σύνθετο ζώντων μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε από κάθε διαφάνεια.

σχηματισμό ενδοθηλιακών σωλήνων.

Για να εξεταστεί το αποτέλεσμα nce σε σχηματισμό αυλού HUVEC σε κύτταρα, μήτρα matrigel ήταν ομοιόμορφα απλώθηκαν σε πλακίδια θαλάμου 8 φρεάτων (0,15 ml) και επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. κύτταρα HUVEC μετρήθηκαν και αραιώθηκαν στα 2 × 10

5 /ml σε μέσο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με nce (25-50 μΜ) αναμίχθηκε με κύτταρα παρουσία ή απουσία VEGF

165 (25 ng /ml) και μεταφέρθηκε σε κάθε φρεάτιο (200 μΙ) επικαλυμμένα με Matrigel. Οι πλάκες ή πλακίδια επωάστηκαν στους 37 ° C για 16 ώρες και απεικονίζεται κάτω από ένα αντίθεσης φάσης ανεστραμμένο μικροσκόπιο σε 10 × αντικειμενική μεγέθυνση.

Στατιστική ανάλυση.

Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με τη χρήση δύο t-test του Student ουρά (Prism). *** P & lt? 0.001? ** P & lt? 0,01, * P & lt? 0,05? NS:. Δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με το μη επεξεργασμένο

Αποτελέσματα

Σύνθεση και Χαρακτηρισμός Δημήτριο Oxide Νανοσωματίδια

νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη περιλαμβάνει ατομική κρυσταλλίτες 3-5 nm, ότι τα χαλαρά συσσωματωμένα με 15-25 nm. Καθώς η διαδικασία σύνθεση είναι ελεύθερη από οποιοδήποτε οργανικό επιφανειοδραστικό, η σκληρή συσσωμάτωση των νανοσωματιδίων ελέγχεται με τον αυστηρό έλεγχο του ρΗ κάτω των 3,5 νανοσωματίδια κατά τη διάρκεια της σύνθεσης για να τους κρατήσει σε κολλοειδή εύρος. Τα νανοσωματίδια μπορεί να αραιωθεί σε υδατικό ή κυτταρικών μέσων μετά την σύνθεση. Σχήμα 1 Α και Β δείχνει την υψηλή ανάλυση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου μετάδοσης (HRTEM) της ΜΥΔ νανοσωματίδια. Είναι προφανές από την εικόνα ότι τα νανοσωματίδια είναι χαλαρά συσσωματωθεί σε περίπου 15-25 nm συσσωματώματα τα οποία θα μπορούσαν επίσης να προκληθεί από τη διαδικασία ξήρανσης. Η υδροδυναμική ακτίνα (37,8 nm ± 0,8) από τη διανομή των πολυτροπικών μέγεθος (όγκος%) ανάλυση των μετρήσεων DLS συμφωνεί με το χαλαρό μέγεθος συσσωματώματος της ανάλυσης HRTEM. Υψηλή μεγέθυνση της εικόνας επιβεβαιώνει τα επίπεδα του πλέγματος των nce σε επιμέρους 3-5 nm κρυσταλλίτες. φασματοσκοπία υπεριώδους-ορατού χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθούν τα καταστάσεις οξείδωσης των νανοσωματιδίων οξειδίου του δημητρίου, πριν και μετά τη γήρανση θεραπεία. Το Σχήμα 1 δείχνει την υν-ορατού φωτός από φρέσκο ​​και παλαιωμένο νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου που δείχνει σαφώς την υπεροχή του Ce

3 κατάσταση οξείδωσης από την κορυφή απορρόφησης στα 252 nm σε σύγκριση με κορυφή απορρόφησης στα 298 nm για Ce

4+ . Περαιτέρω επιβεβαίωση για τα κράτη οξείδωση των νανοσωματιδίων αποκτήθηκε από την ανάλυση XPS. Το φάσμα XPS του δημητρίου είναι πολύ περίπλοκη που περιέχει πολλές κορυφές από το γύρισμα τροχιά σύζευξη των 3d τροχιακών [26]. Αρκετές κορυφές στην περιοχή Ce3d που έχουν αποδοθεί σε 3d

3/2 (899.5, 900.9, 903.5, 906.4 και 916.6) και 3d

5/2 (880.2, 882.1, 8885, 888.1 και 898) που προκύπτουν από πολλαπλές καταστάσεις σθένους δημητρίου. Το φάσμα από NCE δείχνει μία επικράτηση του δημητρίου σε κατάσταση οξείδωσης +3 όπως απεικονίζεται από τις χαρακτηριστικές κορυφές στα 880,2, 885,0, 899,5 και 903,5 eV. Όλα μαζί τα δεδομένα από τον χαρακτηρισμό του NCE είναι συνεπής με προηγούμενες αναφορές όπου δημήτριο μπορεί να συγκρατείται σε οξείδωση τρισθενούς μειώνοντας το μέγεθος των νανοσωματιδίων [15], [16], [17], [26].

Υψηλής ανάλυσης ηλεκτρονικές μικρογραφίες μεταδόσεως δείχνουν την παρουσία ενός χαλαρού συσσωματώματα 15-20 nm σε χαμηλή μεγέθυνση Β επιμέρους 3-5 nm κρυσταλλίτες. Η απόσταση d 0,31 nm δείχνει την παρουσία των επιπέδων οξειδίου του δημητρίου, ενώ η επιλεγμένη περίθλασης ηλεκτρονίων περιοχή (Saed) μοτίβο επιβεβαιώνει την παρουσία του φθορίτη πλέγμα του οξειδίου του δημητρίου. Η τάση σε κατάσταση οξείδωσης των nanoceria σε C δείχνει ότι οι συντίθεται νανοσωματίδια έχουν επικράτηση της κατάστασης οξείδωσης τρισθενούς που υφίσταται μια αργή μεταμόρφωση σε Ce

3 οξειδωτική κατάσταση κατά τη διάρκεια μιας περιόδου 28 ημερών φάσματος φωτοηλεκτρονίων D x-ray από δημητρίου αναφοράς δείγμα στο οποίο το δημήτριο βρίσκεται κυρίως στην κατάσταση οξείδωσης +4 συγκρίνεται με το φάσμα από ένα 4 εβδομάδες δείγμα nanoceria αποδεικνύοντας την υψηλή συγκέντρωση Ce σε 3 καταστάσεις οξείδωσης ηλικίας. Ε βασικά επίπεδα ROS σε καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική σειρά. Α2780 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με nce (50-100 μΜ) επί 48 ώρες. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και φορτώνονται με DCF-DA βαφής (5 μΜ) και ο φθορισμός καταγράφεται σε διέγερση 485 nm και εκπομπή 530 nm για διάφορες χρονικές περιόδους (5-60 λεπτά). Φρεάτια που περιέχουν μόνο κύτταρα χωρίς DCFDA χρωστικής (cross) ή χωρίς κύτταρα που περιέχουν DCFDA χρωστική (γεμάτο διαμάντια) χρησιμοποιήθηκαν σαν τυφλό. ΣΤ Μπαρ γράφημα αντιπροσωπεύει τα επίπεδα ROS στα 60 λεπτά της θεραπείας με DCF-DA βαφής. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.D. του 4 δείγματα. *** P & lt? 0.001 nce σε 100 μΜ? * P & lt?. 0.05 nce σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας δύο-tailed t-test του Student (Prism)

Η

nce θεραπεία αναστέλλει την παραγωγή των ROS επίπεδα σε Α2780 γραμμή κυττάρων

νανοσωματίδια οξειδίου του δημητρίου έχουν δειχθεί ότι δρουν ως μέσα καθαρισμού ελευθέρων ριζών με αναστολή της παραγωγής δραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) [3], [4], [5]. Επειδή, είναι καλά τεκμηριωμένο ότι η συσσώρευση των ROS διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη της ογκογένεσης στον ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών [27], [28], [29], εξετάσαμε την επίδραση της nce στην παραγωγή ROS σε καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική σειρά Α2780. Α2780 κυτταρική σειρά υπέστη επεξεργασία με nce (50-100 μΜ) και μετά 48 ώρες θεραπείας, η παραγωγή ROS μετρήθηκε χρησιμοποιώντας DCFH2-DA βαφής που ακολουθείται από την ανάγνωση φθορισμού. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1 Ε-F, κατεργασία NCE ανέστειλε σημαντικά επίπεδα ROS σε Α2780 κυτταρική σειρά, υποδηλώνοντας ότι η θεραπεία nce αναστέλλει βασικά επίπεδα του οξειδωτικού στρες στην κυτταρική σειρά Α2780 OVCA.

nce δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου των ωοθηκών κυτταρικές Γραμμές

Για να προσδιοριστεί εάν η θεραπεία nce ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, Α2780, C200 και SKOV3 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε 4 χ 10

3 κύτταρα /φρεάτιο και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις NCE (25-200 μΜ). Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε σε 72 ώρες με ανάλυση ΜΤΤ. Όπως φαίνεται στο σχήμα 2Α, η θεραπεία NCE δεν είχε σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό ή την επιβίωση των κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών. Συνεπής με αυτήν την παρατήρηση, κλωνογενείς δοκιμασίες μας έδειξαν επίσης καμία αλλαγή στο ρυθμό πολλαπλασιασμού με αυξανόμενη συγκέντρωση nce (Σχ. 2Β). [3Η] θυμιδίνης στο Α2780, C200 και κύτταρα SKOV3 (Εικ. S1), επιβεβαίωσε επίσης ότι η θεραπεία nce δεν μετέβαλε το ρυθμό πολλαπλασιασμού. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε πρόσθετες κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης συμπεριλαμβανομένων Caov3 και TOV21G (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η θεραπεία nce δεν αναστέλλει σημαντικά την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμές

in vitro

.

A. Ποσοστό βιωσιμότητα του Α2780, C200 και SKOV3 κύτταρα επεξεργασμένα με υποδεικνυόμενες δόσεις NCE (25-200 μΜ) όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπεύει τρία ξεχωριστά πειράματα γίνονται εις τριπλούν. NS: μη σημαντική, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα σε κάθε σημείο χρόνου χρησιμοποιώντας t-test δύο ουρών του Student (Prism). B. Για τον σχηματισμό αποικίας, 2000 κύτταρα /φρεάτιο (Α2780, C200 και SKOV3) επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις nce, κάθε τρίτη ημέρα για 2 εβδομάδες έως ότου σχηματίστηκαν αποικίες. Οι αποικίες βάφτηκαν με ΜΤΤ και μετρήθηκαν. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τρία ξεχωριστά πειράματα γίνονται εις τριπλούν. NS:. Δεν είναι σημαντική σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας t-test δύο-tailed του Student (Prism)

Η

nce ανέστειλε την ανάπτυξη Factor μεσολάβηση μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή

in vitro

Η

Δεδομένου ότι, θεραπεία NCE δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αξιολογήσαμε την επίδραση της nce επί του παράγοντα ανάπτυξης που προκαλείται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. κύτταρα SKOV3 αναπτύχθηκαν επί μία νύκτα σε χαμηλό ορό (0,2%) που περιέχει μέσο είχαν χαραχθεί χρησιμοποιώντας μια αποστειρωμένη πιπέτα 200 μΙ, από τη στιγμή που έφτασε το 90% συρροή. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης συμπεριλαμβανομένων SDF1, ΗΒ-ΕΟΡ, VEGF

165 και HGF (25 ng /ml) προστέθηκαν χωριστά στο μέσο με την παρουσία ή απουσία NCE (100 μΜ). 24 ώρες αργότερα, η ταχύτητα του κλεισίματος του τραύματος υπολογίστηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, nce ανέστειλε όλα αυξητικού παράγοντα μετανάστευσης μεσολάβηση κυττάρων σε κυτταρική γραμμή SKOV3. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για Α2780 και C200 κυτταρικές σειρές (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στη συνέχεια εκτιμήσαμε την επίδραση της nce στην αναστολή GF μεσολάβηση εισβολή των κυττάρων με χρήση του προσδιορισμού SKOV3 Boyden μετανάστευση θάλαμο (BD Bioscience) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Το Σχήμα 3Β καταδεικνύει σαφώς ότι 100 μΜ θεραπεία nce ανέστειλε σημαντικά όλα επάγεται εισβολή αυξητικού παράγοντα των κυττάρων SKOV3 σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, NCE έχει την ικανότητα να αναστέλλει τη μετανάστευση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών χωρίς να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

A. Επίδραση της nce από διάφορους παράγοντες ανάπτυξης που προκαλείται κυτταρική μετανάστευση εξετάστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία κλεισίματος τραύματος, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.D. του n = 7. Β Για την εξέταση της επίδρασης nce επί εισβολή, 1 × 10

5 SKOV3 κύτταρα σπάρθηκαν στα ανώτερα φρεάτια με 100 μΜ nce στο θάλαμο FIA σε 500 μΙ μέσον καλλιέργειας. Διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης (EGF, VEGF

165 και SDF1) (25 ng /ml) προστέθηκε στα υποκείμενα μέσα ενημέρωσης. 24 ώρες αργότερα, εισβολή προσδιορίσθηκε οδηγίες ακόλουθη κατασκευαστή. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.D. του τριπλούν. *** P & lt? 0.001 αυξητικού παράγοντα σε σύγκριση με τον έλεγχο. $$$ P & lt? 0.001 nce σε σύγκριση με αυξητικό παράγοντα χρησιμοποιώντας δύο-tailed t-test του Student (Prism)

Η

nce Θεραπεία εξασθενημένα ανάπτυξη όγκων στο ανθρώπινο Α2780 Καρκίνωμα Ωοθηκών Γραμμή κύτταρο που φέρει Γυμνό μοντέλο ποντικού

Για να προσδιοριστεί η επίδραση της nce

in vivo

, γυμνοί ποντικοί ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με κύτταρα Α2780. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με nce (0,1 mg /kg βάρους σώματος) που δίδεται ενδοπεριτοναϊκά, κάθε τρίτη ημέρα μέχρι το τέλος της μελέτης (ημέρα 30), όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Η Εικόνα 4Α (άνω πλαίσιο) δείχνει ένα αντιπροσωπευτικό φωτογραφία μιας nce επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων ποντίκι που φέρει Α2780 ξενομοσχεύματος στο τέλος της μελέτης (ημέρα 30). Η κοιλιακή περιφέρεια, ενδεικτική του βάρους του όγκου στο περιτόναιο (Εικ. 4Β) και το βάρος του όγκου (Εικ. 4C) στα ποντίκια που έλαβαν nce ήταν σημαντικά (ρ & lt? 0.002) μειώνεται σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ποντικούς. Το μέσο βάρος των όγκων αποκόπηκε ήταν περίπου 33% λιγότερο σε nce (4,56 + 0,345 gm) αγωγή ποντικούς σε σύγκριση με όχημα (PBS) ποντικούς (6,79 + 0,53 gm) (Σχ. 4C). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν σαφώς ότι nce έχει την ικανότητα να περιορίσει την ανάπτυξη του όγκου των ωοθηκών

in vivo

όταν χορηγείται ακόμη και σε πολύ χαμηλή δόση (0,1 mg /kg).

A. Ακαθάριστο μορφολογία του εκπροσώπου του ποντικιού με όγκους κατά την ημέρα 30 (n = 6). B. Σωρευτική κοιλιακή περιφέρεια στο τέλος της μελέτης. Γ Αποκοπείσες βάρος όγκου από το όχημα (PBS) επεξεργασία και nce (0,1 mg /kg βάρους bd? Κάθε τρίτη ημέρα). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± S.D. έξι μεμονωμένων ζώων. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.