Αφηρημένο

Ιστορικό

Η αυξημένη έκφραση του ενζύμου της κυκλοοξυγενάσης-2 (COX2) είναι ένα από τα κύρια χαρακτηριστικά του γαστρικού καρκίνου (GC), η οποία είναι η κύρια αιτία θανάτου στην κόσμο, ιδιαίτερα στην Ασία και τη Νότια Αμερική. Αν και το σηματοδοτικό μονοπάτι /β-κατενίνης Wnt έχει εμπλακεί στη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου της COX2, ο ακριβής μηχανισμός διαμόρφωσης αυτής της απάντησης είναι ακόμα άγνωστη.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Εδώ μελετήσαμε η μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου COX2 σε κυτταρικές σειρές GC και αξιολογείται κατά πόσο αυτό το φαινόμενο διαμορφώνεται από σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης. Εξετάσαμε πρώτα την έκφραση του COX2 mRNA στα κύτταρα GC και βρέθηκε ότι υπάρχει ένα πρότυπο έκφρασης απόκλιση συνεπής με υψηλά επίπεδα πυρηνικά εντοπισμένης β-κατενίνης. Η φαρμακολογική θεραπεία είτε με λίθιο ή βαλπροϊκό οξύ και μοριακών επαγωγή με καθαρισμένο κανονικό Wnt3A σημαντικά ενισχυμένη έκφραση mRNA COX2 σε ένα δόση και το χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Serial διαγραφή ενός θραύσματος COX2 υποκινητή 1,6 Kbp και gain- ή απώλειας λειτουργίας πειραμάτων μας επέτρεψε να προσδιορίσει μια ελάχιστη Wnt /β-κατενίνης αποκρίνεται περιοχή που αποτελείται από 0,8 Kbp του υποκινητή COX2 (pCOX2-0.8), η οποία έδειξε μέγιστη απόκριση σε δοκιμασίες γονίδιο-ανταποκριτή. Η δραστηριότητα της περιοχής του υποκινητή pCOX2-0.8 επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με προσδιορισμούς δέσμευσης μεταλλαξιγένεση και DNA-πρωτεΐνης τοπο-κατευθυνόμενη.

Συμπεράσματα /Σημασία

καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η pCOX2-0.8 ελάχιστου υποκινητή περιέχει παράγοντας νέα λειτουργικά Τ-κυττάρων /λεμφικών παράγοντα ενισχυτή (TCF /LEF) -ανταπόκριση στοιχείο (ΤΒΕ ιστοσελίδας II? -689 /-684) που ανταποκρίνεται άμεσα στην ενίσχυση της σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης και η οποία μπορεί να είναι σημαντική για την εμφάνιση /εξέλιξη του GC

Παράθεση:. Nuñez F, Bravo S, Cruzat F, Montecino Μ, De Ferrari GV (2011) Wnt /β-κατενίνης Σηματοδοσίας Ενισχύει κυκλοοξυγενάσης-2 (COX2) μεταγραφική δραστηριότητα σε κύτταρα γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 6 (4): e18562. doi: 10.1371 /journal.pone.0018562

Επιμέλεια: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Νοέμβρη του 2010? Αποδεκτές: 11, Μάρ του 2011? Δημοσιεύθηκε: 6η Απριλίου 2011

Copyright: © 2011 Nuñez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από CTI-καρκίνο, Programa Bicentenario en Επιστήμης και Tecnología (PBCT) – Comisión Nacional de Investigación Científica y TECNOLOGICA (CONICYT) αριθμός επιχορήγηση PBCT-6 από την κυβέρνηση της Χιλής (MM και GVD). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

γαστρικό καρκίνο (GC) είναι μια πολυπαραγοντική νόσος, η οποία χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά κακοήθη νεοπλάσματα στο γαστρικό βλεννογόνο, και αντιπροσωπεύει την δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως με την υψηλότερη επικράτηση στην Ασία και τη Νότια Αμερική [1], [ ,,,0],2], [3]. Περιβαλλοντική σχετιζόμενους παράγοντες κινδύνου περιλαμβάνουν διατροφή, την κατανάλωση ταμπάκο, η παχυσαρκία και η

Helicobacter pylori

λοίμωξη [4]. Αρκετές μεταλλάξεις σε γονίδια καταστολής όγκων, συμπεριλαμβανομένων των Ρ53, αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC), Ε-καδερίνη και RUNX3 [3], [5], καθώς επίσης και σε ογκογονίδια όπως το k-ras, HER2 και β-κατενίνης [3], [6], [7], έχουν τεκμηριωθεί σε GC. Επιπλέον, πάνω από την έκφραση διαφόρων γονιδίων έχει τεκμηριωθεί, συμπεριλαμβανομένων WNT2B [8], TC1 (C8orf4) [9], και η κυκλοοξυγενάση 2 (COX2) ένζυμο, το οποίο καταλύει την κρίσιμο βήμα στην παραγωγή της προσταγλανδίνης Ε2, ένας κύριος μεσολαβητής της φλεγμονής των αρθρώσεων [10], [11].

έχει παρατηρηθεί ότι η έκφραση του γονιδίου COX2 είναι σημαντικά αυξημένη σε ανθρώπινους ιστούς γαστρικό αδενοκαρκίνωμα, σε σύγκριση με συζευγμένες γαστρικού βλεννογόνου δείγματα άνευ καρκινικών κυττάρων [10 ]. Αυτή η αυξημένη έκφραση έχει προταθεί να επηρεάσει την ένταση της εισβολής, το μέγεθος, μεταστάσεις λεμφαδένων, ανάπτυξη όγκου και κακή πρόγνωση [4], [12], [13]. Σε αυτό το πλαίσιο, μεγάλες ποσότητες δεδομένων περιγράφουν χημειο-προληπτική και αντικαρκινική δράση των μη στεροειδών αντιφλεγμονωδών φαρμάκων (NSAID), συμπεριλαμβανομένων των εκλεκτικών αναστολέων COX2 ως πιθανές θεραπείες για GC [10], [11], [14].

μεταγραφικό έλεγχο του γονιδίου COX2 εξαρτάται από το μοριακό μηχανήματα αλληλεπιδρά με τον υποκινητή COX2, η οποία φαίνεται να ελέγχονται μέσω της δραστηριότητας των διαφόρων οδών σηματοδότησης [15], [16], [17]. Πράγματι, αρχικά καθοριστεί ότι CRE (-59 /-53), NF-IL6 (-132 /-124) και NF-κΒ (-233 /-214) συναινετικές αλληλουχίες στον προαγωγό COX2 ήταν αναγκαίες για την έκφραση του γονίδιο [16]. Μεταγενέστερες λειτουργικές μελέτες στον υποκινητή COX2 προσδιόρισε σειρά ρυθμιστικών στοιχείων που συμμετέχουν στη μεταγραφή του γονιδίου, συμπεριλαμβανομένων των ΑΡ-1, ΑΡ-2, SP-1, C /ΕΒΡβ [18], [19], [20] και πρωτεΐνες που ανήκουν στον παράγοντα Τ-κυττάρων /Λεμφοειδής παράγοντας ενισχυτή (TCF /LEF) της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων, που είναι ζωτικής σημασίας για την μεταγωγή σήματος /β-κατενίνης Wnt [21].

Η /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt αναγνωρίζεται ευρέως ότι παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη ασθένεια, ιδιαίτερα στην έναρξη και ανάπτυξη του καρκίνου [22], [23], [24]. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα πρόσφατα πειράματα στα προερχόμενα GC κύτταρα έχουν δείξει μια σχέση ανάμεσα στην έκφραση της COX2 και την αναστολή της κινάση συνθετάσης γλυκογόνου-3β (ΟδΚ3β) ένζυμο [25], το οποίο είναι ένα βασικό συστατικό Wnt που φωσφορυλιώνει β-κατενίνης και προωθεί επακόλουθη αποδόμηση της μέσω πρωτεασώματος [26]. Η σχέση μεταξύ Wnt /β-κατενίνης και την έκφραση COX2 σε διάφορα μοντέλα των καρκινικών κυττάρων υποστηρίζεται περαιτέρω από τις ακόλουθες μελέτες. Πρώτον, έχει παρατηρηθεί στο μαστικό επιθήλιο που Wnt /β-κατενίνης παίζουν έμμεση επίδραση στην COX2 μεταγραφής, η οποία θα μπορούσε να διαμεσολαβείται από τα πάνω ρύθμιση του ενδιάμεσου παράγοντα PEA3 [27]. Δεύτερον, και σε αντίθεση με έμμεσο τρόπο δράσης, Araki και στήλες. [21] ανέφεραν ότι σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου υπάρχει μία επαγωγή της έκφρασης COX2 μέσω μιας β-κατενίνης /εξαρτώμενο μηχανισμό TCF, και μερικώς χαρακτηριστεί /θέση δέσμευσης LEF συναινετική TCF (ΤΒΕ: πυρήνας CTTTG) τοποθετημένη 1079 bp ανοδικά από την έναρξη μεταγραφής θέση στον υποκινητή COX2. Τρίτον, παρατηρήθηκε ότι σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου και κυτταρικές σειρές που προέρχονται υπάρχει μία συσχέτιση μεταξύ της υπερέκφρασης του μονοπατιού που σχετίζονται με πρωτεΐνες Wnt LEF-1 και Pontin52 /TIP49a και προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης COX2 [28]. Τέλος, χρησιμοποιώντας χονδροκύτταρα, έχει αποδειχθεί ότι LEF-1, μαζί με β-κατενίνης, ρυθμισμένη έκφραση COX2 με άμεση σύνδεση του συμπλόκου LEF-1 /β-κατενίνης στην περιοχή 3’UTR του γενωμικού τόπου COX2 [29] . Ως εκ τούτου, επί του παρόντος δεν υπάρχει σαφής εικόνα ως προς το αν σηματοδότηση Wnt εμπλέκεται στην έκφραση γονιδίου COX2, ή το ρόλο του στην GC έναρξη /πρόοδο. Εδώ επιδιώξαμε να καταλάβουμε αν υπάρχει άμεση ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης COX2 μέσω σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης και να προσδιορίσει Wnt /β-κατενίνης ρυθμιστικά στοιχεία στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου COX2 το οποίο μπορεί να ρυθμίζει προς τα πάνω COX2 μεταγραφή σε κύτταρα GC.

Υλικά και Μέθοδοι

κύτταρα και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ45 (ιαπωνική συλλογή της έρευνας Bioresources, Ιαπωνία), Ν87, SNU 1, SNU 16, KATOIII, AGS, WI38 και ΗΕΚ293 (American Type Culture Collection? Rockville, MD) χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. ΜΚΝ45, Ν87, SNU 1 και KATOIII κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RMPI media (Gibco)? AGS σε μέσο F12K (Hyclone)? WI38 σε ΕΜΕΜ (Gibco)? και ΗΕΚ293 σε ϋΜΕΜ (Gibco). Τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκε με 10% FBS (Gibco) (AGS με 20%) και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Κυτταρικές σειρές διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2 και κορεσμένη υγρασία.

Πλασμίδια και τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση

Ο SuperTOPFlash-λουσιφεράσης και η renilla- pRL-ΤΚ λουσιφεράση πλασμίδια [30], η συστατική δραστική β-κατενίνης (S33Y) [31] και τα κυρίαρχα-αρνητικά πλασμίδια έκφρασης ΔTCF4 [32] έχουν περιγραφεί προηγουμένως. Χιμαιρικά COX2 θραύσματα υποκινητή-λουσιφεράση δημιουργήθηκαν με PCR από ανθρώπινο γονιδιωματικό DNA χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές που περιέχουν θέσεις περιορισμού και εν συνεχεία εισάγεται εντός του pGL3-βασικό φορέα (Promega). Οι μεταλλάξεις στο site ΤΒΕ-ΙΙ (-689 /-684) του υποκινητή COX2 παρήχθησαν χρησιμοποιώντας εκκινητές pCOX-0,8-TBEMUT με την κατευθυνόμενη σε θέση kit mutagesis QuickChange (Stratagene). Κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν μέσω της άμεσης αλληλουχίας (ABI-3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Οι εκκινητές αλληλουχίες που περιγράφονται στον Πίνακα S1.

ποσοτικαί και Real Time RT-PCR

Ολικό RNA εξήχθη σε RNAse ελεύθερη συνθήκες χρησιμοποιώντας TRIZOL (Invitrogen) και 2 μg του RNA μεταγράφηκε αντίστροφα με 200 U του SuperScript II αντίστροφης μεταγραφάσης (RT) (Invitrogen) με τη χρήση 500 ng ολίγο (dT) αρχικά τεμάχια. Πειραματική προσδιορισμό της COX2, c-myc και τα επίπεδα mRNA CCND1 διεξήχθη σύμφωνα με το [33]. Εν συντομία, τα cDNA υποβλήθηκαν σε Real-Time PCR σε ένα iQ Σύστημα iCycler (Bio-Rad Laboratories). Κάθε όγκος αντίδρασης 25 μλ περιείχε 1 μονάδα Platinum Taq DNA πολυμεράσης (Invitrogen), 1Χ ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (20 mM Tris-HCl ρΗ 8.4, και 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl

2, 2.5 μg BSA, 0,01% γλυκερόλη , 200 μΜ dNTPs, 0,3Χ SYBR Green διάλυμα και 0.4 μΜ ειδικών εκκινητών (βλέπε πίνακα S1). Οι συνθήκες PCR καθορίστηκαν ως εξής: 90 δευτερόλεπτα στους 94 ° C και στη συνέχεια 30 κύκλους των 30 δευτερολέπτων στους 94 ° C, 30 δευτερόλεπτα στους 62 ° C και 30 δευτερόλεπτα στους 72 ° C. Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα αποτελέσματα που λαμβάνονται για κάθε γονίδιο κανονικοποιήθηκαν με εκείνα που ελήφθησαν παράλληλα με β-ακτίνη. Η ποιότητα του RNA και PCR προϊόντων παρακολουθήθηκε σε όλα τα πειράματα μέσω ηλεκτροφόρησης σε πηκτές αγαρόζης 1%, βάφονται με βρωμιούχο αιθίδιο.

Επαγωγή του /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt

σηματοδότηση Wnt ήταν φαρμακολογικά επάγεται σε ΜΚΝ45 κύτταρα εμβολιάστηκαν σε πλάκες καλλιέργειας των 6 φρεατίων σε 80-90% συρροής (δηλαδή 1, 2, 4 και 8 ώρες επώασης) είτε με 10-20 mM ϋΟΙ (Sigma) ή 5-10 mM του βαλπροϊκού οξέος (VA? Sigma) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34], [35]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα συλλέχθηκαν για εκχύλιση mRNA και σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμός-PCR όπως περιγράφεται ανωτέρω. Παρομοίως, ΜΚΝ45 κύτταρα διεγέρθηκαν επί 2 ώρες με 200 και 400 ng /ml καθαρισμένης πρωτεΐνης Wnt3A. Ο καθαρισμός του Wnt3A διεξήχθη όπως περιγράφεται [36].

μεταγραφική δραστικότητα του προαγωγού COX2

Δραστηριότητα

του προαγωγού COX2 μετρήθηκε σε 80-90% συρροή ΜΚΝ45, AGS, WI38 και ΗΕΚ293 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας καλά 6. Εν συντομία, κύτταρα συν-επιμολύνονται χρησιμοποιώντας Fugene (Roche) για 24 με το pCOX2-λουσιφεράση ή τα ρεπόρτερ pSuperTOPFlash και είτε συστατική δραστική β-κατενίνης (S33Y) [31] ή του κυρίαρχου αρνητικού ΔTCF4 [32] κατασκευάσματα. Το πλασμίδιο λουσιφεράσης Renilla ρΡΙ_-ΤΚ χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Firefly και δραστηριότητες λουσιφεράσης Renilla προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Dual-Luciferase Reporter (Promega) σε ένα μέσο αναγνώστη πολλαπλών δίσκων Victor-3 (Perkin Elmer), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Σχετική δραστηριότητες λουσιφεράσης εκφράστηκαν διαιρώντας λουσιφεράση πυγολαμπίδας δραστικότητα με δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla για κάθε δείγμα (Ν = 3, κάθε εις τριπλούν).

χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) δοκιμασίες

μελέτες ChIP πραγματοποιήθηκαν σε κύτταρα ΜΚΝ45 όπως περιγράφηκε νωρίτερα [37]. Το κλάσμα της πυρηνικής β-κατενίνης δεσμεύεται είτε να TBE τοποθεσίες I, II, III ή IV στον υποκινητή ανθρώπινης COX2 ανοσοκαταβυθίστηκε με αντισώματα αντι β-κατενίνης (Santa Cruz) και αξιολογήθηκε από πραγματικό χρόνο PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (Πίνακας S1) . Επιπλέον, το κλάσμα του RNA πολυμεράσης II (Pol-II) και ακετυλιωμένων ιστονών Η3 και Η4 (H3ac και H4ac) δεσμεύεται είτε με την περιοχή ΤΒΕ-ΙΙ (-793 /-594) ή το εγγύς περιοχή (-118 /+ 62 ) του υποκινητή COX2 παρομοίως αξιολογήθηκε (αντι-Pol-ΙΙ, Santa Cruz? H3ac και H4ac, Upstate). Ως θετικός έλεγχος χρησιμοποιήθηκε το χώρο ΤΒΕ c-myc [38]. ειδικότητα του αντισώματος αναλύθηκε με φυσιολογική κουνελιού-IgG (Santa Cruz).

δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA)

EMSA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ολιγονουκλεοτιδίων που περιέχουν είτε τη συναινετική αλληλουχία ΤΒΕ-II άγριου τύπου COX2 (βλέπε πίνακα S1) ή έχουν αναφερθεί στο παρελθόν μεταλλαγμένες αλληλουχίες ΤΒΕ [39]. Εν συντομία, άγριου τύπου και μεταλλαγμένου

32Ρ-επισημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων επωάστηκαν σε ρυθμιστικό με πυρηνικά εκχυλίσματα από ΜΚΝ-45 κύτταρα δέσμευσης για 30 λεπτά στους 30 ° C. Στη συνέχεια, τα σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν από τα ελεύθερα ολιγονουκλεοτίδια σε 5% μη μετουσίωσης γέλη πολυακρυλαμιδίου. Μετά την ηλεκτροφόρηση, η πηκτή ξηράνθηκε, και εκτέθηκε σε φιλμ για 1 ημέρα. Η οπτικοποίηση των ραδιενεργών ζωνών αναλύθηκε με αυτοραδιογραφία. Ειδικότητα σύνδεσης ελέγχθηκε με επώαση των συμπλοκών DNA-πρωτεΐνης παρουσία μιας περίσσειας μη-επισημασμένου άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο ολιγονουκλεοτίδια [21], [39].

Στατιστική ανάλυση

Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές με τρεις επαναλήψεις. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση ± SD. Πολλαπλές συγκρίσεις ομάδα διεξήχθησαν με μονόδρομη ANOVA χρησιμοποιώντας το λογισμικό STATISTICA 9.0.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

έκφραση COX2 συσχετίζεται με τα επίπεδα πυρηνικής β-κατενίνης στα κύτταρα GC

Αρχικά προσδιορίζεται η έκφραση επίπεδα COX2 mRNA σε ανθρώπινο GC κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ45, Ν87, SNU 1, SNU 16, KATOIII και AGS [40], [41], [42], καθώς και WI38 ινοβλάστες χρησιμοποιείται εδώ ως κύτταρο ελέγχου γραμμής [43], εξετάζοντας αν συσχετίστηκαν με σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 1, ισχυρή επίπεδα έκφρασης COX2 παρατηρήθηκαν ήδη από 26 κύκλους ενίσχυσης PCR σε μεταστατικές κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ45, SNU 16 και KATOIII, και επίσης στην κυτταρική σειρά AGS που προέρχεται από ένα πρωτογενούς όγκου. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σε συμφωνία με τα επίπεδα έκφρασης COX2 ανιχνεύεται προηγουμένως στο ΜΚΝ45, KATOIII και AGS κύτταρα [44], [45], [46]. Σε αντίθεση, τα επίπεδα COX2 mRNA ήταν είτε πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε WI38 ινοβλάστες ή ανιχνεύσιμη σε Ν87 και τα κύτταρα SNU 1 (Εικόνα 1Α), υποδηλώνοντας ότι αυτή η διαφορική σχήμα έκφρασης δεν σχετίζεται με μεταστατικό στάδια ή το επίπεδο του μετασχηματισμού των κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα επίπεδα πυρηνικής β-κατενίνης ήταν στενά συνδεδεμένη με την έκφραση της COX2, αφού παρατηρήθηκαν υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης σε κύτταρα ΜΚΝ45, AGS, SNU 16 και KATOIII, σε σύγκριση με Ν87, SNU 1 και WI38 κύτταρα (Σχήμα 1Β), υποδηλώνοντας ένα ρόλο για Wnt σηματοδότησης στην έκφραση COX2 mRNA στα κύτταρα GC.

(Α) έκφραση COX2 mRNA σε έλεγχο (WI38) και GC κυτταρικές σειρές (ΜΚΝ45, AGS, SNU 1, SNU 16, KATOIII και Ν87). Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα και ημιποσοτική RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί COX2 και τα επίπεδα του RNA β-ακτίνης ως εσωτερικό έλεγχο. Είκοσι-έξι κύκλους επελέγησαν ως κατάλληλο κύκλο PCR. (Β) Τα επίπεδα Πυρηνικής πρωτεΐνης β-κατενίνης στις ίδιες κυτταρικές σειρές, όπως φαίνεται στο (Α), εξετάστηκαν μέσω ανάλυσης Western Blot χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα. Ο γενικός μεταγραφικός παράγοντας TFIIB χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Ενίσχυση της έκφρασης COX2 μέσω Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης

Για να εξετάσει εάν ο καταρράκτης Wnt εμπλέκεται στην COX2 έκφρασης, τα κύτταρα ΜΚΝ45 είχαν φαρμακολογικά διεγείρονται για διαφορετικές χρονικές περιόδους (δηλαδή 1, 2, 4 και 8 ώρες) είτε με λίθιο (LiCl) ή βαλπροϊκό οξύ (VA), δεδομένου ότι και τα δύο φάρμακα έχουν αποδειχθεί προηγουμένως για να διαμορφώνει σηματοδότηση Wnt μέσω αναστολής της δραστηριότητα της ΟδΚ3β και αυξάνοντας έτσι την πυρηνική επίπεδα β-κατενίνης [34], [35]. Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε μία σημαντική ενίσχυση της έκφρασης COX2 που προκαλείται από 10-20 mM ϋΟΙ ή 5-10 mM VA, που άρχισε αμέσως μετά την επώαση με τις ενώσεις και που κορυφώθηκε μετά από δύο ώρες επεξεργασίας (Σχήμα 2Α). Σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμός των επιπέδων COX2 mRNA στα κύτταρα ΜΚΝ45 παρομοίως σε επεξεργασία με LiCl ή VA (2 ώρες) έδειξε ότι COX2 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (Εικόνα 2Β) και ότι αυτή η επίδραση παράλληλα με εκείνη που παρατηρήθηκε σε γονίδια-στόχους /β-κατενίνης Wnt c-myc [47] και η κυκλίνη D1 [48]. Στη συνέχεια, προκειμένου να αποκλειστεί το ενδεχόμενο ότι το παρατηρούμενο φαινόμενο αντανακλάται μη ειδικές επιδράσεις των φαρμάκων που ενεργούν για πρωτεΐνες που επηρεάζουν διαφορετικές καταρράκτες σηματοδότησης, εφαρμόσαμε άμεσα ένα πλήρως λειτουργικό καθαρισμένη πρωτεΐνη Wnt3A να ΜΚΝ45 κύτταρα (βλέπε Μέθοδοι). Αυτά τα πειράματα έδειξαν σαφώς ότι 200-400 ng /ml καθαρισμένης Wnt3A σημαντικά ενισχυμένη έκφραση του mRNA COX2 μετά σύντομες περιόδους επώασης (Σχήμα 2), εν μέρει εξηγεί την ταχεία δράση του LiCl και VA και υποστηρίζοντας μια άμεση συσχέτιση μεταξύ κανονικών Wnt /β-κατενίνης ενεργοποίηση και διέγερση του COX-2 μεταγραφή σε κύτταρα GC.

(Α) επίπεδα έκφρασης COX2 mRNA στα κύτταρα ΜΚΝ45 θεραπεία για 1 έως 8 ώρες με είτε 10-20 mM του λιθίου (LiCl) ή 5-10 mM βαλπροϊκού οξέος (VA) αξιολογήθηκαν μέσω RT-PCR. Ως εσωτερικός έλεγχος, προσδιορίστηκαν β-ακτίνης επίπεδα. (Β) Q-PCR για COX2, c-myc και έκφραση CCND1 mRNA διεγείρεται φαρμακολογικά με λίθιο (LiCl) και βαλπροϊκό (VA) κατά τη διάρκεια 2 h (άνω πλαίσιο). Κάτω πάνελ, Q-PCR για COX2 σε ΜΚΝ45 κύτταρα διεγερμένα με καθαρισμένο Wnt3A για 2 ώρες. Αποτελέσματα Q-PCR εκφράστηκαν ως Σχετική Ποσότητα (DRN) και τα επίπεδα του mRNA β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. Κάθε εικόνα αντιστοιχεί σε τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω δοκιμής ANOVA (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01)

Η

Ταυτοποίηση νέων τόπων TBE στον υποκινητή του γονιδίου

COX2

Προηγούμενες μελέτες έδειξαν. ότι μια απαντητική περιοχή ΤΒΕ Wnt /β-κατενίνης (συναίνεση πυρήνας: CTTTG) βρίσκεται σε -1079 /-1074 bp ανοδικά από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) του ανθρώπινου γονιδίου COX2 [21] (Τόπος IV? Σχήμα 3Α, βλέπε επίσης Σχήμα S1). Περαιτέρω σάρωση της σειράς ανάντη 1.600 bp από το TSS [49] μας επέτρεψε να εντοπιστούν 3 νέες πιθανές θέσεις ΤΒΕ: -877 /-872 bp (Τόπος ΙΙΙ? Αίσθηση προσανατολισμού), -689 /-684 bp και -318 /-313 bp (Sites II και Ι, αντίστοιχα? τόσο σε αντιπληροφοριακό προσανατολισμό) (Σχήμα 3Α), τα οποία δεν είναι διατηρημένα μεταξύ ανθρώπινου και γονίδια ποντικού COX2 (Σχήμα S1). Ως εκ τούτου, το τμήμα κλωνοποιήθηκε 1600 bp από τον ανθρώπινο προαγωγό COX2 (pCOX2), συμπεριλαμβανομένων όλων τέσσερις τοποθεσίες ΤΒΕ, εντός του pGL3-βασικό φορέα συντηγμένο με το γονίδιο λουσιφεράσης που θα χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια σε δοκιμασίες ανταποκριτή (Σχήμα 3Α). Αξίζει να σημειωθεί ότι, παράλληλα επιμόλυνση 10 ng αυτού του κατασκευάσματος σε ΜΚΝ-45 και κύτταρα ΗΕΚ293 αποκάλυψε ότι pCOX2 εμφανίζεται μια σημαντική υψηλότερη (9 φορές) βασική δραστικότητα προαγωγέα σε κύτταρα ΜΚΝ45 (Σχήμα 3Β και C). Υποθέσαμε ότι αυτή η υψηλότερη δραστικότητα προαγωγέα pCOX2 βασική μπορούσε να σχετίζεται με την αυξημένη περιεκτικότητα του πυρηνικού β-κατενίνης σε αυτή την κυτταρική γραμμή GC (Σχήμα 1Β). Ως εκ τούτου, ΜΚΝ45 και ΗΕΚ293 κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με pCOX2 παρουσία χαμηλότερων δόσεων ενός ιδιοσυστατικού ενεργού πρωτεΐνης β-κατενίνης (S33Y) [31]. Όπως παρατηρήθηκε στην Εικόνα 3, η δραστικότητα pCOX2 πράγματι ενισχύεται σε δύο τύπους κυττάρων, προτείνοντας ότι η β-κατενίνης μπορεί να δεσμεύει και στη συνέχεια ενεργοποιούν παράγοντες μεταγραφής /LEF TCF στις λειτουργικές θέσεις ΤΒΕ εντός του υποκινητή pCOX2.

(Α) σχηματικό διάγραμμα που απεικονίζει τη γονιδιωματική πλαίσιο της ca. 1,6 Κορ από τη θέση έναρξης της μεταγραφής (TSS) του υποκινητή του ανθρώπινου COX2, συμπεριλαμβανομένης της θέσης των γνωστών μεταγραφικών ρυθμιστών (λευκά κουτιά) και τη θέση των τριών νέων TCF /LEF-δεσμευτικές στοιχεία (ΤΒΕ: Πυρήνας CTTTG? Μαύρα κουτιά) καθορίζεται

in silico

. (Β & amp? C) δοκιμασίες γονιδίου ανταποκριτή σε ΜΚΝ45 (Β) και κύτταρα ΗΕΚ293 (C) συν-επιμολύνθηκαν με 10 ng του pCOX2 και αυξανόμενες συγκεντρώσεις ενός ουσιαστικώς δραστικής β-κατενίνης (S33Y) πρωτεΐνη (αριστερό πάνελ). Τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 1 ng του PRL-SV40 Renilla ως ένας εσωτερικός έλεγχος. δραστηριότητα υποστηρικτής κανονικοποιήθηκε ως η αναλογία μεταξύ λουσιφεράση πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράση μονάδες. RLU: Σχετική Λουσιφεράσης Μονάδες. Κάθε εικόνα αντιστοιχεί σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω δοκιμής ANOVA (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01). Πυρηνική επίπεδα της πρωτεΐνης β-κατενίνης εξετάστηκαν σε ίδιες κυτταρικές σειρές μέσω της Western Blot ανάλυση (δεξί πάνελ). Ο γενικός μεταγραφικός παράγοντας TFIIB χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Συμβολή των χώρων ΤΒΕ με δραστηριότητα υποκινητή COX2 στα κύτταρα GC

Για να αναλύσουμε τη συμβολή της Wnt /β-κατενίνης ανταποκρίνεται ΤΒΕ θέσεις επί της μεταγραφικής δραστικότητας των COX2 υποκινητή τέσσερα pCOX2 διαγραφές κατασκευάσματα παράχθηκαν: pCOX-1,2 (-1.123 /+ 35 bp)? pCOX-0.8 (-741 /+ 35 bp)? pCOX-0,65 (-582 /+ 35 bp)? και pCOX-0,4 (-371 /+ 35 bp) (Σχήμα 4Α). Αυτά τα κατασκευάσματα ακολούθως εξετάστηκαν για δραστικότητα τους μέσω παροδικές επιμολύνσεις σε κύτταρα ΜΚΝ45 και AGS, χρησιμοποιώντας τις ινοβλάστες WI38 ως κύτταρο ελέγχου γραμμής. Συνεπής με τα ενδογενή επίπεδα έκφρασης COX2 σε αυτές τις κυτταρικές σειρές GC (Σχήμα 1Α), διαγραφές pCOX2 διατήρησε διαφορετικά επίπεδα δραστηριότητας σε ΜΚΝ45 και AGS κύτταρα (Σχήμα 4Β και C). Σε αντίθεση, καμία δραστηριότητα υποκινητή ανιχνεύθηκε σε WI38 ινοβλάστες (Σχήμα 4D), ακόμη και όταν οι δόσεις επιμόλυνση σε αυτά τα κύτταρα αυξήθηκαν 8 φορές (δηλαδή από 50 έως 400 ng) (Εικόνα S2). Είναι σημαντικό ότι, και σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [50], τα κύτταρα WI38 εκφράζονται αποτελεσματικά ένα κατασκεύασμα λουσιφεράσης-ανταποκριτή που περιέχει τον υποκινητή του γονιδίου p21 (Σχήμα S2), υποδεικνύοντας ότι σε αυτά τα κύτταρα ελέγχου, η μοριακή μηχανήματα υπεύθυνος για την πρόκληση της COX2 μεταγραφή δεν είναι ενεργή . Περαιτέρω πειράματα αποκάλυψαν ότι η επιμόλυνση σε ΜΚΝ45 και AGS κυττάρων με το κατασκεύασμα pCOX2-0.8, η οποία έχει 859 bp, διαγράφονται από το 1,6 Kb pCOX2 ανταποκριτή (Σχήμα 4Α), είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντική αύξηση της δραστηριότητας προαγωγέα όταν συγκρίνεται με τον ανταποκριτή pCOX2-1.2 (Σχήμα 4Α-C). Καθώς δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές μεταξύ του 1.6 Kb pCOX2 και pCOX2-1.2 κατασκευάσματα (Σχήμα S3), δεν είχαμε εκτελέσει περαιτέρω αναλύσεις με το μεγαλύτερο κατασκεύασμα. Σημαντικά, pCOX2-0.8 αντιπροσώπευε το θραύσμα ελάχιστο υποκινητή μέγεθος που εμφανίζουν την μέγιστη βασική δραστικότητα, αφού περαιτέρω διαγραφή είτε 159 ή 370 bp από το 5′-τέλος, όπως συμβαίνει στην περίπτωση της pCOX2-0.65 ή pCOX2-0.4 κατασκευάσματα, αντιστοίχως , μειώθηκε περισσότερο από 2 φορές τα επίπεδα της βασικής δραστηριότητας pCOX2. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η περιοχή που περιλαμβάνεται μεταξύ 0,8 και 0,65 Kbp ανάντη της TSS του γονιδίου COX2, και το οποίο περιλαμβάνει ένα στοιχείο απόκρισης μυθιστόρημα ΤΒΕ (ΤΒΕ ιστοσελίδας II? -689 /-684), Μπορεί να είναι ένα βασικό συστατικό κατά τη διάρκεια της ρύθμισης της το βασικό επίπεδο έκφρασης γονιδίου σε κύτταρα COX2 GC.

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του διαγραφές pCOX2. (Β-D) δοκιμασία γονιδίου αναφοράς σε ΜΚΝ45 (Β), AGS (C) και WI38 (D) κυτταρικές γραμμές παροδικά επιμολυσμένα με διαγραφές pCOX 50 ng (pCOX2-1.2? PCOX2-0.8? PCOX2-0.65 και pCOX2-0.4) και 50 ng του κενού φορέα. Σε όλα τα πειράματα τα κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 1 ng του PRL-SV40 Renilla ως ένας εσωτερικός έλεγχος. δραστηριότητα υποστηρικτής κανονικοποιήθηκε ως η αναλογία μεταξύ λουσιφεράση πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράση μονάδες. RLU: Σχετική Λουσιφεράσης Μονάδες. Κάθε εικόνα αντιστοιχεί σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω τεστ ANOVA (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01)

Η

Η αναβάθμιση του pCOX2-0.8 μέσω Wnt /β-κατενίνης σηματοδότησης

Στη συνέχεια εξετάσαμε. η επίδραση των σηματοδότηση Wnt /β-κατενίνης στο μυθιστόρημα ΤΒΕ ιστοσελίδας II. Εμείς επιμολυσμένα ΜΚΝ45 κυττάρων με το κατασκεύασμα ανταποκριτή pCOX2-0.8 και συν-εκφράζεται η συστατική δραστική πρωτεΐνη β-κατενίνης S33Y παρατηρώντας ότι υπήρχε σημαντική (2 φορές) ενίσχυση της μεταγραφικής δραστικότητας του pCOX2-0.8. Αυτή β-κατενίνης με μεσολάβηση αύξηση ήταν ειδική καθώς το κατασκεύασμα pCOX2-0.4 δεν διεγέρθηκε σε αυτό το β-κατενίνης υπερέκφραση κατάσταση (Σχήμα 5Α και Β). Για τον έλεγχο για Wnt /β-κατενίνης σηματοδότηση στα κύτταρα ΜΚΝ45 χρησιμοποιήσαμε τον /β-κατενίνης αποκρίνεται SuperTOPFLASH (STF) ρεπόρτερ Wnt μεταφέρουν 12 αντίγραφα μιας ΤΒΕ σε συνδυασμό [32], το οποίο επιμολύνθηκε μόνο του ή σε παρουσία του πλασμιδίου κωδικοποίησης για το μεταλλαγμένο β-κατενίνης S33Y πρωτεΐνη. Είναι ενδιαφέρον ότι, ενώ συν-έκφραση με την μεταλλαγμένη πρωτεΐνη β-κατενίνης S33Y σε κύτταρα ΜΚΝ45 ήταν σε θέση να ενισχύσει (1,9 φορές) η δραστηριότητα του STF ρεπόρτερ, τα υψηλά επίπεδα της βασικής δραστηριότητας STF ανιχνεύθηκαν με την απουσία της μεταλλαγμένης β-κατενίνης (Σχήμα 5C). Αυτό το αποτέλεσμα είναι σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματά μας από υψηλά επίπεδα ενδογενούς πυρηνικής β-κατενίνης σε αυτόν τον τύπο κυττάρου (βλέπε Σχήμα 1Β), και επιβεβαιώνει ότι η πυρηνική παράγοντας είναι λειτουργική. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτή η διαπίστωση, εκτελέσαμε πανομοιότυπα πειράματα σε κύτταρα ΗΕΚ293 και λαμβάνονται ουσιαστικά παρόμοια αποτελέσματα αν και σε αυτή την περίπτωση αποκτήθηκε ένα διαυγές καμπύλη δόσης-απόκρισης όταν pCOX2-0.8 επιμολύνθηκε με την παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ουσιαστικώς δραστικής β-κατενίνης S33Y πρωτεΐνης (Εικόνα S4). Επιπλέον, βρήκαμε ότι STF δραστηριότητα σε κύτταρα ΗΕΚ293 ήταν υψηλής απόκρισης στα επίπεδα του εξωγενούς μεταλλαγμένης β-κατενίνης (Σχήμα S4C).

προσδιορισμούς γονιδίου αναφοράς σε κύτταρα ΜΚΝ45 παροδικά επιμολυσμένα με είτε 10 ng pCOX2-0.8 ( Α) ή pCOX2-0.4 (Β), συν 5-10 ng του β-κατενίνης S33Y και 10 ng του κενού φορέα ως μάρτυρα. (Γ) SuperTOPFlash (STF? 10 ng) συν-επιμολύνθηκαν με 10 ng του β-κατενίνης S33Y ως θετικός έλεγχος για δραστικότητα σηματοδότησης Wnt /β-κατενίνης. (D) Επίδραση της δεσπόζουσας αρνητική TCF-4 (ΔTCF) κατασκευή σχετικά με τη δραστηριότητα της pCOX2-0.8. κύτταρα ΜΚΝ45 πρόσκαιρα συν-επιμολύνθηκαν με 50 ng pCOX2-0.8 και 20-50 ng του ΔTCF. (Ε) Σύγκριση μεταξύ της δραστικότητας του pCOX2-0.8 άγριου τύπου και ενός μεταλλαγμένου κατασκεύασμα MpCOX2-0.8, που περιέχουν μεταλλαγμένα υπολείμματα στην TBE Τόπος II στον υποκινητή pCOX2-0.8 ως φόντο. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις pCOX2-0.8, MpCOX-08, ή ίσες ποσότητες κενό φορέα ως μάρτυρα. Σε όλα τα πειράματα 1 ng του PRL-SV40 Renilla διαμολύνθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. δραστηριότητα υποστηρικτής κανονικοποιήθηκε ως η αναλογία μεταξύ λουσιφεράση πυγολαμπίδας και Renilla λουσιφεράση μονάδες. RLU: Σχετική Λουσιφεράσης Μονάδες. Κάθε εικόνα αντιστοιχεί σε τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε μέσω τεστ ANOVA (* p & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01)

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις επιπτώσεις του μονοπατιού /β-κατενίνης Wnt σχετικά με τη δραστηριότητα του pCOX2-0.8. πραγματοποιήσαμε πειράματα απώλειας λειτουργίας με ένα κυρίαρχο αρνητικό TCF4 (ΔTCF) κατασκεύασμα, το οποίο κωδικοποιεί ένα παράγοντα μεταγραφής που στερείται 30 υπολείμματα από αμινο-τέρμα της και ότι δεν είναι σε θέση να δεσμεύει β-κατενίνης [32]. Βρήκαμε ότι σε ΜΚΝ45 κύτταρα ΔTCF έκφραση μείωσε τα υψηλά επίπεδα pCOX2-0.8 βασική μεταγραφή σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 5D). Αυτό το αποτέλεσμα επιβεβαιώνει τον καίριο ρόλο των μεταγραφικών παραγόντων TCF /LEF μεταξύ των ρυθμιστικών αρχών της δραστηριότητας της ακολουθίας pCOX2-0.8 υποκινητή, και την περαιτέρω υποστηρίζει την ιδέα ότι η ΤΒΕ Ιστοσελίδα II (-689 /-684) εμπλέκεται στην απόκριση σε Wnt /β-κατενίνης σηματοδοτήσεως.

Τέλος, για να αντιμετωπίσει άμεσα το ρόλο του TBE Ιστοσελίδας II σε Wnt /β-κατενίνης μεσολάβηση ρύθμιση του προωθητή COX2, παρουσιάσαμε με τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση μια αλλαγή σε 2 βασικές νουκλεοτίδια της συναινετικής αλληλουχίας του πυρήνα ΤΒΕ ιστοσελίδας ΙΙ (δηλαδή pCOX2-0.8: CTTTG? MpCOX2-0.8: CCTCG). Οι αλλαγές αυτές έχουν αποδειχθεί προηγουμένως να καταργήσει Wnt /β-κατενίνης με τη μεσολάβηση της μεταγραφής [39]. Παροδική διαμόλυνση μελέτες αποκάλυψαν ότι η μετάλλαξη του TBE Ιστοσελίδας II μειώθηκε σημαντικά (2-3 φορές) η βασική δραστηριότητα της pCOX2-0.8 κατασκεύασμα ΜΚΝ45 κύτταρα (Σχήμα 5Ε) όταν συγκρίνεται με το κατασκεύασμα υποκινητή pCOX2-0.8 άγριου τύπου. Επιπλέον, και σε συμφωνία με τα προηγούμενα αποτελέσματά μας, η μετάλλαξη αυτού του site ΤΒΕ II σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη β-κατενίνης μεσολάβηση ενίσχυση της κατασκευής pCOX2-0.8 (Σχήμα S4). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΤΒΕ Ιστοσελίδας II (-689 /-684) είναι ένα λειτουργικό συστατικό στο γονίδιο COX2 μεταγραφική ρύθμιση.

β-κατενίνης δεσμεύεται με την περιοχή του γονιδίου υποκινητή COX2 που περιέχει το ΤΒΕ Ιστοσελίδας II

Επειδή ένα μεταγραφικά ενεργή διαμόρφωση της χρωματίνης δομή χαρακτηρίζεται από ένα αυξημένο επίπεδο ακετυλίωσης ιστόνης [51], μπορούμε καθιζάνει διασυνδεδεμένη θραύσματα χρωματίνης (μέσο μέγεθος 300-500 bp) που απομονώνεται από ΜΚΝ45 κύτταρα χρησιμοποιώντας πολυκλωνικά αντισώματα ειδικά για ακετυλιωμένες ιστόνες Η3 και Η4. Παρομοίως, ανιχνεύσαμε τη δέσμευση της RNA πολυμεράσης II (ροΙ II) ως μια παράμετρος που συνήθως συνδέονται με μεταγραφική δραστηριότητα. Εξετάσαμε τον εμπλουτισμό σε ιζήματα μας δύο αλληλουχίες υποκινητή: το εγγύς υποκινητή (PP) περιοχή (-118 /+ 62 από TSS) και την περιφερική περιοχή (-793 /-594) του προωθητή COX2 που περιέχει τη συναίνεση ΤΒΕ ιστοσελίδας II ( -689 /-684). Ειδικότερα, το ΤΒΕ Ιστοσελίδας II είχε ως στόχο αφού προηγούμενα πειράματα έδειξε προνομιακή δέσμευση β-κατενίνης σε αυτήν την περιοχή προαγωγού (Σχήμα S5). Ως θετικός έλεγχος, αξιολογήσαμε πρόσδεσης στη θέση TBE στον υποκινητή του γονιδίου c-myc (-1447 /-1144 από TSS), η οποία περιγράφηκε προηγουμένως σε καρκινικά κύτταρα κόλου [38].

Ακετυλιωμένο ιστόνες Η3 και Η4 και το ένζυμο Polimerase II βρέθηκαν να προσδένονται εντός της περιοχής εγγύς υποκινητή (Σχήμα 6Α), υποδεικνύοντας ότι η δομή της χρωματίνης γύρω από τον προαγωγό COX2 σε ΜΚΝ45 κύτταρα είναι σε ανοικτή διαμόρφωση, έτσι σε συμφωνία με προηγούμενα αποτελέσματα μας αποδεικνύουν ότι το γονίδιο COX2 είναι ενεργά μεταγραφή. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η πρωτεΐνη β-κατενίνης ανοσοκατακρημνίσθηκε από ΜΚΝ45 δείγματα κυρίως σε συνδυασμό με την περιοχή υποκινητή που καλύπτει την αλληλουχία ΤΒΕ -684 /-689 στο γονίδιο COX2 (Σχήμα 6Β). Αυτός ο παράγοντας ήταν σχεδόν μη ανιχνεύσιμη στην περιοχή προαγωγού εγγύς, υποδεικνύοντας ότι η ενδογενής πυρηνικής β-κατενίνης κυρίως προσλήψεως στον TBE Τόπος II σε αυτά τα κύτταρα GC. Όπως ήταν αναμενόμενο, τα ενδογενή β-κατενίνη παρομοίως συνδέεται προς τη θέση TBE υποκινητή c-myc, σε επίπεδα που είναι συγκρίσιμα με εκείνα που παρατηρήθηκαν στο γονίδιο υποκινητή COX2 (Σχήμα 6C).

(Α-Γ) δοκιμασίες ChIP σε ΜΚΝ45 κύτταρα χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα για β-κατενίνη (β-cat), πολυμεράση II (POL), Η3 και Η4 ακετυλιωμένων ιστονών (H3ac? H4ac) και ανοσοσφαιρίνη G (IgG). Η ποσοτικοποίηση έγινε με πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές για τον υποκινητή εγγύς (ΡΡ) περιοχή (Α), η ΤΒΕ Ιστοσελίδας II (-689 /-684) στον υποκινητή ανθρώπινης COX2 (Β) και μία θέση ΤΒΕ εντός του c-myc προαγωγέα, ως θετικός έλεγχος (C). δοκιμασία (D) EMSA σε πυρηνικά εκχυλίσματα από ΜΚΝ45 κύτταρα. σύμπλοκα DNA-πρωτεΐνης που σχηματίζεται με επώαση πυρηνικά εκχυλίσματα (Ν.Ε.) από κύτταρα ΜΚΝ45 με ραδιοσημασμένους ανιχνευτές που περιέχουν την ανέπαφη και ένα μεταλλαγμένο ΤΒΕ Ιστοσελίδας II (λωρίδες 3 και 5) επιλύθηκαν σε πηκτές πολυακρυλαμιδίου εγγενή στο 5% και αποκαλύπτεται μέσω αυτοραδιογραφίας. Για να προσδιοριστεί η ειδικότητα της σύνδεσης 50 φορές περίσσειας μη-ραδιοσημασμένου φυσικού τύπου (γραμμή 4) και μεταλλαγμένων (6 και 7) προστέθηκαν ολιγονουκλεοτίδια. Οι διαδρομές 1 και 2 αντιστοιχούν σε άγριου τύπου και μεταλλαγμένων ραδιοσημασμένων ολιγονουκλεοτιδίων χωρίς επώαση με Ν.Ε. Αυτές οι δοκιμές είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.