Αφηρημένο

χημειοαντίσταση εξακολουθεί να αποτελεί σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, και, πρόσφατα, η αύξηση αποδεικτικά στοιχεία δείχνουν ότι τα miRNAs εμπλέκονται σε ναρκωτικά αντίσταση. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο του στη ρύθμιση miRNAs αντίσταση σισπλατίνη σε καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή και αναλύθηκαν πιθανούς μηχανισμούς τους. Εμείς προφίλ miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε cisplatin ανθεκτικών ανθρώπινων ωοθηκών καρκινική κυτταρική σειρά Α2780 /DDP σύγκριση με γονικά κύτταρα Α2780 χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχιών. Τέσσερις ασυνήθιστα εξέφρασε miRNAs επιλέχθηκαν (miR-146a, -130a, -374a και miR-182) για περαιτέρω μελέτες. έκφρασή τους επιβεβαιώθηκαν από qRT-PCR. MiRNA μιμείται ή αναστολέα επιμολύνθηκαν σε Α2780 και Α2780 κύτταρα /DDP και έπειτα ευαισθησία φαρμάκου αναλύθηκε με συστοιχία MTS. RT-PCR και στυπώματος Western διεξήχθησαν για να εξεταστεί η μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης MDR1, ΡΤΕΝ. Ένα σύνολο 32 miRNAs βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε Α2780 κύτταρα /DDP. Μεταξύ αυτών, miR-146a ήταν κάτω-ρυθμίζονται και miR-130a, -374a, -182 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω σε Α2780 κύτταρα /DDP, η οποία επιβεβαιώθηκε με RT-PCR. MiR-130Α και miR-374Α μιμείται μείωσε την ευαισθησία των κυττάρων Α2780 να σισπλατίνη, αντίστροφα, οι αναστολείς τους θα μπορούσε να επαναευαισθητοποιήσουν Α2780 κύτταρα /DDP. Επιπλέον, η υπερέκφραση του miR-130 θα μπορούσε να αυξήσει τα επίπεδα MDR1 mRNA και P-gp στο Α2780 και Α2780 κύτταρα /DDP, ενώ νοκ ντάουν του miR-130 θα μπορούσε να αναστείλει την έκφραση του γονιδίου MDR1 και ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση της πρωτεΐνης PTEN .Σε ένα συμπέρασμα, την απελευθέρωση των miR-374Α και miR-130a μπορεί να εμπλέκεται στην ανάπτυξη και ρύθμιση της αντίστασης σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ο ρόλος του miR-130 μπορεί να επιτευχθεί με τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης MDR1 και PTEN

Παράθεση:. Λι Ν, Γιανγκ L, Wang Η, Yi Τ, Jia Χ, Chen C, et al. (2015) MiR-130Α και MiR-374Α Λειτουργία ως Novel Ρυθμιστές Cisplatin Αντίστασης Ανθρωπίνων καρκίνου των ωοθηκών Α2780 κύτταρα. PLoS ONE 10 (6): e0128886. doi: 10.1371 /journal.pone.0128886

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, την Κίνα

Ελήφθη: 15 του Φλεβάρη του 2015? Αποδεκτές: 2 του Μαΐου 2015? Δημοσιεύθηκε: τέταρτης Ιουνίου 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή υποστηρίζεται από δύο κεφάλαια. Το ένα είναι η τοπική Ίδρυμα (No.2012SZ0022) από το Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Sichuan (https://www.scst.gov.cn/info/), του οποίου η χρηματοδότη είναι WHJ που συμμετέχουν στο σχεδιασμό της μελέτης και την απόφαση να δημοσιεύσει σε αυτό μελέτη. Το άλλο είναι το Πρόγραμμα για Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα ερευνητική ομάδα του Πανεπιστημίου (NO.IRT0935, https://www.moe.gov.cn/), των οποίων οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, απόφαση να δημοσιεύει, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου σε γυναικολογικές κακοήθειες [1]. Περισσότερο από το 70% των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών έχουν προχωρημένο στάδιο (FIGO στάδιο III ή IV) νόσου κατά τη στιγμή της διάγνωσης [2]. Η σισπλατίνη είναι η κύρια θεραπευτική προσέγγιση για τον προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών, ωστόσο, τα ναρκωτικά αντίσταση ελαχιστοποιεί την αποτελεσματικότητα της σισπλατίνης βάσης χημειοθεραπεία σε έναν μεγάλο αριθμό ασθενών [3]. έχουν πολλαπλούς παράγοντες και τους μηχανισμούς που συμβάλλουν στην σισπλατίνη αντίστασης έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένων εκροή αυξημένη ναρκωτικών, έκτρωμα του στόχου των ναρκωτικών, ενίσχυση της επιδιόρθωσης του DNA και τις μεταβολές των οδών απόπτωσης [4-7] .Nonetheless των υποκείμενων μηχανισμών της χημειοαντίσταση είναι ακόμη πλήρως κατανοητό και το αποτελεσματικοί παράγοντες για τη βελτίωση της αντίστασης είναι μέχρι σε περίπτωση απουσίας.

Πρόσφατα, μελέτες ανέφεραν ότι microRNAs (miRNAs) ενεπλάκησαν σε χημειοαντίσταση. MiRNAs αντιπροσωπεύουν μια κατηγορία από μικρά μη-κωδικοποίησης των μορίων RNA, και θα μπορούσε να συνδεθεί με την 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) των mRNA στόχου, με αποτέλεσμα αποικοδόμηση RNA ή /και μεταφραστικά καταστολή [8]. Έτσι, miRNAs συμμετάσχουν ευρέως στη ρύθμιση των διαφόρων βιολογικών διαδικασιών, όπως η εμβρυϊκή ανάπτυξη, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και την απόπτωση [8,9]. Ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών δείχνουν ότι έχουν παρεκκλίνουσα έκφραση των miRNAs έχουν συσχετιστεί με κάθε πτυχή της βιολογίας των όγκων, συμπεριλαμβανομένης της αντίστασης σε διάφορους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [10-12] .Για παράδειγμα, miR-21 υπερεκφράζεται σε ορθοκολικό καρκίνο ιστούς που ήταν λιγότερο ευαίσθητα σε 5 -FU [13], και η αναστολή της miR-21 έκφραση ήταν σε θέση να ευαισθητοποιήσει κύτταρα σε 5-FU [14]. Επιπλέον, προηγούμενη μελέτη μας [15] διαπίστωσε ότι το miR-130a ρυθμίζεται αυξητικά σε SKOV3 /DDP σε σύγκριση με SKOV3, και η αναστολή του miR-130 θα μπορούσε να ξεπεραστεί η σισπλατίνη αντίστασης με τη ρύθμιση της οδού /P-gp MDR1. Ωστόσο, ο ρόλος της εξειδικεύσεως των κυττάρων miRNAs prensents, έτσι ώστε η έκφραση του miR-130a ή άλλα miRNAs και τους ρόλους τους στις άλλες κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών είναι απαραίτητες για την περαιτέρω μελέτη.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση miRNA προφίλ Α2780 και Α2780 /κυττάρων DDP, και επιλέγονται ορισμένα από τα διαφορικά εκφρασμένων miRNAs σε Α2780 /DDP για περαιτέρω μελέτη. Στη συνέχεια, θα ελέγξει την έκφραση των επιλεγμένων miRNAs από qRT-PCR, και διερευνάται ο ρόλος τους στη διαμόρφωση της σισπλατίνης-αντίσταση, η οποία μπορεί να προσφέρει νέες υποψήφιες στόχοι για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών σισπλατίνη ανθεκτικά.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Το ανθρώπινο Α2780 καρκίνο των ωοθηκών κυτταρική γραμμή και σισπλατίνη ανθεκτική υπογραμμή του Α2780 /DDP καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Gibco, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, Gibco , USA), σε ένα υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2 στους 37 ° C. Α2780 /DPP ήταν εναλλάξ τροφοδοτείται με μέσο που περιέχει 9 μg /mL σισπλατίνης για τη διατήρηση της ανθεκτικότητας στα φάρμακα και περαιτέρω καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο φαρμάκου για μία εβδομάδα πριν από τα πειράματα παρακολούθησης. λαμβάνονται και διατηρούνται σε Γυναικολογική Ογκολογία του Βιοθεραπεία Εργαστηρίου, Δυτική Κίνα Δεύτερον Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο, Πανεπιστήμιο Sichuan, Chengdu, Κίνα Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές.

miRNA ανάλυση μικροσυστοιχιών

Το συνολικό RNA εξήχθη από Α2780 και Α2780 /κυττάρων DDP χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ (Invitrogen, USA) και κιτ miRNeasy mini (QIAGEN, Δανία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα και η ποσότητα μετρήθηκαν με φασματοφωτόμετρο (Beckman Coulter, DU730, USA) και η ακεραιότητα του RNA επαληθεύεται δι ‘ηλεκτροφορήσεως γέλης. RNA (1 μg) σημάνθηκε με Hy3 φθορισμού χρησιμοποιώντας το κιτ επισήμανσης miRCURY Ισχύς (Exiqon, Vedbaek, Δανία) και, στη συνέχεια, σε υβριδισμό στη συστοιχία miRCURYLNA (v.18.0, Exiqon) που περιέχει 1887 ανθρώπινο ανιχνευτές σύλληψης miRNA σχολιασμένο miRBase 18.0. Μετά τον υβριδισμό, οι εικόνες του σήματος φθορισμού αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σαρωτή GenePix 4000B (Αχοη Instruments, Union City, CA, USA) και αναλύθηκαν με GenePix Pro 6.0 soft-ware (Αχοη Instruments), στο οποίο αποκτήθηκε η μέση κανονικοποίηση. Δύο φορές ή μεγαλύτερη αλλαγή ορίστηκε ως κατώφλι σημαντική διαφορά.

Βιοπληροφορική

Οι πιθανοί στόχοι των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs έχουν προβλεφθεί με τη βοήθεια των PicTar ή TargetScan 5.2 του λογισμικού.

σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR

Επαληθεύσαμε την έκφραση των miRNAs seleted στο Α2780 και Α2780 /DDP κύτταρα με qRT-PCR. Ολικό RNA από κάθε κυτταρική σειρά εκχυλίστηκε και εκτιμήθηκε ως η προαναφερθείσα. MiRNA και U6 cDNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές ειδικούς miRNA RT βρόχου στελέχους σύμφωνα με την AMV First Strand cDNA Synthesis Kit πρωτόκολλο (Invitrogen, USA). Όλοι οι εκκινητές σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Guangzhou RiboBio (RiboBio, Κίνα). Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα 20 μΙ όγκο αντίδρασης για την ΑΒΙ StepOne συν όργανο (USA). Σχετική έκφραση miRNA αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδος και ομαλοποιήθηκε ως προς την έκφραση της U6 μικρών RNA. Όλα qRT-PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν.

τηλέφωνα επιμόλυνση

Η miRNA μιμούνται, αναστολέα και αρνητικού ελέγχου σχεδιάστηκαν και χημικά συντίθεται από Guangzhou RiboBio (RiboBio, Κίνα). 24h πριν από την επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με 5.000 κύτταρα /φρεάτιο και καλλιεργήθηκαν σε μέσο χωρίς αντιβιοτικά. Μετά την προσκόλληση των κυττάρων, η διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) και Opti-Mem μειωμένο ορό μέσα (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το μέσο αντικαταστάθηκε 4-6 ώρες μετά την επιμόλυνση με φρέσκο ​​μέσον. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν για περαιτέρω 48 ώρες μετά την επιμόλυνση ανάλυση. Η αποτελεσματικότητα αυτού του συστήματος διαμόλυνσης μεσολάβηση λιποσωμάτων ήταν dectected με τη βοήθεια του Cy3-siRNA. Cy3-siRNA είναι ένα είδος 21-25nt μικρού μορίου RNA, που είναι παρόμοια με αναστολέα miRNA ή μιμητικά, και μπορεί να διεγείρει φθορισμός στο μήκος κύματος 555 nm. Τα κύρια στάδια είναι τα εξής: τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων με 10.000 κύτταρα /πηγάδι και ο επιμολυσμένα με Cy3-siRNA χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 και μεσαίου Opti-Mem. 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού. Η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης παρουσιάστηκε ως ο λόγος των κυττάρων που παρατηρούνται κάτω από το φθορισμό σε κύτταρα παρατηρήθηκε κάτω από το nomal ligtht. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

συστοιχία Κυτταρική βιωσιμότητα

Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων εκτέθηκαν σε διάφορες συγκεντρώσεις σισπλατίνης. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με χρωματομετρική δοκιμασία με τη χρήση του CellTiter 96 Υδατικό One Solution κιτ δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega, Madison, WI, USA). Μετά από 48 ώρες θεραπείας, 20 μΙ Αντιδραστηρίου Ένα διάλυμα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C. Η απορρόφηση σε μήκος κύματος 490 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Model 680, Bio-Rad, USA). Κάθε πείραμα διεξήχθη με επαναλήψεις έξι πηγαδιών και επαναλήφθηκε τρεις φορές.

ημι-ποσοτική RT-PCR

Ολικό RNA από μη επεξεργασμένα κύτταρα ή διαμολυσμένα κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤπζοΙ Αντιδραστήριο. RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του PrimeScript RT κιτ αντιδραστηρίου και Assay Kit Multiplex PCR σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Takara Biotechnology, Dalian, Κίνα). Τα προϊόντα PCR ταυτοποιήθηκαν με ηλεκτροφόρηση με πήκτωμα αγαρόζης 1,5% και καταγράφονται χρησιμοποιώντας το σύστημα απεικόνισης Gel (Bio-Rad, CA, USA). GAPDH RNA είχε υπηρετήσει ως ένα στοιχείο ελέγχου εισόδου.

Δυτική

δοκιμασία κηλίδος

Τα κύτταρα πλύθηκαν με 1 × PBS και λύθηκαν με ρυθμιστικό ΚΙΡΑ. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο BCA. Στη συνέχεια, 20ug πρωτεΐνης χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση της Ρ-gp και πρωτεΐνη ΡΤΕΝ, και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. ποντικού μονοκλωνικό αντι-Pgp (αραιωμένο 1: 1000? Calbiochem, San Diego, CA, USA), αντι-ΡΤΕΝ (αραιωμένο 1: 1000? Santa Cruz, CA, USA) και αντι-GAPDH (αραιωμένο 1: 50.000? Kangchen, Σαγκάη , Κίνα) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτεύοντα αντισώματα. Το δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας. Τα δεσμευμένα αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ECL. Η ποσότητα Ένα λογισμικό χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση εντάσεις ζωνών πρωτεΐνης.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. Η διαφορά μεταξύ των μέσων αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας t-τεστ Student. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 13.0 λογισμικού (Chicago, IL, USA). Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές.

Αποτελέσματα

Διαφορικές εκφράζεται miRNAs σε Α2780 /DDP σε σύγκριση με το γονικό κύτταρο Α2780

της

Το προφίλ έκφρασης των miRNAs των ωοθηκών καρκινική κυτταρική σειρά τα A2780S και Α2780 /DDP ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας συστοιχία miRNA σε αυτή τη μελέτη. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, 32 miRNAs (24 πάνω ρυθμισμένα, 8 ρυθμίζεται προς τα κάτω) βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε Α2780 κύτταρα /DDP συγκριτικά με γονικά κύτταρα του. Το δυναμικό γονίδιο στόχος αυτών των miRNAs είχε προβλεφθεί και παρατίθενται στον Πίνακα 1.

Η

Σε πραγματικό χρόνο qRT-PCR για 4 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs

Μεταξύ 32 διαφορικά εκφρασμένων miRNAs, έχουμε επιλέξει 4 miRNAs για περαιτέρω μελέτη. Τα αποτελέσματα της qRT-PCR έδειξε ότι, σε κύτταρα Α2780 /DDP, η έκφραση του miR-374Α, 130Α, -182 ήταν αντίστοιχα αυξημένη κατά 2,06, 4,87, 1,28 πτυχώσεις και miR-146a μειώθηκε κατά 133.56 φορές σε σύγκριση με τα A2780S κύτταρα (

ρ

& lt? 0,05), η οποία ήταν σύμφωνα με τη μικροσυστοιχία. (Σχήμα 1)

Το επίπεδο του miR-146a σε Α2780 /DDP ήταν εξαιρετικά χαμηλή, αντιπροσωπεύει μόνο το 0,75 ποσοστό ότι τα A2780S (**

σ

& lt? 0,05). Η έκφραση του miR-130a, -374a και miR-182 ήταν 4,8, 2,08 και 1,28 διπλώνει υψηλότερη από ότι στα κύτταρα Α2780 (**

σ

& lt? 0,05, *

σ

& lt? 0.05) .Οι αποτελέσματα έδειξαν τις σταθερές αλλαγές έκφρασης που ανιχνεύεται από τον μικροσυστοιχιών.

η

miR-130a και miR-374Α μιμείται ή αναστολείς ρύθμιση ευαισθησίας σισπλατίνη στο Α2780 και Α2780 /DDP

αυτή η μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το λιπόσωμα να μεσολαβούν την επιμόλυνση αναλόγων miRNA. Έτσι πρώτον εντόπισε την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης. Α2780 και Α2780 /DDP κύτταρα παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού μετά από 24 ώρες από Cy3-siRNA διαμόλυνση. υπολογίσαμε ότι οι τα A2780S και Α2780 κύτταρα /DDP με κόκκινο φθορισμό αντιπροσώπευαν αντίστοιχα 85% και 93%, πράγμα που indictated ότι λιποσώματα με τη μεσολάβηση του συστήματος επιμόλυνση θα μπορούσε να επιτευχθεί μια υψηλή απόδοση

Τρεις miRNA (miR-374Α,. – 130α, -182) μιμείται και ο αναστολέας miR-146a μετήχθησαν σε Α2780 κύτταρα, για να δούμε αν τα επιμολυσμένα κύτταρα θα αποκτήσει αντοχή σε σισπλατίνη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα Α2780 επιμολυσμένα με miR-374Α και miR-130α μιμείται είχαν σημαντικά υψηλότερη επιβίωση από την ομάδα ελέγχου υπό την θεραπεία του 0,8, 3,2 μg /ml cispaltin, αλλά ίδιο φαινόμενο δεν παρατηρήθηκε για miR-182 μιμείται και αναστολέας miR-146a. (Ρ & lt? 0,05, Σχήμα 2Α).

(Α) Τα κύτταρα Α2780 μετά την επιμόλυνση με miR-130a-μιμητικό και miR-374Α-μιμητικό έδειξε αυξημένη αναλογία των κυττάρων που επιβιώνουν κάτω από την θεραπεία του 0.8, 3.2 ug /ml cispaltin (*

σ

& lt? 0,05). (Β) miR-130a-αναστολέα και miR-374Α-αναστολέα μείωσε την αναλογία των κυττάρων που επιβιώνουν κάτω από την θεραπεία των 8, 32 μg /ml cispaltin (*

ρ

& lt? 0,05).

Σας περαιτέρω επιμολυσμένα με αναστολείς miR-374Α και miR-130a σε Α2780 κύτταρα /DDP να διερευνήσει κατά πόσον μπορεί να αντιστρέψει εν μέρει την αντίσταση σισπλατίνη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Β, miR-374Α και αναστολέα miR-130a ενίσχυσε σημαντικά την κυτταροτοξικότητα της θεραπείας σισπλατίνη σε σύγκριση με εκείνη του ελέγχου (ρ & lt? 0,05).

MiR-130α ρυθμίζουν την έκφραση του MDR1 και ΡΤΕΝ σε A2780S και Α2780 κύτταρα /DDP

Εξετάσαμε την έκφραση του MDR1, ΡΤΕΝ mRNA και πρωτεΐνης σε Α2780 και Α2780 /DDP κυττάρων με RT-PCT και κηλίδα western. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, το επίπεδο MDR1 mRNA και P-gp στο Α2780 /κυττάρων DDP ήταν 2,33 και 1,88 φορές υψηλότερη από εκείνη του στα κύτταρα Α2780 (Ρ & lt? 0,05), ενώ η έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης ήταν εξαιρετικά χαμηλή και στις δύο κυτταρικές γραμμές και η έκφραση της ΡΤΕΝ mRNA και της πρωτεΐνης δεν έδειξε σημαντική διαφορά μεταξύ τους (P & gt? 0,05).

(Α) επίπεδα MDR1 και ΡΤΕΝ mRNA σε Α2780 και Α2780 κύτταρα /DDP. Η έκφραση του MDR1 mRNA υπερεκφράστηκε σε Α2780 /DDP σύγκριση με Α2780 (Ρ & lt? 0,05), και το επίπεδο ΡΤΕΝ mRNA δεν έδειξε διαφορά (Ρ & gt? 0,05). (B) P-gp και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης PTEN έχει τα A2780S και Α2780 κύτταρα /DDP. Η έκφραση της Ρ-gp σε Α2780 κύτταρα /DDP ήταν υψηλότερη από εκείνη του Α2780 (Ρ & lt? 0,05), και ΡΤΕΝ πρωτεΐνη ήταν σε πολύ χαμηλά επίπεδα σε Α2780 και Α2780 κύτταρα /DDP. (1,2: Α2780, Α2780 /DDP)

Η

Για να διερευνηθεί κατά πόσο miR-130a θα μπορούσε να ρυθμίζουν την έκφραση ΡΤΕΝ και MDR1, οι αντίστοιχες μιμείται και αναστολείς των δύο miRNAs μετήχθησαν σε Α2780 και Α2780 /κυττάρων DDP. ΡΤΕΝ, MDR1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης τους προσδιορίστηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Όπως φαίνεται στο σχήμα 4, η αναστολή miR-130a αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ και εξασθένησε την expressio του MDR1 mRNA και P-gp (Ρ & lt? 0,05), ενώ miR-130a υπερέκφραση είχε ως αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα πάνω του MDR1 mRNA και P-gp έκφραση σε Α2780 και Α2780 κύτταρα /DDP (Ρ & lt? 0,05) .Η έκφραση του ΡΤΕΝ mRNA δεν άλλαξε με τη θεραπεία του αναστολέα miR-130a και μιμείται σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Ρ & gt? 0,05).

(A1 , Α2): ΡΤΕΝ και MDR1 mRNA σε Α2780 κύτταρα μετά την επιμόλυνση. Το επίπεδο MDR1 mRNA ρυθμίζεται αυξητικά από τις μιμείται miR-130 και ρυθμίζεται προς τα κάτω από τον αναστολέα miR-130a (P & lt? 0,01). (Β1, Β2): P-gp και πρωτεΐνη ΡΤΕΝ σε Α2780 κύτταρα μετά την επιμόλυνση. Η έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης είναι σημαντικά αυξημένα Όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με miR-130a-Ι, την έκφραση της P-gp ήταν απορυθμίζεται από miR-130-M και μειωτικά από miR-130a-I. (C1, C2): ΡΤΕΝ και MDR1 mRNA σε Α2780 /κυττάρων DDP μετά την επιμόλυνση. Η ρυθμιστική επίδραση των miR-130α επί Α2780 κύτταρα /DDP ήταν παρόμοια με εκείνη των κυττάρων Α2780. (D1, D2): P-gp και πρωτεΐνης PTEN σε κύτταρα Α2780 /DDP μετά την επιμόλυνση. Η επίδραση του miR-130a ήταν παρόμοια με εκείνη του τα A2780S κυττάρων. (1,2,3: miR-130a-Μ, miR-130-I και miR-NC? * Ρ & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01)

Η

Εν ολίγοις, βρήκαμε 32 miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε Α2780 κύτταρα /DDP συγκριτικά με γονικά κύτταρα του από συστοιχία miRNA. Μεταξύ αυτών, το ένα κάτω-ρυθμίζονται miRNA (miR-146a) και τρεις up-ρυθμίζονται miRNAs (miR-130a, -374a, -182) επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη, και η έκφρασή τους επικυρώθηκαν με συνέπεια σειρά miRNA χρησιμοποιώντας qRT-PCR. Στο πείραμα επιμόλυνση, η υπερέκφραση του miR-130a και miR-374Α βρέθηκαν να μειώνουν την ευαισθησία του Α2780 και Α2780 κύτταρα /DDP στη σισπλατίνη, και προς τα κάτω-ρύθμιση της miR-130a και έκφραση miR-374Α που εξασκείται το αντίθετο αποτέλεσμα. Τα αποτελέσματα της RT-PCR και στύπωμα Western έδειξε ότι miR-130a θα μπορούσε να ρυθμίζουν θετικά την έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης των MDR1 και ρυθμίζουν αρνητικά την πρωτεΐνη ΡΤΕΝ, το οποίο μπορεί να είναι ένας από τους μηχανισμούς του ρόλου miR-130a σε χημειοαντίσταση.

Συζήτηση

Παρά το γεγονός ότι με βάση την πλατίνα χημειοθεραπεία έχει βελτιώσει σημαντικά την πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών, της ανθεκτικότητας στα φάρμακα παραμένει ως το κύριο εμπόδιο της επιτυχούς θεραπείας [3]. Πρόσφατα, miRNAs έχουν αναφερθεί να εκφράζονται διαφορικά σε φάρμακο καρκίνους ανθεκτικά και θα μπορούσε να ρυθμίσει την αντίσταση των ναρκωτικών [16,17].

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι το 32 miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά σε Α2780 /DDP σε σύγκριση με το Α2780. Είναι ενδιαφέρον ότι μερικά από αυτά τα miRNAs έχουν επιβεβαιωθεί ότι εμπλέκονται στην χημειοαντίσταση. Για παράδειγμα, miR-27a ήταν ρυθμισμένα σε Α2780 /κυττάρων ταξόλη και knockdown του miR-27a ενίσχυσε την ευαισθησία paclitaxel [18]. Takiuchi [19] ανέφεραν ότι miR-181 μείωσε την ευαισθησία των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων να gemcitabine μέσω ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ με αναστολή CYLD. προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε επίσης miR-130a σχετιζόταν με σισπλατίνη αντοχή στα κύτταρα SKOV3. Τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών αποκάλυψε ότι σε Α2780 /DDP η έκφραση του miR-146a ήταν εξαιρετικά χαμηλή, και miR-130a, -374a, -182 ρυθμιζόταν up-. Επιπλέον, ο ρόλος του miR-130 στην σισπλατίνη αντίσταση των κυττάρων Α2780 και αν miR-146a, -374a, -182 θα μπορούσε να ρυθμίζει την αντίσταση φαρμάκου δεν έχουν ακόμα αναφερθεί, έτσι ώστε να επιλέξετε αυτά τα τέσσερα miRNAs για περαιτέρω μελέτη. Αυτά έκφραση τέσσερις miRNAs ελέγχθηκε από qRT-PCR, κάπως γεγονός που υποδηλώνει ότι μικροσυστοιχιών είχε μια υψηλή ακρίβεια.

Στα πειράματα επιμόλυνσης, βρήκαμε αλλοίωση του miR-130a και την έκφραση του miR-374Α θα μπορούσε να αλλάξει τον βαθμό της αντίστασης σισπλατίνη στο Α2780 και Α2780 /DDP. Αρκετές έρευνες έχουν δείξει ότι το miR-130a ενήργησε ως χημειοθεραπεία ρυθμιστή. Up-ρύθμιση του miR-130a θα μπορούσε να επηρεάσει την δοξορουβικίνη αντίσταση στον καρκίνο του μαστού [20], και miR-130α προκάλεσε την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων του ήπατος στη σισπλατίνη με ρύθμιση προς τα κάτω του γονιδίου καταστολής όγκου RUNX3 [21]. Σε προηγούμενη μελέτη μας [15], miR-130a ήταν υπερεκφράζεται σε SKOV

3 /DDP κύτταρα, και η αναστολή των miR-130a θα μπορούσε εν μέρει να αποκαταστήσει την ευαισθησία σισπλατίνη, η οποία ήταν συνεπής με την παραπάνω μελέτη.

Επί του παρόντος, μερικές μελέτες επικεντρώθηκαν στο ρόλο του miR-374Α σε όγκο, η οποία επισήμανε ότι miR-374Α υπερεκφράστηκε στο οστεοσάρκωμα [22] και του παχέος εντέρου [23]. Εκτός αυτού, miR-374Α συμμετείχε στην γένεση του όγκου και την μετάσταση του καρκίνου του μαστού με τη ρύθμιση της Wnt /κατενίνης μονοπάτι [24]. Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν αναφορές σχετικά με το ρόλο του miR-374Α της αντίστασης στα φάρμακα. Εδώ, βρήκαμε ότι miR-374Α ρυθμίζεται αυξητικά σε σισπλατίνη ανθεκτικά κύτταρα, και μειώνοντας την έκφρασή του θα μπορούσε να κάνει τα κύτταρα πιο ευαίσθητα σε σισπλατίνη, ενώ προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασής του σε τα A2780S είχε το αντίθετο αποτέλεσμα.

Συνεπώς, θεωρήσαμε ότι η υπερ-έκφραση του miR-130a και miR-374Α θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ανάπτυξη και τη ρύθμιση της αντίστασης σισπλατίνη σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Την αναστολή της έκφρασης του miR-130a και miR-374Α μπορεί να είναι μια νέα προσέγγιση για το ξεπέρασμα της αντίστασης στα φάρμακα στον καρκίνο των ωοθηκών. Ως αποτέλεσμα, πραγματοποιήσαμε επίσης RT-PCR και Western Blot για να βρει το μηχανισμό του miR-130a ρυθμιστική επίδραση στην αντοχή στα φάρμακα.

Η μελέτη μας διαπίστωσε την έκφραση του MDR1 mRNA και το προϊόν της πρωτεΐνης Ρ-γλυκοπρωτεΐνη του (P -gp) επίπεδα στο Α2780 /DDP ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στα τα A2780S, υποδηλώνοντας ότι η υπερέκφραση του γονιδίου MDR1 μπορεί να είναι ένας μηχανισμός του σχηματισμού αντίστασης φαρμάκου σε κύτταρα Α2780 /DDP. P-gp είναι μία αντλία μεμβράνης ΑΤΡ-εξαρτώμενη που μεταφέρει το φάρμακο έξω από τα κύτταρα, με αποτέλεσμα την αντίσταση σε πολλά φάρμακα [25]. Άφθονο αποδείξεις έδειξαν ότι miRNAs συνδέθηκαν με τη μεσολάβηση Ρ-gp αντοχή στα φάρμακα σε πολλούς καρκίνους. Για παράδειγμα, miR-451 ξεπέρασε την αντίσταση δοξορουβικίνη με ρύθμιση προς τα κάτω την έκφραση της P-gp στις doxorubicin ανθεκτικά καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές MCF-7 /ADR [26]. Αναστολή της miR-27a ενίσχυσε την ευαισθησία paclitaxel σε Α2780 /Taxol διαμορφώνοντας την MDR1 /έκφραση της Ρ-γλυκοπρωτεΐνης [18]. Καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι η αναστολή της έκφρασης του miR-130 οδήγησε σε κάτω-ρύθμισης της MDR1 mRNA και P-gp. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενα πειράματα μας.

Βρήκαμε επίσης ότι το miR-130a ρυθμίζεται αρνητικά την έκφραση της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης. ΡΤΕΝ πρωτεΐνη είναι μια διπλή φωσφατάση ειδικότητα που μπορεί να μπλοκάρει οδούς μεταγωγής σήματος κυτοκίνης με μεσολάβηση, τότε αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την εισβολή και τη μετάσταση και την προώθηση της απόπτωσης [27]. Σε μια ποικιλία των κακοήθων όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου, του καρκίνου του μαστού, της λευχαιμίας, του καρκίνου των ωοθηκών κλπ, ΡΤΕΝ γονίδιο και πρωτεΐνη έχουν διαφορετικούς βαθμούς διαγραφή ή προς τα κάτω ρύθμιση [27,28]. Έχει αναφερθεί ότι το ΡΤΕΝ πρωτεΐνη θα μπορούσε να συμβάλει στην ευαισθησία φαρμάκου με καταστολή της ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι, και να χρησιμεύσει ως γονίδιο στόχος πολλών miRNAs, όπως miR-21, miR-22 και miR-222 [29,30]. Σε αυτό το πείραμα, η έκφραση της πρωτεΐνης σε ΡΤΕΝ τα A2780S και Α2780 κύτταρα /DDP ήταν εξαιρετικά χαμηλή και δεν είχαν σημαντική διαφορά μεταξύ αυτών των δύο κυτταρικών σειρών. Μπορούμε συναχθεί επίσης ότι η αποκατάσταση της έκφρασης ΡΤΕΝ μπορεί να είναι ένας από τους μηχανισμούς αύξησης χημειοευαισθησίας στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Ωστόσο, Α2780 και Α2780 DDP κύτταρα /επιμολυσμένα με miR-130a-αναστολέας δεν ασκούσε υψηλότερη αναστολή της δραστηριότητας των κυττάρων σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου σύμφωνα με την αγωγή της σισπλατίνης χαμηλής δόσης (0.2ug /ml και 2 μg /ml αντίστοιχα), υπολογίσαμε ο λόγος του φαινομένου αυτού είναι ότι ΡΤΕΝ μεσολάβηση κυτταρικής απόπτωσης στηρίζονται εν μέρει από την κυτταρική βλάβη από σισπλατίνη και έχουν μια συνεργιστική δράση. Μόνο μια μικρή ποσότητα κυττάρων που υποβάλλονται σε επεξεργασία σε απόπτωση ή θανάτου σε αυτή την χαμηλή δόση της σισπλατίνης, και η αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων που προκαλείται από PTEN δεν έχουν αρκετή ικανότητα να κάνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ των ομάδων μελέτης και ελέγχου. Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι miR-130a δεν ρυθμίζουν την έκφραση ΡΤΕΝ mRNA παρομοίως ΡΤΕΝ πρωτεΐνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι miR-130a μπορεί να ρυθμίζει την μεταγραφή του γονιδίου PTEN στο μετα-μεταφραστικό επίπεδο με ατελή προσδένονται στο 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR ) του mRNA PTEN.

λογισμικό PicTar andTargetScan προβλέπει ότι οι δυνητικοί γονιδίων στόχων του miR-374Α περιλαμβάνουν ΑΚΤ3, ABI1, PDCD6, ABCC5 και ούτω καθεξής. Μεταξύ αυτών, ABI1 έχει αποδειχθεί ότι σχετίζεται με την αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού [31], το οποίο μπορεί να είναι ένας από τους ρυθμιστικούς μηχανισμούς του miR-374Α για την αντοχή σισπλατίνη, ωστόσο, παραμένει να επαληθευτεί περαιτέρω με expriments.

Πρόσφατα, Xiang et al. [32] ανέφερε ότι το miR-152 και miR-185 ήταν σημαντικά μειωτικά στο SKOV3 /DDP και Α2780 κύτταρα /DDP, σε σύγκριση με τα ευαίσθητα μητρική γραμμή τους SKOV3 και Α2780, και up-ρύθμιση του έκφραση του miR-152 ή miR-185 αυξημένη ευαισθησία σισπλατίνης SKOV3 /DDP και Α2780 κύτταρα /DDP καταστέλλοντας μεθυλοτρανσφεράση DNA 1 (DNMT1) άμεσα. Αντιφατικά, miR-152 και miR-185 (μειώθηκε κατά 0,4 και 0,6 φορές σε Α2780 /DDP κυττάρων σε σύγκριση με κύτταρα Α2780 στη μελέτη Xiang του) βρέθηκε να είναι ανάντη ή ρυθμίζεται προς τα κάτω σε λιγότερο από δύο φορές σε Α2780 /κύτταρα DDP σύγκριση με κύτταρα Α2780, έτσι ώστε αυτά τα miRNAs δεν αναφέρονται ως miRNAs ενδιαφέροντος. Ωστόσο, θα πρέπει να γνωρίζουμε ότι η σειρά miRNA είναι μια προκαταρκτική δοκιμή ελέγχου για τα αποτελέσματα της οποίας χρειάζονται περαιτέρω επικύρωση όπως με qRT-PCR, και το λιγότερο από δύο φορές διαφορικά εκφρασμένων miRNAs μπορούν επίσης να έχουν επίδραση στην αντοχή στα φάρμακα του καρκίνου των ωοθηκών.

εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ότι εκφράζονται διαφορικά miRNAs σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σισπλατίνη ανθεκτικά πιθανώς παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ή την ρύθμιση της αντίστασης σισπλατίνη. Επιπλέον, η επιμόλυνση με miR-130a και αναστολείς miR-374Α ενίσχυσε την κυτταροτοξική δράση της σισπλατίνης. Ο ρόλος του miR-130a σε αντίσταση στο φάρμακο επιτεύχθηκε τουλάχιστον εν μέρει με τη ρύθμιση της έκφρασης της Ρ-gp και πρωτεΐνη ΡΤΕΝ. ΡΤΕΝ μπορεί να είναι ένα γονίδιο στόχος του miR-130a, ωστόσο, χρειάζεται την επικύρωση της διπλής εκθέσεων λουσιφεράσης. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-130a και miR-374Α θα μπορούσε να είναι πολλά υποσχόμενη ως νέων θεραπευτικών στόχων για την αντιμετώπιση της αντοχής στα φάρμακα.

Ευχαριστίες

Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Πρόγραμμα για Changjiang μελετητές και τα καινοτόμα Έρευνας η ομάδα (PCSIRT) στο Πανεπιστήμιο (IRT0935), και το τοπικό Ίδρυμα του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας του Chengdu (Αρ 11DXYB133SF-027).