Αφηρημένο

Στόχοι

Το αισθητήριο και ενεργοποιητής της μεταγραφής-3 (STAT3) διαδραματίζει σημαντικό ρόλο σε προσβολή όγκου κυττάρων και τη μετάσταση. Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει τις επιπτώσεις της STAT3 νοκ ντάουν στον γυμνό ξενομοσχεύματα ποντίκι καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και του υποκείμενου γονιδιακής έκφρασης.

Μέθοδοι

Ένα STAT3 shRNA φορέα λεντοϊού κατασκευάστηκε και μολύνθηκαν σε κύτταρα SW1990. qRT-PCR και δυτική immunoblot διεξήχθησαν για να ανιχνεύσουν την έκφραση του γονιδίου. Γυμνό δοκιμασίες ξενομοσχεύματος ποντικού χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθούν οι αλλαγές σε φαινότυποι αυτών των σταθερών κυττάρων in vivo. HE χρώση χρησιμοποιείται για την εκτίμηση εισβολή των καρκινικών κυττάρων και ανοσοϊστοχημεία έγινε για να αναλυθεί έκφραση του γονιδίου.

Αποτελέσματα

STAT3 shRNA σιγήσει επιτυχώς έκφραση του STAT3 mRNA και της πρωτεΐνης σε κύτταρα SW1990 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. ρυθμός ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων STAT3-σιγήσει σε γυμνούς ποντικούς ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τους όγκους σε φορέα ελέγχου και γονικών όγκων κύτταρα που δημιουργείται. Όγκων εισβολή μέσα στο δοχείο και των μυών ήταν επίσης κατέστειλε στους όγκους STAT3-σιγήσει σύγκριση με τους ελέγχους. έκφραση του κολλαγόνου IV ήταν πλήρης και συνεχής γύρω από τους όγκους των κυττάρων SW1990 STAT3-σιγήσει, ενώ η έκφραση του κολλαγόνου IV ήταν ελλιπή και ασυνεχή γύρω από τους όγκους ελέγχου. Επιπλέον, μικροαγγειακή πυκνότητα ήταν σημαντικά χαμηλότερη σε όγκους STAT3-σιγήσει από το γονέα ή τον έλεγχο των όγκων των κυττάρων SW1990. Επιπλέον, η ΜΜΡ-7 έκφραση ήταν μειωμένη σε όγκους STAT3-σιγήσει σύγκριση με τη μητρική ξενομοσχεύματα SW1990 και τους ελέγχους. Αντίθετα, η έκφραση της IL-1β και IgT7α δεν μεταβλήθηκε.

Συμπέρασμα

Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν σαφώς ότι STAT3 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης του όγκου, εισβολή, και η αγγειογένεση, που θα μπορούσε είναι πράξη με τη μείωση των MMP-7 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος

Παράθεση:. Li Hd, Huang C, Huang Kj, Wu Wd, Jiang Τ, Cao J, et al. (2011) STAT3 Knockdown μειώνει τον καρκίνο του παγκρέατος ικανότητα εισβολής των κυττάρων και μεταλλοπρωτεϊνάσης-7 Έκφραση σε γυμνά ποντίκια. PLoS ONE 6 (10): e25941. doi: 10.1371 /journal.pone.0025941

Επιμέλεια: Marcelo Γ Bonini, Πανεπιστήμιο του Ιλινόις στο Σικάγο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 20, 2011? Αποδεκτές: 13 Σεπτέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 3η Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση (Αρ 09QA1404600) που χορηγείται από το ταμείο για την επιστημονική έρευνα της Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του παγκρέατος είναι μια θανατηφόρα ασθένεια και είναι η τέταρτη πιο κοινή αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις δυτικές χώρες [1]. Πιο πρόσφατα στοιχεία υπολογίζεται ότι 43.140 νέα κρούσματα διαγνώστηκαν το 2010, με περίπου 36.800 θανάτους που σχετίζονται με τις Ηνωμένες Πολιτείες [2]. Αν και η χειρουργική εκτομή παρέχει μια πιθανή θεραπεία, ο καρκίνος του παγκρέατος συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένα στάδια, λόγω της έλλειψης συμπτωμάτων ή μη ειδικά συμπτώματα, καθιστώντας τη χειρουργική επέμβαση αδύνατη. Παρηγορητική χημειοθεραπεία θα μπορούσε να βελτιώσει την ποιότητα της ζωής και να επηρεάσουν την επιβίωση. Αυτές έχουν οδηγήσει σε μια πολύ μελαγχολική πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος, δηλαδή, η διάμεση επιβίωση είναι περίπου 3 έως 6 μήνες και 5-ετή επιβίωση είναι & lt? 5%. Οι παράγοντες κινδύνου για καρκίνο του παγκρέατος περιλαμβάνουν το κάπνισμα, η κατανάλωση αλκοόλ, δίαιτες υψηλές σε κόκκινο κρέας, αλλά χαμηλή σε λαχανικά και φρούτα, χρόνια παγκρεατίτιδα, και το οικογενειακό ιστορικό. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί που ευθύνονται για την ανάπτυξη καρκίνου του παγκρέατος δεν έχουν διευκρινιστεί και δεν υπάρχουν καθιερωμένες κατευθυντήριες γραμμές για παγκρεατικό πρόληψη του καρκίνου. Ως εκ τούτου, καινοτόμες προσεγγίσεις για τη διάγνωση του καρκίνου του παγκρέατος νωρίς για να εξασφαλιστεί η αποτελεσματική θεραπεία είναι δραστικά χρειάζονται.

Ο μετατροπέας σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής του γονιδίου (STAT3) είναι μέλος της πρωτεΐνης STAT οικογένεια παραγόντων μεταγραφής. Σε απάντηση σε κυτοκίνες και παράγοντες ανάπτυξης, τα μέλη της οικογένειας STAT φωσφορυλιώνεται από κινάσες υποδοχέα που συνδέονται, σχηματίζουν ομο- ή ετεροδιμερή και μετατόπισης στον πυρήνα των κυττάρων να συνδέονται με το DNA και ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων-στόχων. STAT3 ενεργοποιείται μέσω φωσφορυλίωσης τυροσίνης 705 και σερίνη 727 σε απόκριση σε διάφορες κυτταροκίνες και αυξητικοί παράγοντες (όπως η ιντερφερόνη, EGF, και ιντερλευκίνες). STAT3 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση διάφορες κυτταρικές διεργασίες (π.χ., ανάπτυξη των κυττάρων, την απόπτωση, και διαφοροποίηση) [3]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ογκογόνο πρωτεΐνη STAT-3 ιδιοσυστατικά ενεργοποιημένα σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [4] – [6]. Σε αντίθεση, η αναστολή της οδού σηματοδότησης STAT-3 καρκινικών κυττάρων κατέστειλε εισβολή σε διάφορους καρκίνους [7] – [9]. Στον καρκίνο του παγκρέατος, η ενεργοποίηση του STAT-3 προωθείται η ανάπτυξη του όγκου των κυττάρων, εισβολή, και μετάσταση, που οδηγεί σε κακή επιβίωση του ασθενούς. Μοριακά, STAT3 μπορεί να ρυθμίζει την έκφραση του VEGF και ΜΜΡ-2 γονίδια [10] – [11]. Αυτά τα δύο γονίδια, μαζί με ΜΜΡ-7, ΜΜΡ-9, bFGF, IL-1β και IgT7αα συνδέονται στενά με την εξέλιξη του όγκου (αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση) [12] – [14]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε την λεντοϊού STAT3 shRNA να φιμώσουν την έκφραση STAT3. Προηγούμενη δεδομένα από την ομάδα μας δείχνει ότι knockdown του STAT3 ανέστειλε την εισβολή των παγκρεατικών κυττάρων καρκίνου του SW1990

in vitro

και αισθητά μειωμένη VEGF και της έκφρασης της ΜΜΡ-2 [7]. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε αν φίμωση της STAT3 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα ρυθμίζει την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου και εισβολής σε ξενομοσχεύματα γυμνού ποντικιού και προσδιορίζονται οι μηχανισμοί που διέπουν σηματοδότησης που εμπλέκονται με τη χρήση ενός μικροσυστοιχιών cDNA.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και λοίμωξη οφειλόμενη σε φακοϊό

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου του παγκρέατος SW1990 ελήφθη από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) και καλλιεργήθηκαν με τροποποιημένο μέσο Dulbecco Eagle (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 και 95% επωαστή αέρα. Να φιμώσουν την έκφραση STAT3, κατασκευάσαμε ένα φορέα λεντοϊού που μεταφέρουν STAT3 shRNA όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7]. κύτταρα SW1990 (1 × 10

5) σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο και αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και στη συνέχεια μολύνονται με αρνητικό φορέα βραδέος ιού ελέγχου (Genechem, Σαγκάη, Κίνα) ή του φορέα βραδέος ιού που φέρει STAT3 shRNA σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) του 40. Μετά από τρεις ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε

vivo

δοκιμασία εισβολής.

ποσοτική πραγματικού χρόνου αντίστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR qRT-)

Ολικό RNA απομονώθηκε από τη γονική SW1990 και αρνητικού φορέα ελέγχου ή STAT3 κύτταρα SW1990 φορέα μολυσμένα χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ από την Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Το RNA στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ RNeasy μίνι σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Qiagen, Valencia, CA, USA). Μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό, 1 μα συνολικού RNA από κάθε δείγμα υποβλήθηκε σε σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου RT PrimeScript (Takara Bio Inc, Shiga, Japan) στους 37 ° C για 15 λεπτά και 85 ° C για 5 s.

qPCR στη συνέχεια διεξήχθη για την ανίχνευση του γονιδίου εκφράσεις με αυτά νεοσυντιθέμενες cDNA. Οι ειδικοί εκκινητές για την αντίδραση PCR ήταν ως ακολούθως: η ΜΜΡ-9, 5′-CGGAGTGAGTTGAACCAG-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-GTCCCAGTGGGGATTTAC-3′ (αντίστροφο) με μέγεθος προϊόν από 118 bp? ΜΜΡ-7, 5’-GAGTGCCAGATGTTGCAGAA-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-AAATGCAGGGGGATCTCTTT-3’ (αντίστροφο) με μέγεθος προϊόν από 1