Αφηρημένο

Παρά την αξιοσημείωτη πρόοδος στη θεραπεία και την πρόληψη του καρκίνου του προστάτη εξακολουθεί να είναι η δεύτερη αιτία θανάτου από καρκίνο στις βιομηχανικές χώρες. Πολλές θεραπείες αρχικά φαίνεται να είναι επωφελής για τους ασθενείς εγκαταλείφθηκαν λόγω της υψηλής ανθεκτικότητας στα φάρμακα και το ποσοστό εξέλιξης των όγκων. Ένας από τους υποψήφιους θεραπευτικοί παράγοντες που χρησιμοποιούνται ακόμη και στις κλινικές δοκιμές πρώτο στάδιο, 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3, δείχθηκε να είναι είτε απρόβλεπτες ή αναποτελεσματική σε πολλές περιπτώσεις. Έχουμε ήδη δείξει ότι το κανάλι TRPV6 ασβέστιο, το οποίο είναι ο άμεσος στόχος του 1,25- υποδοχέων D3, θετικά ελέγχει τον πολλαπλασιασμό του καρκίνου του προστάτη και της αντίστασης απόπτωση (

Lehen’kyi et al.

, Oncogene, 2007). Ωστόσο, το πώς τα γνωστά 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις μπορεί να είναι συμβατή με την αυξητική ρύθμιση των προ-ογκογόνο κανάλι TRPV6 παραμένει ένα μυστήριο. Εδώ δείχνουμε ότι σε χαμηλές συνθήκες στεροειδών 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση του TRPV6, enchances τον πολλαπλασιασμό με την αύξηση του αριθμού των κυττάρων που εισέρχονται σε S-φάση. Δείχνουμε ότι αυτές οι προ-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 συνδέονται άμεσα με τη μεσολάβηση μέσω του υπερέκφραση του καναλιού TRPV6 η οποία αυξάνει την πρόσληψη ασβεστίου στα κύτταρα LNCaP. Η αντίσταση απόπτωση κυττάρων LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα που παρέχει το κανάλι TRPV6 δραστικά αντιστρέφεται όταν 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αποτελέσματα συνδυάστηκαν με την επιτυχημένη knockdown TRPV6. Επιπλέον, η χρήση των ανδρογόνων ανεπάρκεια DU-145 και ανδρογόνο-αναίσθητη κυτταρικές σειρές LNCaP C4-2 αφέθηκε να υποδεικνύουν ότι η ικανότητα του 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 για να επάγει την έκφραση του καναλιού TRPV6 είναι ένας κρίσιμος καθοριστικός παράγοντας για την επιτυχία ή αποτυχία του 1,25- θεραπείες D3-based

Παράθεση:. Lehen’kyi V, Raphaël Μ, Oulidi Α, Flourakis M, Khalimonchyk S, Kondratskyi A, et al. (2011) TRPV6 προσδιορίζει την επίδραση της βιταμίνης D3 για τον Καρκίνο του Προστάτη ανάπτυξη των κυττάρων. PLoS ONE 6 (2): e16856. doi: 10.1371 /journal.pone.0016856

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Σεπτεμβρίου, 2010? Αποδεκτές: 16 Ιανουαρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Φεβρουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Lehen’kyi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Ministère de l’Παιδείας Nationale et Ligue Nationale Contre le Cancer. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη παραμένει η πιο κοινή noncutaneous ανθρώπινη κακοήθεια και η δεύτερη πιο θανατηφόρα όγκου μεταξύ των ανδρών με την υψηλότερη συχνότητα στις βιομηχανικές [1] χώρες. Ο υποδοχέας ανδρογόνων και άλλων στεροειδών ρυθμίζουν ζωτικές πτυχές του προστάτη κυτταρικής ανάπτυξης και λειτουργίας συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης, της απόπτωσης, του μεταβολισμού των λιπιδίων, και εκκριτική δράση [2]. Ανδρογόνων καταστολή ήταν η κορυφαία θεραπεία και σήμερα η πιο επιτυχημένη [3]. Ωστόσο, καρκινώματα του προστάτη τελικά να γίνει ανδρογόνων-irresponsive, και ο καρκίνος είναι ανθεκτική στην ορμονική θεραπεία. – Ο πιο σημαντικός λόγος για θνησιμότητα από καρκίνο του προστάτη [4]

Διαφορετικές πυρηνικών υποδοχέων έχουν μπει στο στόχαστρο για θεραπεία και ανάμεσά τους 1, 25-διυδροξυβιταμίνης D3 η οποία ασκεί μια πληθώρα δραστηριοτήτων κατά του όγκου έναντι καλλιεργημένων κυττάρων καρκίνου του προστάτη και ξενομοσχεύματα [5]. Κανονική και κακοήθη επιθηλιακά κύτταρα του προστάτη εκφράζουν υποδοχέα της βιταμίνης D3 (VDR), και την ενεργοποίηση των VDR με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 γενικά οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού και του κυτταρικού κύκλου σύλληψης [6]. Ωστόσο, για την πρόληψη ή τη θεραπεία του καρκίνου του προστάτη, πρέπει να ληφθούν υπόψη οι αλληλεπιδράσεις των άλλων πυρηνικών υποδοχέων και οδού σηματοδότησης [7].

Η λειτουργία των διαύλων ιόντων έχει συζητηθεί σε σχέση με τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Πιο πρόσφατα, κατάστημα που λειτουργεί Ca

2 + κανάλια και το Ca

2+ πισίνα στο ενδοπλασματικό δίκτυο έχουν επίσης σχετίζονται με την ανάπτυξη καρκίνου του προστάτη [8]. Πολλαπλασιασμό των κυτταρικών σειρών καρκίνου του προστάτη LNCaP και PC3 ανεστάλη από TH-1177, μια ουσία η οποία εμποδίζει Ca

2 + εισόδου [9]. Μεταβολές στο Ca

2+ πισίνα και κυτοσολίων Ca

2 + όχι μόνο έχουν περιγραφεί για την αύξηση της διάδοσης και sarcoendoplasmatic Ca

2 + -ΑΤΡάση (SERCA) έκφραση στα κύτταρα LNCaP [10], αλλά και να προκαλέσει απόπτωση [11]. Έτσι, Ca

2 + ομοιόσταση είναι κριτικά που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου.

Η προσοχή μας έχει συνταχθεί από την παρατήρηση ότι μια παροδική δυναμικό υποδοχέα υψηλής Ca μέλος

2 + εκλεκτικό υποοικογένεια κανάλι V 6, TRPV6 εκφράζεται ισχυρά σε προχωρημένο καρκίνο του προστάτη και συσχετίζεται σημαντικά με την Gleason & gt? 7 ταξινόμησης που αντιπροσωπεύει ένα ισχυρό δείκτη της εξέλιξης του όγκου και την επακόλουθη εισβολή σε υγιείς ιστούς [12], [13]. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι μορφές TRPV6 ιδιαίτερα ασβέστιο επιλεκτική κανάλια στα κύτταρα του προστάτη, του οποίου η ένταση ρεύματος και η συμπεριφορά αδρανοποίηση ρυθμίζονται αυστηρά από την ενδοκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου [10], [14]. Εκτός έχουμε ήδη δείξει ότι το κανάλι TRPV6 εμπλέκεται στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού του καρκίνου του προστάτη και την αντίσταση απόπτωση [15]. Ωστόσο, ο ακριβής ρόλος της TRPV6 στην παθοφυσιολογία του προστάτη παραμένει απατηλή, και η ρύθμισή της από ανδρογόνων – αντιφατικά [16]. Επιπλέον, VDR είναι μια άμεση ενεργοποιητή του

trpv6

υποκινητή [17], και 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 μια ευρέως χρησιμοποιούμενη αντικαρκινική θεραπεία έχουν ολοκληρώσει μια ενδιαφέρουσα υπόθεση για τη ρύθμιση TRPV6 και σημασία στον καρκίνο του προστάτη. Οι μελέτες μας βασίστηκαν στο γεγονός ότι 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3, που έχει ήδη χρησιμοποιηθεί κατά το πρώτο στάδιο των κλινικών δοκιμών έδειξε να είναι είτε απρόβλεπτες ή αναποτελεσματική, σε πολλές περιπτώσεις, και το γεγονός ότι TRPV6 οποίων ελέγχει θετικά πολλαπλασιασμός του καρκίνου του προστάτη και την απόπτωση αντίσταση [15] είναι ένας άμεσος στόχος του 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 [17]. Το ερώτημα πώς οι γνωστές 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αντιπολλαπλασιαστικές επιδράσεις μπορεί να είναι συμβατή με την αυξητική ρύθμιση των προ-ογκογόνο κανάλι TRPV6 ήταν ο στόχος της μελέτης μας.

Υλικά και Μέθοδοι

κυττάρων πολιτισμού

Ανθρώπινα LNCaP (λεμφαδένες καρκίνο κόμβο του προστάτη), LNCaP C4-2, και DU-145 κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI (Gibco-BRL, CergyPontoise, Γαλλία ) συμπληρωμένο με 10 ή 2% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και περιείχε καναμυκίνη (100 μg /ml) και L-γλουταμίνη (2 mM). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στον αέρα. Το μέσο αλλάχθηκε τρεις φορές την εβδομάδα και οι καλλιέργειες χωρίστηκαν με κατεργασία των κυττάρων με 0,25% θρυψίνη (σε PBS) για 5 λεπτά στους 37 ° C πριν από τη συμπλήρωση συρροή. Για τα πειράματα, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων για PCR και κηλίδωση Western και σε γυάλινες καλυπτρίδες για ανοσοκυτταροχημεία και απεικόνιση ασβεστίου. Για την 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 κύτταρα μελέτες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EtOH ως έλεγχος για 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3. Charcoal-ριγέ εμβρυϊκό ορό μοσχαριού (2%) προστέθηκε σε άνευ ερυθρού φαινόλης RPMI μέσο μαζί με καναμυκίνη και L-γλουταμίνη ως ανωτέρω να επωάζονται τα κύτταρα για να δημιουργήσουν συνθήκες στεροειδή στερούνται

.

ΚΤ- PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας την διαδικασία εκχύλισης θειοκυανικού-φαινόλης-χλωροφορμίου γουανιδίου. Μετά DNase Ι (Life Technologies) αγωγή για την εξάλειψη γενωμικό DNA, 2 μg ολικού RNA μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA στους 42 ° C χρησιμοποιώντας τυχαίων εξαμερών εκκινητών (Perkin Elmer) και MuLV αντίστροφη μεταγραφάση (Perkin Elmer) σε μια 40 μΙ τελικό όγκο, που ακολουθείται από ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου.

ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου της TRPV6 και μεταγραφές HPRT mRNA έγινε με τη χρήση MESA GREEN qPCR βασικού μείγματος Plus για Δοκιμασία SYBR (Eurogentec, Γαλλία ) σχετικά με την Biorad CFX96 Real-Time Σύστημα ανίχνευσης PCR. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που υποδεικνύονται στον Πίνακα 1. Το γονίδιο HPRT χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος για την κανονικοποίηση διακυμάνσεις RNA εκχυλίσεις, ο βαθμός αποικοδόμησης RNA, και μεταβλητότητα στην αποτελεσματικότητα RT. Για την ποσοτικοποίηση των αποτελεσμάτων χρησιμοποιήθηκε η συγκριτική μέθοδος κύκλος όριο ΔΔC (t)

Η

Δυτική ειδικής διαγνωστικής ικανότητας

κύτταρα ημισυρρεόντων LNCaP υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ένα παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει:. 10 mM Tris-HCI, ρΗ 7,4, 150 mM NaCl, 10 mM MgCI, 1 mM PMSF, 1% Nonidet Ρ-40, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης από τη Sigma. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν 15,000 χ g στους 4 ° C για 20 λεπτά, αναμιγνύεται με ένα ρυθμιστικό δείγματος που περιέχει: 125 mM Tris-HCl ρΗ 6,8, 4% SDS, 5% β-μερκαπτοαιθανόλη, 20% γλυκερόλη, 0,01% κυανό βρωμοφαινόλης, και έβρασαν για 5 λεπτά στους 95 ° C. Σύνολο δείγματα πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε 8, 10, και 15% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με ημίξηρη στύπωση Western (Bio-Rad Laboratories). Η μεμβράνη μπλοκαρίστηκε σε ένα 5% γάλακτος που περιέχει ρυθμιστικό ΤΝΤ (Tris-HCl, ρΗ 7.5, 140 mM NaCl, και 0,05% Tween 20) επί μία νύκτα, στη συνέχεια ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντίσωμα αντι TRPV6 ειδικό rabit πολύκλωνα (Alomone Labs Ltd., 1/200) , αντι-ΡΟΝΑ (Santa Cruz-, 1/1000), αντι-β-ακτίνης (Lab Vision Co., 1/1000) αντισώματα. Οι ζώνες επί της μεμβράνης οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια μέθοδο (Pierce Biotechnologies Inc.). Η πυκνομετρική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα λήψης εικόνας Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories).

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες τις πλύθηκαν μία φορά με PBS και, ενδεχομένως, επωάστηκαν με χολέρας υπομονάδα Β τοξίνης Alexa Fluor® 488 συζυγούς (Molecular Probes, 1/2000) για 15 λεπτά, στη συνέχεια πλένονται μία φορά με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 3.5% παραφορμαλδεΰδη σε PBS. PBS-γλυκίνης (30 mM) χρησιμοποιήθηκε για τη σβέση της αντίδρασης με την επακόλουθη διαπερατότητας με 0.1% Triton Χ-100. Τα κύτταρα πλύθηκαν πάλι σε PBS και υποβλήθηκαν σε συμβατική διαδικασία ανοσοκηλιδώσεως. Alexa Fluor® 546 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (Molecular Probes, 1/4000) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύον αντίσωμα για χρώση TRPV6. ανάλυση φθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας Carl Zeiss Laser Scanning Συστήματα LSM 510 συνδέεται σε ένα Zeiss Axiovert 200 Μ με 63 × 1,4 αριθμητική φακό ελαιοκαταδυτικό άνοιγμα σε θερμοκρασία δωματίου. Και τα δύο κανάλια ήταν ενθουσιασμένος, συλλέγονται χωριστά και στη συνέχεια συγχωνεύθηκε με τη χρήση του λογισμικού Carl Zeiss LSM εξεταστή εικόνας.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του CellTiter 96 Υδατικό One Λύση δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Promega, Madison , WI), επί τη βάσει της κυτταρικής μετατροπής του χρωματομετρικού αντιδραστηρίου MTS [3,4- (5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλ) -2Η-τετραζόλιο άλας] σε διαλυτές φορμαζάνη με ένζυμα αφυδρογονάσης που βρίσκονται μόνο σε μεταβολικά ενεργές, πολλαπλασιαστικά κύτταρα. Μετά από κάθε θεραπεία, 20 μΙ διαλύματος βαφής προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων και επωάστηκαν για 2 ώρες. Στη συνέχεια, η απορρόφηση καταγράφηκε στα 490 nm μήκος κύματος χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη πλάκας ELISA (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Cellular ρυθμός αναστολής πολλαπλασιασμού υπολογίζεται ως εξής: (

A

control-

A

sample)/(

A

control-

A

blank)×100%.

Cell κύκλου και απόπτωση δοκιμασίες

Η κυτταρομετρία ροής δοκιμασίες διεξήχθησαν επί κυτταρικών πληθυσμών καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν 25-cm

2 φιάλες όπως περιγράφηκε αρχικά [18]. Περίπου 10

6 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 1 ml παγωμένου 70% μεθανόλη για 30 λεπτά. Μετά τον καθορισμό, τα κύτταρα σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση για να απομακρυνθούν τα στερεωτικά, πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) στους 4 ° C, επαναιωρήθηκαν σε 100 μΙ PBS, υπέστη επεξεργασία με 100 μΙ RNAse Α (1 mg /ml, Sigma), και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, Sigma) σε τελική συγκέντρωση 50 μg /ml. Τα βαμμένα κύτταρα αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C στο σκοτάδι και αναλύθηκαν εντός 2 ωρών. Τα βαμμένα δείγματα μετρήθηκαν σε ένα FACScan κυτταρόμετρο ροής (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Τα δεδομένα αποκτήθηκαν για 7000 γεγονότα με συντελεστή διακύμανσης μικρότερη από 5%, και το κόκκινο φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή φθορισμού 3 (FL3) σχετικά με την

X

-άξονα. Τα δεδομένα φυλάχθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό CellQuest να αξιολογήσει πρότυπα κατανομής του κυτταρικού κύκλου (subG1 (αποπτωτικών), G0 /G1, S και G2 /M φάσεις).

Imaging Ασβέστιο

Cells απλώθηκαν πάνω σε γυάλινες καλυπτρίδες και φορτώθηκαν με 4 μΜ Fura-2 π.μ. στα θερμοκρασία δωματίου για 45 λεπτά στο μέσο ανάπτυξης. Καταγραφές διεξήχθησαν σε HBSS που περιέχει (σε ​​mM): 140 NaCl, 5 KCI, 2 MgCl

2, 0.3 Na

2HPO

3, 0,4 ΚΗ

2 ΡΟ

4, 4 NaHCO

3, 5 γλυκόζη και 10 HEPES ρυθμίστηκε σε ρΗ 7.4 με ΝαΟΗ. CaCl

2 ρυθμίστηκε σε 0,07 mM ή 1,8 mM, ανάλογα με το πείραμα. Οι καλυπτρίδες στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε θάλαμο διαπότισης με το στάδιο του μικροσκοπίου. εικόνες φθορισμού των κυττάρων καταγράφηκαν με ένα σύστημα ανάλυσης εικόνας βίντεο (Quanticell). Ο φθορισμός Fura-2, στο μήκος κύματος εκπομπής 510 nm, καταγράφηκε με τη διέγερση ο ανιχνευτής εναλλακτικά στα 340 και 380 nm. Ο λόγος σήματος στα 340/380 nm μετετράπη σε [Ca

2 +]

i επίπεδο, χρησιμοποιώντας ένα

in vitro

βαθμονόμησης.

επιμόλυνση κυττάρων siRNA

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν όλη την νύκτα με 200 ηΜ siRNA-TRPV6 1 και 2 ανά φρέαρ ενός έξι φρεατίων χρησιμοποιώντας το «Gene porter 2» (Gene Therapy Systems, Inc.) σε έναν τελικό όγκο 1 ml. Έτοιμο προς χρήση siRNA-TRPV6s (επιλογή επεξεργασία: A4) συντέθηκαν από Dharmacon Research Inc (Lafayette, USA) (βλέπε Πίνακα 1)

Αντιδραστήρια

Όλα τα αντιδραστήρια αγοράστηκαν από την Sigma. (Sigma, L’Isle d’Abeau Chesnes, Γαλλία), εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Στατιστικά

τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Στατιστική ανάλυση διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αταίριαστο

του Student t

-ΜΕΛΕΤΕΣ. * – P & lt? 0,05 ή ** – P & lt? 0.01 υποδεικνύουν στατιστική σημαντικότητα

Αποτελέσματα

Η επίδραση της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 στον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του προστάτη έχει μελετηθεί σε δύο πειραματικές συνθήκες. : 2% και 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) με συμπλήρωμα μέσου RPMI. Η ανάπτυξη των εξαρτώμενων από ανδρογόνα LNCaP κυτταρική σειρά απροσδόκητα αυξήθηκε κατά 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε 2% FCS συμπληρωμένου μέσου και καταστέλλεται σε 10% FCS (Εικ. 1Α). Έχουμε ήδη καταδείξει το ρόλο του καναλιού TRPV6 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [15], και ως εκ τούτου επιδιώξαμε να διερευνηθεί η ρύθμιση της έκφρασης του καναλιού TRPV6 κατά 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3. Δεδομένου ότι έχει αποδειχθεί ότι

trpv6

είναι ένα VDR-ρυθμιζόμενο γονίδιο [17], έχουμε μελετήσει την ρύθμιση της έκφρασης TRPV6 με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε κύτταρα LNCaP σε διαφορετικές στεροειδούς περιεχόμενο των μέσων ενημέρωσης (Εικ . 1Β, C). 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 φαίνεται να ενεργοποιούν άμεσα το

trpv6

γονιδίου σε κύτταρα LNCaP, αν και σε 10% μέσο FCS αποτελέσματά της δεν ήταν τόσο σημαντική (Σχ. 1 Β) σε σχέση με το 2% FCS (Σχ. 1C) . 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 δοσοεξαρτώμενο σημαντικά αυξημένη έκφραση TRPV6 mRNA σε 2% FCS-περιέχον RPMI μέσο (Εικ. 1 C). Για να ελέγξει αν οι μειωμένη επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 οφείλονταν σε περιεχόμενο FCS και όχι στο βέλτιστο χρόνο επίδραση πραγματοποιήσαμε την καμπύλη χρόνου χρησιμοποιώντας τη μέγιστη συγκέντρωση 100 ηΜ πάνω από τρεις ημέρες σε διάφορα χρονικά διαστήματα (Εικ. 1ϋ). Για να επιβεβαιωθεί η σημαντική επαγωγή του TRPV6 πρωτεΐνης με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε 2% FCS που περιέχει μέσο RPMI που λαμβάνονται με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR μία κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε. Έδειξε μια σημαντική αύξηση σε επίπεδο πρωτεΐνης TRPV6 κατά την ενεργοποίηση με 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 (Σχ. 1Ε). Ανοσοκυτταροχημεία χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα TRPV6 έδειξαν την έκφραση των καναλιών TRPV6 σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 1 F), καθώς και τον εντοπισμό του στην μεμβράνη πλάσματος χρησιμοποιώντας τοξίνη χολέρας (CTX) συζευγμένο με σήμανση FITC ειδικώς G2M λιπίδια στην μεμβράνη. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 για την ανάπτυξη των κυττάρων LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα εξαρτάται από τη σχετική περιεκτικότητα στεροειδούς. Εκτός αυτού, 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αυξάνει σημαντικά την έκφραση του καναλιού TRPV6 σε συνθήκες χαμηλού στεροειδές.

Α, 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 επιδράσεις στο ρυθμό πολλαπλασιασμού μετράται με MTS δοκιμασία των κυττάρων LNCaP επωάζονται είτε με 2 % ή 10% FCS-περιέχον μέσον RPMI, * – Ρ & lt? 0,05, ** – P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τις αντίστοιχες τους ελέγχους τους (DMSO), η = 3. Β, Η προς τα άνω ρύθμιση της έκφρασης TRPV6 mRNA με 1,25- διυδροξυβιταμίνης D3 σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 10% FCS-περιέχον μέσο RPMI? * – Ρ & lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO), η = 3. C, Η προς τα άνω ρύθμιση της έκφρασης TRPV6 mRNA με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS-περιέχον μέσο RPMI? * – Ρ & lt? 0,05, ** – P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO), η = 3. Α, τη χρονική εξάρτηση της έκφρασης TRPV6 κάτω από 100 μΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη θεραπεία D3 σε κύτταρα LNCaP επωάζονται σε 10 % FCS-περιέχον μέσο RPMI. * – Ρ & lt? 0,05, ** – P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο (DMSO), η = 3. Ε, μία κηλίδωση Western των επιπέδων πρωτεΐνης TRPV6 που επάγεται από 1,25-διυδροξυβιταμίνη θεραπεία D3 για 3 ημέρες σε κύτταρα LNCaP επωάζονται σε 2% μέσου FCS-περιέχον RPMI. F, A συνεστιακή μικροσκοπία δείχνει το μοτίβο της έκφρασης πρωτεΐνης TRPV6 και εντοπισμού επί της μεμβράνης των κυττάρων LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS-περιέχον μέσο RPMI πλάσματος. Η τοξίνη της χολέρας συζευγμένο με FITC (CTX, πράσινο) που χρησιμοποιείται για τη χρώση της μεμβράνης του πλάσματος, καθώς και το κανάλι TRPV6 (TRPV6, κόκκινο), και των αντίστοιχων συγχώνευση τους (CTX + TRPV6) δείχνονται.

Η

TRPV6 εμπλέκεται in1,25-διυδροξυβιταμίνη D3-επαγόμενο πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP

Σύμφωνα με τα δεδομένα που λαμβάνονται πάνω από τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε 2% FCS μελετήθηκαν περαιτέρω. Δεδομένου ότι έχουμε ήδη αποδείξει το ρόλο του καναλιού TRPV6 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του προστάτη [15], και γνωρίζοντας ότι δεν υπάρχει καμία χημική ένωση διαθέσιμες μέχρι σήμερα να μπλοκάρει επιλεκτικά TRPV6, χρησιμοποιήσαμε την προσέγγιση siRNA για την νοκ ντάουν επιλεκτικά TRPV6. Τρεις διαφορετικές μεθοδολογικές προσεγγίσεις χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογήσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP σε 2% FCS-περιέχον μέσο (Σχ. 2Α-C). Ο αριθμός των βιώσιμων πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία MTS. siRNA-TRPV6 μείωσε σημαντικά τον αριθμό των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων από την ημέρα 2 έως 4 μετά την επιμόλυνση (D0) (Σχ. 2Α). 100 nM 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 ήταν σε θέση να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP, ενώ TRPV6 νοκ ντάουν αντιστρέφεται αυτή η διέγερση με το επίπεδο ακόμη χαμηλότερο από ό, τι στον έλεγχο. siRNA έναντι υποδοχέα ανδρογόνων (AR), είναι γνωστό ότι είναι κρίσιμης σημασίας για την ανάπτυξη και την ανάπτυξη του προστάτη, χρησιμοποιήθηκε ως ένας θετικός έλεγχος για να επιτευχθεί ισχυρή και αξιόπιστη επιδράσεις στη βιωσιμότητα των κυττάρων του προστάτη.

Α, LNCaP κύτταρα πολλαπλασιασμού σε 2% FCS που περιέχει μέσον RPMI θεραπεία με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 (100 ηΜ, εφαρμόζονται σε D1), siRNA-TRPV6 (siTRPV6, 80 ηΜ, επιμολύνθηκαν σε D0), η συνδυασμένη θεραπεία της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 και siTRPV6 καθορίζεται παραπάνω, και siRNA-AR (Siar, 80 ηΜ, επιμολύνθηκαν σε D0) ως θετικός έλεγχος. * – Ρ & lt? 0,05, ** – P & lt? 0,01, σε σύγκριση με τον έλεγχο, η = 4? Β, μία δοκιμασία κυτταρικού κύκλου των κυττάρων LNCaP (επωάστηκαν με 2% FCS-περιέχον ΚΡΜΙ μέσου) για τις ίδιες συνθήκες όπως στο δοκιμασία MTS (Α) (D3 ισούται με 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3), διεξάγεται με κυτταρομετρία ροής του τα κύτταρα βάφτηκαν με ιωδιούχο προπίδιο. * – P & lt? 0,05, ** – P & lt? 0,01, § – P & lt? 0,05 έναντι βιταμίνη D3? n = 3. C, ένα κηλίδωση Western των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων πυρηνικό αντιγόνο (PCNA) στις συνθήκες που αναφέρονται ανωτέρω, σε σύγκριση με β-ακτίνης. D, μια δοκιμασία απόπτωσης διεξάγεται με κυτταρομετρία ροής ως πληθυσμός subG1 κυττάρων LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS-περιέχον μέσο RPMI βάφονται με ιωδιούχο προπίδιο. * – P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου? n = 3.

Η

Μία δοκιμασία κυτταρικού κύκλου χρησιμοποιώντας χρώση ιωδιούχου προπιδίου διεξήχθη σε ακριβή τα αποτελέσματα της knockdown TRPV6 καθώς και 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αποτελέσματα και ο ρόλος του TRPV6 εντός αυτού, επί του κυτταρικού κύκλου διανομή φάση των κυττάρων LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS που περιέχει μέσο RPMI (Σχ. 2Β). Πράγματι, επιβεβαιώσαμε ότι siRNA-TRPV6 μείωσε τον αριθμό των κυττάρων που έχουν εισαχθεί στο S-φάσης. Το ποσοστό των κυττάρων που έχουν εισαχθεί στο S-φάση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε 100 κύτταρα επεξεργασμένα ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε σχέση με το μάρτυρα. Pretransfection των κυττάρων LNCaP με siRNA-TRPV6 εξασθενημένος 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αυξημένο πολλαπλασιασμό, αν και όχι στην πλήρη έκταση. siRNA-AR όπως παραπάνω χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος και έδειξε σημαντική μείωση στην% των κυττάρων που έχουν εισαχθεί στο S-φάσης.

παρακολουθείται επίσης ένα επίπεδο πρωτεΐνης πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) με τη χρήση του ίδιους όρους. PCNA φάνηκε να είναι σημαντικά μειωμένα κατά siRNA-TRPV6 νοκ ντάουν. 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 κύτταρα επεξεργασμένα εκφράζονται 2-φορές λιγότερο PCNA όπως παρατηρήθηκε επίσης από τη συνδυασμένη θεραπεία του siRNA-TRPV6 και 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3. Το επίπεδο του PCNA σε siRNA-AR-κατεργασμένων κυττάρων ήταν ανιχνεύσιμη (Εικ. 2C).

Μια δοκιμασία κυτταρικού κύκλου επίσης επιτρέπει τη μέτρηση ενός αριθμού αποπτωτικών κυττάρων όπως χρησιμοποιείται ένας πληθυσμός subG1. 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 δεν είχε καμία επίδραση στην ίδια την απόπτωση, ενώ siRNA-TRPV6 είχε σημαντική επίδραση στο ρυθμό απόπτωσης (Σχ. 2D). Ωστόσο, συνδυάζοντας την επεξεργασία των 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 με την επιμόλυνση του siRNA-TRPV6 αύξησε σημαντικά τον αριθμό των αποπτωτικών κυττάρων πολύ περισσότερο από siRNA-TRPV6 προεπεξεργασία μόνο του (Σχ. 2D). Έτσι, TRPV6 εμπλέκεται τόσο πολλαπλασιασμό και την απόπτωση αντίσταση των κυττάρων LNCaP και οι επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 είναι ισχυρά εξαρτάται από την έκφραση TRPV6.

TRPV6 μεσολαβεί 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 επαγόμενη Ca

2 + -uptake σε LNCaP κύτταρα

για να μελετηθεί η συμβολή των TRPV6 ως μια εξαιρετικά Ca

2 + επιλεκτικό κανάλι στο Ca

2 + -uptake στα κύτταρα LNCaP, μετρήσαμε την ενδοκυτταρική επίπεδα του ασβεστίου ([Ca

2 +]

i) σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS που περιέχει μέσο RPMI αφού συνακόλουθες μεταβολές στα εξωκυτταρικά επίπεδα του ασβεστίου ([Ca

2 +]

o). Σε κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με EtOH (CTRL) τη διακύμανση [Ca

2 +]

o παράγονται σημαντικές αλλαγές σε [Ca

2 +]

i (Εικ. 3Α). siRNA-TRPV6 knockdown μείωσε το πλάτος του 2 mM [Ca

2 +]

o-προκλητά αύξηση της [Ca

2 +]

Ι (Σχ. 3Α και C). 100 nM 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αυξήθηκε κατά την ίδια βασική [Ca

2 +]

i σημαντικά καθώς αυξάνεται [Ca

2 +]

i απάντησης για την εφαρμογή των 2 mM [Ca

2 +]

o οποίος αντιστράφηκε πλήρως από την προκατεργασία με siRNA-TRPV6 (Σχ. 3C). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι TRPV6 μεσολαβεί συστατικά Ca

2 + -uptake στα κύτταρα LNCaP και TRPV6 αντιπροσωπεύει επίσης για 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 μεσολάβηση ενισχυμένη Ca

2 + -uptake.

Α, TRPV6 συμμετοχή σε Ca

2+ πρόσληψη σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS-περιέχον μέσο RPMI και αγωγή είτε με SICT (CTRL) ή siRNA-TRPV6 (αμφότερα 80 ηΜ, 24 ώρες). Β, Ca

2+ πρόσληψη σε κύτταρα LNCaP καλλιεργήθηκαν σε 2% FCS-περιέχον μέσο RPMI και κάτω από 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 (100 ηΜ, 3 ημέρες) αγωγή είτε με SICT (CTRL) ή siRNA-TRPV6 (και τα δύο 80 ηΜ, 24 ώρες). C, ένα αντίστοιχο ιστόγραμμα που δείχνει σχετική [Ca

2 +]

επιπέδων i μετά την επακόλουθη [Ca

2 +]

o διακόπτες υπό τις συνθήκες που αναφέρονται ανωτέρω. * – Ρ & lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο)? ** – P & lt? 0,01, η = 140.

Η

Τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές ανεξάρτητος από ανδρογόνο

Δύο διαφορετικές ανεξάρτητες από ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές ήταν χρησιμοποιήθηκαν: ένας υποδοχέας ανδρογόνου με ανεπάρκεια ανδρογόνων-αναίσθητη κυτταρικές σειρές LNCaP C4-2 DU-145 και. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό τις ίδιες συνθήκες με 2 ή 10% FCS συμπληρωμένο μέσο RPMI και τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 μελετήθηκαν (Εικ. 4). Οι επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε υποδοχέα ανδρογόνων με ανεπάρκεια κυτταρική γραμμή DU-145 ήταν πιθανό να είναι ορό εξαρτώμενη αφού σε 2% FCS οι proproliferative επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 συντηρήθηκαν (Σχήμα 4Α), ενώ σε 10 % FCS αποτελέσματα της καταργήθηκαν (Εικ. 4Β). Η άλλη κυτταρική σειρά μη ευαίσθητη σε στεροειδή, αλλά εξακολουθεί να εκφράζουν τον υποδοχέα ανδρογόνων, LNCaP C4-2 χρησιμοποιήθηκε, όπου αναγράφονται οι επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 να είναι FCS-ανεξάρτητη και 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 εξασκείται του ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστικά αποτελέσματα (Σχ. 4C-D). Μια ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε δείχνει την ρύθμιση της έκφρασης TRPV6 σε DU-145 κύτταρα με 100 μΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε αμφότερα FCS που περιέχει μέσο 2 και 10% (Σχ. 4Ε). Στεροειδών στερημένα συνθήκες στην περίπτωση των LNCaP κυττάρων (LNCaP-ST) χρησιμοποιήθηκαν επίσης για να επιβεβαιωθεί ότι η επαγωγή της έκφρασης TRPV6 εξαρτάται έντονα από το στεροειδές περιεχόμενο του μέσου καλλιέργειας (Εικ. 4στ). Έτσι, οι προ-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 στην ανάπτυξη των κυττάρων προστάτη προσδιορίζεται από την ικανότητά της να επάγει την έκφραση του καναλιού TRPV6 και επαγωγή του φαίνεται να είναι ισχυρά στεροειδή-εξαρτώμενη.

Α, Β, Τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 σε υποδοχέα ανδρογόνων με ανεπάρκεια κυτταρική γραμμή DU-145 σε αμφότερα 2 και 10% FCS-περιέχον μέσο RPMI (Α και Β, αντίστοιχα), * – Ρ & lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο ), η = 3. Γ, Δ, Τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε ανδρογόνο αναίσθητη κυτταρική γραμμή LNCaP C4-2 τόσο 2 και 10% FCS-περιέχον μέσο RPMI (C και D, αντίστοιχα), * – Ρ & lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο), η = 3. Ε, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του καναλιού TRPV6 σε DU-145 κύτταρα κατεργασμένα με 100 μΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 για 3 ημέρες σε 2 και 10% FCS που περιέχει RPMI μέσου, * – Ρ & lt? 0,05 (σε σύγκριση με τον έλεγχο), η = 3. F, η έκφραση του διαύλου TRPV6 επάγεται από 100 ηΜ 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 για 3 ημέρες σε κύτταρα LNCaP σε στεροειδή στερούνται μέσο RPMI (LNCaP- ST), n = 3.

η

Συζήτηση

Ένα από τα πιο σημαντικό εύρημα της παρούσας εργασίας είναι η 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 μπορεί να αυξήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων LNCaP. Έχουμε δείξει σαφώς ότι τόσο ρυθμό πολλαπλασιασμού και ο αριθμός των κυττάρων που εισέρχονται στην S-φάση αυξήθηκε κατά 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 θεραπεία. Αυτές οι επιδράσεις εξαρτώνται εξ ολοκλήρου από την έκφραση και τη λειτουργία του καναλιού TRPV6 το οποίο έχει προηγουμένως δειχθεί ότι εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου του προστάτη και την απόπτωση αντοχής [15]. Μια προηγουμένως αναφερθεί 1,25- D3 ανασταλτική δράση στον καρκίνο του προστάτη μπορεί να τεθεί σε κίνδυνο από TRPV6 ρύθμιση προς τα πάνω.

Ο αριθμός των έργων έχει ήδη δημοσιευθεί επαγωγή TRPV6 από 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 στο έντερο [19], των νεφρών [20], ημικυκλικό σωλήνα [21], και ακόμη και καρκινικά κύτταρα προστάτη [22]. Πέντε VDR στοιχεία απόκρισης βρέθηκαν στο ανθρώπινο γονίδιο που κωδικοποιεί την επιθηλιακή TRPV6 διαύλων ασβεστίου που υποδηλώνει άμεση ρύθμιση της από 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 μέσω υποθετικό υποδοχέα του [17]. Έχουμε επιβεβαιώσει στο μοντέλο των κυττάρων μας ότι η έκφραση του TRPV6 άμεσα προς τα πάνω ρυθμισμένη με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η φύση αυτής της προς τα επάνω ρύθμιση είναι εξαρτώμενο από στεροειδές αφού σε συνθήκες στεροειδή στερούνται καταργούνται οι επιδράσεις της 25-διϋδροξυβιταμίνης D3. Το εύρημα αυτό συμφωνεί με τα δεδομένα που δραστηριοτήτων του 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 σε κύτταρα LNCaP εξαρτώνται από στεροειδές από κοινού ρύθμιση και ότι, για παράδειγμα, προς τα πάνω ρύθμιση ανδρογόνου υποδοχέα από 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 πιθανό συμβάλλει στις συνεργιστικές δράσεις του 1 , 25-διυδροξυβιταμίνη D3 και DHT σε αυτά τα κύτταρα [23]. Τα δεδομένα από το εργαστήριο του Feldman δείχνουν ότι η προσθήκη της DHT στο 1 ηΜ στο μέσο αποκατέστησε την αντιπολλαπλασιαστική δραστικότητα της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3, ενώ ένα αντιανδρογόνο, Casodex, μπλοκάρει εντελώς 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αντιπολλαπλασιαστική και PSA δραστηριότητες διέγερση όταν τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο FBS [23].

Η ικανότητα του 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 να αναστέλλει την ανάπτυξη του προστάτη έχει αποδειχθεί σε πρωτογενή καλλιεργημένα κύτταρα από φυσιολογικούς ιστούς, καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΒΡΗ) και του καρκίνου του προστάτη , και αρκετές μοντέλα ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη [5], ωστόσο, δεν έχουν σχέση με TRPV6 ανταπόκριση έχει αποδειχθεί μέχρι στιγμής. Ο μηχανισμός για τη δραστικότητα D3 1,25-διυδροξυβιταμίνη δεν είναι εντελώς σαφής αλλά αφορά διαφορετικές δραστηριότητες οι διαφορές να προ-υποδοχέα σε φαρμακοκινητικής, καθώς και οι διαφορές στη λειτουργική διαμόρφωση του συμπλόκου VDR συνδεδεμένο με πρόσδεμα το οποίο μπορεί να μεταβάλλει τις ιδιότητες του ρετινοειδούς Χ υποδοχέα υβριδοποίηση, δέσμευσης DNA και συν-ενεργοποιητή πρόσληψη [24]. Ο μηχανισμός της αναστολής της ανάπτυξης κατά 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 φαίνεται να είναι mutifactorial αλλά η επαγωγή της p21

WAF1 /Cip1 ή /και p27

Kip1 φαίνεται να είναι μια σημαντική οδός [25].

Είμαστε οι πρώτοι που αναφέρουν ότι τα αποτελέσματα της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 μπορεί να είναι προ-πολλαπλασιαστική όταν μεσολαβεί από την άμεση επαγωγή

trpv6

γονιδιακής έκφρασης σε ανθρώπινα καρκινικά άκρως εξαρτώμενη από ανδρογόνο LNCaP κυτταρική σειρά. Το ερώτημα παραμένει ανοικτό το ερώτημα αν 1,25- θεραπεία D3 είναι εφικτή σε στάδια του καρκίνου και μετάσταση είναι διακριτή σε υψηλή έκφραση TRPV6, ή, αλλιώς, στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη βιοψίες εξακολουθεί να ανταποκρίνεται στις 1,25- θεραπεία D3 από υπερεκφράζουν TRPV6.

Έτσι, 1,25- D3 ρυθμίζει προς τα πάνω TRPV6 το οποίο αυξάνει σημαντικά [Ca

2 +]

i προσφέροντας ενισχυμένη Ca

2 + -uptake από τα κύτταρα LNCaP. Αυτή 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 επαγόμενη Ca

2 + -uptake αυξάνει δραματικά ρυθμό πολλαπλασιασμού και έναν αριθμό των κυττάρων που εισέρχονται στην S-φάση και επίσης συμβάλλει στην αυξημένη αντίσταση απόπτωση. Περιέργως, η απόπτωση παραμένει ανεπηρέαστη κατά την κατεργασία D3 1,25-διυδροξυβιταμίνη η οποία μπορεί να εξηγηθεί από την ανταπόκριση της κυτταρικής γραμμής LNCaP σε 1,25-dihydroxyvitamin D3 μέσω αυξάνοντας την έκφραση του καναλιού TRPV6 και ως εκ τούτου ενισχύοντας την αντίσταση στην απόπτωση. Ωστόσο, όταν τα κύτταρα LNCaP σε επεξεργασία με 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 αλλά pretransfected με siRNA-TRPV6, και άρα άκυρη αυτού του καναλιού είναι πολύ πιο υποβάλλονται σε απόπτωση που γίνεται συγκρίσιμος στην κρούση των siRNA κατά AR χρησιμοποιηθεί ένα θετικό μάρτυρα. Αυτό συνεπάγεται ότι το ασβέστιο που παρέχεται μέσα στο καρκινικό κύτταρο μέσω του καναλιού TRPV6 χρησιμοποιείται για να εξουδετερώσει τις επιδράσεις της 1,25-διυδροξυβιταμίνης D3 τα οποία πρέπει να είναι αντιπολλαπλασιαστική απουσία ή χαμηλή παρουσία αυτού του καναλιού. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι TRPV6 είναι ένα σοβαρό καθοριστικός παράγοντας για την 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3 προ- ή αντι-πολλαπλασιαστική δράση.

Τα δεδομένα μας δεν είναι αντιφατικές με τις ήδη δημοσιευμένες εργασίες και είναι συνεπείς με την υπόθεση ότι τα ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης του 1 , 25-διυδροξυβιταμίνη D3 είναι μερικώς διαμεσολαβείται μέσω της ικανότητάς της να ρυθμίζει την έκφραση PCNA [26]. Ένα πρωτεϊνικό επίπεδο PCNA είναι δύο φορές μειώθηκε κατά την κατεργασία D3 1,25-διυδροξυβιταμίνη περαιτέρω μειώθηκαν σε κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με siRNA-TRPV6, με ή χωρίς 1,25-διυδροξυβιταμίνη D3.