Αφηρημένο

Προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι η επιδερμική αυξητικού παράγοντα (EGF) προάγει την εξέλιξη του όγκου. Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι οι αυξητικοί παράγοντες μπορούν να προκαλέσουν οξυγονάσης αίμης (ΗΟ) -1 έκφρασης, προστατεύουν από κυτταρική βλάβη και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη συμμετοχή των c-Src, της οξειδάσης του NADPH, αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), ΡΙ3Κ /Akt, και NF-κΒ περιόδων EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 σηματοδότηση σε ανθρώπινα ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου . Θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με EGF προκάλεσε ΗΟ-1 να εκφράζονται σε συγκέντρωση και το χρόνο που εξαρτάται από τρόπους. Θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με AG1478 (ένα EGF υποδοχέα (EGFR) αναστολέα), μικρά παρεμβαλλόμενα RNA του EGFR (EGFR siRNA), ένα κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα της c-Src (c-Src DN), DPI (ένας αναστολέας της οξειδάσης του ΝΑϋΡΗ) , γλουταθειόνη (ένας αναστολέας ROS), LY294002 (ένας αναστολέας ΡΙ3Κ), και ένα Akt DN ανέστειλε EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1. Η διέγερση των κυττάρων με EGF προκάλεσε μία αύξηση στη φωσφορυλίωση c-Src σε Tyr406 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με EGF προκάλεσε μία αύξηση στο Ρ47

phOx

μετατόπιση από το κυτοσόλιο στο μεμβρανών. Το EGF-επαγόμενη παραγωγή ROS ανεστάλη από DPI. Η διέγερση των κυττάρων με EGF είχε ως αποτέλεσμα μία αύξηση στην φωσφορυλίωση της Akt σε Ser473, η οποία αναστέλλεται από c-Src DN, DPI, και LY 294002. Επιπλέον, η θεραπεία του ΗΤ-29 κυττάρων με ένα κυρίαρχο αρνητικό μετάλλαγμα της ΙκΒ (IκBαM) ανέστειλαν EGF επαγόμενη ΗΟ-1 έκφρασης. Η διέγερση των κυττάρων με προκαλούμενη EGF p65 μετατόπιση από το κυτοσόλιο στο πυρήνες. Θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με EGF προκάλεσε μία αύξηση στη δραστικότητα κΒ-λουσιφεράσης, η οποία αναστέλλεται από ένα c-Src DN, LY 294.002, και ένα Akt DN. Επιπλέον, ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου EGF επαγόμενη ανεστάλη από Sn (IV) πρωτοπορφυρίνης-IX (SnPP, ένας αναστολέας ΗΟ-1). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η c-Src, μονοπάτια ΝΑΟΡΗ οξειδάσης, ΡΙ3Κ, και Akt σηματοδότησης παίζουν σημαντικούς ρόλους στην προκαλούμενη από EGF ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ και ΗΟ-1 έκφρασης σε κύτταρα ΗΤ-29. Επιπλέον, η υπερέκφραση του ΗΟ-1 διαμεσολαβεί πολλαπλασιασμό του παχέος εντέρου καρκινικών κυττάρων EGF που προκαλείται

Παράθεση:. Lien GS, Wu MS, Bien ΜΟΥ, Τσεν CH, Λιν CH, Chen π.Χ. (2014) επιδερμικού αυξητικού παράγοντα Τονώνει Πυρηνική Factor -κB ενεργοποίηση και η οξυγενάση της αίμης-1 έκφραση μέσω της c-Src, NADPH οξειδάση, PI3K, και Akt σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (8): e104891. doi: 10.1371 /journal.pone.0104891

Επιμέλεια: Chuen-Μάο Γιανγκ, Chang Gung Πανεπιστήμιο, την Ταϊβάν

Ελήφθη: 25 Μαρτίου, 2014? Αποδεκτές: 29 Ιουνίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Lien et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από επιχορηγήσεις (101TMU-WFH-02-1, 102TMU-WFH-01-1, και 103TMU-WFH-02-1) από Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο-Wan Fang Νοσοκομείο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περίπου ένα εκατομμύριο περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου διαγιγνώσκονται σε όλο τον κόσμο κάθε χρόνο, και μια αυξανόμενη τάση στη συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου του παχέος εντέρου σε ασιατικές χώρες αναφέρθηκε κατά τα τελευταία έτη [1]. Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι η πρόσληψη του κόκκινου και επεξεργασμένα κρέατα σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου του παχέος εντέρου, επειδή το κόκκινο κρέας περιέχει περίπου 10 φορές υψηλότερα επίπεδα της αίμης από το λευκό κρέας [2]. Οξυγονάσης αίμης (ΗΟ) παίζει ζωτικό ρόλο στην φυσιολογική ομοιοστασία του σιδήρου, αντιοξειδωτική άμυνα, και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [3]. HO καταλύει τη μετατροπή της αίμης προς χολοπρασίνης, απελευθερώνοντας ισομοριακές ποσότητες μονοξειδίου του άνθρακα, και η ταυτόχρονη επαγωγή του σιδήρου συμπλοκοποιήσεως φερριτίνη [4]. Τρεις ισομορφές του HO (ΗΟ-1, -2, και -3) ταυτοποιήθηκαν [5]. ΗΟ-1 είναι ένα διεγέρσιμο ένζυμο που προκαλείται από αυξητικούς παράγοντες συμπεριλαμβανομένων αυξητικό παράγοντα μετασχηματισμού (TGF) παράγοντας -β και επιδερμικής ανάπτυξης (EGF), αντανακλώντας τον κύριο ρόλο αυτού του ενζύμου στην προστασία από οξειδωτική βλάβη [6], [7]. Επιπλέον, ΗΟ-1 συχνά ρυθμίζεται αυξητικά ιδιαίτερα σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε σύγκριση με περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό, υποδηλώνοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν υψηλά HO απολαύσουν ένα πλεονέκτημα ανάπτυξης και να παρέχει την κυτταρική αντίσταση ενάντια αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) μεσολάβηση αντικαρκινικών θεραπειών [8] – [10 ].

Η σημασία της ΕΤΠ για την ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου τονίστηκε κατά τα τελευταία χρόνια [11]. Ένα αυξανόμενο σώμα της στοιχεία δείχνουν ότι ο EGF ρυθμίζει πολλαπλές βιολογικές λειτουργίες όπως την εξέλιξη των καρκινικών κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, και τη μετάσταση [11]. Ο υποδοχέας EGF (EGFR) δείχθηκε να συμμετάσχουν στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [11]. EGF δεσμεύεται με την εξωκυτταρική περιοχή του EGFR που ενεργοποιεί καθοδικά μονοπάτια σηματοδότησης, συμπεριλαμβανομένου του c-Src και φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /οδοί Akt [12], [13]. Μια προηγούμενη έκθεση ανέφερε ότι η υπερέκφραση του ΗΟ-1 παίζει ένα προστατευτικό ρόλο στην εξασθένηση κυτταρική βλάβη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [6], [7]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το πώς EGF ρυθμίζει την επαγωγή της έκφρασης της πρωτεΐνης ΗΟ-1.

Η έκφραση του

ΗΟ-1

γονίδιο ρυθμίζεται κυρίως στο επίπεδο της μεταγραφής, με την ενεργοποίηση παραγόντων μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένων των πυρηνικών παράγοντα (NF) -κB, πρωτεΐνη ενεργοποίησης (AP) -2, και η θερμότητα στοιχείο σοκ-απόκρισης (HSE) [14], [15]. NF-κΒ είναι ένας σημαντικός παράγοντας για τη ρύθμιση της μεταγραφής ΗΟ-1 έκφραση [16]. Σε κατάσταση ηρεμίας, ο ΝΡ-κΒ σύνδεση προς ΙκΒα αποτρέπει ΝΡ-κΒ πυρηνική μετατόπιση και δραστικότητα μεταγραφής [17]. Ωστόσο, οι αυξητικοί παράγοντες επάγουν την ενεργοποίηση ΙκΒ κινάσης (ΙΚΚ), φωσφορυλίωση ΙκΒα, και η υποβάθμιση ΙκΒα. Αυτό απελευθερώνει διαδικασία ενεργός ΝΡ-κΒ, η οποία στη συνέχεια μετατοπίζεται από το κυτοσόλιο στο πυρήνες, δεσμεύοντας την περιοχή προαγωγού ΗΟ-1 και επάγουν

ΗΟ-1 έκφραση

γονίδιο [16], [18]. Πολλές εκθέσεις έδειξαν ότι προκαλούμενη από EGF ενεργοποίηση ΝΡ-κΒ επέρχεται μέσω πολλαπλών μορίων σηματοδότησης EGFR-εξαρτώμενη, συμπεριλαμβανομένων των ΡΙ3Κ, πρωτεϊνική κινάση C (PKC), και τα μονοπάτια σηματοδότησης ΙΚΚ [19]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι ο ΤΟΡ-β επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 μέσω της ΡΙ3Κ /Akt-εξαρτώμενη οδό σηματοδότησης ΝΡ-κΒ [6]. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά σχετικά με το γεγονός μεταγωγής σήματος? Ειδικότερα, το c-Src, NADPH οξειδάση, ROS, και ΡΙ3Κ /Akt οδούς, οι οποίες οδηγούν σε ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ και την έκφραση της ΗΟ-1 με διέγερση EGF, δεν είναι καλά περιγραφεί.

Αρκετές μελέτες έδειξαν ότι c-Src και play ΝΑϋΡΗ οξειδάσης σημαντικό ρόλο στην επαγωγή γονίδιο εκφράσεις [20], [21]. Μια προηγούμενη έκθεση απέδειξε ότι η θρομβίνη επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 και εξαρτιόταν από την c-Src-μεσολαβητική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ [20]. Ανακαλύφθηκε πρόσφατα ότι η παραγωγή της οξειδάσης του ΝΑϋΡΗ της παραγωγής ROS είναι μια αμυντική απόκριση από ένα ξενιστή σε απόπτωση και κυτταρικό μετασχηματισμό [22]. NADPH οξειδάση ρυθμίζεται από ρ47

phOx

το οποίο είναι ικανό να υποστηρίζει την ενεργοποίηση των ΝΑΟΡΗ οξειδάσης [23]. Είναι γνωστό ότι η EGF διεγείρει δραστικότητα ΝΑΟΡΗ οξειδάσης για την παραγωγή υπεροξειδίου, και η παραγόμενη υπεροξειδίου ταχέως dismutated να H

2O

2, που οδηγεί σε προκαλούμενη από EGF φυσιολογικών αποκρίσεων [24]. Ωστόσο, λίγες πληροφορίες είναι διαθέσιμες για το ρόλο της ΝΑϋΡΗ οξειδάσης στη ρύθμιση της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ και ΗΟ-1 έκφραση μετά την διέγερση EGF σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Τα ευρήματά μας αποκάλυψαν ότι EGF ενεργοποίηση του c-Src, NADPH οξειδάση, ROS, και ΡΙ3Κ /Akt σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν σε ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην προκαλούμενη από EGF έκφραση ΗΟ-1 στον ανθρώπινο πνεύμονα καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα. Επιπλέον, ΗΟ-1 εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου που προκαλείται από EGF.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

EGF λήφθηκε από την PeproTech (London, UK). LY 294002, χλωριούχο diphenyleneiodonium (DPI), γλουταθειόνη, και 2 ‘, 7’-διοξική dichloroflurorescein (DCF-DA) αγοράστηκαν από την Sigma (St. Louis, ΜΟ, USA). Μια κυρίαρχη αρνητική μετάλλαξη (DN) του ΙκΒα (IκBαM) αγοράστηκε από την Clontech (Mountain View, CA, USA). pGL2-ΕΛΑΜ-Luc (η οποία είναι υπό τον έλεγχο ενός NF-κΒ θέση δέσμευσης) και ρΒΚ-CMV-Lac Ζ ήταν ευγενική προσφορά από το Δρ Wan-Wan Λιν (Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊπέι, Ταϊβάν). Μια DN της Akt (Akt DN) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Τσε-Ming Teng (Εθνικό Πανεπιστήμιο της Ταϊβάν, Ταϊπέι, Ταϊβάν). Το πλασμίδιο pcDNA παρεσχέθη από τον Dr. M.-C. Chen (Ταϊπέι Ιατρικό Πανεπιστήμιο, Ταϊπέι, Ταϊβάν). Μια c-Src DN αγοράστηκε από την Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Ορός εμβρύου μόσχου (FCS), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη, και Lipofectamine Plus αντιδραστηρίου αγοράστηκαν από την Life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Sn (IV) πρωτοπορφυρίνης-IX (SNPP) αγοράστηκε από την Frontier Scientific (Logan, UT, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τον έλεγχο των φορητών παρεμβαίνοντας (SI) RNA, EGFR siRNA, και αντισώματα ειδικά για ΗΟ-1, c-Src, Ρ47

phOx

, Akt1 /2, EGFR, Na

+ /K

+ ΑΤΡάσης, p65, ΙκΒα, και αντι-ποντικού και αντι-ανοσοσφαιρίνης κουνελιού G (IgG), συζευγμένης υπεροξειδάσες horseradish (HRPs) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Dallas, ΤΧ, USA). Akt φωσφορυλιώνεται σε Ser473 και c-Src φωσφορυλιωμένο στο Tyr416 αγοράστηκαν από την New England Biolabs (Beverly, ΜΑ, USA). Lamin A /C αγοράστηκε από GeneTex (Ίπσουιτς, CA, USA). AG1478 και κιτ προσδιορισμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων BrdU αγοράστηκαν από την Merck (Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα υλικά για την ηλεκτροφόρηση δωδεκυλοθειϊκού νατρίου (SDS-PAGE) αγοράστηκαν από τη Bio-Rad (Hercules, CA, USA).

Κυτταροκαλλιέργεια

ΗΤ29 ανθρώπινου καρκίνου κόλου κύτταρα ελήφθησαν από το American Type Culture Collection (Livingstone, MT, USA), και τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FCS, 100 U /ml πενικιλλίνη G, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε υγροποιημένο επωαστή 37 ° C. Μετά την επίτευξη συρροής, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα για κηλίδωση Western και μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR), επάνω σε 12 φρεατίων για κυτταρική επιμόλυνση και την δοκιμασία κΒ-λουσιφεράσης δραστηριότητα, και πάνω σε πλάκες 96 φρεατίων για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων BrdU και προσδιορισμοί παραγωγή ROS.

Western ανάλυση κηλίδος

για να προσδιοριστεί εκφράσεις ΗΟ-1, c-Src φωσφορυλιωμένο στο Tyr416, Akt φωσφορυλιώνεται σε Ser473, c-Src, Akt1 /2, και EGFR σε κύτταρα ΗΤ-29, πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν, και μια ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Εν συντομία, ΗΤ-29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πιάτα 6 cm. Μετά την επίτευξη συρροής, το μέσο ανάπτυξης απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με 2 ml RPMI 1640 χωρίς FCS για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με το όχημα και EGF, ή προεπεξεργασία με ειδικούς αναστολείς όπως υποδεικνύεται ακολουθούμενη από EGF. Μετά την επώαση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές σε παγωμένο ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και διαλυτοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης που περιέχει 10 mM Tris (ρΗ 7.0), 140 mM NaCl, 2 mM φθοριούχο φαινυλμεθυλσουλφονύλιο (PMSF), 5 mM διθειοθρεϊτόλη, 0,5% ΝΡ-40, 0,05 mM πεπστατίνη Α, και 0,2 mM λευπεπτίνη. Δείγματα ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (50 μg) υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, κατόπιν μεταφέρθηκαν πάνω σε φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) τα οποία στη συνέχεια επωάζονται σε Tris-ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα με 0.1% Tween-20 (TBST) ρυθμιστικό που περιέχει 5% βόειο ορό λευκωματίνη. Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με ειδικές πρωτογενή αντισώματα και κατόπιν επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένο με HRP. Η ανοσοαντιδραστικότητα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ενισχυμένη χημειοφωταύγεια ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ποσοτικά δεδομένα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα υπολογιστικό πυκνόμετρο με επιστημονικά συστήματα απεικόνισης (Eastman Kodak, Rochester, ΝΥ, USA).

εξαγωγή RNA και το RT-PCR

Για την ενίσχυση του ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρο ΗΟ- 1 mRNA, ειδικοί εναρκτήρες συνετέθησαν. Οι εκκινητές ΗΟ-1 που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: με νόημα 5′-CTG TGT AAC CTC TGC TGT TCC-3 ‘και αντιπληροφοριακό 5′-CCA CAC TACCTG AGT CTA CC-3’. β-ακτίνης mRNA επίπεδα χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. Οι β-ακτίνη εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: με νόημα 5′-GAC TAC CTC AAG ATC CT-3 ‘και αντιπληροφοριακό 5′-CCA CAT CTG CTG ΟΑΑ GGT GG-3’. ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν σε τρυβλία 6 cm. Μετά την επίτευξη διάσκεψης, το μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με βασικό μέσο άνευ FBS όλη τη νύχτα, μετά την οποία τα κύτταρα διεγέρθηκαν με EGF για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Ολικό RNA καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το TRI αντιδραστηρίου (Research Center Molecular, Cincinnati, ΟΗ, USA), και ένα RT-PCR διεξάγεται χρησιμοποιώντας ένα κιτ RT-PCR (Epicentre, Madison, WI, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, χρησιμοποιώντας 10 μΐ ολικού RNA σαν εκμαγείο. Ίσες ποσότητες (10 μg cDNA) του κάθε PCR προϊόντος ΡΟΚ-ενισχυμένο με Tag πολυμεράση σε 35 κύκλους που αποτελούνται από 30 s στους 95 ° C, 30 s στους 58 ° C, και 1 λεπτό στους 72 ° C. Το ενισχυμένο cDNA εκτελέστηκε σε πηκτώματα αγαρόζης 2% και οπτικοποιήθηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Τα δείγματα RT χρησιμοποιήθηκαν επίσης για την παραγωγή β-ακτίνης PCR προϊόντα και το ύψος τους χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η επιμόλυνση και η κΒ-λουσιφεράσης

δοκιμασία

ΗΤ 29-κύτταρα (2 × 10

5) σπάρθηκαν σε 12 φρεατίων πλάκες, και τα κύτταρα επιμολύνθηκαν την επόμενη ημέρα χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Lipofectamine Plus που περιείχε 0,5 μα pGL2-ELAM-Luc και 0,5 μg ρΒΚ-ΟΜν-Lac Ζ Μετά από 24 ώρες, το μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 άνευ FCS, και στη συνέχεια τα κύτταρα διεγέρθηκαν με EGF (0.3~10 ng /ml) για άλλες 24 ώρες πριν από την συγκομιδή. Για την αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των αναστολέων υποδεικνύονται, φάρμακα προστέθηκαν σε κύτταρα 20 λεπτά πριν από την προσθήκη του EGF. Για να εκτιμηθούν τα αποτελέσματα της c-Src DN και Akt DN, τα κύτταρα συνεπιμολύνθηκαν με pGL2-ELAM-Luc και δραστικότητα ρΒΚ-ΟΜν-Lac Ζ λουσιφεράσης προσδιορίσθηκε με ένα σύστημα δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA), και ομαλοποιήθηκε με βάση έκφρασης Lac Ζ. Το επίπεδο της επαγωγής της δραστηριότητας της λουσιφεράσης συγκρίθηκε ως αναλογία των κυττάρων με και χωρίς διέγερση.

Ανάλυση της ρ47

phOx

μετατόπιση

Για την ανίχνευση ρ47

phOx

μετατόπιση, κυτοσολικά και μεμβράνη κλάσματα διαχωρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με EGF για τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ή για τα διάφορα χρονικά διαστήματα. Μετά την επώαση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πάγο, ξεπλένονται με PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα ομογενοποίησης (20 mM Tris-HCl, 0,5 mM EGTA, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, και 10 μg /ml λευπεπτίνη (ρΗ 7.5) ) και κατεργασία με υπερήχους. Το προϊόν λύσης διαχωρίστηκε σε κλάσματα κυτοσολίου και μεμβράνης με φυγοκέντρηση σε 40,000 χ

g

για 45 λεπτά. Επίπεδα της ρ47

phOx

πρωτεΐνη στα κλάσματα κυτοσολίου και της μεμβράνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. α-τουμπουλίνης και Na

+ /K

+ ΑΤΡάσης αντιστοίχως χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι των κλασμάτων του κυτταροπλάσματος και της μεμβράνης.

Ανάλυση της p65 μετατόπιση

Για την ανίχνευση p65 μετατόπιση , ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με EGF για τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ή για τα διάφορα χρονικά διαστήματα. Τα κυτοσολικά και πυρηνικά πρωτεϊνικά κλάσματα στη συνέχεια διαχωρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, ΗΤ-29 κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS, και σφαιροποιήθηκαν. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν σε υποτονικό ρυθμιστικό διάλυμα (10 mM HEPES (ρΗ 7.9), 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 10 mM απρωτινίνη, 10 mM λευπεπτίνη, και 20 mM PMSF) για 15 λεπτά σε πάγο, και στροβιλίστηκαν για 10 s. Οι πυρήνες ιζηματοποιήθηκαν με φυγοκέντρηση στα 15.000 χ

g

για 1 λεπτό. Τα υπερκείμενα που περιέχουν κυτοσολικό πρωτεΐνες συλλέχθηκαν. Ένα σφαιρίδιο που περιέχει πυρήνες επαναιωρήθηκε σε υπερτονικό ρυθμιστικό (20 mM HEPES (ρΗ 7.6), 25% γλυκερόλη, 1.5 mM MgCl

2, 4 mM EDTA, 0,05 mM DTT, 10 mM απρωτινίνη, 10 mM λευπεπτίνη, και 20 mM PMSF ) για 30 λεπτά σε πάγο. Τα υπερκείμενα που περιέχουν πυρηνικές πρωτεΐνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 15.000 χ

g

για 2 λεπτά. Τα επίπεδα πρωτεΐνης του p65 στα κυτοσολικά και πυρηνικά κλάσματα προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. α-τουμπουλίνης και λαμίνη A /C χρησιμοποιήθηκαν αντιστοίχως ως κυτοσόλιο και η πυρηνική εσωτερικών ελέγχων.

Προσδιορισμός της ROS παραγωγής

ROS προσδιορίσθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Εν συντομία, ΗΤ-29 κύτταρα σπάρθηκαν επί πλακών 96 φρεατίων σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FCS επί μία νύκτα. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 άνευ FCS. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ROS ευαίσθητο DCF για 15 λεπτά, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF για υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ή για διάφορα χρονικά διαστήματα. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της DPI (10 μΜ), το φάρμακο προστέθηκε στα κύτταρα 20 λεπτά πριν από την προσθήκη του EGF. Ο φθορισμός προσδιορίστηκε με αναγνώστη Varioskan Flash πλάκας φθορισμού (Electron Corporation Θέρμο, Marietta, OH, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) με διέγερση στα 485 nm και εκπομπή στα 528 nm.

BrdU τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων δοκιμασία

HT -29 κύτταρα (7.5 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε RPMI 1640 που περιέχει 10% FCS. Την επόμενη ημέρα, το μέσο αναρροφήθηκε και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​RPMI 1640 άνευ FCS επί μία νύκτα. Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με SnPP (3 μΜ) για 20 λεπτά, και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF (10 ng /ml) για άλλες 48 ώρες. BrdU προστέθηκαν σε κύτταρα κατά τη διάρκεια των τελευταίων 2 ώρες επώασης. Μετά την απομάκρυνση του μέσου σήμανσης, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και το DNA denaturized. Το ενσωματωμένο BrdU σημάνθηκε με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-BrdU και ενός αντισώματος κατσίκας αντι-ποντικού συζευγμένο με υπεροξειδάση. Τα ανοσοσύμπλοκα ανιχνεύθηκαν με την μετέπειτα αντίδραση του υποστρώματος και προσδιορίζεται ποσοτικά με μέτρηση της απορρόφησης στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός.

Στατιστική ανάλυση

Αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα του μέσου ( SEM) από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Μία μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA) που ακολουθείται από, κατά περίπτωση, δοκιμή πολλαπλών συγκρίσεων του Dunnett χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η στατιστική σημαντικότητα της διαφοράς μεταξύ μέσων. Ένα

σ

αξία των & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

EGF προκαλεί ΗΟ-1 έκφρασης σε κύτταρα ΗΤ-29

Πολλές μελέτες αποκάλυψαν ότι ΗΟ-1 έκφρασης παίζουν σημαντικό για την προστασία των λαών απέναντι στο κυτταρικού θανάτου ο καρκίνος. Ανθρώπινη ΗΤ-29 κύτταρα καρκίνου κόλου επιλέχτηκαν για να διερευνηθούν οι πορείες σήματος του EGF σε ΗΟ-1 έκφρασης. Η θεραπεία με EGF (1~10 ng /ml) για 18 ώρες επαγόμενη ΗΟ-1 έκφραση πρωτεΐνης σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο (Εικ 1Α.)? Αυτή η επαγωγή συνέβη επίσης σε μια χρονο-εξαρτώμενο τρόπο, ξεκινώντας από 8 ώρες και φτάνοντας ένα μέγιστο στις 12~18 h (Σχ. 1Β). Μετά από 18 ώρες της θεραπείας με 10 ng /ml EGF, η πρωτεΐνη ΗΟ-1 είχε αυξηθεί κατά 185 ± 11% (Σχ. 1Β). Στη συνέχεια, θα εξετασθεί αν το ΕΤΠ μπορεί να επάγει την έκφραση του mRNA ΗΟ-1. Μετά τη θεραπεία, η επαγωγή της ΗΟ-1 mRNA είχε αρχίσει στις 2 ώρες και έφθασε ένα μέγιστο σε 4 ώρες μετά την EGF (10 ng /ml) θεραπεία (Εικ. 1 C). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, ο EGFR είναι απαραίτητη για αποκρίσεις EGF. Για να εξεταστεί κατά πόσον η EGFR εμπλέκεται στην EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1, AG1478 χρησιμοποιήθηκε. Το Σχήμα 1D δείχνει ότι προκατεργασία των κυττάρων ΗΤ-29 με AG4178 (10 μΜ) παρεμπόδισε πλήρως EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 (

n =

3). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω το ρόλο του EGFR σε EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1, EGFR siRNA χρησιμοποιήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Ε, επιμόλυνση με EGFR siRNA (25 ηΜ) επίσης παρεμπόδισε πλήρως EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 (

n

= 3) (Σχ. 1Ε). Για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων πειράματος EGFR siRNA, χρησιμοποιήσαμε επίσης EGFR siRNA για την καταστολή της έκφρασης πρωτεΐνης EGFR σε κύτταρα ΗΤ-29. Βρήκαμε ότι η έκφραση του EGFR siRNA αξιοσημείωτα ανέστειλε πρωτεΐνης EGFR (Εικ. 1 F). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι EGFR εμπλέκεται στην EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 σε κύτταρα ΗΤ-29.

Α, ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις του EGF για 18 ώρες, και στη συνέχεια, ΗΟ-1 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Β, τα κύτταρα επωάστηκαν επί διάφορα χρονικά διαστήματα με EGF (10 ng /ml), και στη συνέχεια προσδιορίστηκαν ΗΟ-1 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. C, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί διάφορα χρονικά διαστήματα με EGF (10 ng /ml). Ολικό RNA παρασκευάστηκε, και μία RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Taces αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. D, τα κύτταρα προκατεργάστηκαν για 30 λεπτά με 10 μΜ AG1478 και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10 ng /ml EGF για άλλες 18 ώρες. Μετά την επώαση, ΗΟ-1 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

* ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τη θεραπεία του ΕΤΠ. Ε, κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 25 ηΜ siRNA ελέγχου (con siRNA) ή 25 ηΜ siRNA EGFR για 24 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF (10 ng /ml) για άλλες 18 ώρες. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης και, στη συνέχεια, ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα για ΗΟ-1 ή α-τουμπουλίνης. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E.M.

* ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τη θεραπεία του ΕΤΠ. F, κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 25 ηΜ siRNA ελέγχου (con siRNA) ή 25 ηΜ siRNA EGFR για 24 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και στη συνέχεια ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα για τον EGFR ή α-τουμπουλίνης. Ίχνη αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

c-Src εμπλέκεται σε EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 σε κύτταρα ΗΤ-29

Για να εξεταστεί αν c-Src, ένα κατάντι πρωτεΐνη του EGFR [12], μπορεί να παίξει κρίσιμο ρόλο στην προκαλούμενη από EGF έκφραση ΗΟ-1, χρησιμοποιήθηκε ένα πλασμίδιο c-Src DN. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, η επιμόλυνση των κυττάρων ΗΤ-29 με την c-Src DN (0,5 μg) ανέστειλε την ΕΟΡ-επαγόμενη αύξηση της ΗΟ-1 έκφραση κατά 91 ± 6% (

n

= 3). Επιπλέον, το επίπεδο του c-Src πρωτεΐνης εντόνως εκφρασμένο σε κύτταρα ΗΤ-29 c-Src DN πλασμίδιο-επιμολυσμένα σύγκριση με pcDNA πλασμίδιο-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ-29 (Σχ. 2Β). Ρύθμιση της δραστηριότητας c-Src εμφανίζεται ως αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης των πολλαπλών θέσεων επί συγκεκριμένων υπολειμμάτων, συμπεριλαμβανομένων Tyr416 [25]. Στη συνέχεια, εξετάσαμε περαιτέρω φωσφορυλίωση c-Src στο Tyr416 με διέγερση EGF σε κύτταρα ΗΤ-29 χρησιμοποιώντας το αντι-φωσφο-c-Src αντίσωμα στο Tyr416. Το Σχήμα 2C δείχνει ότι η θεραπεία της ΗΤ-29 κυττάρων με 10 ng /ml EGF προκάλεσε μία αύξηση στη φωσφορυλίωση της c-Src σε Tyr416 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Φωσφορυλίωση της c-Src σε Tyr416 άρχισε στα 0,5 λεπτά και διατηρήθηκε μέχρι 30 λεπτά μετά EGF διέγερση (Σχ. 2C, επάνω πίνακα). Το επίπεδο πρωτεΐνης του c-Src δεν επηρεάστηκε από EGF διέγερση (Σχ. 2C, κάτω πλαίσιο). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση c-Src απαιτείται για EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1.

Α, ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 0,5 μg του pcDNA ή 0,5 μg δεσπόζουσας αρνητική μεταλλαγμένη του c- src (c-src DN) για 24 ώρες. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με EGF (10 ng /ml) για άλλες 18 ώρες. Μετά την επώαση, ΗΟ-1 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

* ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τη θεραπεία του ΕΤΠ. Β, κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με 0,5 μg του pcDNA ή 0,5 μg του c-Src DN για 24 ώρες. Επίπεδα c-Src ή α-τουμπουλίνης εκφράσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Ίχνη αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. C, ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν με 10 ng /ml EGF επί 0~30 λεπτά. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και φωσφορυλίωση c-Src Tyr416 προσδιορίστηκε με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας αντίσωμα φωσφο-c-Src Tyr416. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Συμμετοχή των NADPH οξειδάσης και ROS σε EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 σε κύτταρα ΗΤ-29

c-Src θα μπορούσε να ενεργοποιήσει ένα αριθμός των οδών σήματος, συμπεριλαμβανομένων NADPH οξειδάση [27]. Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι κύτταρα ΗΤ-29 εκφράζεται κυρίως NADPH οξειδάση 1 [28]. Για να καθοριστεί εάν ΝΑϋΡΗ οξειδάσης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην προκαλούμενη από EGF έκφραση ΗΟ-1, ο αναστολέας της οξειδάσης του ΝΑϋΡΗ, DPI [29], χρησιμοποιήθηκε. Το Σχήμα 3Α δείχνει ότι EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 αναστέλλεται από DPI (3 και 10 μΜ) σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο. Όταν ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 10 μΜ DPI, EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 αναστέλλεται από 86 ± 13% (

n =

3) (Σχ. 3Α). Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η επαγωγή του ρ47

phOx

μετατόπιση από το κυτοσόλιο στο μεμβρανών οδήγησε σε αύξηση της δραστικότητας ΝΑΟΡΗ οξειδάσης [27]. Εμείς επόμενη προσπάθεια να προσδιοριστεί εάν EGF ενεργοποιεί NADPH οξειδάση εξετάζοντας την μετατόπιση του ρ47

phOx

από το κυτοσόλιο στο κλάσμα μεμβράνης χρησιμοποιώντας ανάλυση κηλίδος Western. Η διέγερση των κυττάρων με 10 ng EGF /ml για 0~30 min οδήγησε σε μετατόπιση της ρ47

phOx

από το κυτοσολικό κλάσμα στο κλάσμα μεμβράνης που αρχίζει από 3 λεπτά, το αποτέλεσμα διατηρήθηκε για 10 λεπτά, και μειώθηκε κατά 30 λεπτά (Σχ. 3Β). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η επώαση των κυττάρων με EGF (1~10 ng /ml) που παράγεται εξαρτάται από τη συγκέντρωση αυξήσεις στην μετατόπιση του ρ47

phOx

από το κυτοσολικό κλάσμα στο κλάσμα μεμβράνης (Σχ. 3C). Μια προηγούμενη μελέτη προτείνει ότι ΝΑΟΡΗ οξειδάσης που δημιουργείται παραγωγή ROS συμμετέχει στο σηματοδοτικό μονοπάτι που οδηγεί στην επαγωγή της ΗΟ-1 έκφραση με κατεργασία με ένα εκχύλισμα καπνού των τσιγάρων [29]. Για να εξεταστεί αν θα μπορούσε να ROS μεσολαβούν EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1, χρησιμοποιήθηκε η γλουταθειόνη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D, η θεραπεία των κυττάρων με γλουταθειόνη (3-10 mM) αναστέλλεται σημαντικά EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1. Όταν κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM γλουταθειόνη, EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 εξασθένισε κατά 91 ± 6% (

n

= 3). (Σχ. 3D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι NADPH οξειδάσης και ROS εμπλέκονται στην προκαλούμενη από EGF ΗΟ-1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

ΗΤ-29 κύτταρα προκατεργάστηκαν για 30 λεπτά με 3-10 μΜ DPI (Α) και 3 ~ 10 mM γλουταθειόνη (D) και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10 ng /ml EGF. Μετά από επώαση 18 h, ΗΟ-1 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

* ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τη θεραπεία του ΕΤΠ. ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με 10 ng /ml EGF για τα υποδεικνυόμενα χρονικά διαστήματα (Β) ή κατεργασμένα με διαφορετικές συγκεντρώσεις EGF (C). Τα κλάσματα κυτοσολίου και μεμβράνης μετά απομονώθηκαν, και τα επίπεδα πρωτεΐνης του ρ47

phOx

στα κλάσματα κυτοσολίου και της μεμβράνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Na

+ /K

+ ΑΤΡάσης και α-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκαν αντιστοίχως ως η μεμβράνη και κυτοσολικά εσωτερικών ελέγχων. Τυπικά ίχνη αντιπροσωπεύουν τρία πειράματα με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

NADPH οξειδάση εμπλέκεται σε EGF που προκαλείται από την παραγωγή ROS σε ΗΤ 29-κύτταρα

Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε ότι το ΕΤΠ προκάλεσε αύξηση των ROS γενιά σε κύτταρα ΗΤ-29 [30]. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε το ρόλο της NADPH οξειδάσης σε EGF-επαγόμενη παραγωγή ROS. Το Σχήμα 4Α και 4Β δείχνουν ότι η θεραπεία των κυττάρων ΗΤ-29 με EGF προκάλεσε μια αύξηση στην παραγωγή ROS σε χρόνο και την εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση τρόπους (Σχ. 4Α, 4Β). Μετά από 20 λεπτά από τη θεραπεία με 10 ng /ml EGF, η παραγωγή ROS είχε αυξηθεί κατά 62 ± 5% (

n

= 3) (Εικ. 4Β). Επιπλέον, η προκατεργασία των κυττάρων με DPI (10 μΜ) ανέστειλε σημαντικά EGF επαγόμενη ROS παραγωγή κατά 85 ± 8% (

n

= 3) (Εικ. 4C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ΝΑϋΡΗ οξειδάσης μεσολαβεί EGF-επαγόμενη παραγωγή ROS σε κύτταρα ΗΤ-29.

ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν επί διάφορα χρονικά διαστήματα με EGF (10 ng /ml) (Α) ή επωάστηκαν με EGF ( 1~10 ng /ml) για 20 λεπτά, και στη συνέχεια η παραγωγή ROS προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, οι οποίες παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E.M. *

ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. C, ΗΤ-29 κύτταρα προκατεργάστηκαν για 30 λεπτά με 10 μΜ DPI και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10 ng /ml EGF. Μετά από 20 λεπτά επώασης, η παραγωγή ROS προσδιορίστηκε. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, οι οποίες παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E.M.

* ρ

& lt?. 0,05, σε σύγκριση με αγωγή με EGF

Η

ΡΙ3Κ /Akt εμπλέκεται σε EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 σε κύτταρα ΗΤ-29

μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι ΡΙ3Κ /Akt διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ΗΟ-1 έκφραση [31]. Για να κατανοήσουμε τη σχέση μεταξύ ΗΟ-1 έκφραση EGF και PI3K του /Akt σηματοδοτικό μονοπάτι, τον αναστολέα της PI3K (LY 294002) και ένα Akt DN, χρησιμοποιήθηκαν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 αναστέλλεται από 10 μΜ LY 294002 κατά 85 ± 8% (Σχ. 5Α). Επιπλέον, η επιμόλυνση των κυττάρων ΗΤ-29 με 0,5 μg του Akt DN ανέστειλε επίσης EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1 κατά 78 ± 8% (Σχ. 5Β). Επιπλέον, το επίπεδο της Akt πρωτεΐνη εντόνως εκφρασμένο σε κύτταρα ΗΤ-29 Akt DN πλασμίδιο-επιμολυσμένα σύγκριση με pcDNA πλασμίδιο-επιμολυσμένα κύτταρα ΗΤ-29 (Σχ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σηματοδότησης είναι απαραίτητος για EGF-επαγόμενη έκφραση ΗΟ-1. υπόλειμμα φωσφορυλίωση της Akt Ser473 από μονοπάτι σηματοδότησης της ΡΙ3Κ-εξαρτώμενη προκαλεί ενζυματική ενεργοποίηση [32]. Για να επιβεβαιώσετε το σημαντικό ρόλο της PI3K /Akt σε ΗΟ-1 έκφρασης, προσδιορίσαμε φωσφορυλίωση της Akt Ser473 ως απάντηση στην ΕΤΠ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5D, η αγωγή των ΗΤ-29 κυττάρων με 10 ng /ml EGF οδήγησε σε χρόνο-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση της Akt Ser473. φωσφορυλίωση της Akt Ser473 κορυφώθηκε σε 5~10 λεπτά, και στη συνέχεια είχε μειωθεί κατά 20 λεπτά μετά την αγωγή με EGF (Σχ. 5D, άνω φωτογραφία). Τα επίπεδα πρωτεΐνης του Akt1 /2 δεν επηρεάσθηκαν από αγωγή με EGF (Σχ. 5D, κάτω πλαίσιο).

ΗΤ-29 κύτταρα προκατεργάστηκαν για 30 λεπτά με 10 μΜ LY 294002 (Α) ή διαμολύνθηκαν παροδικά με 0,5 μα pcDNA ή 0,5 μg δεσπόζουσας αρνητική μεταλλαγμένη του Akt (Akt DN) (Β) για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια διεγέρθηκαν με EGF (10 ng /ml) για άλλες 18 ώρες. Μετά την επώαση, ΗΟ-1 και α-τουμπουλίνης επίπεδα πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων, τα οποία παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SEM.

* ρ

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τη θεραπεία του ΕΤΠ. C, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά είτε με 0,5 μg του pcDNA ή 0,5 μg του Akt DN για 24 ώρες. Επίπεδα Akt ή α-τουμπουλίνης εκφράσεις πρωτεΐνης προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Ίχνη αντιπροσωπεύουν αποτελέσματα από τρία ανεξάρτητα πειράματα. D, ΗΤ-29 κύτταρα επωάστηκαν με 10 ng /ml EGF επί 0~60 λεπτά. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν και φωσφορυλίωση της Akt Ser473 προσδιορίστηκε με ανοσοστύπωμα χρησιμοποιώντας το αντίσωμα φωσφο-Ακί Ser473. Ανοσοστυπώματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

c-Src, της οξειδάσης του NADPH, και ΡΙ3Κ μεσολαβούν EGF επαγόμενη Akt φωσφορυλίωση στη Ser473 σε κύτταρα ΗΤ-29

Στη συνέχεια, ερεύνησε τους ρόλους του c-Src, της οξειδάσης του ΝΑϋΡΗ, και ΡΙ3Κ σε EGF-επαγόμενη Akt Ser473 φωσφορυλίωση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6, η επιμόλυνση των κυττάρων ΗΤ-29 με ένα c-Src DN (0,5 μg) εξασθενημένου EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση Akt Ser473 (Σχ. 6Α). Εξετάσαμε περαιτέρω εάν NADPH οξειδάσης και της PI3K μεσολαβήσει Akt φωσφορυλίωση. Βρήκαμε ότι ο EGF-επαγόμενη φωσφορυλίωση της Akt Ser473 επίσης αναστέλλεται από DPI (10 μΜ) (Σχ. 6Β). Παρομοίως, προκαλούμενη από EGF Ακί Ser473 phosphohrylation ανεστάλη επίσης με LY294002 (10 μΜ) (Σχ. 6C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση της c-Src, της οξειδάσης του NADPH, και ΡΙ3Κ λαμβάνει χώρα ανάντη της Akt στην οδό σηματοδότησης EGF-επαγόμενη.

ΗΤ-29 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με 0,5 μg του pcDNA ή 0.5 μg από ένα Όπως φαίνεται στο Σχ.