Αφηρημένο

Έκφραση Η caveolin-1 (Cav1), ένα βασικό συστατικό της κυτταρικής επιφάνειας μικροσπηλαίων, είναι αυξημένα σε προστάτη καρκίνο (PCA) και σχετίζεται με προστάτη μετάσταση και φτωχή πρόγνωση για τους ασθενείς του προστάτη. Πολυμεράση Ι και μεταγραφής συντελεστή έκλυσης (PTRF) /Cavin-1 είναι μία κυτταροπλασματική πρωτεΐνη που απαιτείται για την εξαρτώμενη από Cav1 σχηματισμό μικροσπηλαίων. Έκφραση των PTRF μειώνει την κινητικότητα των κυττάρων PC3, μια μεταστατική κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη που εκφράζει ενδογενώς άφθονο Cav1 αλλά όχι PTRF και όχι μικροσπηλαίων, υποδηλώνοντας ένα ρόλο για μη caveolar domains Cav1, ή ικριώματα Cav1, σε κυτταρική μετανάστευση PCa. Φωσφορυλιωμένη τυροσίνη Cav1 (pCav1) λειτουργεί σε συνεννόηση με γκαλεκτίνη-3 (Gal3) και το πλέγμα γκαλεκτίνη να σταθεροποιηθεί κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) μέσα σε εστιακό συμφύσεις (FAS) και την προώθηση της κινητικότητας των κυττάρων του καρκίνου. Ωστόσο, αν ο κανονισμός PTRF της λειτουργίας Cav1 στη μετανάστευση των κυττάρων του προστάτη σχετίζεται με την έκφραση Gal3 και τη λειτουργικότητα έχει ακόμη προσδιοριστεί. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η έκφραση PTRF στα κύτταρα PC3 μειώνει ΡΑΚ σταθεροποίηση των συμφύσεων και μειώνει την κινητικότητα των κυττάρων χωρίς να επηρεάζει τα επίπεδα pCav1. Εξωγενείς Gal3 σταθεροποιημένο FAK σε εστιακές συμφύσεις των PTRF κύτταρα που εκφράζουν και να αποκατασταθεί κυτταρική κινητικότητα του PTRF κυττάρων που εκφράζουν PC3 σε επίπεδα των κυττάρων PC3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, με μια βέλτιστη συγκέντρωση 2 μg /ml. Εξωγενείς Gal3 σταθεροποιηθεί FAK σε εστιακό συμφύσεις της Gal3 κυττάρων νοκ ντάουν PC3 αλλά όχι σε Cav1 κύτταρα νοκ ντάουν PC3. Cav1 νοκ ντάουν εμπόδισε επίσης Gal3 διάσωσης της FA που σχετίζεται με τη σταθεροποίηση της FAK στα κύτταρα PC3 PTRF εκφράζουν. Τα δεδομένα μας υποστηρίζουν ένα ρόλο για PTRF /Cavin-1, μέσω του σχηματισμού μικροσπηλαίων, ως εξασθενητή του μη-caveolar λειτουργικότητα της Cav1 σε Gal3-Cav1 σηματοδότηση και τη ρύθμιση της εστιακής δυναμική προσκόλληση και μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

Παράθεση : Meng F, Joshi Β, Nabi IR (2015) γκαλεκτίνη-3 Υπερβάσεις PTRF /Cavin-1 Μείωση των PC3 καρκίνου του προστάτη κυτταρική μετανάστευση. PLoS ONE 10 (5): e0126056. doi: 10.1371 /journal.pone.0126056

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Christophe Lamaze, Institut Curie, ΓΑΛΛΙΑ

Ελήφθη: 28 του Νοέμβρη 2014? Αποδεκτές: 28 Μάρτη του 2015? Δημοσιεύθηκε: 5 Μάη 2015

Copyright: © 2015 Meng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τον καρκίνο του προστάτη Καναδά, καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (MOP-126029), την Κίνα υποτροφιών του Συμβουλίου-UBC διδακτορική υποτροφία. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα ανταγωνιστικά συμφέροντα: Συν-συγγραφέας Ιβάν Nabi είναι μέλος PLoS ONE Συντακτική Επιτροπή. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE Editorial πολιτικές και κριτήρια.

Εισαγωγή

Η caveolin-1 (Cav1), ένα μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών caveolin, αποτελεί βασικό συστατικό της μικροσπηλαίων , η φιάλη σχήματος εγκολπώσεις στην κυτταρική επιφάνεια εμπλέκονται σε πολλές κυτταρικές διεργασίες, όπως φυσαλιδώδης μεταφορές, ενδοκυτταρική σηματοδότηση και μηχανική μεταγωγή [1]. Cav1 εμπλέκεται στη ρύθμιση των λιπιδικών σχεδιών και των πολλαπλών διεργασιών σχετίζονται με τον καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων κυτταρικό θάνατο και την επιβίωση, κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, και ανάπτυξη όγκου και μετάσταση [1-4]. Cav1 έκφραση είναι αυξημένη σε κύτταρα μεταστατικό καρκίνο του προστάτη (PCA) και Cav1 έχει αξιολογηθεί ως προγνωστικός δείκτης της επιθετικής προστάτη [5-7]. Cav1 έχει επίσης βρεθεί σχετίζονται με προστάτη μετάστασης σε ποντικού και ανθρώπου κυτταρικές γραμμές PCa [5, 8]. PC3 είναι μια μεταστατική κυτταρική γραμμή καρκίνου του προστάτη που εκφράζει άφθονο επίπεδα φωσφορυλιωμένου σε τυροσίνη Cav1 (pCav1) αλλά στερείται της κυτταρικής επιφάνειας μικροσπηλαίων λόγω της απουσίας του πολυμεράσης 1 και παράγοντας απελευθέρωσης μεταγραφής (PTRF) /Cavin-1, απαιτείται μαζί με Cav1 για το σχηματισμό μικροσπηλαίων [7, 9-11]. Η υπερέκφραση του PTRF στα κύτταρα PC3 μειώνει την κυτταρική κινητικότητα μέσω της μήτρας μειωμένου μεταλλοπρωτεάση 9 (ΜΜΡ9) παραγωγής [12]. Περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι PTRF /Cavin-1 έκφραση μεταβάλλει το κύτταρο PC3 secretome επηρεάζοντας δυναμική της χοληστερόλης και τον κυτταρικό σκελετό ακτίνης, και εξασθενεί την προώθηση της εξέλιξης προστάτη από μη caveolar Cav1 μικροπεριοχή [13, 14].

Κυττάρων μετανάστευση, ένα κρίσιμο στοιχείο της μεταστατικής νόσου, είναι μια δυναμική και πολυσταδιακή διαδικασία ρυθμίζεται μέσω χωροχρονικών ανάδρασης μεταξύ συρρίκνωση ακτινομυοσίνης, τον πολυμερισμό της ακτίνης, και τη συνεχή αποσυναρμολόγηση και σχηματισμό συμφύσεων [15-17]. Συμφύσεων (FAS) είναι μακρομοριακές συγκροτήματα που συνδέουν την εξωκυττάρια μήτρα και τον κυτταρικό σκελετό και μεταδίδουν μηχανική δύναμη και ρυθμιστικά σήματα [18, 19]. Κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) είναι η κύρια κινάση που εμπλέκονται στην FA σηματοδότηση και ρυθμίζει την εστιακή δυναμική πρόσφυση μέσω του πεδίου κινάσης (frnk) και τυροσίνη 397 (Y397) αυτοφωσφορυλίωση. Μειωμένη FAK Y397 φωσφορυλίωση σχετίζεται με αυξημένη ανταλλαγή ΡΑΚ μεταξύ ΕΧΟ και κυτταρόπλασμα, πιο αργή αποσυναρμολόγηση FA και μειωμένη κυτταρική μετανάστευση [20, 21]. pCav1 αυξάνει μεμβράνη προκειμένου λιπίδιο σε ΕΧΟ και προάγει ΡΑΚ σταθεροποίηση εντός ΕΧΟ σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής γραμμής PC3 προστάτη, μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει ενδογενή PTRF και έτσι δεν μικροσπηλαίων, υποδηλώνουν έναν ρόλο για τους μη caveolar ικριώματα Cav1 [4 , 11, 22]. Cav1 είναι ένα σημαντικό υπόστρωμα της Src κινάσης και φωσφορυλιώνεται σε τυροσίνη 14 (Y14) [23-26]. Στο ανθρώπινο μητρικό, κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου και του προστάτη, Src-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του Cav1 προωθεί τη σταθεροποίηση της FAK στα εστιακές συμφύσεις, εστιακή κύκλος εργασιών πρόσφυση, RhoA σηματοδότησης και μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή [11]. Γαλεκτίνη-3 (Gal3), μια γαλακτόζη-ειδική οικογένεια λεκτίνη που δεσμεύεται επιλεκτικά κυτταρικής επιφάνειας ΟΙοΝΑο-τρανσφεράση V (Mgat5)-τροποποιημένα Ν-γλυκάνες, διεγείρει την ενεργοποίηση FAK και ΡΙ3Κ, ενισχύει την ενεργοποίηση ιντεγρίνης και στρατολόγηση τις ινιδικές συμφύσεις, και αυξάνει F- ακτίνης κύκλος εργασιών [27-30]. Έχουμε δείξει ότι pCav1 και Gal3 πράξη μαζί για τη σταθεροποίηση της FAK κατά ΕΧΟ και την προώθηση της δυναμικής FA και της μετανάστευσης των κυττάρων και ότι συντονίζει έκφραση Cav1 και Gal3 διακρίνει διαφοροποιημένο καρκίνο του θυρεοειδούς από καλοήθεις [4, 31].

Ωστόσο, έχει ακόμα να καθοριστεί εάν και πώς η έκφραση των PTRF και, ως εκ τούτου, μικροσπηλαίων, επιπτώσεις η συντονισμένη ρύθμιση Cav1-Gal3 της δυναμικής FA και της μετανάστευσης των κυττάρων. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται κύτταρα PC3 προστάτη που στερούνται PTRF και μικροσπηλαίων αλλά εκφράζουν Cav1 και pCav1, για να καθοριστεί συγκεκριμένα το ρόλο των PTRF στη ρύθμιση Cav1-Gal3 της δυναμικής FA και η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

Αποτελέσματα

έκφραση των PTRF /Cavin-1 μειώνει τη μετανάστευση PC3 κυττάρων και διαταράσσουν ΡΑΚ σταθεροποίηση σε εστιακό συμφύσεις

καρκινικά κύτταρα προστάτη PC3 που εκφράζουν σταθερά PTRF-GFP (PC3-GFP-PTRF) δείχνουν μειωμένη κινητικότητα των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3 σταθερή εκφράζουν GFP (PC3-GFP) ή μη-επιμολυσμένα κύτταρα PC3 (Εικόνα 1Α), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [12]. Η μειωμένη μετανάστευση των κυττάρων PC3-PTRF-GFP δεν συνδέθηκε με μια αλλαγμένη αριθμό εστιακών συμφύσεων επισημασμένου για FAK (Σχήμα 1Β). Για τον προσδιορισμό της σταθερότητας της FAK στα ΕΧΟ, PC3 κύτταρα επιμολυσμένα μόνο με ΡΑΚ-GFP, ΡΑΚ-GFP συν mCherry ή ΡΑΚ-GFP συν PTRF-mCherry και υποβάλλεται σε ανάκτηση φθορισμού μετά φωτολεύκανση (FRAP) δοκιμασία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, η έκφραση του PTRF-mCherry αύξησε το κινητό κλάσμα FAK-GFP σε ΕΧΟ σε σχέση με κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν μόνο με FAK-GFP ή ΡΑΚ-GFP με mCherry. Ένα αυξημένο κλάσμα κινητά, αυξημένη ανάκτηση φθορισμού του ΡΑΚ-GFP σε σχέση με την ένταση φθορισμού προ-χλωρίνη, αντανακλά υψηλότερο ανταλλαγή ΡΑΚ-GFP μεταξύ της εστιακής προσκόλλησης και κυτταρόπλασμα, ως εκ τούτου λιγότερο σταθεροποίηση του ΡΑΚ-GFP μέσα FA. Ως εκ τούτου, η έκφραση PTRF μειωθεί σταθεροποίηση της FAK στα ΕΧΟ, ενδεικτικό της αυξημένης ανταλλαγής με κυτταροπλασματική FAK και μειωμένη FA αποσυναρμολόγηση [20, 21].

(Α) δοκιμασία μετανάστευσης Transwell δείχνει ότι τα κύτταρα PC3-GFP-PTRF μεταναστεύουν πιο αργή από ό, τι τα άγρια -τύπου PC3 και PC3-GFP κύτταρα. (Β) Αντιπροσωπευτική ομοεστιακή εικόνες των PC3, PC3-GFP και PC3-GFP-PTRF κύτταρα και ποσοτικός προσδιορισμός των ΕΧΟ ανά κύτταρο σε κάθε μία από τις κυτταρικές σειρές δείχνουν ότι ο αριθμός των ΕΧΟ ανά κύτταρο δεν επηρεάζεται σημαντικά από την έκφραση PTRF στο κύτταρο. (C) φθορισμού ανάκαμψη μετά φωτολεύκανσις (FRAP) ο προσδιορισμός δείχνει ότι η FAK-GFP επίπεδο ανάκτησης ένταση αυξάνεται με PTRF-mCherry συν-επιμόλυνση σε σύγκριση μόνο με ΡΑΚ-GFP ή ΡΑΚ-GFP και mCherry συν-επιμόλυνση. Η FAK-GFP ανάκτηση ένταση καμπύλη γραφική παράσταση ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος και ραβδόγραμμα του κινητού κλάσματος FAK-GFP (που υπολογίζεται με βάση το οροπέδιο ανάκτηση φθορισμός) συνοψίζονται από όλα τα πειράματα φαίνονται. (N≥3? ***: P & lt? 0.001? **: P & lt? 0,01? *: P & lt? 0.05.)

Η

έκφραση PTRF δεν επηρεάζει PCAV1 επίπεδα, αλλά επιπλέον restrores θεραπεία Gal3 ΡΑΚ σταθεροποίησης στο FA και την κυτταρική κινητικότητα των PTRF εκφράζουν PC3 κύτταρα

η τυροσίνη-φωσφορυλιωμένη Cav1 (pCav1) ρυθμίζει τη μετανάστευση των πολλαπλών καρκινικές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένων PC3 [4, 11]. Σταθερή έκφραση σε κύτταρα PTRF PC3, ωστόσο, δεν μετέβαλλε τα επίπεδα έκφρασης Cav1 ή φωσφορυλίωση (Σχήμα 2). Όπως Gal3 έχει δειχθεί να λειτουργεί μαζί με τη ρύθμιση pCav1 FAK σταθερότητα σε ΕΧΟ [4, 31], ελέγξαμε κατά πόσο εξωγενές Gal3 θα μπορούσε να αποκαταστήσει FAK σταθεροποίηση σε ΕΧΟ σε κύτταρα PC3-PTRF-GFP. Η προσθήκη His-tagged Gal3 (Gal3-His) σε συγκεντρώσεις από 1-4 μg /ml δεν επηρέασαν FAK σταθεροποίηση εντός ΕΧΟ σε κύτταρα PC3. Ωστόσο, σε PTRF κύτταρα που εκφράζουν PC3, η προσθήκη 1,5 ή 2 μg /mlGal3-His αποκατέστησε σημαντικά την σταθεροποίηση της FAK σε ΕΧΟ, με 2 μg /ml του Gal3-His σταθεροποιητικό FAK σε ΕΧΟ πιο σημαντικά (ρ & lt? 0.001)? προσθήκη συγκεντρώσεις υψηλότερες (3 ή 4 μg /ml) ή κατώτερο (1 μg /ml) Gal3-His απέτυχε να αποκαταστήσει την FA συνδέεται σταθεροποίηση FAK (Σχήμα 3Α). Η δόση-εξάρτηση της Gal-His σταθεροποίηση των FAK σε ΕΧΟ είναι συνεπής με την έννοια του πλέγματος γαλεκτίνη, στην οποία μια κρίσιμη αναλογία Gal3 να γλυκάνης υποστρώματα επιτρέπει τη βέλτιστη γλυκοπρωτεΐνη σταυροειδών δεσμών που οδηγεί σε δυναμική υποδοχέα και τη σηματοδότηση [32, 33] . Μια δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων Transwell έδειξαν ότι η βέλτιστη 2 μg /ml Gal3-His ενισχυμένη η μετανάστευση και των τριών κυτταρικών σειρών (PC3, PC3-GFP και PC3-GFP-PTRF) στο μεγαλύτερο βαθμό και στο ίδιο επίπεδο (Σχ 3Β) . 1, 1,5 και 3 μg /ml του Gal3-His δεν είχε καμία επίδραση στην κυτταρική μετανάστευση του PC3 ελέγχου και PC3-GFP κύτταρα, αλλά αυξημένη κυτταρική μετανάστευση PC3-GFP-PTRF με το επίπεδο του μη επεξεργασμένου PC3 και PC3-GFP κύτταρα (Σχ 3Β). 4 μg /ml Gal3 δεν επηρέασαν σημαντικά την κυτταρική μετανάστευση κάποιας από τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Β). Ως εκ τούτου, η προσθήκη εξωγενούς πρωτεΐνης Gal3 αποκαθιστά την ανεπάρκεια σταθεροποίηση FAK σε FAS και η μειωμένη μετανάστευση του PTRF κυττάρων που εκφράζουν PC3 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο.

κηλίδος Western δείχνει τα επίπεδα έκφρασης της GFP, GFP-PTRF, Cav1 και pCav1 σε κύτταρα άγριου τύπου PC3 (PC3), κύτταρα PC3 σταθερά επιμολυσμένα με GFP (PC3-GFP) και τα κύτταρα PC3 σταθερά επιμολυσμένα με GFP-PTRF (PC3-GFP-PTRF). Western ένταση μπάντα στυπώματος Cav1 και pCav1 ποσοτικοποιείται και εξομαλύνθηκαν με εκείνη της β-ακτίνης και δεν δείχνει σημαντική διαφορά της έκφρασης Cav1 ή φωσφορυλίωση μεταξύ PC3, PC3-GFP και τα κύτταρα PC3-GFP-PTRF. (N≥3? ***: Ρ. & Lt? 0.001)

Η

(Α) ανάλυση FRAP των ΡΑΚ-GFP δείχνει το FA-σχετίζεται σταθερότητα FAK στα κύτταρα PC3 επιμολυσμένα μόνο με ΡΑΚ-GFP ή ΡΑΚ -ΟΡΡ συν PTRF-mCherry και υποβλήθηκε σε Gal3-His θεραπεία στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (1, 1,5, 2, 3, ή 4 μg /ml). Μειωμένη σταθεροποίηση FAK σε ΕΧΟ των κυττάρων PC3 PTRF εκφράζουν αποκαθίσταται με Gal3-His σε μια δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Ένα γράφημα ράβδων της FAK-GFP κινητό κλάσμα συνοψίζονται από όλα τα πειράματα και ένας εκπρόσωπος ΡΑΚ-GFP καμπύλη ανάκτησης γράφημα από ένα πείραμα (που δείχνει NT και 2 μg /ml Gal3-His θεραπεία μόνο) παρουσιάζονται. (Β) Ποσοτικοποίηση των PC3, PC3-GFP και τη μετανάστευση των κυττάρων PC3-GFP-PTRF χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία transwell χωρίς θεραπεία ή έλαβαν θεραπεία με Gal3-His (1, 1,5, 2, 3 ή 4 μg /ml) δείχνει ότι 2 μg /ml Gal3-His θεραπεία αυξάνει την κυτταρική μετανάστευση του όλες τις κυτταρικές σειρές σε παρόμοιο βαθμό. Άλλες συγκεντρώσεις Gal3 αύξηση μετανάστευσης των κυττάρων PC3-GFP-PTRF σε μικρότερο βαθμό, αλλά δεν επηρεάζουν τη μετανάστευση των PC3 ή PC3-GFP κύτταρα. (ΝΤ: μη επεξεργασμένα? N≥3? *: P & lt? 0,05? **: P & lt? 0,01? ***: P & lt? 0.001? Ns: δεν είναι σημαντική.)

Η

Gal3 διάσωση FA-συνδέονται σταθεροποίηση FAK είναι CAV1 εξαρτώμενη

Για να καθοριστεί εάν τα ενδογενή Gal3 σταθεροποιεί FAK σε ΕΧΟ των κυττάρων PC3, έχουμε εξαντληθεί Gal3 με siRNA απόκτηση συνεπή μείωση κατά 90% στα επίπεδα Gal3 μετά από 48 ώρες (Εικόνα 4Α). Μετά από 24 ώρες επιμολύναμε τα κύτταρα με μόνη FAK-GFP ή ΡΑΚ-GFP μαζί με PTRF-mCherry, και τους ή όχι σε κατεργασία με 2 μg /ml Gal3-His πριν FRAP ανάλυση του ΡΑΚ-GFP σταθερότητα στην FAS. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Β, knockdown του Gal3 (Gal3 KD) μείωσε FAK σταθεροποίηση σε ΕΧΟ, σε παρόμοια έκταση όπως παρατηρήθηκε για PTRF κύτταρα που εκφράζουν PC3, ενώ siCTL είχε καμία επίδραση στην FAK σταθεροποίηση σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα κύτταρα. Σημαντικά, η θεραπεία με Gal3-His διασώζονται σταθεροποίηση FAK σε ΕΧΟ τόσο PTRF εκφράζουν και Gal3 κύτταρα knockdown (Σχήμα 4Β).

(Α) Western στύπωμα δείχνει την αποτελεσματικότητα της Gal3 siRNA knockdown. (Β) Δοκιμασία FRAP δείχνει FA-σχετίζεται ΡΑΚ-GFP σταθερότητα σε κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν χωρίς siRNA, siRNA ελέγχου σκαρφάλωμα (siCTL) ή το siRNA κατά της ανθρώπινης Gal3 (siGal3), και υποβλήθηκε σε 2 μg ml Gal3-His θεραπεία /. Οι ΡΑΚ-GFP γραφήματα καμπύλη ανάκτηση ένταση ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος και ραβδόγραμμα της FAK-GFP κινητό κλάσμα συνοψίζονται από όλα τα πειράματα φαίνονται. (N = 3? ***: Ρ. & Lt? 0.001)

Η

Στη συνέχεια, γκρέμισε Cav1 στα κύτταρα PC3 με siRNA (siCav1) (Σχήμα 5Α) πριν από την επιμόλυνση με μόνη ή ΡΑΚ είτε ΡΑΚ-GFP -ΟΡΡ συν PTRF-mCherry και θεραπεία με εξωγενή Gal3-His (2 μg /ml). siCav1 αύξησε το κινητό κλάσμα FAK-GFP σε ΕΧΟ σε PC3 αλλά όχι σε PTRF κύτταρα που εκφράζουν PC3, αποδεικνύοντας ότι Cav1 ρυθμίζει επιλεκτικά δυναμική FA σε κύτταρα PC3 που στερούνται PTRF (Σχήμα 5Β). Gal3-του δεν ήταν σε θέση να προωθήσει ΡΑΚ σταθεροποίηση σε ΕΧΟ των PC3 ή PC3-PTRF κύτταρα στα οποία Cav1 χτυπήθηκε κάτω (Σχήμα 5Β). Cav1 εκ τούτου, είναι αναγκαία για την Gal3 εξαρτώμενη από τη σταθεροποίηση της FAK στα ΕΧΟ των κυττάρων PC3. Συντονισμένη ρύθμιση της FA δυναμική από Cav1 και Gal3 ως εκ τούτου επηρεάζεται από την έκφραση της PTRF και Cav1 στρατολόγησης μικροσπηλαίων. Αυτό υποδηλώνει ότι η πρόσληψη του Cav1 να μικροσπηλαίων μπορεί να μεταβάλει τη σχέση μεταξύ των μη-caveolar Cav1 και Gal3 που είναι κρίσιμη για συντονισμένη ρύθμισή τους δυναμική FA και η μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

(Α) κηλίδας Western δείχνει την αποτελεσματικότητα της Cav1 siRNA νοκ ντάουν. (Β) ποσοτικός προσδιορισμός FRAP του ΡΑΚ-GFP δείχνει FA-σχετίζεται σταθερότητα FAK κυττάρων PC3 διαμολύνθηκαν χωρίς siRNA, έλεγχος σκαρφάλωμα siRNA (siCTL) ή το siRNA κατά της ανθρώπινης Cav1 (siCav1), και υποβλήθηκε σε 2 μg /ml Gal3-His θεραπεία . Οι ΡΑΚ-GFP γραφήματα καμπύλη ανάκτηση ένταση ενός αντιπροσωπευτικού πειράματος και ραβδόγραμμα της FAK-GFP κινητό κλάσμα συνοψίζονται από όλα τα πειράματα φαίνονται. (N = 3? ***: P & lt? 0.001)

Η

Συζήτηση

Η Cavin οικογένεια περιλαμβάνει PTRF /Cavin-1, SDPR /Cavin-2, PRKCDBP /cavin-. 3 και MURC /Cavin-4, τα οποία μοιράζονται ένα διατηρημένο Ν-τερματικό πεδίο που αποτελείται από επαναλήψεις επτάδας υδρόφοβων αμινοξέων, πιθανώς σχηματίζοντας περιτυλιγμένα πηνία, και μια ακόλουθη περιοχή αρκετών βασικών αμινοξέων [34]. Η έκφραση των Cavins σχετίζεται με την έκφραση και την σταθεροποίηση του Cav1 και το σχηματισμό και τη λειτουργία των μικροσπηλαίων [34]. Από τις Cavins, PTRF /Cavin-1 είναι απαραίτητη για το σχηματισμό μικροσπηλαίων και την απώλεια των αποτελεσμάτων PTRF σε απώλεια μικροσπηλαίων και αρνητική ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης Cav1 [9, 35]. Cav1 έχει αποδοθεί μη caveolar λειτουργίες [36-38] και στοιχειομετρία μεταξύ caveolins και Cavins πρέπει να επηρεάζει αναγκαστικά την έκφραση όχι μόνο μικροσπηλαίων αλλά και μη caveolar τομείς Cav1 ή ικριώματα Cav1. κύτταρα PC3 είναι μια εξαιρετική κυτταρικό μοντέλο για τη μελέτη μη caveolar λειτουργίες Cav1 καθώς δεν έχουν PTRF και μικροσπηλαίων αλλά εμφανίζουν αυξημένα επίπεδα Cav1 [7]. Πράγματι, η έκφραση των PTRF σε κύτταρα PC3 εξουδετερώνει τις μη caveolar μικροεπικράτειες Cav1 και μεταβάλλει την κινητικότητα των κυττάρων, μονοπάτια έκκριση και την αγγειογένεση και λεμφαγγειογένεση ικανότητες σε κύτταρα PC3 [12-14, 39, 40]. Σταθερά, δείχνουμε εδώ ότι η έκφραση PTRF στα κύτταρα PC3 όρια ρύθμισης Cav1-Gal3 της FAK σταθεροποίησης στην ΕΧΟ και κυτταρική κινητικότητα.

Gal3 και pCav1 λειτουργία στη συναυλία για την προώθηση της δυναμικής FA και την κυτταρική κινητικότητα. pCav1 προωθεί την κυτταρική πόλωση και τη μετανάστευση και ρυθμίζει την μεμβράνη προκειμένου λιπιδίων σε ΕΧΟ [4, 22, 26]. Gal3 πρόσδεση σε κυτταρική επιφάνεια Mgat5 τροποποιημένων Ν-γλυκανών σχηματίζει ένα πλέγμα γαλεκτίνη που διεγείρει την ενεργοποίηση FAK και ΡΙ3Κ, και προωθεί την ενεργοποίηση ιντεγκρίνης και F-ακτίνης κύκλου εργασιών [27-30]. Gal3 επάγει την ενεργοποίηση ιντεγρίνης α5β1 και FAK (p397FAK) φωσφορυλίωση, που σχετίζεται με τη σταθεροποίηση της FAK στα ΕΧΟ, αυξημένη FA σηματοδότησης και αποσυναρμολόγηση, και ως εκ τούτου η κυτταρική μετανάστευση [20, 21, 28]. Επιπλέον, σε κύτταρα που στερούνται το πλέγμα γαλεκτίνη λόγω της απουσίας Mgat5, pCav1 δεν επαρκεί για να προωθήσει FA-σχετίζεται σταθεροποίηση FAK? έκφραση Mgat5 και η γκαλεκτίνη πλέγμα αυξάνει την εξάπλωση των κυττάρων και προκαλεί ΕΧΟ αλλά απαιτεί pCav1 για τη σταθεροποίηση της FAK κατά ΕΧΟ [4]. Σταθερά, συντονισμένη έκφραση Cav1 και Gal3 παρατηρείται σε διαφοροποιημένο καρκίνο κυτταρικές γραμμές που παράγονται θυρεοειδούς και προσδιορισμοί knockdown siRNA στις ίδιες κυτταρικές σειρές δείχνουν ότι και οι δύο Cav1 και Gal3 οφείλουν να προωθήσουν σταθεροποίηση FAK σε ΕΧΟ και μετανάστευσης κυττάρων σε σύγκριση με καλοήθη θυρεοειδούς αλλοιωμένο κύτταρα προερχόμενα [31]. Πιο πρόσφατα στοιχεία που δείχνουν ότι Gal3 απαιτείται για τον επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF) σηματοδότηση που επάγει φωσφορυλίωση Cav1 και προωθεί κυκλική ραχιαία σούφρα (CDR) σχηματισμός, η μετανάστευση των κυττάρων και φιμπρονεκτίνης ινιδιογένεση? Οι μελέτες αυτές οδήγησαν στην πρόταση μιας μονάδας σηματοδότησης Gal3-ιντεγκρίνης-pCav1 που μεσολαβεί ΕΤΠ σηματοδότησης σε Rho Α [41]. Αυτό υποδηλώνει ότι έξω στο σηματοδότησης ιντεγκρίνης μεσολαβεί συντονισμένη ρύθμιση Gal3-pCav1 της δυναμικής FA, όπου εξωκυττάρια Gal3 αλληλεπιδρά με και ενεργοποιεί ιντεγκρίνες η οποία στη συνέχεια προσλαμβάνει pCav1 οδηγεί σε κατάντη RhoA σηματοδότησης και τη μετανάστευση των κυττάρων.

Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι PTRF έκφρασης σε κύτταρα PC3 δεν μεταβάλλει Cav1 ή τα επίπεδα pCav1, γεγονός που υποδηλώνει ότι PTRF ρυθμίζει τη λειτουργία pCav1 στη δυναμική FA μέσω προσλήψεων Cav1 να μικροσπηλαίων, μειώνοντας τη διαθεσιμότητα των λειτουργικών pCav1 σε μη caveolar τομείς ικρίωμα. Σχηματισμός μικροσπηλαίων μπορούν να ρυθμίζουν την έκφραση και τη λειτουργία των μη caveolar ικριώματα Cav1 με την πρόσληψη pCav1 να μικροσπηλαίων. φωσφορυλίωση Cav1 Υ14 είναι περιττή για τον σχηματισμό μικροσπηλαίων αλλά pCav1 έχει εντοπιστεί στο ΜΙΚΡΟΣΠΗΛΑΙΑ [42, 43]. Πράγματι, έχει αποδειχθεί ότι η προτιμησιακή έκφραση Cav1 σε μη caveolar τομείς Cav1 λόγω της απουσίας PTRF συνδέεται με την προηγμένη προστάτη και ότι η έκφραση PTRF /μικροσπηλαίων εξουδετερώνει τις μη caveolar τομείς Cav1 να επιβραδύνει προστάτη εξέλιξη [14] . Το γεγονός ότι η υπερβολική Gal3 μπορεί να αποκαταστήσει pCav1 εξαρτώμενη FA σηματοδότησης δείχνει ότι η συντονισμένη αλληλεπίδραση μεταξύ Gal3 και pCav1 είναι ζωτικής σημασίας για την ικανότητά τους να ρυθμίζουν FA σηματοδότησης και δυναμική. Από ένα εύρος συγκεντρώσεων από 1-4 μg /ml, 2 μg /ml ήταν η βέλτιστη για τη διάσωση PTRF-εκφράζοντα κύτταρα, τονίζοντας την εξάρτηση από την συγκέντρωση της λειτουργίας πλέγματος Gal3. Ομοίως, Gal3 διέγερση ιντεγκρίνης που εξαρτάται από φιμπρονεκτίνη ινιδιογένεσης είναι εξαρτώμενη από τη συγκέντρωση [28]. Οι ιντεγκρίνες τροποποιούνται από Mgat5 και Gal3 ενεργοποιεί α5β1 ιντεγκρίνη και στρατολογεί το τις ινιδικές συμφύσεις [28, 44]. pCav1 έχει αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρά με ιντεγκρίνες και ρυθμίζουν προκειμένου λιπιδίων σε ΕΧΟ [22, 45-47]. Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι η σχετική συγκέντρωση του Gal3 να μη caveolar pCav1 είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστή του Gal3-pCav1 σηματοδότηση και ότι PTRF είναι ένας νέος ρυθμιστής αυτής της ενότητας σηματοδότησης. PTRF έχει αποδειχθεί για να αλλάξει exosomal έκκριση των κυττάρων PC3 [13] και κατά πόσον PTRF διαταράσσει τη μονάδα Gal3-pCav1 περιορίζοντας την έκκριση Gal3, ή απομόνωσης pCav1 σε μικροσπηλαίων και μακριά από μη caveolar ικριώματα Cav1, ή ακόμα και με την άμεση αλληλεπίδραση με μη -caveolar ικριώματα Cav1, μένει να καθοριστεί (Σχήμα 6).

Εξωκυττάρια Gal3 και μη caveolar pCav1 κάθε σταθεροποιεί ΡΑΚ μέσα ΕΧΟ εξαρτώνται από κάθε άλλη. Έκφραση των PTRF διαταράσσει τη λειτουργία αυτή μέσα από τρεις πιθανούς τρόπους: 1) με την πρόσληψη pCav1 μακριά από μη caveolar ικριώματα Cav1 και σε μικροσπηλαίων? 2) με άμεση αλληλεπίδραση με μη caveolar pCav1? 3) επηρεάζοντας Gal3 έκκριση και έτσι εξωκυττάρια συγκέντρωση Gal3. Μέσω του οποίου μονοπάτι PTRF επηρεάζει τη λειτουργία Gal3-pCav1 στο FA δυναμική απομένει να μελετηθεί.

Η

Τόσο Cav1 και Gal3 παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του προστάτη. Gal3 έχει αναγνωριστεί ως σημαντικός ρυθμιστής της προστάτη μετάσταση [48-50] και πολλές προσπάθειες έχουν γίνει για να στοχεύσετε Gal3 στη ΣΕΣ, χρησιμοποιώντας είτε το Gal3 δέσμευσης του καρκίνου που σχετίζονται Thomsen-Friedenreich glycoantigen (TF-Ag) -mimic λακτόζη L-λευκίνη ή ένα υψηλής συγγένειας Gal3-bingding γλυκοπεπτιδίου καθαρίζεται από γάδου [51, 52]. Cav1 έχει αξιολογηθεί ως προγνωστικός δείκτης της επιθετικής προστάτη από το 1990 [5, 6].

Πιο πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι PTRF εξουδετερώνει Cav1 δράση που εμπλέκουν έναν κρίσιμο ρόλο για τη μη caveolar τομείς σε προστάτη [14]. επίδειξη μας που Gal3 μπορεί να αντιστρέψει τη μειωμένη σταθεροποίηση της FAK στα ΕΧΟ και κυτταρική κινητικότητα που προκαλείται από PTRF προσδιορίζει Gal3 και pCav1 ως κρίσιμη ρυθμιστές της λειτουργίας των μη caveolar τομείς της μετανάστευσης των κυττάρων του προστάτη. Συντονίζει τη δράση των Cav1 και Gal3 μπορεί, επομένως, να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην προστάτη μετάσταση και αντιπροσωπεύουν ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο για την PCA.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα αντισώματα, τα πλασμίδια, siRNA μια ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Gal3-His

λευκωματίνη ορού βοοειδούς (BSA), και αντισώματα ποντικού αντι-β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich. Rabbit anti-FAK αγοράστηκε από Santa Cruz Biotechnology, Inc., κουνέλι αντι-pY14Cav1 από κυτταρική σηματοδότηση, Inc., και ποντικού αντι-PTRF και αντι-Cav αντισώματα κουνελιού από την BD Transduction Laboratories. δευτερογενή αντισώματα συζευγμένο με HRP ποντικού και κουνελιού αγοράστηκαν από Jackson ImmunoResearch Laboratories. Φαλλοειδίνη και δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα σε Alexa 488, 568, ή 647 αγοράστηκαν από την Life Technologies, Thermo Fisher Scientific. PTRF-mCherry και mCherry πλασμίδια ήταν πλούσια δώρα από τον Dr. Michelle λόφο (The University of Queensland Diamantina Ινστιτούτο, το Πανεπιστήμιο του Queensland, Translational Research Institute, Brisbane, QLD, Αυστραλία). ΡΑΚ-GFP πλασμίδιο που προέκυψε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Επικυρωμένη ON-TARGET συν SMARTpool μικρά παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA) για την ανθρώπινη Cav1, τον έλεγχο siRNA (siCONTROL μη στόχευση siRNA αρ. 1) και προσαρμοσμένες siRNA διπόλων για Gal3 [53] αγοράστηκαν από Dharmacon.

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη Gal3 με ετικέτα 6XHis στο C-τερματικό παρήχθη χρησιμοποιώντας το πλασμίδιο, pHIS-Parallel2, που περιγράφηκε προηγουμένως [54]. Αυτό το πλασμίδιο και πρωτόκολλα ήταν ένα είδος δώρο από Ludger Johannes (Institut Curie, Παρίσι, Γαλλία). Για να δημιουργηθούν Gal3-His, χρησιμοποιήσαμε βακτήρια BL21-DE3 (New England Biolabs). Εν συντομία, ολονύκτια καλλιέργεια επανα-εμβολιάστηκαν (1: 5) σε φρέσκο ​​LB συμπληρωμένο με αμπικιλλίνη και καλλιεργήθηκαν στους 37 Κελσίου βαθμό από 225 σ.α.λ. αναδευτήρα μέχρι οπτική πυκνότητα στα 600 φθάσει 1 και, στη συνέχεια, προκαλείται χρησιμοποιώντας 0.4 mM IPTG για 3 ώρες στους 30 βαθμούς Κελσίου σε έναν αναδευτήρα 225 rpm. Ανασυνδυασμένη Gal3-His καθαρίστηκε σε μήτρα συγγένειας Talon (Clontech) χρησιμοποιώντας το παρεχόμενο πρωτόκολλο, μεταφέρονται σε 1 χ PBS πριν από την ταχεία κατάψυξη σε υγρό Ν2.

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά PC3 ήταν από την American Type Culture Collection (ATCC) και διατηρήθηκαν σε πλήρες RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). Τα PC3 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν σταθερά GFP ή PTRF-GFP (PC3-GFP και PC3-GFP-PTRF) ήταν πλούσια δώρα από τον Dr. Michelle Χιλ (Πανεπιστήμιο του Queensland Institute Diamantina, Μπρίσμπεϊν, Αυστραλία) [13]. Όλες οι κυτταρικές σειρές ανακαλλιεργήθηκαν τουλάχιστον δύο φορές μετά την ανάρρωση από κατεψυγμένα αποθέματα πριν από την έναρξη των πειραμάτων και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για ένα μέγιστο 8 έως 10 περάσματα για να ελαχιστοποιηθεί η φαινοτυπική drift.

Το πλασμίδιο διαμόλυνση έγινε 24 ώρες μετά την επίστρωση των κυττάρων ή siRNA επιμόλυνση, χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα πειράματα διεξήχθησαν 24 ώρες μετά την επιμόλυνση πλασμιδίου. Προκειμένου να knockdown Cav1, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο για 24 ώρες πριν την επιμόλυνση με ειδικές ποντίκι Cav1 siRNA ή ελέγχουν smartpools siRNA (ποντίκι siCav1: L-0058415-00, siCONTROLS: D-001210-01? Dharmacon) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη διαμόλυνση 2000 αντιδραστήριο (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για Gal3 νοκ ντάουν, χρησιμοποιήσαμε προηγουμένως περιγράφεται έθιμο αλληλουχίες ολιγονουκλεοτιδίων siRNA και του πρωτοκόλλου [53]. Εν συντομία, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τη συγκεκριμένη ομάδα των τεσσάρων έθιμο συντίθεται ποντίκι Gal3 siRNA ολιγονουκλεοτίδια διπόλων ή ελέγχουν έξυπνες πισίνα siRNA (siCONTROLS) χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 48 ώρες πριν από τον πειραματισμό.

κηλίδωση Western

σβώλοι κυττάρων από το 80% συρρέουσες καλλιέργειες πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (20 mM Tris-HCl, ρΗ 7,6, 0,5% ΝΡ-40, 250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA που περιέχει προσφάτως προστέθηκε 2 mM DTT, 0,5 mM PMSF, 1 mM βαναδικό νάτριο, φθοριούχο νάτριο 2,5 mM, και 1 μΜ λευπεπτίνη) επί 30 λεπτά στους 4 ° C, σφαιροποιήθηκαν στις 13.000 rpm στους 4 ° C, και το υπερκείμενο συλλέγεται και αποθηκεύεται στους -80 ° C ΝΤΟ. Ίσες ποσότητες πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε 12% SDS-PAGE, ηλεκτροστυπώθηκαν πάνω σε νιτροκυτταρίνη (GE Healthcare Life Science), ανιχνεύθηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα και συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα, και αποκαλύφθηκε με ECL (Merck Millipore).

ανοσοφθορισμού επισήμανση

τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, ξεπλύθηκαν με PBS, κατέστησαν διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS /CM, δεσμεύονται με PBS /cm που περιέχει 0,2% βόεια λευκωματίνη ορού (BSA), και στη συνέχεια επωάστηκαν με το πρωτογενές και φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα σε PBS /cm που περιέχει 0,2% BSA. Μετά την επισήμανση, οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε CelVol (Celanese, Ltd.), και τις εικόνες που αποκτήθηκαν με τα 100 × στόχους planapochromat (NA 1.35) ενός ομοεστιακό μικροσκόπιο FV1000 Ολύμπου.

μετρήσεις FRAP

FRAP έγινε σε συνεστιακό μικροσκόπιο (FV1000, Όλυμπος) εξοπλισμένο με στόχο 60x planapochromat (NA 1,35? πετρέλαιο) και σαρωτή SIM. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε χαμηλή πυκνότητα σε FN (10 μg /ml) για 24 ώρες σε ένα θάλαμο μ-slide 8 φρεατίων (ibidi), επιμολυσμένα με ΡΑΚ-GFP ή ΡΑΚ-GFP συν mCherry ή ΡΑΚ-GFP συν PTRF-mCherry, και πειράματα που εκτελέστηκαν 24 ώρες αργότερα στους 37 ° C. siRNA επιμολύνονται 48 ώρες πριν από τα πειράματα FRAP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Gal3-His αλλάζοντας το μέσο σε μέσο άνευ ορού που περιέχει ένδειξη συγκέντρωσης του Gal3-His για 10 λεπτά πριν την αλλαγή σε διττανθρακικό-ελεύθερο RPMI. Για κάθε ανάλυση FRAP, ένα πλαίσιο prebleach αποκτήθηκε ακολουθείται από ένα μοναδικό γεγονός λευκαντικό χρησιμοποιώντας την ταυτόχρονη και ανεξάρτητη διέγερση της γραμμής 405 του σαρωτή SIM. ανάκτηση φθορισμός παρακολουθήθηκε σε διαστήματα 4 δευτερολέπτων έως ότου η ένταση έφθασε ένα πλατό. Φθορισμού κατά τη διάρκεια της ανάκαμψης ομαλοποιήθηκε με την ένταση prebleach. αναλογίες της έντασης στην περιοχή λευκανθεί συγκρίθηκαν πριν τη λεύκανση και μετά την ανάρρωση για τον υπολογισμό του κινητού κλάσματα χρησιμοποιώντας Prism 4 (GraphPad). Γραφήματα είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων στα οποία έγιναν λευκανθεί μεταξύ 10 και 25 εστιακές συμφύσεις.

Μετανάστευση δοκιμασία

Για δοκιμασία μετανάστευσης, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και μετρήθηκαν, και 200.000 κύτταρα /φρεάτιο μεταφέρθηκαν σε μη επικαλυμμένα 8-μm ένθετα κυτταρικής καλλιέργειας (BD Falcon) σε μέσο που περιείχε 2% ορό και το συγκρότημα τοποθετείται σε πλάκες 24 φρεατίων που περιέχουν πλήρες μέσο. Μετά από 16 ώρες, τα μη μεταναστεύσαντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από την κορυφή του φίλτρου με μια μπατονέτα, και κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στο κάτω μέρος του φίλτρου σταθεροποιήθηκαν με 3% PFA, χρωματίστηκαν με 5% crystal violet και επισημασμένα κύτταρα μετρήθηκαν. μετρήσεις κυττάρων κανονικοποιήθηκαν στην ομάδα PC3. Εναλλακτικά, 200.000 κύτταρα /φρεάτιο μεταφέρθηκαν σε ένθετα σε μέσο ελεύθερο ορού με ή χωρίς 2 μg /ml Gal3-His και το συγκρότημα τοποθετήθηκε σε πλάκες 24 φρεατίων που περιέχουν πλήρες μέσο για 14 ώρες πριν από καθήλωση και χρώση. Οι αριθμοί κυττάρων κανονικοποιήθηκαν προς το μη επεξεργασμένο ομάδα PC3.