Abstract

προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι η ανθρώπινη ριβοσωμική L6 πρωτεΐνη (RPL6) ήταν ρυθμισμένη σε πολυανθεκτικά γαστρικά καρκινικά κύτταρα και υπερ-έκφραση του RPL6 θα μπορούσε να προστατεύσει από καρκίνο του στομάχου που προκαλείται από φάρμακα απόπτωση. Απεδείχθη περαιτέρω ότι πάνω ρύθμιση του RPL6 επιτάχυνση της ανάπτυξης και την ενίσχυση της in vitro ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων GES ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του RPL6 επέδειξε τα αντίθετα αποτελέσματα. Η παρούσα μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει το δυνητικό ρόλο του RPL6 στη θεραπεία του γαστρικού καρκίνου για κλινική. Η έκφραση του RPL6 και κυκλίνη Ε σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο αξιολογήθηκε με immunohistochemisty. Διαπιστώθηκε ότι RPL6 και η κυκλίνη Ε εκφράστηκαν σε υψηλότερο επίπεδο σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς από ότι σε κανονικό γαστρικό βλεννογόνο και τα δύο ήταν συνακόλουθη σε γαστρικό καρκίνο. χρόνο επιβίωσης μετεγχειρητικούς ασθενείς αναλύθηκε με ανάλυση Kaplan-Meier και διαπιστώθηκε ότι οι ασθενείς με RPL6 θετική έκφραση έδειξε μικρότερο χρόνο επιβίωσης από τους ασθενείς ότι με RPL6 αρνητική έκφραση. RPL6 ήταν τότε γενετικά κάτω-ρυθμίζονται σε γαστρικό SGC7901 καρκίνου και κυτταρικές σειρές AGS με siRNA. Απεδείχθη ότι τα κάτω ρύθμιση RPL6 μειωμένη ικανότητα σχηματισμού του γαστρικού καρκινικών κυττάρων in vitro αποικία και μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων in vivo. Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση θα μπορούσε να καταστείλει RPL6 G1 στην S φάση μετάβασης σε αυτά τα κύτταρα. Περαιτέρω, θα αποδεικνύεται ότι RPL6 siRNA κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση της κυκλίνης Ε στα κύτταρα SGC7901 και AGS. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι RPL6 ήταν υπερεκφράζεται σε ανθρώπινο γαστρικό ιστούς και που προκαλούνται φτωχή πρόγνωση. Κάτω ρύθμιση των RPL6 θα μπορούσε να καταστείλει την κυτταρική ανάπτυξη και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, τουλάχιστον μέσα από τα κάτω ρύθμιση κυκλίνης Ε και το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια νέα προσέγγιση για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Wu Q, Gou Υ, Γουάνγκ Ε, Jin Η, Cui L, Zhang Y, et al. (2011) Ελάττωση της RPL6 με siRNA αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και κυτταρικού κύκλου Εξέλιξη του Ανθρώπου γαστρικός καρκίνος Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 6 (10): e26401. doi: 10.1371 /journal.pone.0026401

Επιμέλεια: Xin-γιουάν Guan, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 7 Αυγούστου του 2011? Αποδεκτές: 26 του Σεπτεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 17, Οκτ 2011

Copyright: © 2011 Wu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (Αρ 2010CB732400, Νο 2010CB529300), και το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30801349). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου, με υψηλή ηθική, ήταν μία από τις πιο κακοήθεις καρκίνους στις χώρες της Ασίας. Η παρουσία του ήταν μια διαδικασία με πολυ-παραγόντων και πολλαπλών σταδίων, που εμπλέκονται σε μεταβολές στην πολλά μόρια, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των πρωτο-ογκογονιδίων, απενεργοποίηση των γονιδίων καταστολής όγκων, μεταβολές στις πρωτεΐνες που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο και ούτω καθεξής. Κατά την τελευταία δεκαετία, ένας μεγάλος αριθμός των πρωτο-ογκογονιδίων και γονιδίων καταστολής όγκων έχουν βρεθεί. Παρά τον αρκετά μεγάλο αριθμό των γονιδίων που έχουν ήδη περιγραφεί, νέα γονίδια με ογκογόνο δυναμικό ή καταστολής όγκου δραστηριότητες εξακολουθούν να εντοπιστεί. Ωστόσο, ο μοριακός μηχανισμός του γαστρικού καρκινογένεση παραμένει ασαφής.

ριβοσώματος είναι ουσιώδης για την πρωτεϊνική σύνθεση σε όλα τα κύτταρα, το οποίο αποτελείται από ριβοσωματικών RNA (rRNAs) και ριβοσωμικές πρωτεΐνες (RPS). Πολλοί ρετροϊών παίζουν επίσης διάφορους ρόλους που είναι ανεξάρτητοι της βιοσύνθεσης πρωτεΐνης, η οποία ονομάζεται εκτός λειτουργίας ριβοσωμάτων [1]. Αύξηση περισσότερη έρευνα κατέδειξε ότι η διαταραχή της μετάφρασης πρωτεϊνών συμμετείχε στην ογκογένεση και πολλά ριβοσωματικές πρωτεΐνες ήταν δυσλειτουργικό σε όγκους, αλλά οι μηχανισμοί ήταν ακόμα άγνωστη [2]. Έχει προταθεί ότι πολλά ρετροϊών δρουν ως καταστολείς όγκων haploinsufficient σε ψάρια και πολλά ρετροϊών γονιδίων θα μπορούσε επίσης να είναι ογκογονίδια σε ανθρώπινους είδος [3]. Η πρώτη έκθεση σχετικά με τις σχέσεις μεταξύ των ρετροϊών και οι όγκοι δημοσιεύθηκε σε 90 s του 20

ου αιώνα, η οποία κατέδειξε την ένωση των RPS19 με την εξέλιξη και διαφοροποίηση καρκίνωμα του παχέος εντέρου [4] .Thereafter, όλο και περισσότερες ρετροϊών βρέθηκαν δυσλειτουργική σε όγκους , όπως η υψηλή έκφραση του RPL 19 σε όγκους του μαστού [5], υπερ-έκφραση του RPL7a και RPL37 σε δείγματα προστάτη-καρκινικού ιστού [6], υψηλότερη έκφραση του RPL15 σε καρκίνο του οισοφάγου [7], ρετροϊών δείκτη όπως έγκαιρη ανίχνευση της ανθρώπινης πλακώδους καρκίνωμα του τραχήλου της μήτρας [8], και η υπερ-έκφραση του RPL36a που σχετίζονται με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [9] και ούτω καθεξής. Εκθέσεις σχετικά με τη σύνδεση των ρετροϊών με καρκινογένεση ήταν εξακολουθεί να αυξάνεται [2], [10]. Ωστόσο, οι ακριβείς ρόλοι των ρετροϊών στην ανάπτυξη του όγκου είναι ποικίλα και εξακολουθούν να χρειάζονται περαιτέρω διευκρίνιση.

Προηγουμένως, αναλύσαμε τα προφίλ mRNA ενός ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή SGC7901 και πολυανθεκτική παραλλαγή SGC7901 /VCR της με διαφορικό εμφανίζεται PCR και καταστολή αφαιρετικής υβριδοποίησης [11], [12]. RPL6 ταυτοποιήθηκε ως ένα από τα υπερ-εκφρασμένα γονίδια σε SGC7901 /ADR σε σύγκριση με SGC7901, η οποία επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με RT-PCR και ανάλυση Northern blot [13]. Μετέπειτα μελέτες αποκάλυψαν ότι πάνω ρύθμιση του RPL6 προστατευόμενων γαστρικού καρκίνου κύτταρα από αδριαμυκίνη επαγόμενη απόπτωση και ενίσχυσε την αντοχή του γαστρικού καρκίνου κυττάρων σε πολλαπλές χημειοθεραπευτικά φάρμακα, συμπεριλαμβανομένων βινκριστίνη, αδριαμυκίνη, ετοποσίδη, σισπλατίνη και 5-fludrouracil [13]. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι RPL6 θα μπορούσε να προωθήσει τα κακοήθη φαινότυπο των γαστρικών καρκινικών κυττάρων, η οποία μας οδήγησε να πραγματοποιήσει την επακόλουθη μελέτη για να διερευνηθεί περαιτέρω ο ακριβής ρόλος του RPL6 στην καρκινογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Στη συνέχεια ανακαλύψαμε ότι οι γενετικά πάνω ρύθμιση RPL6 σε κύτταρα GES θα μπορούσε να επιταχύνει την ανάπτυξη και την ενίσχυση της in vitro ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων GES ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του RPL6 μπορεί να εμφανίσει τα αντίθετα αποτελέσματα. Επιπλέον, πάνω ρύθμιση της RPL6 θα μπορούσε να προωθήσει G1 στην S φάση μετάβασης των κυττάρων GES. Περαιτέρω μελέτη απέδειξε ότι RPL6 επάνω ρυθμισμένη έκφραση κυκλίνης Ε σε κύτταρα GES [14]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι RPL6 μπορούσε να προωθήσει την κακοήθη φαινοτύπους του γαστρικού καρκινικών κυττάρων και RPL6 θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν ογκογόνο ρόλο στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου, η οποία μας οδήγησε στην διεξαγωγή της παρούσας μελέτης για τη διερεύνηση του δυναμικού ρόλου του RPL6 σε γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του στομάχου και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μια νέα προσέγγιση για την θεραπεία του καρκίνου του γαστρικού.

Αποτελέσματα

RPL6 και κυκλίνη Ε έκφραση σε ανθρώπινο γαστρικό δείγματα καρκίνου και συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικά ιστούς

Για να διερευνήσει τις σχέσεις μεταξύ των RPL6 και της έκφρασης κυκλίνης Ε με την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου, ανιχνεύσαμε RPL6 και κυκλίνη Ε έκφραση σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα παρακείμενες μη-νεοπλασματικών ιστών με ανοσοϊστοχημική χρώση. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι RPL6 και κυκλίνη εντοπίζεται σχεδόν σε κυτταρόπλασμα και μόνο περιστασιακά σε πυρήνες σε γαστρικό καρκίνο κύτταρα (Σχ. 1Α). Περαιτέρω ανάλυση ανακάλυψε ότι η θετική αναλογία (συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων που Coomassie) των RPL6 ήταν 84% (46 από 55 ασθενείς), ενώ η θετική αναλογία της κυκλίνης Ε ήταν 75% (41 από 55 ασθενείς) σε ανθρώπινο γαστρικό δείγματα καρκίνου. Η θετική αναλογία των δύο RPL6 και κυκλίνη Ε ήταν 70% (38 από 55 ασθενείς), ενώ η αρνητική αναλογία (συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων που δεν λεκιάζει) τόσο RPL6 και κυκλίνη Ε ήταν 11% (6 από 55 ασθενείς) σε ανθρώπινο γαστρικό δειγμάτων καρκίνου . Η θετική αναλογία των δύο RPL6 και κυκλίνη Ε ήταν 18% (8 από 55 ασθενείς) σε συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικά ιστούς (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όσον αφορά τις διαφορές μεταξύ της έκφρασης RPL6 και έκφραση κυκλίνη σε ανθρώπινο γαστρικό καρκίνο δείγματα, δεν υπήρξε διαφορά. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι RPL6 και κυκλίνη Ε εκφράσεις σε ανθρώπινο γαστρικό δειγμάτων καρκίνου ήταν σχετική (Εικόνα 1Β, σ & lt?. 0.05), η οποία μπορεί να παίξει ένα con-γενναιόδωρη ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου και RPL6 και η κυκλίνη Ε μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα βιοδείκτη για τη διάγνωση του καρκίνου του γαστρικού και ενός γονιδίου στόχου για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου. Στο τέλος της παρακολούθησης, ο χρόνος επιβίωσης των ασθενών αναλύθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι κατά τη διάρκεια που οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν, οι ασθενείς με δύο RPL6 θετικά και κυκλίνη Ε θετικών έδειξε μικρότερο χρόνο επιβίωσης και χειρότερη πρόγνωση από εκείνους τόσο με RPL6 αρνητικό και κυκλίνη Ε αρνητική έκφραση, ή εκείνων με RPL6 θετικό και κυκλίνη Ε αρνητική ή με RPL6 αρνητικά και κυκλίνη θετική έκφραση αντίστοιχα (Σχήμα 2 Α, σ & lt?. 0.01), η οποία μπορεί να αποκαλύψει ότι οι ασθενείς με δύο RPL6 θετική και κυκλίνης Ε θετικό έδειξε κακή πρόγνωση. Επίσης αποδεικνύεται ότι οι ασθενείς με RPL6 αρνητική έκφραση έδειξε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από RPL6 θετικά (Σχήμα 2Β, ρ & lt?. 0.01), και σε ασθενείς με κυκλίνη Ε θετική έκφραση έδειξε κακή πρόγνωση (Σχήμα 2C, ρ & lt?. 0.01). Ως εκ τούτου, μπορεί να εξαχθεί το συμπέρασμα ότι RPL6 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα βιοδείκτη για την αξιολόγηση της πρόγνωσης των ασθενών με καρκίνο του στομάχου.

Α. Αντιπροσωπευτικές εικόνες παρουσιάζονται είναι αρνητικός ανοσοϊστοχημική έλεγχο της IgG (α) και θετική ανοσοϊστοχημική χρώση RPL6 (β) και η κυκλίνη Ε (γ) στις ίδιες γαστρικό καρκινικούς ιστούς (μεγέθυνση χ 200). B. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων σχετικά με τη συσχέτιση μεταξύ RPL6 και της έκφρασης κυκλίνη σε ανθρώπινο γαστρικό δείγματα καρκίνου. (P & lt? 0,05)

Η

Α.. Οι ασθενείς τόσο με RPL6 και Κυκλίνη Ε θετική, RPL6 θετικές και αρνητικές Κυκλίνη Ε, RPL6 αρνητικές και θετικές Κυκλίνη Ε, τόσο RPL6 και Κυκλίνη Ε αρνητική. B. Οι ασθενείς με RPL6 θετικά και αρνητικά. C. Οι ασθενείς με Κυκλίνη Ε θετικές και αρνητικές. p & lt? 0.01 vs τόσο RPL6 και κυκλίνης Ε θετικό και τον αντίστοιχο έλεγχο? * P & lt? 0.01 vs RPL6 θετικές και αρνητικές RPL6

Η

Η έκφραση της RPL6 σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου και των παραγώγων του

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το δυναμικό ρόλο της RPL6 στη γονιδιακή θεραπεία του γαστρικού. καρκίνος, SGC7901 και AGS κύτταρα επιμολύνθηκαν με RPL6 ειδικό siRNA και τη μικτή ομάδα των παραλλαγών ανθεκτικών στο G418 κυττάρων που παράγονται. Οι παραλλαγές G418-ανθεκτικές φιλοξενούν RPL6 ειδικά siRNA ήταν ανάλογα ονομάστηκε ως SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 και SGC7901-siRPL6-2, AGS-siRPL6-2. Οι G418-ανθεκτικά κύτταρα που φιλοξενούν πλασμίδια siRNA αγωνίζομαι σχεδιάστηκαν ως SGC7901-siControl και AGS-siControl αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η έκφραση RPL6 ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 και SGC7901-siRPL6-2, κύτταρα AGS-siRPL6-2 σύγκριση με γονικά κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου. Στην παρούσα μελέτη, SGC7901-siRPL6-2 και AGS-siRPL6-2 έδειξε πιο αποτελεσματική ανασταλτική αποτελέσματα, τα οποία έδειξαν ότι τα κύτταρα SGC7901-siRPL6-2 και AGS-siRPL6-2 θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως ένα καλό μοντέλο κύτταρο για να διευκρινίσει τις δυνατότητες ρόλος της RPL6 στη γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του στομάχου για την κλινική.

Α. Ανίχνευση RPL6 σε SGC7901 /AGS, SGC7901 /AGS-siRPL6-1, SGC7901 /AGS-siRPL6-2, κύτταρα SGC7901 /AGS-siRPL6-Control. β-ακτίνη ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β προσδιορίστηκαν οι καμπύλες ανάπτυξης του AGS παραλλαγές κυττάρων SGC7901 /με κάτω-ρυθμίζονται RPL6. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων AGS παράγωγα SGC7901 /παρακολουθήθηκε με ΜΤΤ δοκιμασία όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι» και καμπύλες ανάπτυξης τους απεικονίστηκαν γραφικά. γραμμές σφάλματος αντιστοιχούν σε μέση τιμή ± SD. P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. ικανότητα σχηματισμού Γ αποικία της SGC7901 AGS κυττάρων /παραλλαγές με κάτω-ρυθμίζονται RPL6 προσδιορίστηκε με προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού άγαρ όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD του τριπλούν σε κάθε πείραμα. Ορατή είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ξεχωριστών πειραμάτων. (P & lt? 0,05).

Η

Ελάττωση της RPL6 να καταστείλουν τη γαστρική ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων in vitro

Για να μελετήσει κατά πόσον τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης RPL6 θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων SGC7901 και AGS, γονικά κύτταρα, κύτταρα ελέγχου και τις παραλλαγές τους σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας και την ανάπτυξή τους παρακολουθήθηκε καθημερινά με ΜΤΤ δοκιμασία. Όπως φαίνεται από τις καμπύλες ανάπτυξης στο Σχήμα 3Β, ελέγχου (SGC7901-siControl και AGS-siControl) κύτταρα έδειξαν παρόμοια ρυθμό ανάπτυξης της γονικής (SGC7901 και AGS) κύτταρα, αντίστοιχα, ενώ SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 και SGC7901 κύτταρα -siRPL6-2, AGS-siRPL6-2 παρουσίασαν χαμηλότερο ρυθμό ανάπτυξης σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, και SGC7901-siRPL6-2, κύτταρα AGS-siRPL6-2 έδειξε το χαμηλότερο ρυθμό ανάπτυξης (Σχήμα 3Β, σ & lt?. 0.05). Η αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη αυτών των κυττάρων αναλύθηκε περαιτέρω με προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας μαλακού agar. Αποκαλύφθηκε ότι SGC7901-siRPL6-1, AGS-siRPL6-1 και SGC7901-siRPL6-2, κύτταρα AGS-siRPL6-2 παράγεται πολύ λιγότερο κύτταρο αποικίες σε μαλακό άγαρ από ό, τι τα γονικά κύτταρα τους και κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 3C, σ & lt.? 0.05), κύτταρα που ονομάζεται με SGC7901-siRPL6-2 και AGS-siRPL6-2 παρήγαγαν τα λιγότερο αποικίες. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι τα κάτω ρύθμιση RPL6 θα μπορούσε να καταστείλει γαστρικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και αναστέλλουν την ικανότητα σχηματισμού αποικίας των κυττάρων SGC7901 και AGS.

RPL6 siRNA ανέστειλε την ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου κυττάρων in vivo

Για επιβεβαιώνουν περαιτέρω τις επιπτώσεις της RPL6 για ογκογένεση του καρκίνου του στομάχου, δοκιμασία σχηματισμού όγκων εκτελέσθηκε σε γυμνά ποντίκια. SGC7901, AGS και SGC7901-siRPL-2, τα κύτταρα AGS-siRPL6-2 υποδόρια εμβολιάστηκαν στο δεξί ή το αριστερό πάνω μέρος της πλάτης αθυμικών άτριχων ποντικών σε ένα μόνο σημείο. (Εικ. 4Α και C) Τέσσερις εβδομάδες αργότερα, τα ποντίκια θανατώθηκαν και οι μεταμοσχευμένων όγκων αποκόπηκαν και τα μεγέθη των όγκων αξιολογήθηκαν (Εικόνα 4Β και D, ρ & lt?. 0.05). Υπήρξε μια σημαντική μείωση του μεγέθους ξενομοσχευμάτων σε RPL6 ρυθμισμένα προς τα κάτω κύτταρα. Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι knock-down της RPL6 μπορούσαν να καταστείλουν τη γαστρική ογκογένεση των καρκινικών κυττάρων in vivo και RPL6 μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στην προώθηση της κακοήθη ανάπτυξη των γαστρικών καρκινικών κυττάρων in vivo.

Α. κύτταρα SGC7901 σταθερά επιμολυσμένα με RPL6-ειδικό siRNA1 (αριστερά) ή με RPL6-σκαρφάλωμα siRNA εγχύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. B. Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση, οι ποντικοί φωτογραφήθηκαν και σκοτώθηκαν. Μετρήθηκαν μεγέθη όγκου. Οι ράβδοι σφάλματος δεικνύουν μέση τιμή ± SD. ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. κύτταρα C. SGC7901 σταθερά επιμολυσμένα με RPL6-ειδικό siRNA2 (αριστερά) ή με RPL6-σκαρφάλωμα siRNA εγχύθηκαν σε γυμνούς ποντικούς. Δ Τέσσερις εβδομάδες μετά την ένεση, οι ποντικοί φωτογραφήθηκαν και σκοτώθηκαν. Μετρήθηκαν μεγέθη όγκου. Οι ράβδοι σφάλματος δεικνύουν μέση τιμή ± SD. p & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου

Η

RPL6 επιβραδύνθηκε G1-S μεταβατική φάση SGC7901 κυττάρων

Για να αποκαλύψει τους μηχανισμούς που διέπουν τον κατασταλτικό ρόλο της RPL6 στο γαστρικό ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, αναλύθηκαν τα αποτελέσματα της RPL6 στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου των SGC7901 κύτταρα (Σχ. 5Α). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Β, κύτταρα SGC7901-siRPL6-1 έδειξε ελαφρώς αυξημένο ποσοστό φάση G1 και μειώθηκε το ποσοστό του S φάση, ενώ τα κύτταρα SGC7901-siRPL6-2 εμφάνισαν σημαντικά αυξημένο ποσοστό φάση G1 και μειώθηκε το ποσοστό του S φάση (Ρ & lt? 0,05 ) σε σύγκριση με γονικά κύτταρα και κύτταρα ελέγχου. Αυτές έδειξαν ότι RPL6 ειδικά siRNA θα μπορούσε να επιβραδυνθεί το G1-S μετάβαση της SGC7901 κυττάρων.

Α. SGC7901 και τα παράγωγά της σε λογαριθμική φάση συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κυτταρικού κύκλου. Η κατανομή φάση του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκε με FACS. Που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά εικόνες από τέσσερα ξεχωριστά πειράματα. Β κατανομή κυτταρικού κύκλου του SGC7901, SGC7901-siRPL6-1, SGC7901-siRPL6-2 και κυτταρικές σειρές SGC7901-siRPL6Control. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου υπολογίστηκε και εκφράστηκε ως μέση τιμή ± SD από τέσσερα ξεχωριστά πειράματα. ρ & lt?. 0.05

Η

RPL6 κάτω-ρυθμιζόμενη έκφραση της κυκλίνης Ε σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα στο επίπεδο πρωτεΐνης

Είναι γνωστό ότι η πρόοδος G1-S ελέγχεται από κυκλίνη D /CDK4 και κυκλίνη E /CDK2 σύμπλοκα, τα οποία ρυθμίζονται από μέλη της οικογένειας ΙΝΚ4, ρ21 και ρ27, αντίστοιχα. Η έκφραση αυτών των ρυθμιστικών αρχών σε SGC7901 και AGS κύτταρα και τις παραλλαγές του προσδιορίστηκαν με ανάλυση Western Blot. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 6, η έκφραση της κυκλίνης Ε ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα κάτω σε SGC7901-siRPL6-2 και τα κύτταρα AGS-siRPL6-2. Εκφράσεις των CDK2, p16, p21 και p27 ήταν αμετάβλητες σε παραλλαγές των κυττάρων SGC7901 και AGS. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι τα κάτω ρύθμιση RPL6 μείωσε την έκφραση της κυκλίνης Ε σε κύτταρα SGC7901 και AGS, η οποία θα μπορούσε να περιγραφεί λεπτομερώς ο πιθανός ρόλος των RPL6 και κυκλίνη Ε στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου και RPL6 μπορεί χρησιμοποιηθεί ως στόχος γονίδιο για καρκίνο του στομάχου σε η κλινική.

η έκφραση της κυκλίνης Ε, CDK2, p21, p16 και p27 σε παραλλαγές των κυττάρων SGC7901 και AGS με κάτω-ρυθμίζονται RPL6 προσδιορίστηκε με κηλίδα Western με τη χρήση των αντίστοιχων αντισωμάτων. β-ακτίνη ανιχνεύθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι RPL6 και η κυκλίνη Ε ήταν υπερ-εκφράζεται σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς και υπάρχει μια θετική συσχέτιση μεταξύ τους σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς. Παρακολούθηση αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με RPL6 αρνητική έκφραση έδειξε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης από ό, τι τα άτομα με RPL6 θετική έκφραση, η οποία πρότεινε ότι RPL6 θετικούς ασθενείς παρουσίασαν κακή πρόγνωση. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι τα κάτω ρύθμιση RPL6 με RPL6 ειδικό siRNA ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου in vitro, καταστέλλεται εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και η καταστολή της έκφρασης Ε κυκλίνης, Περισσότερο, knockdown του RPL6 με RPL6 ειδικό siRNA κατέστειλε ικανότητα σχηματισμού όγκων των γαστρικών καρκινικών κυττάρων in vivo.

σε προηγούμενη μελέτη μας, διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια που σχετίζονται με την αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα του καρκίνου του στομάχου κύτταρα απομονώθηκαν με τη χρήση διαφορικής εμφάνισης RT-PCR και αφαιρετικού υβριδισμού [11], [ ,,,0],12]. RPL6, ένα συστατικό της μεγάλης υπομονάδας του ριβοσώματος, ήταν έτσι απομονώνεται ως ένα κλώνο υπερ-εκφράζεται σε καρκίνο του στομάχου κύτταρα πολυανθεκτικά [11]. Αποδείχθηκε ότι RPL6 θα μπορούσε να προστατεύσει γαστρικά καρκινικά κύτταρα από χημειοθεραπευτικό φάρμακο προκαλούμενη απόπτωση [13]. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι RPL6 μπορεί να συνεπάγεται στη ρύθμιση του κακοήθους φαινοτύπου του καρκίνου του στομάχου. Περαιτέρω μελέτη σχεδιάστηκε για να διερευνήσει τον ρόλο της RPL6 στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου, και τα αποτελέσματα υπέδειξαν ότι τα άνω ρύθμιση του RPL6 επιταχυνόμενη ανάπτυξη και in vitro η ικανότητα σχηματισμού αποικιών των κυττάρων GES ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του RPL6 εμφάνισαν αντίθετα αποτελέσματα. Επίσης, up-ρύθμιση του RPL6 επιταχύνθηκε G1 στην S φάση μετάβασης των κυττάρων GES τουλάχιστον μέσω up-ρύθμιση της έκφρασης της κυκλίνης Ε, ενώ κάτω ρύθμιση των RPL6 έδειξαν αντίθετα αποτελέσματα [14]. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι RPL6 θα μπορούσε να διαδραματίσει έναν ρόλο ογκογόνο στην ογκογένεση και την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου και θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια νέα προσέγγιση για την γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Σήμερα, αυξάνοντας περισσότεροι ασθενείς πέθαναν από καρκίνο λόγω της τα κακοήθη φαινότυποι από αυτούς. θεραπεία του καρκίνου διαταραχθεί τους ανθρώπους σε όλο τον κόσμο. Εκτός από τη χημειοθεραπεία και χειρουργική θεραπεία, η γονιδιακή θεραπεία είναι μια νέα και πολλά υποσχόμενη θεραπεία καρκίνου. Μία από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μέθοδοι για γονιδιακή θεραπεία είναι παρεμβολή RNA (RNAi). RNAi, ένα άκρως συντηρημένη μηχανισμός γονιδιακή σίγηση παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Γονιδιακή σίγηση από ένα μετα-μεταγραφικό μηχανισμό που περιλαμβάνει ομόλογο δίκλωνο RNA ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά σε τεχνητά συστήματα όπου διπλή έλικα RNA (dsRNA) εισήχθη μέσω ένεσης ή με έκφραση των διαγονιδιακών κατασκευασμάτων. Αυτό το φαινόμενο συμβαίνει με μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων θηλαστικού. Στην τεχνολογία siRNA, εξετάστηκαν δύο μηχανισμών παράδοσης, άμεση παράδοση των συνθετικών νουκλεοτιδίων siRNA και εισαγωγή ενός πλασμιδίου DNA (pDNA) που κωδικοποιεί ένα κατασκεύασμα μικρή φουρκέτα (shRNA) που θα είναι ενζυμικά υποβαθμισμένη σε siRNA [15]. SiRNA παίξει ανασταλτικό ρόλο της με το ταίριασμα με τις αλληλουχίες του mRNA και ανέστειλε την έκφραση επακόλουθη mRNA και τη μετάφραση, και εργάστηκε ως αρνητική ρύθμιση. Σήμερα, όλο και περισσότερο οι επιστήμονες έχουν ανακαλύψει ότι γκρέμισε έκφραση γονιδίων με siRNA θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά την ανάπτυξη του όγκου και τη μετάσταση. αναστολέας φυλοσύνδετη πρωτεϊνών απόπτωσης (ΧΙΑΡ), ένα σημαντικό μέλος των αναστολέων των πρωτεϊνών απόπτωσης (ΙΑΡ) οικογένεια, συμμετέχει στον έλεγχο της κυτταρικής διαίρεσης, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αναστολή της απόπτωσης [16], [17]. Κάτω ρύθμιση των ΧΙΑΡ με siRNA θα μπορούσε να καταστείλει σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και να ευαισθητοποιήσει κύτταρα όγκου σε χημειοθεραπευτικούς παράγοντες [18], [19]. Η οστεοποντίνη (ΟΡΝ) πρωτεΐνη, η οποία υπερεκφράζεται στην πλειονότητα των ασθενών γαστρικό καρκίνο και που συνδέονται με την παθογένεση του, έπαιξε σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό, εισβολή, μετάσταση και επιβίωση του γαστρικού καρκίνου [20]. Στη συνέχεια, προς τα κάτω ρύθμιση OPN με OPN ειδικό siRNA ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή του γαστρικού καρκινικών κυττάρων [21]. CML66, ένα νέο αντιγόνο όγκου που έπαιξε ογκογόνο ρόλο, ήταν πάνω-εκφράζεται στην πλειοψηφία των καρκινικών κυτταρικών γραμμών και καρκίνων [22], να χτυπήσει κάτω την έκφρασή της από CMl66 ειδικό siRNA ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και τη μετάσταση των κυττάρων HeLa τόσο σε vivo και in vitro πειράματα [23]. FABP5, το οποίο κωδικοποιεί δερματική λιπαρό οξύ πρωτεΐνη σύνδεσης (C-FABP), ρυθμίζεται προς τα πάνω στον καρκίνο του προστάτη και δρα ως υποθετικό ογκογονίδιο. Κάτω ρύθμιση των FABP5 με FABP5 ειδικό siRNA αποτελεσματικά ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη σε γυμνούς ποντικούς [24]. Επιπλέον, όταν ριβοσωμική πρωτεΐνη RPS13 οποία ενισχύεται γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ανάπτυξης SGC7901 χτυπήθηκε κάτω από RPS13 ειδικό siRNA, θα ανάπτυξης ανέστειλε σημαντικά SGC7901 κυττάρων και αποικιών ικανότητα σχηματισμού in vitro και κατέστειλε την ικανότητα σχηματισμού όγκων σε γυμνό ποντικό [25]. Προηγούμενη έρευνα διαπίστωσε επίσης ότι η συστηματική παράδοση των siRNA μέσω ατελοκολλαγόνο, το οποίο στοχεύει ειδικά όγκους, είναι ασφαλές και εφικτό για τη θεραπεία του καρκίνου στον καρκίνο του προστάτη [26]. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία πάνω πρότεινε ότι siRNA, με την αναστολή της γονιδιακής έκφρασης μπορεί να είναι μια νέα προσέγγιση στη θεραπεία του καρκίνου και να κάνουν τη γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου είναι εφικτό για την κλινική θεραπεία.

Στην παρούσα μελέτη, οι εκφράσεις του RPL6 και κυκλίνη Ε σε γαστρικά καρκινικούς ιστούς και τα συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικά ιστών ανιχνεύθηκαν και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι RPL6 και κυκλίνη Ε έδειξαν υψηλότερη έκφραση σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικά ιστούς. Επιπλέον, υπάρχει ένας συσχετισμός μεταξύ της έκφρασης RPL6 και κυκλίνης Ε σε γαστρικό καρκινικούς ιστούς, που πρότεινε ότι μπορεί να παίζουν con-γενναιόδωρη ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου και RPL6 μπορούσε να χρησιμεύσει ως βιοδείκτη για γαστρικό διάγνωση του καρκίνου. Παρακολούθηση αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ασθενείς με δύο RPL6 θετική και η κυκλίνη Ε θετικές εκφράσεις έδειξε ένα μικρότερο χρόνο επιβίωσης και χειρότερη πρόγνωση από τον αντίστοιχο έλεγχο και, επίσης, έδειξε ότι οι ασθενείς με RPL6 αρνητική έκφραση έδειξε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης και καλύτερη πρόγνωση από τους ασθενείς με RPL6 θετική έκφραση, η οποία πρότεινε ότι RPL6 μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα βιοδείκτη για γαστρικό πρόγνωση του καρκίνου και ένα στόχο γονίδιο για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου στην κλινική.

για να διερευνήσουν περαιτέρω το δυναμικό σκοπιμότητα RPL6 ως στόχο γονιδιακή θεραπεία του γαστρικού καρκίνου σε κλινική, έχουμε χτυπήσει κάτω έκφραση RPL6 σε SGC7901 και AGS κύτταρα με RPL6 ειδικό siRNA, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι κάτω ρύθμιση RPL6 σε γαστρικού καρκίνου γονικές κυτταρικές σειρές (SGC7901 και AGS) ανέστειλαν αποτελεσματικά την κυτταρική ανάπτυξη και in vitro η ικανότητα σχηματισμού αποικιών. Περαιτέρω, η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έδειξε ότι κάτω ρύθμιση RPL6 επιβραδύνθηκε G1 στην S φάση του γαστρικού καρκίνου κύτταρα. Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι RPL6 ανέστειλε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μέσω της προς τα κάτω ρύθμιση των πειραμάτων σχηματισμού κυκλίνης Ε όγκου σε γυμνούς ποντικούς πρότεινε ότι τα κάτω ρύθμιση RPL6 θα μπορούσε να καταστείλει το σχηματισμό όγκων in vivo.

Κυκλίνη Ε, βασικό κύτταρο πρωτεΐνη κύκλο που έπαιξαν βασικό ρόλο στη μετάβαση G1-S ήταν σε αναταραχή σε πολλούς διαφορετικούς όγκους [27], [28], [29], [30], [31]. Προηγούμενη έρευνα έδειξε ότι η κυκλίνη Ε ήταν ένα σημαντικό μόριο στην ογκογένεση. Στην παρούσα μελέτη, ανακαλύψαμε ότι η έκφραση της κυκλίνης Ε, μαζί με RPL6 ήταν υψηλότερη σε ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς από ότι σε συμφωνημένα παρακείμενες μη νεοπλασματικά ιστούς, η οποία πρότεινε το ρόλο της κυκλίνης Ε έπαιξε στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Περαιτέρω έρευνα έδειξε ότι RPL6 επηρεάζονται κυτταρική ανάπτυξη ρυθμίζοντας κυκλίνη Ε, η οποία έδειξε ότι η υψηλή έκφραση της κυκλίνης Ε επιταχυνόμενη ανάπτυξη των κυττάρων, ενώ η χαμηλή έκφραση της κυκλίνης Ε επιβραδύνθηκε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Κυκλίνη Ε και RPL6 μπορεί να παίξει con-γενναιόδωρη ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η έκφραση RPL6 και κυκλίνη συνδέθηκαν μεταξύ τους με γαστρικό καρκινικούς ιστούς και θα μπορούσαν να παίξουν CON- γενναιόδωρη ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου, η οποία πρότεινε ότι RPL6 μπορεί χρησιμοποιηθεί ως διαγνωστικό εργαλείο σε γαστρικό καρκίνο. Παρακολούθηση ανάλυση των δεδομένων έδειξε ότι οι ασθενείς με RPL6 αρνητική έκφραση έδειξε μεγαλύτερο χρόνο επιβίωσης και καλύτερη πρόγνωση από τους ασθενείς με RPL6 θετική έκφραση μετεγχειρητικά, η οποία πρότεινε ότι RPL6 υπηρέτησε ως βιοδείκτη για γαστρικό πρόγνωση του καρκίνου και ενός νέου γονιδίου στόχου για γαστρικό θεραπεία του καρκίνου. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης RPL6 με RPL6 ειδικό siRNA ανέστειλε SGC7901 κυτταρική ανάπτυξη και in vitro ικανότητα σχηματισμού αποικίας, επιβραδύνθηκε SGC7901 κύτταρο G1 προς S φάση μετάβασης, και κατέστειλε το σχηματισμό όγκων in vivo. Εν κατακλείδι, παρούσα μελέτη μας επιβεβαίωσε ότι RPL6 siRNA που θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως μια νέα προσέγγιση για την γαστρική θεραπεία του καρκίνου για την κλινική.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Για δείγματα ιστών , όλοι οι ασθενείς ενημερώθηκαν συναίνεση για τη χρήση περίσσειας παθολογικά δείγματα για ερευνητικούς σκοπούς. Τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, εγκρίθηκαν από την προστασία του νοσοκομείου ανθρώπινων υποκειμένων επιτροπής. Η χρήση ανθρώπινων ιστών εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο και ήταν σύμφωνη με τη δήλωση του Ελσίνκι, και με την τοπική νομοθεσία. Ασθενείς που προσφέρουν δείγματα για τη μελέτη υπεγράφη ενημέρωση μορφές συναίνεσης. Για την έρευνα των ζώων, όλες οι διαδικασίες για τα πειράματα σε ζώα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήση του κέντρου πείραμα με ζώα της τέταρτης Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Το αναγνωριστικό έγκρισης για τη χρήση των ζώων ήταν Νο 10218 από Πείραμα Κέντρο Ζώων του τετάρτου Στρατιωτικό Ιατρικό Πανεπιστήμιο.

δείγματα ιστών και κυτταρικών σειρών

δείγματα ιστών ενσωματωμένα με παραφίνη συλλέχθηκαν από 55 ασθενείς με γαστρικό καρκίνο που υποβλήθηκαν σε γαστρεκτομή στο νοσοκομείο μας μεταξύ 2004 και 2009. Όλες οι περιπτώσεις καρκίνου του στομάχου και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου διαγνώστηκαν κλινικά και παθολογικά. Δεδομένα σχετικά με κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά και οι προγνώσεις των ασθενών συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν αναδρομικά. Συνολικά 55 ασθενείς παρακολουθήθηκαν μέχρι το τέλος του έτους 2009 και δύο από αυτά χάθηκαν κατά τη διάρκεια της περιόδου παρακολούθησης. Ανθρώπινου γαστρικού αδενοκαρκινώματος κυτταρική γραμμή SGC7901 ελήφθη από την Ακαδημία Στρατιωτικής Ιατρικής Επιστήμης, AGS ελήφθη από την Σαγκάη Τράπεζας Κυττάρων (Σαγκάη, Κίνα). Οι δύο κυτταρικές σειρές που διατηρούνται σε ινστιτούτο μας. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου απενεργοποιημένο με θέρμανση (FCS) στους 37 ° C με 5% CO

2 σε υγροποιημένο επωαστή (Forma Scientific, Marietta, ΟΗ).

Η ανοσοϊστοχημεία και ανοσοϊστοχημική βαθμολόγησης

αποπαραφινοποιήθηκαν και επανυδατώθηκαν τμήματα πλύθηκαν σε γλυκό νερό για 10 λεπτά. Heat-επαγόμενη ανάκτηση αντιγόνου πραγματοποιήθηκε για 20 λεπτά στους 95 ° C με 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό νάτριο (ρΗ 6,0). Μετά τα πλακίδια ψύχθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 40 λεπτά, είχαν μπλοκαριστεί σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% επί 20 λεπτά και στη συνέχεια σε κανονικό περιοριζόμενη υγρό ορό κατσίκας για 40 λεπτά. Μετά από αυτό, αυτά αφέθηκαν να αντιδράσουν όλη τη νύχτα στους 4 ° C με πρωτεύοντα αντισώματα για IgG, RPL6 και κυκλίνη (Santa Cruz). Μετά επαναθέρμανση για 40 λεπτά, ήταν στη συνέχεια αντιδρά με δεύτερα αντισώματα (Zhongshan Goldenbridge Biotechnology CO.LTD) για άλλα 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, τα προϊόντα αναπτύχθηκαν με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη και βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη. Βαθμολόγησης ολοκληρώθηκε από ειδικό παθολόγο και έναν επιστήμονα που αγνοούσαν την κλινική και παθολογική πληροφορίες. Σε περίπτωση ασυμφωνίας, η συναίνεση επιτεύχθηκε από conferencing. Οι αναλογίες των θετικών κυττάρων (0 έως +3) και οι εντάσεις χρώσης (0 έως +3) αξιολογήθηκαν ξεχωριστά με μεγέθυνση × 200. Ο πρώην υπολογίστηκε μετρώντας τον αριθμό των κυττάρων του όγκου χρωματίζονται μεταξύ του συνολικού αριθμού των κυττάρων του όγκου, για παράδειγμα, όταν χρωματίστηκαν 25% των συνολικών κυττάρων, το σκορ αναλογία ήταν 1, και 50% ισούται με 2, το 75% μεταξύ ίσων για 3, 0% ισούται με 0. Η βαθμολόγηση ένταση αξιολογήθηκε από το χρώμα του χρωματισμένο πυρήνα των καρκινικών κυττάρων, ειδικά, το σκορ 0 σημαίνει αχρωματικό, 1 σημαίνει κεχριμπάρι, 2 σημαίνει κίτρινο, και 3 σημαίνει καφέ. Σε συνδυασμό βαθμολόγησης + 1~ + 2 ορίστηκαν «αρνητικό», και + 3 ~ + 6 θεωρήθηκαν «θετική».

κατασκευή πλασμιδίου και επιμόλυνσης

Δύο ζευγάρια φουρκέτα μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA ) ολιγονουκλεοτίδια για RPL6 σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές σχεδιασμού siRNA της TaKaRa Βιοτεχνολογία, Ltd Σύγκριση αλληλουχίες στόχους στη βάση δεδομένων ανθρώπινου γονιδιώματος σε μια αναζήτηση BLAST για την εξάλειψη από την εξέταση κάθε αλληλουχία στόχο με 21 ζεύγη βάσεων ομολογίας συνεχόμενα με άλλες ακολουθίες κωδικοποίησης . Για ολιγο-1, νόημα: 5′-GATCCGGAGAAGGTTCTCGCAACTTTCAAGAGAAGTTGCGAGAACCTTCTCCTTTTTTGGAAA-3 ‘, αντινόημα: 5’AGCTTTTCCAAAAAAGGAGAAGGTTCTCGCAACTTCTCTTGAAAGTTGCGAGAACCTTCTCCG-3′? για ολιγο-2, νόημα: 5’-GATCCGTCGAGTTCCTCTACGAAGATTCAAGAGATCTTCGTAGAGGAACTCGATTTTTTGGAAA-3 ‘, αντινόημα: 5′-AGCTTTTCCAAAAAATCGAGTTCCTCTACGAAGATCTCTTGAATCTTCGTAGAGGAACTCGACG-3′? Ένα διπλό σκαρφάλωμα DNA σχεδιάστηκε επίσης ως έλεγχος, για ολιγο-1, νόημα: 5’-GATCCGGTGAGATCTTCGACACAGTTCAAGAGACTGTGTCGAAGATCTCACCTTTTTTGGAAA-3 ‘, αντινόημα: 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGTGAGATCTTCGACACAGTCTCTTGAACTG TGTCGAAGATCTCACCG-3’. Για ανασύνδεση για το σχηματισμό διπλών ϋΝΑ, 0,01 Μ καθένα από νόημα και αντινόημα ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν. Οι μεζονέτες αραιώνονται και στη συνέχεια συνδέθηκε με pSilencer3.1-H1 neo φορέα (Takara Βιοτεχνολογίας (Dalian) Co., Ltd). Τα προϊόντα μετασχηματίστηκαν σε ϋΗ5α-ικανά κύτταρα. Αμπικιλλίνη αποικίες ανθεκτικές επιλέχθηκαν, που προσδιορίζονται με πέψη περιορισμού, και επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με αλληλούχιση του DNA.