Αφηρημένο

Ιστορικό

Η υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα ERG λόγω γενωμική

ERG

-rearrangements ορίζει μια ξεχωριστή μοριακή υπότυπο των όγκων του προστάτη. Μία από τις συνέπειες της συσσώρευσης ERG είναι η διαμόρφωση του προφίλ γονιδιακής έκφρασης του κυττάρου. Tudor τομέα πρωτεΐνη που περιέχει 1 γονίδιο (

TDRD1

) αναφέρθηκε να εκφράζονται διαφορικά μεταξύ

TMPRSS2: ERG

-αρνητικοί και

TMPRSS2: ERG

-θετικό καρκίνο του προστάτη. Ο σκοπός της μελέτης μας ήταν να παρέχει μια μηχανιστική εξήγηση για την μεταγραφική ενεργοποίηση του

TDRD1

στην ERG αναδιάταξη-θετικούς όγκους του προστάτη

Μεθοδολογία Κύρια ευρήματα

μετρήσεις γονιδιακής έκφρασης. /με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR έδειξε μια αξιοσημείωτη συν-έκφραση του

TDRD1

και

ERG

(r

2 = 0,77), αλλά όχι

ETV1

(r

2 & lt? 0,01) σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη

in vivo

. Ανάλυση μεθυλίωσης του DNA από MeDIP-Seq και όξινο θειώδες αλληλουχίας έδειξε ότι

TDRD1

έκφραση συσχετίζεται αντίστροφα με μεθυλίωσης του DNA στο

TDRD1

υποστηρικτής

in vitro

και

in vivo

(ρ = -0.57). Κατά συνέπεια, η απομεθυλίωση του

TDRD1

προαγωγό σε

TMPRSS2: ERG

-αρνητικοί καρκινικά κύτταρα του προστάτη από τους αναστολείς μεθυλοτρανσφεράσης DNA οδήγησε στο

TDRD1

επαγωγής. Με τη χειραγώγηση των

ERG

δοσολογίας μέσω γονιδιακής αποσιώπησης και ανάγκασε την έκφραση δείχνουμε ότι ERG διέπει την απώλεια της μεθυλίωσης του DNA στο

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί, οδηγώντας σε

TDRD1

υπερέκφραση.

Συμπεράσματα /Σημασία

Έχουμε αποδείξει ότι η ERG είναι ικανή να διαταράξει την ιστο-ειδικό πρότυπο μεθυλίωσης του DNA στο

TDRD1

υποκινητή. Ως αποτέλεσμα,

TDRD1

γίνεται μεταγραφικά δραστηριοποιείται στο

TMPRSS2: ERG

-θετικό καρκίνο του προστάτη. Με δεδομένη την επικράτηση της ERG συγχωνεύσεις,

TDRD1

υπερέκφραση είναι μια κοινή αλλοίωση στο ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη η οποία μπορεί να αξιοποιηθεί για διαγνωστικές ή θεραπευτικές διαδικασίες

Παράθεση:. Kacprzyk LA, Laible Μ, Andrasiuk Τ, Brase JC, Bornø ST, Fälth M, et al. (2013)

ERG

Προκαλεί Επιγενετική ενεργοποίηση του Tudor Τομέα πρωτεΐνη που περιέχει 1 (

TDRD1

) στο

ERG

Αναδιάταξη-θετικό καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (3): e59976. doi: 10.1371 /journal.pone.0059976

Επιμέλεια: Μπαντάνα Chatterjee, Πανεπιστήμιο του Τέξας Κέντρο Διάδοσης Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 4 Σεπτέμβρη 2012? Αποδεκτές: 19η Φεβρουαρίου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 29 Μαρτίου του 2013

Copyright: © 2013 Kacprzyk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το γερμανικό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας (https://www.bmbf.de/en/) στο πλαίσιο του Προγράμματος για την Ιατρική Genome Research (NGFNplus? IG-καρκίνο του προστάτη, 01GS0890 και 01GS0891? IG-Mutanom , 01GS08107? Εντερική Τροποποίησης, 01GS08111), καθώς και η Helmholtz Διεθνές Graduate School για την Έρευνα του Καρκίνου του DKFZ ((www.dkfz.de/phd/)). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Περίπου το ήμισυ των ανθρώπινων κρουσμάτων καρκίνου του προστάτη που προσδιορίζονται από λιμάνι γονιδιωματική αναδιατάξεις PSA-διαλογής στην οποία αποκρίνονται στο ανδρογόνο ρυθμιστικά στοιχεία αντιπαρατίθενται σε γονίδια που κωδικοποιούν για τους παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας ETS [1] – [3]. Ως αποτέλεσμα, τα γονίδια ETS καταστεί συνδεδεμένο με τον υποδοχέα ανδρογόνων (AR) σηματοδότησης και υπερεκφράζονται σε σύντηξη θετικούς όγκους του προστάτη [4] – [6]. Η πιο διαδεδομένη από αυτές τις γονιδιωματικές αναδιατάξεων, το

TMPRSS2

:

ERG

γονίδιο σύντηξης, οδηγεί σε μια ισχυρή υπερέκφραση του μεταγραφικού παράγοντα ERG που κατά τα άλλα είναι απούσα σε κύτταρα του επιθηλίου του προστάτη [7] ? υπό φυσιολογικές συνθήκες

ERG

εμφανίζει ένα πρότυπο έκφρασης ιστού-περιορισμένα και μεταγράφεται στο αιμοποιητικό linage [8] και ενδοθηλιακά κύτταρα [9]. Το ζήτημα του τρόπου συσσώρευσης ERG επηρεάζει την βιολογία των κυττάρων του καρκίνου του προστάτη

in vitro

και

in vivo

έχει αποκτήσει σημαντικό ενδιαφέρον. Μέχρι τώρα, ERG προτάθηκε να διαμορφώνει τον φαινότυπο των κυττάρων καρκίνου του προστάτη από ένα ευρύ φάσμα των διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένων: διάσπαση του AR σηματοδότηση [10], η ενεργοποίηση του c-myc σηματοδότηση [11] και του δικτύου υποδοχέα οιστρογόνου [12], η ενεργοποίηση του μονοπάτι Wnt και επαγωγή των επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση [13], η προαγωγή της κυτταρικής εισβολής [14], φυσική αλληλεπίδραση με PARP1 [15] και την ενεργοποίηση του ΤΟΡ-β /ΒΜΡ σηματοδότηση [16]. Οι όγκοι που φιλοξενεί το σύντηξης ERG βρέθηκαν επίσης να εμπλουτιστεί για την απώλεια του

ΡΤΕΝ

ογκοκατασταλτικό [17], [18]. Κατά συνέπεια, σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο του προστάτη ERG δείχθηκε να συνεργαστεί με μονοπάτι ΡΙ3Κ στην οδήγηση καρκινογένεση [19], [20]. Συσσώρευση ERG βρέθηκε επίσης να συνδέεται με μια αλλαγμένη πρότυπο μεθυλίωσης του DNA σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη [10], [21], [22]. Ανάλυση της μεταγραφικό καρκίνου του προστάτη εκτελείται από εμάς και άλλους έδειξαν ότι οι όγκοι φιλοξενούν το

TMPRSS2

:

ERG

μερίδιο σύντηξης ένα προφίλ έκφρασης μοναδικό γονίδιο, το οποίο διαφέρει σημαντικά από τα προφίλ της καλοήθους ιστού του προστάτη και κακοήθεις όγκοι λείπει η σύντηξη [1], [10], [12], [13], [16], [23]. Συγκεκριμένα, οι όγκοι υπερεκφράζουν ERG χαρακτηρίζεται από μεταγραφική ρύθμιση των γονιδίων που εμπλέκονται στις οδούς Wnt και ΤΟΡ-β /ΒΜΡ [16], β-οιστραδιόλη δίκτυο [12], [23] και NF-κΒ μονοπάτι [24].

μεταξύ των γονιδίων απελευθερωθεί στο

ERG

-rearranged καρκίνο του προστάτη, τουλάχιστον δύο ανεξάρτητες μελέτες που εντοπίστηκαν Tudor πρωτεΐνη που περιέχει την περιοχή 1 (

TDRD1)

ως το πιο διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ

ERG

καρκίνο αναδιάταξη θετικών και -αρνητικοί του προστάτη, εκτός από

ERG

ίδιο [16], [23]. Ομοίως με

ERG

,

TDRD1

δεν μεταγράφεται στο φυσιολογικό επιθήλιο προστάτη [25], [26].

TDRD1

έχει αρχικά ταυτοποιηθεί ως αντιγόνο καρκίνου /όρχεων, δηλαδή ένα γονίδιο το οποίο εκφράζεται στους όρχεις και τον καρκίνο, αλλά σιωπηλός σε ενήλικες σωματικούς ιστούς [26]. ορθόλογο ποντικού του,

Tdrd1

, εκφράζεται κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης, όπου δρα στο συντηρημένο μονοπάτι Pirna να καταστείλει τη δράση των LINE1 ρετροτρανσποζόνια από μεθυλίωση [27]. Μια πρόσφατη μελέτη στο zebrafish πρότεινε ότι Tdrd1 δρα ως μοριακός ικρίωμα για Piwi πρωτεΐνες, piRNAs και τους στόχους Pirna [28]. Και στις δύο ποντικιού και zebrafish, Tdrd1 απαιτείται για τη σωστή λειτουργία του μονοπατιού Pirna και

Tdrd1

νοκ-άουτ στα αποτελέσματα του ποντικιού σε μια ελαττωματική σπερματογένεση [28], [29].

Εδώ, έκθεση που

ERG

και

TDRD1

συν-εκφράζονται σε ανθρώπινους καρκίνους του προστάτη και παρέχουμε μια μηχανιστική εξήγηση για την παρατηρούμενη συν-έκφραση. Έχουμε αποδείξει ότι η ERG ενεργοποιεί

TDRD1

μεταγραφή με την πρόκληση της απώλειας της μεθυλίωσης του DNA στο

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί. Προτείνουμε ότι αυτή η επιγενετική συνέπεια των

TMPRSS2:. ERG

σύντηξη αποτελεί ένα νέο μηχανισμό που μπορεί να εξηγήσει μέρος του μεταγραφικού διαφοροποίησης που επάγεται από ERG στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

δείγματα ιστού του προστάτη ελήφθησαν από το Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου του Αμβούργου Eppendorf. Έγκριση για τη μελέτη λήφθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας και όλοι οι ασθενείς συμφώνησαν σε συμπληρωματικές δειγματοληψίες ιστού για επιστημονικούς σκοπούς.

Δείγματα του προστάτη ιστών, Γονιδίωμα-ευρύ Έκφραση Profiling και Ανάλυση μεθυλίωσης

Λεπτομέρειες της ανθρώπινης συλλογή δειγμάτων, η εκχύλιση του RNA, η μετατροπή σε cDNA και γονιδιώματος σε επίπεδο προφίλ έκφρασης περιγράφονται αλλού [16]. εκχύλιση του DNA και ανάλυση μεθυλίωσης του γονιδιώματος-πλάτους MeDIP-Seq περιγράφονται αλλού [22]. Τα δεδομένα από προφίλ έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία και ανάλυση της μεθυλίωσης του γονιδιώματος-ευρεία είναι διαθέσιμες στο κοινό στην έκφραση του γονιδίου της βάσης δεδομένων Omnibus (αριθμοί πρόσβασης GSE29079 και GSE35342).

TMPRSS2: ERG

κατάσταση σύντηξης προσδιορίσθηκε με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που περιγράφηκαν προηγουμένως [30] και από qPCR [16]. Δείγματα, για τις οποίες υπήρχαν διαθέσιμα τόσο mRNA έκφρασης και της μεθυλίωσης του DNA των δεδομένων, συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση.

Cell Culture

vcap, NCI-H660, LNCaP, DU145, PC-3, και RWPE -1 κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA, USA). ΒΡΗ-1 κύτταρα ήταν ένα είδος δώρο της Doris Mayer (DKFZ, Heidelberg). Κ-562 και τα κύτταρα KG-1 δόθηκαν από τον Christoph Plass και Peter Krammer, αντίστοιχα (DKFZ, Heidelberg). MOLT4 και CMK κύτταρα ελήφθησαν από DSMZ (Braunschweig, Γερμανία). κύτταρα VCAP διατηρήθηκαν σε μέσο DMEM (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco). κύτταρα NCI-H660 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 5% FBS (Gibco), 2 mM L-gluatmine, 0,005 mg /ml ινσουλίνη, 0.01 mg /ml τρανσφερίνη, 30 ηΜ σεληνικό νάτριο, 10 ηΜ υδροκορτιζόνης και 10 ηΜ β-οιστραδιόλη (όλα από την Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA). LNCaP και DU145 διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS. PC-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο F12-K (ATCC) συμπληρωμένο με 10% FBS. κύτταρα RWPE1 καλλιεργήθηκαν σε κερατινοκυττάρων μέσο άνευ ορού συμπληρωμένο με 0.05 mg /ml βόεια εκχύλισμα pituary και 5 ng /ml ανασυνδυασμένου EGF (Gibco). κύτταρα BPH1 καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FBS και 20 ng /mL 5α-διυδροτεστοστερόνη (Sigma). Κ-562 και MOLT-4 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 και συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, KG-1 και τα κύτταρα CMK καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 20% θερμο-απενεργοποιημένο FBS.

δημιουργία σταθερών LNCaP κλώνοι και Επαγωγή διαγονιδιακής έκφρασης

ERG κωδικοποιητική αλληλουχία (εξώνια 4-11 από NM_004449.3), το οποίο αντιστοιχεί σε TMPRSS2: ERG σύντηξης T1 /Ε4 [31], ενισχύθηκε από NM_004449. 3-πλασμίδιο που περιέχει (γονιδιωματικής και πρωτεϊνωματικής Πυρήνας διευκόλυνσης, DKFZ) με PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές: προς τα εμπρός GCAGGCTCCACCATGACCGCGTCCTCCTCCAG, αντίστροφη CAAGAAAGCTGGGTCTTAGTAGTAAGTGCCCAGAT. Σταθερά επιμολυσμένα κλώνοι LNCaP δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32]. Η διαγονιδιακή έκφραση προκλήθηκε με 50 ng /ml δοξυκυκλίνη (Sigma).

RNA Εκχύλιση και Αντίστροφη Μεταγραφή

Ολικό RNA απομονώθηκε από εκθετικά αυξανόμενη κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία ) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA σύνθεση performend χρησιμοποιώντας SuperScript III αντίστροφης μεταγραφάσης (Life Technologies) και ολιγο-dT εκκινητές (Sigma-Aldrich) ακολουθώντας τις οδηγίες των κατασκευαστών. Για τη μέτρηση της LINE1 ORF2-mRNA, ολικό RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Turbo DNase (Life Technologies) για να απομακρυνθεί το μολυσματικό γονιδιωματικό DNA. ΫΝάση επεξεργασμένο RNA στη συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy MinElute Kit Cleanup (Qiagen) και υποβάλλεται σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας RevertAid Η Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Burlington, Canada) και τυχαία εξαμερή εκκινητήρια μόρια.

Ποσοτική RT- PCR

επίπεδα γονιδιακής έκφρασης μετρήθηκαν στο LightCycler 480 Real-Time PCR System (Roche, Mannheim, Germany). cDNA ισοδύναμο του 10 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκαν ανά φρεάτιο. Όλες οι μετρήσεις έγιναν εις τριπλούν. Δοκιμασίες Taqman (Applied Biosystems) έτρεξαν με 2x απόλυτη QPCR Mix (AbGene, Thermo Fischer, Epsom, Ηνωμένο Βασίλειο). δοκιμασίες καθολικό σύστημα Probe Βιβλιοθήκη (UPL) (Roche) έτρεξαν χρησιμοποιώντας 480 Κεφαλές Μάστερ (Roche). Πρώτες τιμές Cp υπολογίστηκαν από το λογισμικό 480 Roche Lightcycler χρησιμοποιώντας την 2η παράγωγο μέγιστη μέθοδο. Οι δοκιμασίες και οι αλληλουχίες εκκινητή που παρατίθενται στον Πίνακα S1 μαζί με τα αντίστοιχα τους αριθμούς σχημάτων. Τα επίπεδα έκφρασης παρουσιάζονται ως απόλυτες τιμές (Cp) ή ως έκφρασης σε σχέση με ένα εσωτερικό γονίδιο αναφοράς (χρησιμοποιώντας ΔCp μέθοδος).

Western Blotting

Εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα υποβλήθηκαν σε λύση με ρυθμιστικό RIPA (50 mM Tris-HCl ρΗ 8, 150 mM NaCl, 1% ΝΡ-40, 0.5% δεοξυχολικό νάτριο, 0,1% SDS) συμπληρωμένο με 5 mM EDTA και να σταματήσει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με κιτ BCA Protein Assay (Pierce). Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, 30 μg από προϊόντα λύσης πρωτεΐνης διαχωρίστηκαν σε πηκτές 10% SDS-PAGE και στυπώθηκαν πάνω σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Macherey-Nagel, Düren, Germany) και ανιχνεύθηκαν με τα αντισώματα παρατίθενται στον Πίνακα S1. Σήματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα ECL υποστρώματος [33] και καταγράφονται στην Fusion-SL 3500 WL σύστημα λήψης εικόνας (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Γαλλία).

siRNA μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση

Όλα siRNAs που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη συντέθηκαν από Dharmacon (Thermo Fisher Scientific, Epsom, UK) και επαναιωρήθηκαν στο 1χ siRNA Buffer (Dharmacon). Εκτός αν υποδεικνύεται διαφορετικά, τα κύτταρα σπάρθηκαν μία ημέρα πριν από την επιμόλυνση, στη συμβολή των 50-70%. siRNA διαμόλυνση διεξήχθη χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAi Max (Life Technologies) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. σύμπλοκα Η επιμόλυνση παρασκευάστηκαν σε μέσο OptiMEM άνευ ορού (Gibco) και προστέθηκε σε ένα πλήρες μέσο ανάπτυξης σε 20:80 ν /ν αναλογία. Οι τελικές συγκεντρώσεις των siRNAs ήταν 50 nM (μη στόχευση πισίνα siRNA, ERG siRNA) ή 25 nM (TDRD1 siRNAs). Όλα τα siRNA που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη παρατίθενται στον Πίνακα S1.

CpG νησί Ορισμός και Bisulfite DNA Sequencing

TDRD1

προαγωγέα που συνδέεται νησί CpG ορίστηκε σύμφωνα με την προεπιλογή κριτήρια που προβλέπονται από UCSC γονιδίωμα Browser (https://genome.ucsc.edu/). Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα με τη χρήση QIAamp DNA του αίματος Mini Kit (Qiagen). Όξινο θειώδες νάτριο μετατροπή του DNA πραγματοποιήθηκε με την EpiTect Bisulfite Kit (Qiagen) χρησιμοποιώντας 1 μα γονιδιωματικού DNA. Το 525-bp DNA που περιέχει το TDRD1 υποκινητή που σχετίζεται με CpG-νησί ενισχύθηκε με HotStarTaq DNA πολυμεράση (Qiagen) χρησιμοποιώντας εκκινητές που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Το προϊόν PCR κλωνοποιήθηκε σε φορέα pCR2.1 χρησιμοποιώντας ΤΟΡΟ ΤΑ κιτ κλωνοποίησης (Life Technologies). ΤΟΡ10 χημικώς ικανά κύτταρα (Life Technologies) μετασχηματίστηκαν με το προϊόν σύνδεσης. Μετά μπλε-λευκό διαλογής, τα πλασμίδια από τις αποικίες που περιέχουν το ένθετο υποβλήθηκαν σε ανάλυση αλληλουχίας Sanger (GATC, Konstanz, Germany). αλληλουχίας των πρώτων Sanger διαβάζει αναλύθηκαν για εκδηλώσεις μεθυλίωση χρησιμοποιώντας το online εργαλείο Bisma [34].

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης Θεραπεία

LNCaP ή vcap κύτταρα σπάρθηκαν σε πολυ-L- λυσίνη (Sigma-Aldrich) επικαλυμμένες πλάκες 12 φρεατίων σε χαμηλή πυκνότητα. Από την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (0,1% DMSO, Applichem, Darmstadt, Γερμανία) ή τις δεικνυόμενες συγκεντρώσεις 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Sigma-Aldrich) για πέντε συνεχόμενες ημέρες. Κάθε 24 ώρες, το μέσο ανάπτυξης αντικαταστάθηκε με ένα φρέσκο ​​παρασκευασμένο μέσο που περιέχει είτε 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη ή όχημα.

Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία

Για τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας, 2.5×10

4 κύτταρα VCAP σπάρθηκαν σε μαύρο πυθμένα πλάκες 96 φρεατίων (Perkin Elmer, Waltham, ΜΑ, USA) σε 80 μΐ του κανονικού μέσου ανάπτυξης. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA όπως περιγράφεται παραπάνω και αυτή η ημέρα ήταν αναφέρεται ως «ημέρα 1». Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με την CellTiter-Μπλε Κυττάρων Δοκιμασία Βιωσιμότητας (Promega Corporation, WI, USA) κατά τις ημέρες 1, 3, 5, 7 και 9 σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ο φθορισμός καταγράφηκε με αναγνώστη πλάκας Tecan Άπειρο M200 (Tecan Group Ltd, Männedorf, Ελβετία).

Στατιστική Ανάλυση Δεδομένων

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism 5.04. Τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM (τυπικό σφάλμα του μέσου) που υπολογίζεται από όλα εκτελούνται τα πειράματα, εκτός και αν αναφέρεται διαφορετικά. Όλες οι συγκρίσεις μεταξύ των πειραματικών ομάδων πραγματοποιήθηκαν με τη δοκιμασία Mann-Whitney-Wilcoxon με διόρθωση Bonferroni (* P & lt? 0.05, ** P & lt? 0,01, *** P & lt? 0.001, **** P & lt? 0,0001). Spearman (

ρ

) και Pearson (r) συντελεστές συσχέτισης υπολογίστηκαν με GraphPad Prism 5.04.

Αποτελέσματα

TDRD1

συν-εκφράζεται με

ERG

αλλά όχι με το

ETV1

ανθρώπων του καρκίνου του προστάτη

προηγούμενη έκφραση μας προφίλ μελέτη των ανθρώπινων δειγμάτων καρκίνου του προστάτη αποκάλυψε ότι em

TDRD1

είναι, εκτός από το

ERG

, η πιο διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ

TMPRSS2

:

ERG

-αρνητικοί και -θετικό όγκων [16]. έτσι πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση συσχέτισης στα δεδομένα από δείγματα ιστού 93 του προστάτη (46 καλοήθη, 30

TMPRSS2: ERG

-αρνητικοί, 17

TMPRSS2: ERG

-θετικό όγκους του προστάτη) και διαπίστωσε ότι το mRNA επίπεδα

ERG

και

TDRD1

μετράται από Ανθρωπίνων εξόνιο 1.0 ST Array τα εντυπωσιακά συσχετίζονται σε όλες δείγματα (r

2 = 0,84), υποδηλώνοντας μια μηχανιστική σχέση μεταξύ των δύο γονιδίων. Σε αντίθεση,

TDRD1

δεν ήταν συν-εκφράζεται με το

ETV1

(r

2 = 0,05), η οποία είναι ένας παράγοντας μεταγραφής ETS βρέθηκε να αναδιαμορφωθούν σποραδικά στον καρκίνο του προστάτη. Να επιβεβαιώσει αυτές τις παρατηρήσεις, μετρήσαμε

TDRD1

,

ERG

και

ETV1

επίπεδα mRNA με ποσοτική RT-PCR στο ίδιο σύνολο των δειγμάτων. Και πάλι,

TDRD1

έκφραση βρέθηκε να συσχετίζεται με

ERG

(r

2 = 0,77), αλλά όχι με το

ETV1

(r

2 & lt? 0,01 ) έκφραση (Σχ. 1α). Να παρέχει μια ανεξάρτητη επικύρωση των ευρημάτων μας, αμφισβήτησε την Oncomine βάση δεδομένων [35] χρησιμοποιώντας «TDRD1» και «τον καρκίνο του προστάτη», όπως όρους αναζήτησης. Η ανάλυση των δύο συγκεκριμένων μελετών που υποστηρίζει τις παρατηρήσεις μας: στα δεδομένα της Grasso et al. [36]

ERG

ήταν η σημαντικότερη συνεργασία γονίδιο εκφράζεται με

TDRD1

. Στα δεδομένα του Taylor et al. [17],

TDRD1

βρέθηκε να συν εκφράζεται με

ERG

(r

2 = 0.55), αλλά όχι με

ETV1

(r

2 = 0.02) σε όλη 149 πρωτοπαθείς όγκους του προστάτη. Για να εξηγήσει την παρατηρούμενη συν-έκφραση, χρησιμοποιήσαμε κυτταρικά μοντέλα καρκίνου του προστάτη, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων που εκπροσωπούν καλοήθεις (RWPE-1, ΒΡΗ-1), η σύντηξη αρνητικά (PC-3, DU145),

ERG

-rearranged (VCAP, NCI-H660) και

ETV1

-rearranged (LNCaP) καρκίνο του προστάτη. μετρήσεις της γονιδιακής έκφρασης σε κυτταρικές σειρές προστάτη έδειξε ότι ενώ

TDRD1

επίπεδα mRNA ήταν ανεξάρτητη από

ETV1

έκφρασης, υπάρχει εμφανής σχέση μεταξύ

TDRD1

και

ERG

έκφραση

in vitro

(Σχ. 1β). Καμία από τις κυτταρικές σειρές, χωρίς να

ERG

υπερέκφραση εξέφρασε

TDRD1

, ενώ κυτταρικές σειρές NCI-H660 και vcap, δύο από τα οποία φιλοξενούν το

TMPRSS2: ERG

σύντηξης, εξέφρασε την υψηλή επίπεδα

TDRD1

(Σχ. 1β). Στη συνέχεια ρώτησε αν τα υψηλά επίπεδα τόσο

TDRD1

και

ERG

αγγελιοφόρο RNA στο ERG-θετικά κύτταρα του προστάτη μεταφράζεται σε σημαντικές ποσότητες των αντίστοιχων πρωτεϊνών και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα vcap εκφράζουν ERG και TDRD1 σε επίπεδα ανιχνεύσιμα με κηλίδωση western (Σχ. 1γ). Με βάση αυτά τα αρχικά αποτελέσματα, αποφασίσαμε να χρησιμοποιήσουμε κύτταρα vcap ως

in vitro

μοντέλο για τη μελέτη της μηχανιστική σχέση μεταξύ

ERG

και

TDRD1

γονίδια στο

ERG –

αναδιατάσσεται καρκίνο του προστάτη

(Α) ανάλυση συσχέτισης των επιπέδων mRNA μετρήθηκε από qRT-PCR σε

TMPRSS2: ERG

-αρνητικοί (ERG-, n = 30) και

TMPRSS2: ERG καρκίνους

-θετικό (ERG +, n = 17), του προστάτη, καθώς και παρακείμενο καλοήθη ιστό του προστάτη (n = 46). Pearson συντελεστής συσχέτισης παρουσιάζεται. (Β) Ανάλυση της έκφρασης mRNA σε κυτταρικές σειρές προστάτη από qRT-PCR. Δύο ανεξάρτητα πειράματα εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Ανθρώπινους όρχεις RNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για

TDRD1

έκφρασης. (C) Ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης σε κυτταρικές σειρές προστάτη με κηλίδωση Western. (Δ) Ανάλυση της έκφρασης mRNA σε αιμοποιητικά καρκινικές κυτταρικές σειρές με qRT-PCR. Δύο ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν.

Η

TDRD1

δεν είναι συν-εκφράζεται με το

ERG

σε αιμοποιητικά Καρκίνοι

Μερικές αιμοποιητικών καρκίνων υπερεκφράζουν ERG πρωτεΐνη [37], [38] και είναι γνωστό ότι μυελοειδή, Τ- και Β-κυττάρου λευχαιμία εξαρτώνται ERG για τη συντήρησή τους [39], [40]. έτσι ερευνήσαμε

ERG

και

TDRD1

συν-έκφραση με qRT-PCR σε ένα πάνελ των κυτταρικών σειρών που αντιπροσωπεύουν διάφορες αιμοποιητικών καρκίνων. Παρόλο που ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα

ERG

mRNA σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές σειρές που προέρχονται από το αιμοποιητικής γραμμής, η αντίστοιχη έκφραση του

TDRD1

mRNA ήταν περίπου 50 φορές χαμηλότερη από ό, τι στα κύτταρα VCAP (Σχ. 1δ). Να επεκτείνει την ανάλυσή μας πέρα ​​από κυτταρικές σειρές, συγκρίναμε

ERG

και

TDRD1

έκφραση mRNA σε ιστούς του προστάτη και κυτταρογενετικά ανώμαλη οξεία μυελογενή λευχαιμία (CA-AML) μετράται με την ίδια πλατφόρμα (Human Exon 1.0 ST Array) [41]. Σε αντίθεση με τις παρατηρήσεις μας στον καρκίνο του προστάτη (r

2 = 0,84),

ERG

και

TDRD1

δεν ήταν συν-εκφράζονται σε CA-AML (r

2 = 0.07 ).

ERG

έχει επίσης αναφερθεί ότι υπερεκφράζεται σε σαρκώματα του Ewing [42] – [45]. Έτσι, ανέλυσαν τα διαθέσιμα γονιδιακής έκφρασης προφίλ μελέτες όγκων σάρκωμα Ewing για

TDRD1

και

ERG

έκφραση [46], [47]. Σε αντίθεση με τον καρκίνο του προστάτη, δεν υπήρχε συν-έκφραση του

ERG

και

TDRD1

σε οποιαδήποτε από αυτές τις μελέτες (r

2 = 0,03 και 0,02, αντίστοιχα). Αυτό υποδηλώνει ότι η συν-έκφραση του

ERG

και

TDRD1

είναι ειδικό για τον καρκίνο του προστάτη.

ERG Μεταγραφή Factor είναι αναγκαία για τη διατήρηση υψηλής

TDRD1

έκφραση σε

TMPRSS2: ERG

-θετικό Cells

Συν-έκφραση των δύο γονιδίων μπορεί να εξηγηθεί από, μεταξύ άλλων, τη ρύθμιση της ένα από τα γονίδια από το άλλο ή με αμοιβαία ρύθμιση τους σε μια feed-προς τα εμπρός βρόχο. Για να δοκιμαστούν αυτές οι πιθανότητες, εμείς απεμπλουτισμένο είτε ERG ή πρωτεΐνης στα κύτταρα TDRD1 VCAP με παρεμβολή RNA και προσδιορίζεται mRNA και πρωτεΐνης έκφραση και των δύο γονιδίων. Αποσιώπηση του

ERG

με απόδοση 80% είχε ως αποτέλεσμα 3,9 φορές προς τα κάτω ρύθμιση του

TDRD1

mRNA 72 ώρες μετά την επιμόλυνση (P & lt?. 0,0001, Σχήμα 2α). Σε αντίθεση, σίγηση του

TDRD1

δεν οδηγούν σε οποιεσδήποτε αλλαγές στο

ERG

έκφραση του mRNA. Ανάλυση των αντίστοιχων επιπέδων πρωτεΐνης με western blot αποκάλυψε ότι σίγηση του

ERG

και

TDRD1

γονίδια ήταν πολύ αποτελεσματική, οδηγώντας σε πλήρη εξάντληση των δύο πρωτεϊνών από τα κύτταρα (Σχ. 2β). Ενώ νοκ ντάουν του

ERG

προκάλεσε μια βαθιά αρνητική ρύθμιση των TDRD1 πρωτεΐνης σε 72 ώρες, δεν ανιχνεύθηκαν τέτοιες επιπτώσεις στην ERG μετά την φίμωση του

TDRD1

γονίδιο. Ένα παρόμοιο πρότυπο έκφρασης επίσης παρατηρήθηκε στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συμπερασματικά, μια σταθερή παρουσία του ERG απαιτείται για να διατηρηθεί υψηλή έκφραση του

TDRD1

σε κύτταρα VCAP και η παρατηρούμενη συν-έκφραση των δύο γονιδίων σε όγκους του προστάτη θα μπορούσε να εξηγηθεί από μια μονόδρομη ενεργοποίηση των

TDRD1

μέσω του παράγοντα ERG μεταγραφής.

(Α)

ERG

και

TDRD1

επίπεδα έκφρασης του mRNA στα κύτταρα vcap μετράται 72 ώρες μετά από γονιδιακή αποσιώπηση με τα siRNA. Τρία ανεξάρτητα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν. (Β) έκφραση της πρωτεΐνης ERG και TDRD1 στα κύτταρα vcap 72 ώρες μετά από γονιδιακή αποσιώπηση με siRNA που

Η

TDRD1

Ανάδοχος που σχετίζεται με CpG νησί είναι μεθυλιωμένος εις

TMPRSS2:. ERG

-θετικό προστάτη όγκοι

η έκφραση του

TDRD1

, μαζί με εκείνη των άλλων γονιδίων γραμμής ειδικά μικρόβιο, είναι γνωστό ότι καταστέλλεται σε σωματικούς ιστούς από επιγενετικές αποσιώπηση [26], [48 ]. Ως εκ τούτου, διερευνώνται κατάσταση μεθυλίωσης του

TDRD1

υποκινητή και το σχετικό CpG νησί στο πλαίσιο της

ERG

αναδιατάξεις. Είμαστε επιθεωρούνται μεθυλίωση του DNA γύρω από το

TDRD1 Ιστοσελίδα έναρξης της μεταγραφής σε όγκους του προστάτη, ότι είχαμε αναλύονται από MeDIP-Seq [22], και διαπιστώθηκε ότι η περιοχή αυτή να διαφορικά μεθυλιωμένο μεταξύ όγκων με και χωρίς το

TMPRSS2: ERG

γονίδιο σύντηξης. Συγκεκριμένα, η περιοχή 1 kb που εκτείνεται το

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί ήταν σημαντικά μεθυλιωμένος στο

TMPRSS2: ERG

-θετικό όγκους σε σύγκριση με καλοήθεις και

TMPRSS2: ERG

-αρνητικοί όγκους (P & lt?. 0,0001, Σχήμα 3α). 500-bp παράθυρο αμέσως κατάντη του νησιού CpG δεν έδειξε διαφορές στην μεθυλίωση του DNA μεταξύ ERG-αρνητικών και ERG-θετικούς όγκους (Ρ = 0.41, Σχ. 3α). Επιπλέον, αλληλουχία DNA που πλαισιώνει την υποθετική

TDRD1

υποκινητή δεν διαφορικά μεθυλιώθηκε μεταξύ οποιασδήποτε από τις τρεις ομάδες (Ρ & gt? 0,05), υποδεικνύοντας ότι η μεθυλίωση απόκλιση DNA λαμβάνει χώρα στην άμεση εγγύτητα του

TDRD1

έναρξης της μεταγραφής περιοχή, αλλά όχι γύρω από αυτό. Αξίζει να σημειωθεί ότι το μέσο επίπεδο των

TDRD1

μεθυλίωση προαγωγού αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα του

TDRD1

mRNA σε όλα τα 93 δείγματα (

ρ

= -0,57), γεγονός που υποδηλώνει ότι η απώλεια της μεθυλίωση υποστηρικτής συμβάλλει ουσιαστικά στην

TDRD1

υπερέκφραση σε

TMPRSS2:. ERG

σύντηξης-θετικό καρκίνο του προστάτη (Σχ. 3β)

(Α) Ανάλυση του

TDRD1

μεθυλίωση προαγωγού σε όγκους του προστάτη από MeDIP-Seq. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο βαθμό της μεθυλίωσης του DNA των 500 bp-κάδους. (Β) Ανάλυση Συσχετισμός

TDRD1

μεθυλίωση προαγωγού και

TDRD1

έκφραση mRNA σε καρκίνο του προστάτη. Ο συντελεστής συσχέτισης Spearman εμφανίζεται.

Η

ERG που προκαλείται από την απώλεια των επιγενετικών καταστολής κατά τη

TDRD1

Ανάδοχος είναι ένας κύριος μηχανισμός του

TDRD1

Ενεργοποίηση

από διαφορικά μεθυλιωμένο περιοχή διευρυμένοι το νησί CpG που σχετίζονται με το

TDRD1

νησιά υποκινητή και CpG είναι γνωστό ότι παίζουν ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής [49], έχουμε εκτελούνται θειώδους αλληλουχίας του

TDRD1

-associated νησί CpG σε κυτταρικές σειρές του προστάτη. Βρήκαμε ότι το νησί CpG ήταν πλήρως μεθυλιωμένα σε καλοήθη κύτταρα και ERG αρνητικών καρκινικές κυτταρικές σειρές, με ένα μέσο όρο μεθυλίωση που κυμαίνεται από 89,3% για LNCaP στο 98,6% για το PC-3 (Σχ. 4α). Σε αντίθεση, CpG μεθυλίωση ήταν σχεδόν εντελώς απούσα στο

TMPRSS2: ERG

-θετικό κυτταρικές σειρές NCI-H660 και vcap (11,4% και 0,7%, αντίστοιχα). Σύγκριση των επιπέδων

TDRD1

mRNA (σχ. 1β) στο DNA μεθυλίωση του CpG-νησί κατά τη

TDRD1

προαγωγό (Εικ. 4α) αποκάλυψε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των δύο παραμέτρων σε όλη την κυτταρικές γραμμές που ερευνήθηκαν, η οποία ήταν σύμφωνη με τα αντίστοιχα δεδομένα από όγκους του προστάτη. Λαμβάνοντας υπόψη τις έντονες διαφορές στη μεθυλίωση του DNA κατά τη

TDRD1

υποστηρικτής μεταξύ η ERG-αναδιατάσσονται και απομένει κυτταρικές σειρές, υποθέσαμε ότι η απώλεια της μεθυλίωσης του DNA κατά τη

TDRD1

υποκινητής είναι ο κύριος μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για την

TDRD1

ενεργοποίηση. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, υποβάλλαμε σε αγωγή ERG-αρνητικά κύτταρα LNCaP με τον αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης DNA 5-αζα-δεοξυκυτιδίνη (δεκιταβίνη? [50]). Μετά από πέντε ημέρες αγωγής με υπομικρογραμμομοριακές συγκεντρώσεις δεκιταβίνη παρατηρήσαμε μια εξαρτώμενη από τη δόση αύξηση στην έκφραση του

GSTP1

γονίδιο το οποίο είναι γνωστό ότι σιγήσει με μεθυλίωση σε κύτταρα LNCaP [51] (Σχ. 4β). Αξίζει να σημειωθεί ότι,

TDRD1

mRNA ρυθμίζεται αυξητικά κατά περισσότερο από 25 φορές. Κατά συνέπεια, μετά την αύξηση του

TDRD1

επίπεδα mRNA, TDRD1 πρωτεΐνης έγινε ανιχνεύσιμη στα κύτταρα LNCaP με ανοσοαποτύπωση (Εικ. 4β, ένθετο), υποδεικνύοντας ότι η απώλεια της μεθυλίωσης του DNA μπορεί πράγματι να είναι επαρκής για να οδηγήσει

TDRD1

ανάλυση της έκφρασης.

(Α) μεθυλίωση του DNA του

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί σε κυτταρικές σειρές προστάτη από όξινο θειώδες αλληλουχίας. Μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του νησιού CpG υπολογίζεται από πέντε αλληλουχία αποικίες που εμφανίζονται (%). (Β) Ανάλυση της έκφρασης mRNA σε κύτταρα LNCaP μετά την επεξεργασία με τον παράγοντα απομεθυλίωσης 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. Εισαγωγή: Ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης σε κύτταρα LNCaP μετά από θεραπεία με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. 75 μg πρωτεΐνης κυτταρολύματος από κύτταρα LNCaP εχρησιμοποιήθη ανά λωρίδα. (C) Ανάλυση της έκφρασης mRNA σε σταθερούς κλώνους LNCaP που υπερεκφράζουν

ERG

. Δύο ανεξάρτητα πειράματα εκτελέστηκαν εις τριπλούν. Εισάγετε: ανάλυση της έκφρασης ERG σε 48 ώρες σε LNCaP κλώνους με κηλίδωση Western. (D) Bisulfite αλληλουχίας του

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί στα κύτταρα LNCaP 48 ώρες μετά την επαγωγή της έκφρασης ERG με δοξυκυκλίνη. (Ε) Bisulfite αλληλουχίας του

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί 96 ώρες μετά την φίμωση του

ERG

στα κύτταρα vcap. Τα στοιχεία που εμφανίζονται στο (Δ) και (Ε) είναι οι μέσες% της μεθυλίωσης του ολόκληρο το νησί CpG υπολογίζεται 11-12 αλληλουχία κλώνους.

Η

Για να ελέγξετε αν ERG μπορούν να μιμηθούν οι επιδράσεις που ασκούνται στο

TDRD1

έκφραση με απομεθυλίωση του γονιδιώματος LNCaP, δημιουργήσαμε σταθερά κύτταρα LNCaP που υπερεκφράζουν ακολουθία κωδικοποίησης του

TMPRSS2: ERG

σύντηξης T1 /Ε4 σε ένα επαγώγιμο τρόπο. Επαγωγή

ERG

έκφρασης με δοξυκυκλίνη οδήγησε σε μια σχεδόν 5-φορές αύξηση σε ποσοστό

TDRD1

mRNA, ενώ η δοξυκυκλίνη δεν είχε καμία επίδραση στο

TDRD1

έκφραση του κλώνου LNCaP που μεταφέρουν το κενό φορέα έκφρασης (Σχ. 4c). Έχουμε χρησιμοποιήσει θειώδους αλληλουχίας για να αναλύσει την αντίστοιχη κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των

TDRD1

υποκινητή που σχετίζεται με CpG νησί κατά τη διέγερση ERG. ERG υπερέκφραση οδήγησε στην υπομεθυλίωση του

TDRD1

περιοχή του υποκινητή σε 27% των αλληλομόρφων διερευνώνται, ενώ δεν παρατηρήσαμε καμία υπομεθυλίωση μετά τη θεραπεία με δοξυκυκλίνη στο κενό φορέα ελέγχου (Εικ. 4δ, Εικ. S1a). Δεδομένου ότι το αντίστροφο πείραμα, δηλαδή η εξάντληση των ERG στα κύτταρα vcap από RNAi, έχει οδηγήσει σε αρνητική ρύθμιση της έκφρασης TDRD1 (Εικ. 2) έχουμε πραγματοποιήσει, επίσης, όξινο θειώδες αλληλουχίας του

TDRD1

CpG νησί μετά ERG αποσιώπηση στην vcap κύτταρα. Σε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση, αποσιώπηση του ERG με απόδοση 65% οδήγησε σε σχεδόν 3-φορές αύξηση σε μέσο μεθυλίωσης του DNA στο νησί CpG, από 15,7% μεθυλιωμένου CpGs σε μη στόχευση ελέγχου σε 45% σε κύτταρα κατεργασμένα με στόχευση siRNA

ERG

(Εικ. 4Ε, Σχ. S1b).

Οι παραπάνω παρατηρήσεις δείχνουν ότι κατάσταση μεθυλίωσης του DNA των

TDRD1

υποκινητή και έτσι μεταγραφική δραστηριότητα της είναι μηχανιστικά συνδεθεί με τα επίπεδα του παράγοντα μεταγραφής ERG στα καρκινικά κύτταρα του προστάτη.

Διαφορικές ρόλος του

TDRD1

στους όρχεις και τον καρκίνο του προστάτη

Η εξελικτική διατηρημένη οδός Pirna παίζει σημαντικό ρόλο στην ανδρική βλαστική κατά τη διάρκεια της σπερματογένεσης [52] – [54]. Τα συστατικά της οδού πράξη Pirna να καταστέλλει τη δραστηριότητα των μεταθετών στοιχείων, ενδεχομένως με σκοπό να διατηρηθεί η ακεραιότητα των χρωμοσωμάτων κατά τη διάρκεια της γαμετικής σειράς γονιδιώματος σε επίπεδο απομεθυλίωση σε αρχέγονα βλαστικά κύτταρα [55] – [57]. Μελέτες που έγιναν σε ποντικούς και zebrafish έχουν δείξει ότι Tdrd1, ορθόλογο της ανθρώπινης

TDRD1

, είναι ένα συστατικό του μονοπατιού Pirna που αλληλεπιδρά ειδικά με Pirna πρωτεΐνες που συνδέονται για να ενισχύσουν το Pirna μεσολάβηση αποσιώπηση του LINE1 ρετροτρανσποζόνια. Κατά συνέπεια, η απώλεια της Tdrd1 στο ποντίκι δείχθηκε να οδηγήσει σε LINE1 αποκαταστολή [27], [58]. Στους ανθρώπους, τέσσερις ορθόλογα κωδικοποιεί για Pirna πρωτεΐνες που συνδέονται υπάρχουν:

PIWIL1

–

PIWIL4

[59]. [17].