Αφηρημένο

Η κατανάλωση τροφών που περιέχουν ρεσβερατρόλη παράγει σημαντικά οφέλη για την υγεία. Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τον καρκίνο με τη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και τη μετάσταση και με διέγερση απόπτωσης. Οι δράσεις αυτές θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ικανότητά της να αναστέλλει (ΕΚΚ-1/2), Akt και την καταστολή των επιπέδων των οιστρογόνων και παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης -1 (IGF-1) υποδοχέα. Πώς αυτές οι διαδικασίες εκδηλώνεται στις ενέργειες κατά του όγκου της ρεσβερατρόλης δεν είναι σαφής. Χρησιμοποιώντας μελέτες μικροσυστοιχίας, δείχνουμε ότι η ρεσβερατρόλη μείωσε την έκφραση διαφόρων προστάτη που σχετίζεται με όγκους microRNAs (Mirs) περιλαμβανομένων

miR-21

σε ανδρογόνου υποδοχέα αρνητικό και άκρως επιθετικό καρκίνο του ανθρώπινου προστάτη κύτταρα, PC-3M-mm2. Αυτή η επίδραση της ρεσβερατρόλης συνδέθηκε με μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα, τη μετανάστευση και διεισδυτικότητα. Επιπλέον, η ρεσβερατρόλη αυξάνει την έκφραση της καταστολείς των όγκων, PDCD4 και maspin, τα οποία ρυθμίζονται αρνητικά από

miR-21

. Σύντομης παρεμβολής (SI) RNA κατά PDCD4 εξασθενημένο επίδραση της ρεσβερατρόλης για τον καρκίνο του προστάτη κύτταρα, και παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν μετά από υπερέκφραση του

miR-21

με

προ-miR-21

ολιγονουκλεοτίδια. κύτταρα PC-3M-MM2 παρουσίασαν επίσης υψηλά επίπεδα της φωσφο-Ακί (pAkt), που μειώθηκαν τόσο από ρεσβερατρόλη και LY294002 (αναστολέας ΡΙ3-κινάση).

MiR-21

έκφραση σε αυτά τα κύτταρα φάνηκε να εξαρτάται από Akt, ως LY294002 μείωσε τα επίπεδα του

miR-21

μαζί με μια ταυτόχρονη αύξηση στην έκφραση PDCD4. Αυτά

in vitro

ευρήματα επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου του προστάτη. Η στοματική χορήγηση της ρεσβερατρόλης δεν ανέστειλε μόνο την ανάπτυξη του όγκου, αλλά επίσης μείωσε την συχνότητα εμφάνισης και τον αριθμό των μεταστατικών βλαβών του πνεύμονα. Αυτά από όγκο και μεταστατικούς-κατασταλτικά αποτελέσματα της ρεσβερατρόλης συσχετίστηκαν με μειωμένη

miR-21

και pAkt, και αυξημένα επίπεδα PDCD4. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν κατά του όγκου της ρεσβερατρόλης σε DU145 και LNCaP κύτταρα καρκίνου του προστάτη που σχετίζεται με την καταστολή της Akt και PDCD4, αλλά ανεξάρτητα από

miR-21

.Οι στοιχεία δείχνουν ότι οι δράσεις αντι-όγκου της ρεσβερατρόλης στον προστάτη ο καρκίνος θα μπορούσε να εξηγηθεί, εν μέρει, μέσω της αναστολής της Akt /

miR-21

μονοπατιού σηματοδότησης

Παράθεση:. Sheth S, Jajoo S, Kaur Τ, Mukherjea D, Sheehan Κ, Rybak LP , et al. (2012) Η ρεσβερατρόλη Μειώνει προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου και μετάσταση, αναστέλλοντας την Akt /microRNA-21 Διαδρομή. PLoS ONE 7 (12): e51655. doi: 10.1371 /journal.pone.0051655

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 8 Μαρτίου του 2012? Αποδεκτές: 5, Νοέμβρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 13, Δεκεμβρίου 2012

Copyright: © 2012 Sheth et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ Grant (R15CA135494), SIU της Ιατρικής Σχολής του Κέντρου Καρκίνου Grant και SIU της Ιατρικής Σχολής του Αριστείο Βραβείο Ακαδημαϊκής Ιατρικής σε VR. SJ υποστηρίχθηκε από το Υπουργείο Άμυνας των ΗΠΑ Grant (PC100127). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ένας αριθμός φυσικών προϊόντων, όπως η κουρκουμίνη, ισοφλαβόνη, ρεσβερατρόλη και epigallactocatechin-3-gallate (EGCG), η αποτελεσματικότητα δείχνουν στον έλεγχο της ανάπτυξης και μετάστασης των διαφόρων μορφών καρκίνου [1]. Μελέτες δείχνουν ότι η διαιτητική πρόσληψη ορισμένων από τα προϊόντα αυτά θα μπορούσε να βοηθήσει στην πρόληψη του καρκίνου ή να ενισχύσει την αποτελεσματικότητα των τυποποιημένων χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Η ρεσβερατρόλη (trans-3, 4, 5-τριυδροξυστιλβένιο) είναι ένα πολυφαινολικά αντιοξειδωτικά που βρέθηκαν στα φιστίκια, τα σταφύλια και το κόκκινο κρασί [2], [3], η οποία διαθέτει σημαντικά οφέλη για την υγεία [4]. Αυτή η ένωση έχει δείξει ευεργετικά αποτελέσματα σε πειραματικά μοντέλα καρκίνου, όπου καταστέλλει την έναρξη, προαγωγή και πρόοδο των όγκων [5]. Πρόσφατες μελέτες έχουν ενοχοποιήσει την ενεργοποίηση του αποπτωτικού μονοπατιού ως μηχανισμός που αντιπροσωπεύουν τα οφέλη κατά του όγκου της ρεσβερατρόλης. Για παράδειγμα, η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση των ανθρώπινων DU145 καρκινώματος κυττάρων του προστάτη [6] και οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία κυττάρων [7]. Η ρεσβερατρόλη παράγει επίσης διακοπή του κυτταρικού κύκλου των PC3 και DU145 ανδρογόνου αναίσθητη κύτταρα [8]. Σε ένα μοντέλο ποντικού Διαγονιδιακά Αδενοκαρκίνωμα Mouse προστάτη (TRAMP), η ρεσβερατρόλη αποδείχθηκε ότι εξασκούν δράση κατά του όγκου της αυξάνοντας την έκφραση του υποδοχέα οιστρογόνου-β και με τη μείωση παράγοντα ανάπτυξης ινσουλίνης 1-(IGF-1) και εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάση 1 /2 (ERK1 /2) φωσφορυλίωση [9]. Οι τελευταίες δράσεις της ρεσβερατρόλης θα μπορούσε να παραχθεί από την ικανότητά της να χρησιμεύσει ως ένας αγωνιστής /ανταγωνιστής στους υποδοχείς οιστρογόνων επί κυττάρων καρκίνου του προστάτη [10].

Προκλινικές μελέτες δείχνουν ευεργετικές δράσεις της ρεσβερατρόλης στην πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου, με λίγα συνδέονται παρενέργειες. Μια μελέτη των επιδημιολογικών δέκα χρόνια παρουσίασαν μείωση μεγαλύτερη από 50% του κινδύνου καρκίνου του μαστού σε γυναίκες που έλαβαν ρεσβερατρόλη με την κατανάλωση σταφυλιών, αλλά δεν το κρασί [11]. Αρκετές φάσης Ι και φάσης ΙΙ των κλινικών δοκιμών είναι σε εξέλιξη για την ρεσβερατρόλη στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (http: /clinicaltrials.gov). Για παράδειγμα, η ρεσβερατρόλη του παρόντος εξετάζεται στη φάση Ι δοκιμές κατά μονοπάτι Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Η ρεσβερατρόλη έχει επίσης χρησιμοποιηθεί σε μελέτες Φάσης ΙΙ σε ασθενείς με λέμφωμα [12].

Η αποτελεσματικότητα των φυσικών προϊόντων, όπως η ρεσβερατρόλη, θα μπορούσε να εξηγηθεί, τουλάχιστον εν μέρει, μέσω της ρύθμισης τους microRNAs (miRNAs) [ ,,,0],13]. MiRNAs είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs που ρυθμίζουν την κωδικοποίηση RNAs στο μετα-μεταγραφικό επίπεδο [14]. Αρκετές πρόσφατες αναφορές εμπλέκουν miRNAs στην ανάπτυξη και μετάσταση διαφόρων καρκίνων [15], [16]. Up-ρύθμιση του

ΜΙΚ

21 έχει ανιχνευθεί σε έναν αριθμό καρκίνων [14], συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη [17], [18], [19], υποδηλώνοντας ότι αυτό το miRNA μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτη για αυτοί οι καρκίνοι. Αρκετές μελέτες έχουν ενοχοποιήσει

miR-21

στην ογκογένεση. Για παράδειγμα,

miR-21

ρυθμίζει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του μαστού (MCF7)

in vitro

και σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού [20]. Αυτοί οι ερευνητές στη συνέχεια έδειξε ότι

miR-21

ρυθμιζόμενη καρκίνου του μαστού μετάσταση από τα κάτω ρύθμιση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, όπως προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο 4 (PDCD4) και maspin [21].

MiR-21

έχει επίσης ενοχοποιηθεί στον πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων ηπατοκυτταρικού μειώνοντας την φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10 (ΡΤΕΝ) [22]. Επιπλέον,

miR-21

ρυθμίζει ενδαγγείωση καρκίνο του παχέος εντέρου και μετάσταση του καρκίνου του παχέος εντέρου με τη στόχευση PDCD4 για ρύθμιση προς τα κάτω [23]. Πρόσφατες αναφορές έχουν επίσης εντοπιστεί υποδοχέα μορφογενετικής πρωτεΐνης οστού II (BMPRII) [24] και την πλούσια lucine επανάληψης (σε FLII) αλληλεπιδρώντας πρωτεΐνη 1 (LRRFIP1) [25] ως στόχοι του

miR-21

. Αναστολή της

miR-21

αυξημένη απόπτωση των ανθρώπινων κυττάρων γλοιοβλαστώματος [26], υποδηλώνοντας ένα αντι-αποπτωτικό ρόλο αυτού του miRNA. Το αντι-αποπτωτικό ρόλο του

miR-21

αποδίδεται επίσης στην επαγωγή αντιαποπτωτικού πρωτεΐνης Bcl-2 [20] και, ενδεχομένως, με την ενεργοποίηση του πυρηνικού παράγοντα (NF) -κB [27].

σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η ρεσβερατρόλη μειώνει τη βιωσιμότητα και διεισδυτικότητα των κυττάρων PC-3M-MM2 σε καλλιέργεια και ανάπτυξη του όγκου σε μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού με αναστολή

miR-21

έκφρασης. Η δράση αυτή διαμεσολαβείται από την αναστολή της Akt, ανάντη ρυθμιστή της

miR-21

γονίδιο.

Δοκιμασία

MTS διεξήχθη επί κυττάρων PC-3M-MM2 αγωγή με φορέα ή διάφορες συγκεντρώσεις ρεσβερατρόλης ( 5-100 μΜ) για 72 ώρες η οποία έδειξε ότι η ρεσβερατρόλη δοσοεξαρτώμενο μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων.

B,

μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων με ρεσβερατρόλη ήταν εξαρτώμενη από το χρόνο στις ομάδες που έλαβαν ρεσβερατρόλη (25 και 50 μΜ) σε σύγκριση με όχημα.

C,

ρεσβερατρόλη (25 και 50 μΜ) αυξημένη απόπτωση των κυττάρων PC-3M-MM2 σε χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, όπως προσδιορίζεται με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ χρώση.

D,

ρεσβερατρόλη (25 μΜ) αυξημένη απόπτωση των κυττάρων PC-3M-MM2, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία TUNEL. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ρεσβερατρόλη για 24 ώρες και χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμασίες TUNEL, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. χρώση DAPI χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση κυτταρικών πυρήνων. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. μπαρ κλίμακας αντιπροσωπεύει 100 μm.

E,

Μπαρ γράφημα δείχνουν την επί τοις εκατό των αποπτωτικών κυττάρων σε παρουσία 25 μΜ ρεσβερατρόλης φαίνεται στο

D

. Τα στοιχεία δείχνουν μέση ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Αστερίσκο (*) δηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05). Από τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

διεξήχθησαν Όλες οι μελέτες σε ζώα σύμφωνα με τα Εθνικά Ινστιτούτα κατευθυντήριες γραμμές για τη χρήση ζωικών Υγείας και ένα πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Southern Illinois University School of Medicine Εργαστήριο Φροντίδα ζώων και Επιτροπή χρήσης.

Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής αναλύσεις έγιναν σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με όχημα ή ρεσβερατρόλη (25 και 50 μΜ) για 24 ώρες. Η ρεσβερατρόλη ανέστειλε σημαντικά τη μετανάστευση των κυττάρων εντός του απογυμνωμένες περιοχές, όπως υποδεικνύεται από διπλά βέλη

(Α)

και στο διάγραμμα μπάρα

(Β)

.

C, D,

τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden εισβολή έδειξαν ότι η ρεσβερατρόλη (25 και 50 μΜ) αγωγή για 24 ώρες ανέστειλε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων PC-3M-MM2 όπως υποδεικνύεται από κόκκινο βέλος

(C)

. Αντιπροσωπευτικά εικόνες των μεταστατικών κυττάρων ανά ομάδα θεραπείας απεικονίζεται. Τα στοιχεία που παρουσιάζονται στο διάγραμμα γραμμή

(Β, D)

είναι μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Αστερίσκο (*) δηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05). Από τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

γονίδιο microRNA προφίλ ποικιλία των γονιδίων που ρυθμίζονται από τη ρεσβερατρόλη. κύτταρα PC-3M-MM2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή ρεσβερατρόλη (25 μΜ) για 24 ώρες, μετά από το οποίο απομονώθηκε το ολικό RNA. Τα δείγματα στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση μικροσυστοιχιών για την ανίχνευση εκείνων

Mirs

που είναι γνωστό ότι ρυθμίζονται σε καρκίνο του προστάτη [19] χρησιμοποιώντας γονίδιο τσιπ Affymetrix (βλέπε Μέθοδοι). Πάνελ συγκρίνετε

miRNA

προφίλ του οχήματος και η ρεσβερατρόλη επεξεργασμένα κύτταρα PC-3M-mm2. Η ένταση του κόκκινου και του πράσινου χρώματος δείχνει την έκταση της επάνω και κάτω ρύθμιση των

miRNAs,

αντίστοιχα. Παρόμοιες μελέτες διεξήχθησαν σε τρία ανεξάρτητα δείγματα για κάθε ομάδα θεραπείας. Η μεγαλύτερη αλλαγή παρατηρήθηκε για

miR-21

όπως υποδεικνύεται.

Β,

ρεσβερατρόλη μειώνει

miR-21

επίπεδα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. κύτταρα PC-3M-MM2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή ρεσβερατρόλη (5-100 μΜ) για 24 ώρες, μετά από το οποίο απομονώθηκε το ολικό RNA και

miR-21

επίπεδα ανιχνεύθηκαν με ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας TaqMan® miRNA χημική δοκιμή.

C, D,

ρεσβερατρόλη αυξάνει τα επίπεδα του PDCD4 και maspin με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. κύτταρα PC-3M-MM2 υπέστησαν αγωγή είτε με όχημα ή ρεσβερατρόλης (5-100 μΜ) για 24 ώρες, μετά την οποία λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν για κηλίδωση Western για την ανίχνευση του PDCD4 και maspin, αντίστοιχα.

Ε,

ρεσβερατρόλη αυξημένη δραστηριότητα λουσιφεράσης PDCD4. Το πλασμίδιο που περιέχει PDCD4 3 ‘UTR εισαχθεί καθοδικά της αλληλουχίας κωδικοποίησης λουσιφεράσης μορφομετατράπηκε εντός των κυττάρων PC-3M-MM2 για 48 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ρεσβερατρόλη (25 μΜ) για 24 ώρες, μετά την οποία παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία λουσιφεράσης κυτταρολύματα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Αστερίσκο (*) δηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05). Από τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

Cell Culture

Πολύ επεμβατική, ανδρογόνο-ανεξάρτητες ανθρώπινου καρκινώματος του προστάτη PC-3M-MM2 κύτταρα ελήφθησαν από το Δρ Kounosuke Watabe (SIU Ιατρική Σχολή, Springfield, IL). Αυτή η κυτταρική γραμμή προέρχεται από οστά μεταστατικό κυτταρικές καλλιέργειες του ενδο-καρδιακής ενέσεις κυττάρων PC-3M-MM1 σε γυμνά ποντίκια [28]. κύτταρα PC-3M-MM1 με τη σειρά τους προήλθαν από τα κύτταρα PC-3M [28], τα οποία είναι μια επιθετική παραλλαγή του PC-3 κύτταρα [29]. Άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, DU145 και LNCaP, παρεσχέθησαν ευγενώς από τον Dr. Daotai Nie (SIU School of Medicine, Springfield, IL). Όλες οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA), 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 25 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA ). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν στους 37 ° C υπό την παρουσία

2 και 95% του αέρα του περιβάλλοντος 5% CO. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε πλήρες μέσο χρησιμοποιώντας συρρέουσες μονοστοιβάδες, εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά.

Α,

Western blot των ολόκληρων κυτταρικών λυμάτων των κυττάρων PC-3M-MM2 επιμολυσμένα με είτε σκαρφάλωμα ή PDCD4 siRNA (10 ηΜ) για 48 ώρες έδειξε κάτω ρύθμιση των επιπέδων PDCD4 και μειωμένη απόκριση σε ρεσβερατρόλη (25 μΜ). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ρεσβερατρόλη για 24 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA.

B,

PDCD4 siRNA (10 ηΜ) μείωσε σημαντικά την ικανότητα της ρεσβερατρόλης (25 μΜ) για την αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων PC-3M-MM2 όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία MTS. Μετά από 24 ώρες siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και εκτίθενται σε ρεσβερατρόλη για 72 ώρες.

C,

PDCD4 siRNA αναστρέφει μερικώς την ικανότητα της ρεσβερατρόλης να επάγει απόπτωση σε κύτταρα PC-3M-mm2. δοκιμασία απόπτωση διεξήχθη με αννεξίνη χρώση V-FITC μετά από 48 ώρες της ρεσβερατρόλης (25 μΜ) αγωγή μετά από 24 ώρες από την επιμόλυνση siRNA.

D, E,

PDCD4 siRNA (10 ηΜ) μπλοκάρει την ικανότητα της ρεσβερατρόλης (25 μΜ) για την αναστολή της μετανάστευσης των κυττάρων PC-3M-MM2 σε πληγή δοκιμασία επούλωσης όπως αποδεικνύεται από τα διπλά βέλη

(D )

. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν για 24 ώρες, μετά τις οποίες δημιουργήθηκε η πληγή και οι εικόνες λήφθηκαν σε χρόνο, 0 h. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με ρεσβερατρόλη για 24 ώρες και οι εικόνες ελήφθησαν και πάλι. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. Τα δεδομένα από

(D)

παρουσιάζονται στο διάγραμμα μπαρ στο

(Ε)

.

F,

PDCD4 siRNA (10 ηΜ) αντιστρέφεται ρεσβερατρόλη επαγόμενη αναστολή της εισβολής κυττάρων PC-3M-MM2 σε τροποποιημένη δοκιμασία θαλάμου Boyden εισβολή. Κύτταρα επιμολύνθηκαν σε φιάλες για 24 ώρες πριν από την σπορά τους στο επάνω διαμέρισμα. Τα στοιχεία δείχνουν μέση ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. (*), (**) Και (***) δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) από αγωνίζομαι siRNA, από ρεσβερατρόλη + αγωνίζομαι siRNA και από τις ομάδες θεραπείας PDCD4 siRNA, αντιστοίχως

Η

. κύτταρα επιμολυσμένα με το

προ-miR-21

(30 nm) έδειξε αυξημένα επίπεδα του

miR-21

. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με

προ-miR-21

αλληλουχία για 48 ώρες και στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό των

miR-21

επίπεδα με ποσοτική RT-PCR με χρήση του προσδιορισμού TaqMan® miRNA. κύτταρα ελέγχου επιμολύνθηκαν με τα ανακατωμένα

προ-miR.

Β,

Pre-miR-21

(30 nM) επιμόλυνση μειώθηκαν τα επίπεδα των PDCD4 και εξασθενεί την απόκριση της ρεσβερατρόλης (25 μΜ για 24 ώρες), όπως καθορίζεται από τη Δυτική λέκιασμα.

C,

Pre-miR-21

(30 nM) αντιστραφεί η ρεσβερατρόλη που προκαλείται από την αναστολή της εισβολής των κυττάρων PC-3M-MM2 στην τροποποιημένη δοκιμασία θάλαμο εισβολή Boyden.

D, E,

Wound δοκιμασία δείχνει αναστροφή της ρεσβερατρόλης που προκαλείται αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης PC-3M-MM2 θεραπεύοντας

προ-miR-21

(30 ηΜ). Αντιπροσωπευτικά εικόνες. Τα δεδομένα σε ιστογράμματα που παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Οι αστερίσκοι (*), (**) και (***) δείχνουν στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05) από αγωνίζομαι επεξεργασμένο ελέγχου, η ρεσβερατρόλη + αγωνίζομαι

προ-miR

και

προ-ΜΙΚ 21

επιμολυσμένα κύτταρα PC-3M-MM2, αντίστοιχα.

Η

Αντιδραστήρια

Η ρεσβερατρόλη και LY294002 αγοράστηκαν από την Sigma Chemical, Co (St. Louis, ΜΟ).

Pre-miR-21

ολιγονουκλεοτιδίων,

προ-miR

αρνητικού ελέγχου, PDCD4 siRNA και αρνητικές siRNA ελέγχου αγοράστηκαν από την Ambion (Houston, TX). Αντι-PDCD4 αντισώματος ήταν από Epitomics, Inc (Burlingame, CA), ενώ αντισώματα έναντι φωσφο-Ακί αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Αντισώματα έναντι maspin και Akt αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA) και αντίσωμα αντι-β-ακτίνης αγοράστηκε από την Sigma Chemical, Co. Όλα τα αντιδραστήρια και τα εφόδια ήταν υψηλότερη διαθέσιμη βαθμό και αγοράστηκαν από τις συνήθεις πηγές.

Η ρεσβερατρόλη αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της Akt σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. κύτταρα PC-3M-MM2 εκτέθηκαν σε όχημα ή διαφορετικές δόσεις ρεσβερατρόλης (5-100 μΜ) για 24 ώρες και τα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου που παρασκευάζονται από αυτά τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western.

Β,

αναστολή της φωσφορυλίωσης της Akt από LY294002. κύτταρα PC-3M-MM2 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 (10 μΜ), έναν αναστολέα ΡΙ3 κινάσης, για 24 ώρες και χρησιμοποιείται για την κηλίδωση Western για την αξιολόγηση Akt ενεργοποίηση.

αναστολή C,

Akt μειωμένη

miR-21

επίπεδα, όπως προσδιορίζεται από την ανάλυση συστοιχία microRNA. κύτταρα PC-3M-MM2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή LY294002 (10 μΜ) για 24 ώρες, μετά από το οποίο απομονώθηκε το ολικό RNA. Τα δείγματα του RNA στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε ανάλυση μικροσυστοιχιών του

Mirs

. Οι

Mirs

που είναι γνωστό ότι ρυθμίζεται με καρκίνο του προστάτη [19] παρουσιάζονται με τη χρήση γονιδιακής τσιπ Affymetrix. Πάνελ συγκρίνετε

miRNA

προφίλ του οχήματος και LY294002 επεξεργασμένα κύτταρα PC-3M-mm2. Η ένταση του κόκκινου και του πράσινου χρώματος δείχνει την έκταση της επάνω και κάτω ρύθμιση των

miRNAs

, αντίστοιχα. Παρόμοιες μελέτες διεξήχθησαν σε τρία ανεξάρτητα δείγματα για κάθε ομάδες θεραπείας.

D,

LY294002 αυξημένα επίπεδα PDCD4. κύτταρα PC-3M-MM2 εκτέθηκαν σε LY294002 (10 μΜ) για 24 ώρες και χρησιμοποιείται για την κηλίδωση Western.

Ε,

LY294002 αυξημένη δραστηριότητα PDCD4-λουσιφεράσης. Το πλασμίδιο που περιέχει PDCD4 3′-UTR καθοδικά της αλληλουχίας που κωδικοποιεί το γονίδιο λουσιφεράσης μορφομετατράπηκε εντός των κυττάρων PC-3M-MM2 για 48 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με LY294002 (10 μΜ) για 24 ώρες, μετά την οποία παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε δοκιμασία λουσιφεράσης κυτταρολύματα. Τα δεδομένα σε ραβδόγραμμα παρουσιάζεται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Ο αστερίσκος (*) υποδεικνύουν στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05). Από κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

κύτταρα PC-3M-MM2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα ή LY294002 (10 μΜ) για 72 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS.

B,

LY294002 (10 μΜ) αγωγή για 48 ώρες επαγόμενη απόπτωση σε κύτταρα PC-3M-MM2 όπως προσδιορίζεται με Αννεξίνη V-FITC και ΡΙ χρώση η οποία προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής.

C,

LY294002 (10 μΜ) αυξημένη απόπτωση των κυττάρων PC-3M-MM2, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία TUNEL. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LY294002 για 24 ώρες και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για δοκιμασία TUNEL, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. χρώση DAPI χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση κυτταρικών πυρήνων. Αντιπροσωπευτικά εικόνες. μπαρ κλίμακας είναι 100 μm. Μπαρ γράφημα

(D)

δείχνει το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε παρουσία 10 μΜ LY294002.

E, F,

LY294002 (10 μΜ) έκθεση για 24 ώρες μειωμένη μετανάστευση των κυττάρων PC-3M-MM2, όπως προσδιορίζεται με δοκιμασία επούλωσης της πληγής. Αντιπροσωπευτικά εικόνες.

G,

LY294002 (10 μΜ) έκθεση για 24 ώρες μείωσε την ικανότητα εισβολής των κυττάρων PC-3M-MM2, όπως προσδιορίζεται με τροποποιημένη δοκιμασία διαμερίσματος Boyden. Τα δεδομένα σε ιστογράμματα που παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SEM από τουλάχιστον 3 ανεξάρτητα πειράματα. Αστερίσκο (*) δηλώνει στατιστικά σημαντική διαφορά (p & lt? 0,05). Από τα κύτταρα υπό αγωγή με όχημα

Η

Η ρεσβερατρόλη κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Δώδεκα SCID ποντικοί διαιρέθηκαν εξίσου σε δύο θεραπεία ομάδες- οχήματος και ρεσβερατρόλης (20 mg /kg σωματικού βάρους). Τα φάρμακα χορηγήθηκαν από του στόματος καθετηριασμό κάθε δεύτερη ημέρα μέχρι το τέλος της μελέτης. Λουσιφεράσης-tagged κύτταρα PC-3M-mm2 (1 × 10

6) ενέθηκαν στην περιοχή του πλευρού του κάθε ποντικού την ημέρα 8 (βέλος) της αγωγής ρεσβερατρόλη και στη συνέχεια παρακολουθούνται για την ανάπτυξη του όγκου. ποντίκια που έλαβαν ρεσβερατρόλη έδειξε κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου

(Α)

, μειώνεται το σήμα της λουσιφεράσης

(Β, Γ)

και μικρότερους όγκους

(D)

. Αντιπροσωπευτικές εικόνες φαίνεται στο

(Β)

και

(D)

, ενώ τα ιστογράμματα στο

(C)

και

(D)

αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SEM έξη ποντίκια από κάθε ομάδα θεραπείας.

Ε,

όγκοι απομονώθηκαν από ποντίκια ρεσβερατρόλη που έλαβαν παρουσίασαν μειωμένα επίπεδα

miR-21

όπως προσδιορίζεται με τη δοκιμασία TaqMan®.

F,

ρεσβερατρόλη ρυθμίζει την έκφραση pAkt και PDCD4 στον ιστό του όγκου. Απομονωμένη όγκους από φορέα και ρεσβερατρόλη αγωγή ποντίκια κόπηκαν για ανοσοϊστοχημική χρώση για pAkt και PDCD4. μπαρ κλίμακα είναι 50 μm. Ο αστερίσκος (*) υποδηλώνει στατιστικώς σημαντική διαφορά (ρ & lt? 0,05). Από ποντικούς υπό αγωγή με όχημα

Η

SCID ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με έκδοχο (n = 4) ή ρεσβερατρόλη (20 mg /kg σωματικού βάρους) (n = 6), μέσω του στόματος καθετηριασμό, κάθε δεύτερη ημέρα μέχρι το τέλος της μελέτης, αρχίζοντας μία εβδομάδα πριν από την ένεση των κυττάρων PC-3M-mm2 (1 × 10

6), iv μέσω της φλέβας της ουράς. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με ρεσβερατρόλη έδειξε μειωμένη σημαντικά τον αριθμό των μεταστατικών βλαβών (βέλος). Αντιπροσωπευτικά εικόνες των πνευμόνων από ένα ποντίκι ανά ομάδα θεραπείας παρουσιάζεται.

Η

Κυττάρου Δοκιμασία Βιωσιμότητας (MTS Δοκιμασία)

In vitro πολλαπλασιασμό των κυττάρων

PC-3M-MM2 διεξήχθη με χρήση CellTiter 96® υδατικό Ένα διάλυμα της δοκιμασίας κυτταρικού πολλαπλασιασμού Kit (Promega, Madison, WI) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Εν συντομία, 2500 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων. Μετά τις αντίστοιχες θεραπείες, τα κύτταρα αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 72 ώρες. Μετά από 72 ώρες, 20 μΙ CellTiter 96 Υδατικό αντιδραστήριο Ένα διάλυμα προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο σε 100 μΙ του συνολικού όγκου των μέσων. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 3 έως 4 ώρες, και η απορρόφηση καταγράφηκε στα 490 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας ELISA. Η απορρόφηση είναι ευθέως ανάλογη με τον αριθμό των ζωντανών κυττάρων και εκφράζεται ως επί τοις εκατό σε σχέση με κύτταρα υπό αγωγή με όχημα.

Η απόπτωση Ανίχνευση με Κυτταρομετρία Ροής

κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης προσδιορίστηκε με χρήση FITC kit -AnnexinV απόπτωση ανίχνευση (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) και ποσοτικοποιείται με κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [30]. Εν συντομία, στο τέλος του χρόνου θεραπείας, τα κύτταρα PC-3M-MM2 πλύθηκαν μία φορά με φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικά (PBS) και συλλέγονται σε ένα διάλυμα θρυψίνης /ΕϋΤΑ 0,5% στους 37 ° C, φυγοκεντρείται στα 220 χ

g

για 5 λεπτά και στη συνέχεια αμέσως επαναιωρήθηκε σε φυσιολογικό ρυθμιστικό διάλυμα (1Χ) που παρέχεται στο κιτ. Κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα /500 μΙ) στη συνέχεια διατηρήθηκαν στο σκοτάδι για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 5 μΐ τόσο ιωδιούχο προπίδιο και FITC ανεξίνη V, μετά την οποία τα δείγματα αναλύθηκαν αμέσως από την BD Biosciences

FACSCalibur

κυτταρόμετρο ροής (San Jose, CA). Τα αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA).

Η απόπτωση Ανίχνευση με TUNEL Δοκιμασία

κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης σε κύτταρα PC-3M-MM2 ανιχνεύθηκε με TUNEL προσδιορισμός χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης κατακερματισμό φλουορεσκεΐνη FragELTM DNA (EMD Biosciences). Συνοπτικά, μονοστιβάδες κυττάρων PC-3M-MM2 καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες. Στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα στη συνέχεια

διαπερατά

χρησιμοποιώντας πρωτεϊνάση Κ (1:100 αραίωση) (που παρέχεται στο κιτ) για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στο τέλος της επώασης τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με 1Χ Τρις-ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (TBS). Ακολουθώντας την οποία επωάστηκαν με ρυθμιστικό εξισορρόπησης 1Χ TdT για 10-30 λεπτά. Μετά την επώαση ήταν πάνω, 60 μΙ TdT μίγματος αντίδρασης επισήμανσης εφαρμόστηκε σε κάθε καλυπτρίδα και τοποθετήθηκαν σε θάλαμο υγρασίας και επωάστηκαν για 1-1.5 ώρες στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν δύο φορές με 1Χ TBS. Τα κύτταρα που περιέχουν γυάλινες καλυπτρίδες στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας φλουορεσκεΐνη-FragELTM μέσα στερέωσης. Περίσσεια των μέσων στερέωσης σκουπίστηκε και τα άκρα σφραγίστηκαν με τη χρήση βερνίκι νυχιών. Διαφάνειες στη συνέχεια απεικονίζονται χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο του Ολύμπου (Olympus America Inc., Melville, ΝΥ).

Τροποποιημένο επούλωση της πληγής Δοκιμασία

Ίδιος αριθμός κύτταρα τοποθετήθηκαν σε κάθε φρεάτιο δώδεκα καλά τρυβλία καλλιέργειας. Αφού τα κύτταρα έφθασαν 70% σε 80% συρροή, μια γραμμή ήταν γδαρμένο στη μέση του φρεατίου χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας για τη δημιουργία ενός τραύματος. αντίθεση διαφορικής παρεμβολής (DIC) εικόνες της απογυμνωμένη περιοχή σε τρία τυχαία πεδία ανά καθώς συνελήφθησαν από ομοεστιακό μικροσκόπιο αμέσως μετά την απογύμνωση (χρόνος, 0 h). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικά αντιδραστήρια και επωάστηκαν για άλλες 24 ώρες, και οι εικόνες καταγράφηκαν ξανά. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, η περιοχή του τραύματος κλεισίματος μετριέται από το απογυμνωμένη περιοχή και ομαλοποιήθηκε ως προς τους ελέγχους υποστεί αγωγή με έκδοχο. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της PDCD4 siRNA και

προ-miR-21

επί επούλωση πληγών των κυττάρων PC-3M-MM2, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με PDCD4 siRNA,

προ-miR-21

και τα αντίστοιχα αρνητικά δείγματα αναφοράς τους για 24 ώρες μετά από το οποίο δημιουργήθηκε η πληγή και οι εικόνες λήφθηκαν σε χρόνο, 0 h.

Τροποποιημένο Boyden Invasion Δοκιμασία τμήμα

η ικανότητα των κυττάρων καρκίνου του προστάτη να μεταναστεύουν μέσω Matrigel επικαλυμμένων μεμβρανών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας θαλάμους 24 φρεατίων BD Biocoat Matrigel εισβολής (BD Biosciences, San Jose, CA). κύτταρα PC-3M-mm2 (5 × 10

4) αιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας χωρίς ορό και σπάρθηκαν στο άνω διαμέρισμα του θαλάμου εισβολής που ακολουθείται από τις αντίστοιχες θεραπείες. Πλήρης media προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Στο τέλος των 24 ωρών, οι κυτταρικές ένθετα αφαιρέθηκαν, και τα κύτταρα σκουπίζονται προσεκτικά από την άνω επιφάνεια της μεμβράνης με ένα βαμβάκι. Τα κύτταρα επεμβατική προσκολλημένο στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με 100% μεθανόλη και 1% κυανούν της τολουϊδίνης, αντίστοιχα. Οι εικόνες ελήφθησαν υπό μικροσκόπιο φωτός χρησιμοποιώντας ένα 20χ αντικειμενικό. Συνολικός αριθμός εισέβαλε κυττάρων με το χέρι μετρήθηκαν σε τέσσερις τυχαία επιλεγμένους τομείς ανά θεραπεία ανά ένθετο. Για τη μελέτη των επιπτώσεων της PDCD4 siRNA και

προ-miR-21

, κύτταρα PC-3M-MM2 επιμολύνονται με PDCD4 siRNA,

προ-miR-21

και τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες για 24 ώρες πριν από την σπορά τους στην κορυφή διαμέρισμα.

Ανάλυση Western Blot

στο τέλος της θεραπείας, τα κύτταρα PC-3M-MM2 πλύθηκαν με παγωμένο 1Χ PBS και ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας μία συσκευή υπερήχων σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα λύει που περιέχει 50 mM Tris HCI, 10 mM MgCl2 και 1 mM EDTA σε παρουσία μίγματος αναστολέων πρωτεάσης (Sigma) και αναστολέα φωσφατάσης 1 (1:100) (Sigma). Οι ολόκληρων κυττάρων προϊόντα λύσης στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [31]. Εν συντομία, η συγκέντρωση πρωτεΐνης προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Bradford και ίση ποσότητα πρωτεΐνης από κάθε δείγμα αναμείχθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα διαλυτοποίησης (20% SDS, 1Μ Tris, 20% γλυκερόλη και πρέζα βρωμοφαινόλης μπλε) και θερμάνθηκε σε υδατόλουτρο στους 95 ° C για 5 min. Τα δείγματα στη συνέχεια αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου SDS. Οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης, αποκλείστηκε σε ένα διάλυμα που περιέχει 10Χ PBS, 10 mM EDTA, 20% TritonX-100 και 5% χαμηλών λιπαρών αποβουτυρωμένο γάλα για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύχτα με το πρωτογενές αντίσωμα. Μετά από τρεις πλύσεις σε διάλυμα αποκλεισμού (BLOTTO), στυπώματα επωάστηκαν με υπεροξειδάση αρμορακίας-επισημασμένο είδος ειδικού δευτερογενές αντίσωμα IgG για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, πλύθηκαν τρεις φορές με 1Χ TBS που περιέχει 1% Tween20. Αυτό ακολουθήθηκε από τρεις πλύσεις με 1Χ TBS, χωρίς Tween 20. Η κηλίδα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ECL συν το αντιδραστήριο (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL) και οπτικοποιήθηκαν με χρήση συζευγμένου φορτίου συσκευή LAS 4000 (Fujifilm Βόρεια Αμερική Corporation, Valhalla, ΝΥ). Η πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών διεξήχθη με χρήση MultiGauge έκδοση λογισμικού 2.0. Μεμονωμένα ζώνες ομαλοποιήθηκαν είτε Σύνολο-Ακί ή β-ακτίνη ως ο λόγος της πρωτεΐνης-στόχου. Αυτό ήταν περισσότερο κανονικοποιημένη ως% του ελέγχου από τη λήψη των τιμών του ελέγχου ως 100%.

ολιγονουκλεοτιδίων και σύντομης παρεμβολής (SI) RNA Οι επιμολύνσεις

Συνθετικά

προ-miR-21

(30 ng) (ID # PM10206, Ambion, Austin, TX), PDCD4 siRNA (10 ng) (ID siRNA # s223740, Ambion) και τα αντίστοιχα αρνητικά τους ελέγχους τους παραδόθηκαν σε κύτταρα PC-3M-MM2 χρησιμοποιώντας Lipofectamine ™ RNAiMAX ( Life Technologies Corp., Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα PC-3M-MM2 σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε 30% συρροή. Την επόμενη ημέρα, κατάλληλη ποσότητα

προ-miR-21

ή PDCD4 siRNA και αρνητικοί έλεγχοι τους αραιώθηκαν σε 100 μΐ μέσου άνευ ορού και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 15 έως 20 λεπτά με 5 μΙ Lipofectamine ™ αντιδραστήριο επιμόλυνσης RNAiMAX να επιτρέψει το σχηματισμό συμπλοκών διαμόλυνση, τα οποία προστέθηκαν στις κυτταρικές καλλιέργειες με προσεκτική περιδίνηση των τρυβλίων. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο μετά από 5-6 ώρες και τα κύτταρα επωάστηκαν για 48 ώρες. Για όλες τις άλλες επόμενα πειράματα, το ίδιο πρωτόκολλο ακολουθήθηκε εκτός αν ορίζεται διαφορετικά.

Απομόνωση RNA, αντίστροφη μεταγραφή και TaqMan PCR Πραγματικού χρόνου

Απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα PC-3M-MM2 και καρκινικούς ιστούς διεξήχθη χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο QIAzol Λύσης (Qiagen, Valencia, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

MiR-21

cDNA παρήχθη από 200 ng του συνολικού RNA το οποίο μεταγράφηκε ανάστροφα χρησιμοποιώντας

HSA-miR-21

ομάδα εκκινητών qRT-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) και TaqMan ® microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (RT) kit (Applied Biosystems). Κάθε αντίδραση RT περιείχε 1Χ RT ειδικό εκκινητή, 1Χ RT ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης, 0,15 μΙ 100 mM dNTPs, 50 U /μl ένζυμο MultiScribe RT και 3,8 U αναστολέα ΚΝάσης /μl. Το 15 μλ μίγματος αντίδρασης στη συνέχεια επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 16 ° C, 30 λεπτά στους 42 ° C, και 5 λεπτά στους 85 ° C και κατόπιν διατηρήθηκε στους 4 ° C σε μία PCR κυκλοποιητή. Η PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε σε Applied Biosystems StepOnePlus ™ Real-Time PCR System χρησιμοποιώντας ένα τυποποιημένο κιτ TaqMan® PCR (Applied Biosystems) πρωτόκολλο. Εν συντομία, μετά το στάδιο RT, 2 μΐ της αντίδρασης RT συνδυάστηκε με 1 μΙ 20Χ Δοκιμασία TaqMan® microRNA (πρόσθιο εκκινητή, αντίστροφο εκκινητή και ανιχνευτή) και 17 μΙ TaqMan® καθολική PCR Master Mix σε 20 μΐ τελικό όγκο. Οι αντιδράσεις επωάστηκαν στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 40 κύκλους των 95 ° C για 15 s και 60 ° C για 1 λεπτό. Ζευγάρι

miR-21

έκφραση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας το 2

-ddC

t μέθοδο σε σχέση με U6-snRNA και εκφράζονται ως φορές μεταβολής. Όλα TaqMan-PCR διεξήχθησαν εις τριπλούν.

μικροσυστοιχιών Ανάλυση

Η μικροσυστοιχία προφίλ miRNA έγινε χρησιμοποιώντας συστοιχίες Affymetrix GeneChip miRNA v1 (Santa Clara, CA) σύμφωνα με το συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή και διεξήχθη από τη διευκόλυνση CFG μικροσυστοιχιών πυρήνα (Πανεπιστήμιο στο Albany, Rensselaer, NY). Εν συντομία, 500 ng του ολικού RNA που εκχυλίζεται από τα κύτταρα σημάνθηκε με την προσθήκη πολυμεράσης πολυΑ χρησιμοποιώντας το κιτ Genisphere FlashTag HSR (Genisphere, Hatfield, ΡΑ). RNA υβριδίστηκε σε σειρά του Affymetrix miRNA v1 και σαρώνεται σε GeneChip Scanner 30007G όπως συνιστάται από τον πωλητή. Τα ακατέργαστα δεδομένα ελέγχθηκε για την ποιότητα χρησιμοποιώντας το λογισμικό εργαλείο miRNA QC (Affymetrix). Περαιτέρω ανάλυση έγινε με τη χρήση GeneSpring Gx v11.3. Όπως φαίνεται στο Σχ.