Αφηρημένο

Η επίπτωση και η θνησιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) είναι υψηλότερο στις χώρες της Αφρικής Αμερικανούς (AAS) από ό, τι άλλες εθνοτικές ομάδες στην U. S., αλλά και τους λόγους για τους διαφορές είναι άγνωστες. Πραγματοποιήσαμε προφίλ γονιδιακής έκφρασης των σποραδικές CRCs από ΣΣ έναντι της Ευρωπαϊκής Αμερικανοί (EAS) για να αξιολογήσει τη συμβολή στην CRC ανισότητες. Αξιολογήσαμε την έκφραση γονιδίων των 43 ΑΑ και 43 EA CRC όγκων συνδυάζεται με το στάδιο και 40 που ταιριάζουν κανονική του παχέος ιστούς χρησιμοποιώντας τα ανθρώπινα ολόκληρο το γονιδίωμα συστοιχίες 4x44K cDNA Agilent. Γονιδίων και οδός αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Σημασία ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM), δέκα φορές επικύρωση σταυρό, και την εφευρετικότητα Pathway Ανάλυση (IPA). SAM αποκάλυψε ότι το 95 γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ ΑΑ και των ασθενών ΕΑ σε ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη ≤5%. Χρησιμοποιώντας IPA διαπιστώσαμε ότι πιο σημαντικό νόσου και της οδού ενώσεις των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων που σχετίζονται με τη φλεγμονή και την ανοσολογική απόκριση. Δέκα φορές σταυρό επικύρωσης έδειξε ότι μετά από 10 γονίδια που μπορεί να προβλέψει την εθνικότητα με ακρίβεια 94%: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 και WDR8. Έκφραση αυτών των 10 γονιδίων που επικυρώθηκε από qRT-PCR σε ένα ανεξάρτητο σύνολο δοκιμής από 28 ασθενείς (10 AA, 18 EA). Τα αποτελέσματά μας είναι τα πρώτα που εμπλέκουν διαφορική έκφραση γονιδίων σε CRC φυλετικές ανισότητες και να αναφέρει εξέχουσα διαφορά στην CRC φλεγμονή μεταξύ των ΑΑ και των ασθενών EA. Οι διαφορές στην ευαισθησία σε φλεγμονή υποστηρίζουν την ύπαρξη διακριτών μικροπεριβάλλοντα όγκου σε αυτά τα δύο πληθυσμούς ασθενών

Παράθεση:. Jovov Β, Araujo-Perez F, Sigel CS, Stratford JK, McCoy AN, Yeh JJ, et al. (2012) διαφορική γονιδιακή έκφραση μεταξύ των αφρικανικών αμερικανικών και ευρωπαϊκών Αμερικής ορθοκολικό καρκίνο ασθενείς. PLoS ONE 7 (1): e30168. doi: 10.1371 /journal.pone.0030168

Επιμέλεια: Hassan Ashktorab, Πανεπιστήμιο Howard, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30 του Μαρτίου 2011? Αποδεκτές: 15η Δεκεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 19 του Ιαν 2012

Copyright: © 2012 Jovov et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις για γαστρεντερικού εξειδικευμένο πρόγραμμα της ερευνητικής αριστείας (GI Spore, Ρ50 106.991) και από το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας Κέντρο του γαστρεντερικού Βιολογίας και Ασθενειών (CGIBD, Ρ30 DK 34.987). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) παραμένει η πιο κοινή γαστρεντερικό καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, παρά τις πρόσφατες βελτιώσεις στη διάγνωση και θεραπεία της νόσου. Τα ποσοστά εμφάνισης και θνησιμότητας της CRC για Αφροαμερικανοί (AAS) είναι υψηλότερες από ό, τι στο γενικό πληθυσμό των ΗΠΑ [1], [2]. Πολλές επιδημιολογικές και γενετικές έρευνες έχουν επικεντρωθεί στην ΕΑ [3], [4], [5], [6] με στόχο την αποκρυπτογράφηση τους λόγους για τέτοιες διαφορές. Ενώ κανείς δεν μπορεί να προεξοφλήσει τη συμβολή των κοινωνικοοικονομικών παραγόντων, όπως ένα πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση σε συμφωνίες σύνδεσης, άλλοι βιολογικοί παράγοντες συμβάλλουν επίσης στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [4]? [7]. Ωστόσο, μια βιολογική βάση για την ύπαρξη ενός πιο επιθετική CRC στην αμερικανική ασθενείς της Αφρικής παραμένει να διευκρινιστεί περαιτέρω. Γενωμική αστάθεια είναι ένα κρίσιμο χαρακτηριστικό για την ανάπτυξη των όγκων και υπάρχουν τουλάχιστον 3 ξεχωριστές πορείες στο CRC παθογένεια: χρωμοσωμική αστάθεια (CIN), μικροδορυφόρων αστάθεια (MSI), και μονοπάτια φαινότυπο νησί CpG methylator (CIMP) [8], [9]. Οποιαδήποτε ή όλα από αυτά τα μονοπάτια μπορεί να συμβάλει σε μια πιο επιθετική βιολογίας CRC σε χώρες της Αφρικής Αμερικανούς. Πρόσφατες μελέτες συσχέτισης γονιδιώματος σε επίπεδο στο CRC κατέδειξαν όχι μόνο ισχυρές ενδείξεις για κοινή πολυμορφισμού ενός νουκλεοτιδίου (SNP) ένωση σε ένα αριθμό γονιδίων και χρωμοσωμικές περιοχές, αλλά και η γενετική ετερογένεια σε συνδυασμό CRC σε ΕΑ έναντι ΕΑ [4], [10] , [11], [12], [13]. Διαφορετικές επίπτωση της MSI και διαφορετικό επίπεδο μεθυλίωσης για λειτουργικά πολύ σχετικά γονίδια έχουν επίσης αναφερθεί ως πιθανοί παράγοντες στην CRC φυλετικές ανισότητες [8], [14], [15].

Υποθέσαμε ότι τα προφίλ της γονιδιακής έκφρασης του CRC σε ασθενείς αφρικανική-αμερικανική και την ευρωπαϊκή-αμερικανική μπορεί να αποκαλύψει βιολογικές διαφορές μεταξύ των δύο πληθυσμών που θα μπορούσε να εξηγήσει την πιο επιθετική φαινότυπο καρκίνου σε Αφρο-Αμερικανούς. Έτσι, πραγματοποιήσαμε γονιδιώματος σε επίπεδο προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε ένα μεγάλο σύνολο δειγμάτων όγκων που αντιστοιχήθηκαν για επιλεγμένες κλινικές μεταβλητές. Αναλύσαμε τα αποτελέσματά μας σχετικά με τα επίπεδα του γονιδίου και μονοπάτι για τον εντοπισμό βασικές διαφορές στη βιολογία του όγκου μεταξύ της Αφρικής και της Αμερικής και της Ευρωπαϊκής Αμερικής ασθενείς.

Μέθοδοι

Ασθενείς

Εκατόν δεκατέσσερα όγκους (86 περιλαμβάνεται στην αρχική ανάλυση και 28 για τη μελέτη επικύρωσης) και 40 φυσιολογικούς ιστούς από το de-εντοπίστηκαν ασθενών CRC ελήφθησαν από το Διοικητικό συμβούλιο Έρευνας Θεσμικές (IRB) που εγκρίθηκε το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας (UNC) διευκόλυνση ιστών Προμηθειών μετά UNC της Ιατρικής Σχολής του IRB έγκριση για τη μελέτη αυτή. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν μεταξύ του 1999 και του 2008 κατά το χρόνο της λειτουργίας και καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο. Ασθενείς με γνωστή οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση και κληρονομικά μη πολυποδίαση CRC αποκλείστηκαν. De-εντοπίστηκαν δεδομένα, συμπεριλαμβανομένων των αγώνων, των όγκων, κόμβων και μετάσταση (ΤΝΜ), βαθμού ή διαφοροποίηση, το καθεστώς του περιθωρίου κέρδους, και η επιβίωση ήταν διαθέσιμα για την πλειοψηφία των ασθενών.

Απομόνωση RNA και μικροσυστοιχιών υβριδισμός

όλα απομόνωση RNA και υβριδισμός διεξήχθη σε Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ανθρώπινο ολόκληρο το γονιδίωμα 4X44 Κ μικροσυστοιχίες DNA στο UNC. Το RNA που εξάγεται από τα δείγματα όγκων macrodissected snap-κατεψυγμένα χρησιμοποιώντας όλα τα κιτ prep (Qiagen, Valencia, CA) και ποσοτικά χρησιμοποιώντας Nanodrop φασματοφωτομετρία (ThermoScientific, Wilmington, DE). ποιότητα του RNA εκτιμήθηκε με τη χρήση του Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). επιλέχθηκε RNA για υβριδισμό χρησιμοποιώντας τον αριθμό ακεραιότητα του RNA και επιθεώρηση των 18S και 28S ριβοσωμικού RNA. Παρόμοια ποιότητα RNA επιλέχθηκε σε όλη δείγματα. Ένα μικρογραμμάριο RNA χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για cDNA παρασκευή πριν από την υβριδοποίηση σε ολόκληρο το ανθρώπινο γονιδίωμα συστοιχίες Agilent 4X44 Κ. cDNA σημάνθηκε με Cy5-dUTP και ελέγχου αναφοράς (Stratagene? Αριθμός Catalog # 740000? Agilent Technologies, Santa Clara, Καλιφόρνια? [16] σημάνθηκε με Cy3-dUTP χρησιμοποιώντας το κιτ ενίσχυσης Agilent χαμηλών εισροών RNA γραμμική και υβριδοποιήθηκαν όλη τη νύκτα στους 65 ° C έως Agilent 4X44 Κ ολόκληρη συστοιχίες ανθρώπινου γονιδιώματος. συστοιχίες πλύθηκαν και σαρώθηκαν με τη χρήση ενός σαρωτή Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

Όλα τα δεδομένα μικροσυστοιχιών είναι συμβατή μορφή MIAME και των πρώτων και επεξεργασία δεδομένων έχει έχουν κατατεθεί στο Gene Expression Omnibus (GEO)? δούμε https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/, αριθμός ένταξης:. GSE28000

μικροσυστοιχιών και στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα συστοιχία ομαλοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Lowess ομαλοποίηση. τα δεδομένα αποκλείστηκαν για τα γονίδια με την κακή ποιότητα κηλίδα ή γονίδια που δεν έχουν μια μέση ένταση μεγαλύτερη από 10 για ένα από τα δύο κανάλια (πράσινο και κόκκινο) σε τουλάχιστον 70% των πειραμάτων. Η αναλογία log2 της μέσης κόκκινο ένταση πάνω μέση ένταση πράσινου υπολογίστηκε για κάθε γονίδιο που ακολουθείται από Lowess ομαλοποίηση [17]. Τα ελλείποντα στοιχεία του καταλόγισε χρησιμοποιώντας τον καταλογισμό k-πλησιέστερων γειτόνων (KNN) με k = 10 [18]. Γονίδια που ήταν σημαντικά επέκτασης ή υποβιβασμού ρυθμίζονται ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Σημασία Ανάλυση των μικροσυστοιχιών (SAM) [19]. SAM εκχωρεί μια βαθμολογία για κάθε γονίδιο με βάση τη μεταβολή στην έκφραση γονιδίου σε σχέση με την τυπική απόκλιση των επαναλαμβανόμενων μετρήσεων. Για τα γονίδια με σκορ μεγαλύτερο από ένα ρυθμιζόμενο όριο, SAM χρησιμοποιεί μεταθέσεις των επαναλαμβανόμενων μετρήσεων για την εκτίμηση του ποσοστού των γονιδίων που εντοπίζονται κατά τύχη – το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR). παραμέτρους ανάλυσης (Delta) τέθηκαν σε οδηγήσει σε FDR≤5%.

Δίκτυο και γονιδίων οντολογίας ανάλυση

διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια διερευνήθηκαν για το δίκτυο και το γονίδιο λειτουργική συσχέτιση με Ingenuity Pathways ανάλυση (IPA) λογισμικό (Ingenuity Systems, www.ingenuity.com?. [20] ΙΡΑ σαρώνει το σύνολο των γονιδίων εισόδου για τον εντοπισμό των δικτύων με τη χρήση Ingenuity Pathways Knowledge Base για αλληλεπιδράσεις μεταξύ εντοπίστηκαν «Focus γονίδια», σε αυτή τη μελέτη, τα διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ ΑΑ και ΕΑ και των γνωστών και των υποθετικών γονιδίων που αλληλεπιδρούν αποθηκεύονται στη βάση γνώσης στο λογισμικό IPA χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει ένα σύνολο δικτύων με μέγιστο μέγεθος του δικτύου των 35 γονιδίων /πρωτεϊνών. τα δίκτυα εμφανίζονται γραφικά ως προϊόντα γονιδίων /γονίδιο ( «κόμβους») και οι βιολογικές σχέσεις μεταξύ των κόμβων ( «άκρες»). Όλα τα άκρα είναι από κανονική πληροφορίες που είναι αποθηκευμένες στο Ingenuity Pathways της Γνωσιακής βάσης. Επιπλέον, IPA υπολογίζει τη βαθμολογία για κάθε δίκτυο, σύμφωνα με την τακτοποίηση του συνόλου του χρήστη σημαντικών γονιδίων. Η βαθμολογία δείχνει την πιθανότητα των Focus γονίδια σε ένα δίκτυο από τη βάση γνώσεων Ingenuity για να βρεθεί μαζί οφείλεται στην τυχαία πιθανότητα. Μια βαθμολογία των 3, καθώς η αποκοπή για την ταυτοποίηση δίκτυα γονίδιο, δείχνει ότι υπάρχει μόνο μια πιθανότητα 1/1000 ότι τα γονίδια εστίαση εμφανίζονται σε δίκτυο οφείλονται σε τυχαία πιθανότητα. Ως εκ τούτου, ένα σκορ 3 ή υψηλότερη δείχνει ένα επίπεδο εμπιστοσύνης 99,9% για τον αποκλεισμό τυχαία πιθανότητα.

Δέκα φορές Cross Validation (Ten-f-CV)

Δέκα-f-CV ανάλυση [ ,,,0],21] χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξετε μικρότερο αντιπροσωπευτικό σύνολο των γονιδίων για τη μελέτη επικύρωσης από qRT-PCR. Χρησιμοποιώντας Δέκα-f-CV ανάλυση εντοπίσαμε 10 γονίδια που μπορεί να προβλέψει την εθνικότητα του ασθενή για τον οποίο η σειρά έγινε με ένα ποσοστό σφάλματος του 6%, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα 10 γονίδια είναι αντιπροσωπευτικά του συνόλου της λίστας γονίδιο.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

η επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών έγινε σε 28 ασθενείς CRC (10 ΑΑ και 18 EA). Δέκα διαφορικά εκφρασμένα γονίδια (που προσδιορίζονται από SAM και επιλέγονται με τη χρήση της μεθόδου δέκα-f-CV) επικυρώθηκαν από qRT-PCR. Το γονίδιο υδροξυμεθυλοχολάνη συνθάσης (HMBS) υπηρέτησε ως το γονίδιο καθαριότητας [22]. qRT-PCR πραγματοποιήθηκε εις διπλούν χρησιμοποιώντας SYBR Green Gene Expression Δοκιμασίες (Applied Biosystems, Forester City, CA), τα οποία περιλαμβάνουν προ-βελτιστοποιημένες ομάδες εναρκτών ειδικών για τα γονίδια που επικυρώνεται [23]. Τα επικυρωμένα γονίδια ήταν: Κρυσταλλική, β-Β2 (CRYBB2), ομόλογο φωσφοσερίνης φωσφατάση (PSPH), Αδενοσινοαπαμινάση-όπως (ADAL), V-set και τον τομέα ανοσοσφαιρίνης που περιέχουν 10, όπως (VSIG10L), χρωμόσωμα 17 ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης 81 (C17orf81) , επανάληψης ανκυρίνης τομέα 36Β (ANKRD36B). Ψευδαργύρου πρωτεΐνη δάκτυλο 83 (ZNF83), Rho ΟΤΡάσης ενεργοποίηση της πρωτεΐνης 6 (ARHGAP6), WD επανάληψη τομέα 8 (WDR8), TRNA νουκλεοτιδυλικής τρανσφεράσης, CCA-προσθήκη, 1 (TRNT1), και HMBS. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με τη χρήση του PRISM 7500 σύστημα ανίχνευσης ακολουθίας ΑΒΙ (Applied Biosystems, Forster City, CA). δεδομένα qRT-PCR για κάθε δείγμα κανονικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την έκφραση των γονιδίων HMBS καθαριότητας. Γραφήματα παρασκευάστηκαν από κανονικοποιημένα δεδομένα σε σχέση με HMBS. Η στατιστική ανάλυση αυτών των δεδομένων έγινε με δύο όψεων

t-test

ή με δύο όψεων τεστ rank-sum Wilcoxon αν τα δεδομένα έκφρασης δεν ακολουθούν κανονική κατανομή.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ ΑΑ και των ασθενών ΕΑ CRC

ασθενής χαρακτηριστικά του πληθυσμού για 43 ΑΑ και 43 ασθενείς ΕΑ συνδυάζεται με ΤΝΜ σταδιοποίηση (Πίνακας 1). Οι δύο πληθυσμοί ήταν παρόμοια σε ηλικία, το φύλο και τον εντοπισμό του όγκου. Σαράντα ιστούς του παχέος εντέρου μη-όγκου (13 ΕΑ και 27 ΕΑ) χρησιμοποιήθηκαν για τη γενετική συγκρίσεις της κανονικής έκφρασης του γονιδίου του παχέος εντέρου μεταξύ ΕΑ και ΕΑ.

Η

Η σύγκριση των προφίλ γονιδιακής έκφρασης από ΑΑ και όγκους EA χρησιμοποιώντας SAM αποκάλυψε 95 μεταγραφές γονίδιο που θα εκφραστεί διαφορικά μεταξύ των δύο ομάδων στο FDRs του ≤5%. Πενήντα-οκτώ γονίδια μέχρι ρυθμιζόμενη (Πίνακας 2) και 37 ρυθμίζεται προς τα κάτω (Πίνακας 3) στον όγκο της ΕΑ. Χρησιμοποιήσαμε Ingenuity Διαδρομή ανάλυση για την αξιολόγηση των ενώσεων της νόσου και την πορεία αυτών των 95 γονιδίων που εκφράζονται διαφορικά σε όγκους CRC από τη φυλή. Η ανάλυση σύνδεσης ασθένεια αποκάλυψε ενώσεις των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με γενετική οδούς που συνδέονται με φλεγμονώδη απόκριση, ηπατική νόσο σύστημα, αναπτυξιακές διαταραχές, γενετικές διαταραχές και νευρολογική νόσο (Πίνακας S1). Οι έξι κορυφαίες συνδεδεμένες διόδους για διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων που φαίνεται στο Σχ. 1. Τρεις από αυτές τις έξι οδών σχετίζονται με φλεγμονώδη και ανοσοαπόκριση. διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σε πέντε υψηλότερων δίκτυα βαθμολόγησης φαίνεται στον Πίνακα 4. Λειτουργίες δικτύου που σχετίζονται Top για διαφορετικά εκφρασμένα γονίδια ήταν: 1) ζημία οργανισμικό και ανωμαλίες, η γονιδιακή έκφραση, κυτταρική ανάπτυξη 2) μεταβολισμό των λιπιδίων, μικρό μόριο βιοχημεία, μοριακή μεταφορά 3) κυτταρικές συναρμολόγηση και την οργάνωση, την ανάπτυξη των οργάνων, το μεταβολισμό των υδατανθράκων 4) παρουσίαση αντιγόνου και φλεγμονώδη αντίδραση, κυτταρική κίνηση 5) συμπεριφορά, πεπτικά ανάπτυξη και λειτουργία του συστήματος, την ανάπτυξη και τη λειτουργία του ενδοκρινικού συστήματος. Ένα από αυτά τα δίκτυα (δίκτυο 4? Αντιγόνο παρουσίαση και φλεγμονώδη αντίδραση) έχει παρασταθεί γραφικά στο σχήμα. 2. Επτά από τους εννέα γονίδια σε αυτό το δίκτυο ήταν μέχρι ρυθμίζονται σε ασθενείς ΑΑ (HLA-DQB1, IL33, ΡΑΚ2, PROKR1, SAA2, TLR4, ZNF234), και τα δύο γονίδια τα κάτω ρύθμιση (DHX58, IL27).

Υ-άξονας είναι μια αντίστροφη ένδειξη της p-value ή σημασία. Η γραμμή Όριο σηματοδοτεί την p = 0,05. (Σημειώστε ότι οι 3 από 6 κορυφαία μονοπάτια εμφανίζονται σχετίζονται με τη φλεγμονή και την ανοσολογική απόκριση).

Η

Κόκκινα σύμβολα έχουν εκχωρηθεί μέχρι ρυθμιζόμενα και πράσινο για τα γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω. σχήμα Κόμβος αντιστοιχεί στο λειτουργικό ρόλο των μορίων, όπως φαίνεται στο υπόμνημα. Οι άμεσες ή έμμεσες αλληλεπιδράσεις φαίνεται από την πλήρη ή διακεκομμένες γραμμές.

Η

Η

Θα πραγματοποιηθεί, επίσης, ανάλυση SAM χρησιμοποιώντας ιστούς του παχέος εντέρου μη-όγκου από ασθενείς ΑΑ και ΕΑ και δεν είδα διαφορική γονιδιακή έκφραση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι αλλαγές που εντοπίζονται είναι μικροπεριβάλλον του όγκου συγκεκριμένες.

επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών

για να επιλέξετε μια αντιπροσωπευτική ομάδα γονιδίων για την επικύρωση qRT-PCR των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ ΑΑ και των ασθενών EA CRC, πραγματοποιήσαμε ένα σταυρό ανάλυση επικύρωσης 10 φορές που είχε ως αποτέλεσμα την επιλογή των παρακάτω δέκα γονίδια: CRYBB2, PSPH, ADAL, VSIG10L, C17orf81, ANKRD36B, ZNF835, ARHGAP6, TRNT1 και WDR8.

η έκφραση αυτών των δέκα γονίδια που επικυρώθηκε από qRT-PCR σε μια ανεξάρτητη σειρά δοκιμών των 28 ασθενών CRC (10 ΑΑ και 18 EA). Τα αποτελέσματα qRT-PCR που φαίνεται στο Σχ. 3. Δύο από τα 10 διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων ήταν πάνω ρυθμισμένα σε AA εναντίον ασθενείς ΕΑ CRC? CRYBB2, ρ = 0,0004 και PHSP, ρ = 0.001 (σχήμα 3?. Πίνακα Α). Οκτώ ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε AA εναντίον ασθενείς ΕΑ CRC? VSIG10L, p = 0,015? C17orf81, p = 0,032? WDR8, ρ = 0.002? TRNT1, ρ = 0.004? ANKRD36B, p = 0,044? ARHGAP6, p = 0.049? ADAL, p = 0,074? ZNF83, ρ = 0,11? (Εικ. 3? Panel Β). Η κατεύθυνση της αλλαγής (προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση) για τις επικυρωμένες qRT-PCR γονιδίων ήταν σε συμφωνία με τα αποτελέσματα SAM. Οκτώ στους δέκα γονιδίων στη μελέτη επικύρωσης qRT-PCR έφθασε σε στατιστικώς σημαντικό επίπεδο (p & lt? 0,05? CRYBB2, PSPH, C17orf81, ANKRD36B, VSIG10L, WDR8, TRNT1 και ARHGAP6).

Πίνακας Α Έκφραση των δύο up-ρυθμιζόμενων γονιδίων σε ασθενείς αφροαμερικάνων καρκίνο του παχέος εντέρου: CRYBB2, PSPH. Πίνακας Β Έκφραση των οκτώ κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια σε ασθενείς αφροαμερικάνων καρκίνο του παχέος εντέρου: ARHGAP6, VSIG10L, C17orf81, ZNF83, ANKRD36B, ADAL, WDE8 και TNRT1. Σημεία είναι σχετικές τιμές Ct για τα μεμονωμένα δείγματα? οριζόντιες γραμμές είναι οι μέσες τιμές για το σύνολο του δείγματος. Τα σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (p & lt? 0,05) μεταξύ της Αφρικής και της Αμερικής (n = 10) έναντι του Ευρωπαϊκού-Αμερικανικού (n = 18), οι όγκοι CRC επισημαίνονται με ένα αστέρι. Γραφήματα παρασκευάστηκαν από ομαλοποιημένη γονίδια τα δεδομένα έκφρασης σε σχέση με την καθαριότητα (HMBS) γονίδιο.

Η

Συζήτηση

Τα αίτια της ανισότητας CRC που υπάρχει μεταξύ των ασθενών ΑΑ και ΕΑ παραμένουν να είναι πλήρως διευκρινιστεί. Παρά το γεγονός ότι το μεγαλύτερο μέρος της έρευνας για τη διαφορά αυτή έχει επικεντρωθεί σε κοινωνικοοικονομικούς παράγοντες, πρόσφατα ευρήματα υποστηρίζουν σθεναρά το ρόλο των γενετικών και βιολογικών παραγόντων. Γενετικές διαφορές μεταξύ ΑΑ και των ασθενών ΕΑ CRC αναφέρθηκαν για συσχέτιση SNP, για συχνότητα εμφάνισης MSI και το επίπεδο της γονιδιακής μεθυλίωσης [4], [14], [15]. Οποιαδήποτε από αυτές τις διαφορές μπορούν να οδηγήσουν σε διαφορική γονιδιακή έκφραση μεταξύ ΑΑ και των ασθενών EA CRC. Σε αυτή τη μελέτη αναλύσαμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των 86 όγκους από 43 ΑΑ και 43 ασθενείς EA. Σημαντικές διαφορές στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την ανοσολογική απόκριση και φλεγμονή στο εσωτερικό του όγκου μικρο-περιβάλλον ταυτοποιήθηκαν μεταξύ αυτών των δύο ομάδων. Η ερμηνεία αυτή υποστηρίζεται τόσο σύνδεσης ασθένεια και αναλύσεις οδό. Οι περισσότεροι από τους συνδέονται με το ανοσοποιητικό γονίδια είχαν υψηλότερη έκφραση στους όγκους από ασθενείς Αφρο-Αμερικανός από ό, τι εκείνων που προέρχονται από ευρωπαϊκή-αμερικανική ασθενείς. Αν και προκαταρκτικά, τα ευρήματα αυτά είναι νέα και θα μπορούσαν να έχουν επιπτώσεις για τη θεραπεία του καρκίνου. Από την παρούσα μελέτη, δεν ξέρουμε γιατί CRC από χώρες της Αφρικής και της Αμερικής οι ασθενείς θα έχουν ένα διαφορετικό ανοσολογικό προφίλ από τους όγκους από την ευρωπαϊκή-αμερικανική ασθενείς. Υποθέτουμε ότι οι αιτίες αυτών των διαφορών είναι πολυπαραγοντική. Η χρόνια φλεγμονή πιστεύεται ότι είναι ένας αιτιολογικός παράγοντας σε ορθοκολικό καρκινογένεση [24], [25]. Αποδείχθηκε ότι μια ανοσολογική απόκριση υπογραφή στο ήπαρ των ασθενών με καρκίνο προβλέπει μετάσταση και η επανάληψη των ηπατο-κυτταρικό καρκίνωμα [26]. Έτσι, οι μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να αξιολογηθεί κατά πόσον η ανοσολογική προφίλ του CRC σε ασθενείς Αφρο-Αμερικανός είναι ένας προδιαθεσικός παράγοντας για την εξέλιξη του όγκου και των μεταστάσεων. Προηγούμενες έρευνες εντόπισαν την υπογραφή του όγκου των δύο γονιδίων (CRYBB2 και PSPHL) που με ακρίβεια διαφοροποιούνται μεταξύ των ασθενών αφρο-αμερικανική και την ευρωπαϊκή-αμερικανική καρκίνο του προστάτη [27]. Αυτά τα δύο γονίδια εκφράζονται διαφορικά μεταξύ των ασθενών αφρο-αμερικανική και την ευρωπαϊκή της Αμερικής τον καρκίνο του μαστού [28] Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε up-ρύθμιση του CRYBB2 και γονιδίου PSPH στο CRC της Αφρικής και της Αμερικής ασθενείς. Μεταλλάξεις στο γονίδιο CRYBB2 είναι επίσης υπεύθυνες για την οικογενή καταρράκτη [29]. PSPHL είναι ένα ομόλογο της PSPH. Είναι ενδιαφέρον, PSPH βρίσκεται στο χρωμόσωμα 7p15.2, μία χρωμοσωμική περιοχή που είναι γνωστό ότι έχουν κέρδος της λειτουργίας που σχετίζονται με προχωρημένο στάδιο του όγκου στον πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα μη-μικρού κυττάρου [30]. Αποδείχθηκε ότι η αυξημένη έκφραση του PSPH στον καρκίνο του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου αντιστοιχεί με την κλινική ανταπόκριση στη θεραπεία με erlotinib [31]. Έτσι, είναι πιθανό ότι υψηλότερη έκφραση του PSPH συμβάλλει στην επιδεκτικότητα CRC σε ΕΑ και ότι τα επίπεδα έκφρασης PSPH μπορεί να συσχετίζεται με την απάντηση σε αντι-EGFR θεραπεία. Οι δυνατότητες αυτές θα πρέπει να δοκιμαστεί σε μελλοντικές μελέτες. Λαμβάνοντας υπόψη τα κάτω ρυθμιζόμενα γονίδια σε ΕΑ βρήκαμε χαμηλότερη έκφραση του γονιδίου C17orf81. Κάτω ρύθμιση αυτού του γονιδίου που σχετίζεται με καρκίνο του παχέος εντέρου [32], υποδηλώνοντας ότι οι χαμηλότερες έκφραση αυτού του γονιδίου μπορεί να συμβάλει στην πιο επιθετική CRC σε ΕΑ. Άλλες κάτω ρυθμιζόμενων γονιδίων σε συμφωνίες σύνδεσης περιλαμβάνουν: TRNT1 (συμμετοχή στην επεξεργασία του RNA? [33])? ARHGAP6 (προωθεί αναδιαμόρφωση ακτίνη: [34])? WDR8 (διευκολύνει το σχηματισμό του πολυπρωτεϊνικού συγκροτήματα: [35]). Λαμβάνοντας υπόψη τις κυτταρικές λειτουργίες των γονιδίων αυτών δεν είναι δύσκολο να οραματίζονται πως η έκφρασή τους μπορεί να επηρεάσει την επιθετικότητα του CRC.

γονιδιακή έκφραση ολόκληρου γονιδιώματος πειράματα ανάλυση μπορεί να είναι επιρρεπής σε ευρήματα τα οποία είναι είτε μοναδικά σε έναν επιλεγμένο πληθυσμό ασθενών ή δημιουργούνται τεχνητά από την εφαρμοσμένη τεχνολογία. Να αποκλειστεί η πιθανότητα ενός τεχνουργήματος, δύο διαφορετικές προσεγγίσεις χρησιμοποιήθηκαν για να περάσουν την επικύρωση των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης μας. Πρώτον, συγκρίναμε τα αποτελέσματα μας των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ 86 όγκων και 40 περιβάλλοντες ιστούς μη-όγκου με εκείνα από ένα δημοσιευμένο μετα-ανάλυση των πέντε σύνολα δεδομένων γονιδιακής έκφρασης CRC σε Oncomine [36], [37], [38], [ ,,,0],39], [40]? Πίνακας S2. Βρήκαμε μια πολύ καλή συμφωνία μεταξύ των αποτελεσμάτων μας και των αποτελεσμάτων των άλλων 5 μετα-αναλύσεις. Από τα κορυφαία 20 υπερ-εκφρασμένων γονιδίων σε όγκους CRC σε όλα τα 5 άλλα μετα-αναλύσεις (Oncomine? Https://www.oncomine.org), 15 βρέθηκαν επίσης να είναι σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (FDR, & lt? 5%) στη μελέτη μας. Από τα κορυφαία 20 εκφράζεται υπό-γονιδίων σε όγκους CRC σε όλα τα 5 άλλα μετα-αναλύσεις, 17 ήταν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται (FDR, & lt? 5%). Στη μελέτη μας

Δεύτερον, επικύρωσε την έκφραση της δέκα βασικά γονίδια μέσω qRT-PCR και επιβεβαίωσε τις διαφορές στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ CRCs της ΕΑ και ΕΑ για οκτώ από αυτούς.

Εν κατακλείδι, το προφίλ της γονιδιακής έκφρασης της CRC αντιστοιχεί σε διαφορές στη βιολογία του όγκου μεταξύ της Αφρικής και της Αμερικής και Ευρωπαϊκή-αμερικανική ασθενείς. Οι επιπτώσεις αυτών των διαφορών στην επιθετικότητα της νόσου και την ανταπόκριση στη θεραπεία θα πρέπει να αξιολογηθεί σε μελλοντικές μελέτες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Ingenuity Pathway Ανάλυση του συνεταιρίζεσθαι των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων με κορυφαίες λειτουργίες βιο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0030168.s001

(DOCX)

Πίνακας S2.

Σύγκριση των κορυφαίων 40 διαφορετικά γονίδια που εκφράζονται σε πέντε άλλες μελέτες μικροσυστοιχιών CRC και αυτή τη μελέτη.

doi: 10.1371 /journal.pone.0030168.s002

(DOCX)