Αφηρημένο

Αν και οι κλινικοί γιατροί μπορούν να προβλέψουν ποιοι ασθενείς βρίσκονται σε κίνδυνο για την ανάπτυξη μεταστάσεων, παραδοσιακές θεραπείες συχνά αποδεικνύονται αναποτελεσματικές και μεταστατική νόσος είναι η κύρια αιτία του καρκίνου του θανάτου του ασθενούς? Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ανάγκη για την ανάπτυξη αντι-μεταστατικό θεραπείες που μπορεί να χορηγηθεί σε μεγάλες διάρκειες για να αναστέλλουν ειδικά την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων.

Withania

somnifera

εκχυλίσματα ρίζας (WRE) έχουν αντι-πολλαπλασιαστική δράση και το δραστικό συστατικό, Withaferin A, αναστέλλει την προ-μεταστατικό πρωτεΐνη, βιμεντίνη. Βιμεντίνης είναι ένα ενδιάμεσο πρωτεΐνη πυράκτωσης και αποτελεί μέρος της επιθηλιακής προς μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) πρόγραμμα για την προώθηση της μετάστασης. Εδώ, προσδιορίσαμε αν WRE τυποποιηθεί να Withaferin Α (sWRE) διαθέτει αντι-μεταστατική δραστηριότητα και αν αναστέλλει την κινητικότητα του καρκίνου μέσω αναστολής της βιμεντίνης και το πρόγραμμα ΕΜΤ. Αρκετές συνθέσεις του sWRE δημιουργήθηκαν για να εμπλουτίσουν για Withaferin Α και ένα απόθεμα διαλύματος sWRE σε EtOH θα μπορούσε να ανακτήσει πάνω από το 90% του Withaferin Α που βρέθηκε στην αρχική σκόνη εκχύλισμα. Αυτό το σκεύασμα sWRE ανέστειλε τον καρκίνο του μαστού κινητικότητα κυττάρων και εισβολή σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 1 μΜ, ενώ έχουν αμελητέα κυτταροτοξικότητα σε αυτή τη δόση. θεραπεία sWRE διαταράσσεται μορφολογία βιμεντίνη σε κυτταρικές σειρές, επιβεβαιώνοντας βιμεντίνη ανασταλτική δράση της. Για να προσδιοριστεί εάν sWRE ανέστειλε EMT, ΤΟΡ-β χρησιμοποιήθηκε για να επάγει EMT σε μαστικά επιθηλιακά κύτταρα ΜΟΡ10Α άνθρωπο. Σε αυτήν την περίπτωση, sWRE εμπόδισε επαγωγή ΕΜΤ και ανέστειλαν 3-D σφαιροειδές εισβολή. Αυτές οι μελέτες λήφθηκαν σε ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ανθρώπινου και μαστού ποντικού καρκίνωμα. Και στα δύο μοντέλα, sWRE και Withaferin Α έδειξε δοσο-εξαρτώμενη αναστολή της ανάπτυξης του όγκου και του σχηματισμού οζιδίων μεταστατικό πνεύμονα με την ελάχιστη συστηματική τοξικότητα. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι χαμηλές συγκεντρώσεις sWRE αναστολή μετάστασης του καρκίνου μέσω αναστολής δυνητικά EMT. Επιπλέον, αυτές οι δόσεις των sWRE έχουν σχεδόν καμία τοξικότητα σε φυσιολογικά όργανα ποντίκι, γεγονός που υποδηλώνει τη δυνατότητα για κλινική χρήση των καψουλών από του στόματος χορηγούμενη WRE

Παράθεση:. Yang Z, Γκαρσία Α, Xu S, Πάουελ DR, Vertino μμ, Singh S, et al. (2013)

Withania

somnifera

Root Extract Αναστέλλει καρκίνο του μαστικού Μετάσταση και επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβαση. PLoS ONE 8 (9): e75069. doi: 10.1371 /journal.pone.0075069

Επιμέλεια: Μιχαήλ Klymkowsky, Πανεπιστήμιο του Κολοράντο, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Μαρτίου 2013? Αποδεκτές: 9 Αυγούστου 2013? Δημοσιεύθηκε: 12 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την R21 από το Εθνικό Κέντρο για τη συμπληρωματική και εναλλακτική ιατρική (1R21AT005231) που χορηγείται στο AIM, το Godfrey Φιλανθρωπικό Ταμείο, και Παίχτης του κατά του καρκίνου. Το έργο αυτό υποστηρίζεται επίσης από μια CCSG Ρ30 ανατέθηκε στο Ινστιτούτο Winship Καρκίνου (3P30CA138292). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του μαστού είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους μεταξύ των γυναικών στις Ηνωμένες Πολιτείες και η δεύτερη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο των γυναικών [1]. Μεγαλύτερη από το 90% του καρκίνου του μαστού θάνατοι ασθενών αποδίδονται σε μεταστατική νόσο, όπου ο κύριος όγκος έχει εισβάλει απομακρυσμένες περιοχές. Δεδομένου ότι αυτά τα μεταστατικά κύτταρα είναι συχνά εξαιρετικά επιθετική, δύσκολο να ανιχνευθούν, και στη χημειοθεραπεία [2], μια θεραπευτική στρατηγική θα μπορούσε να είναι για την πρόληψη της μεταστατικής νόσου και όχι να το αντιμετωπίσουμε μία φορά αυτό συμβαίνει.

Η μεταστατική διαδικασία μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις φάσεις-κυττάρου όγκου εισβολή στον περιβάλλοντα ιστό, ενδαγγείωση σε αίμα ή λεμφικά αγγεία, και εξαγγείωση σε ένα νέο περιβάλλον ξενιστή [3-5]. Σε πολλές περιπτώσεις, μεταστατικά κύτταρα υφίστανται επιθηλιακών-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), όπου η γενετική και επιγενετικές συμβάντα προκαλούν ένα πολωμένο επιθηλιακών κυττάρων για να γίνει μεταναστευτικών και επεμβατική [6]. Στο μοριακό επίπεδο, EMT προκαλεί ένα κέρδος βιμεντίνης και της έκφρασης ινονεκτίνη, και την απώλεια της Ε-καδερίνης στην κυτταρική μεμβράνη [7,8]. Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι η EMT είναι ένας σημαντικός μηχανισμός οδήγησης εξέλιξης του καρκίνου του μαστού και τη μετάσταση [9-13].

Withania

somnifera

(Ashwagandha) τα φυτά χρησιμοποιούνται ευρέως στην Ανατολή ινδική ιατρική. Το εκχύλισμα της ρίζας W. somnifera (WRE) αποτελείται από 14 ενώσεις γνωστές ως withanolides, με Withaferin Ένα είναι το πιο σημαντικό [14-16]. Withaferin Α είναι μια στεροειδής λακτόνη που διεγείρει απόπτωση και αναστέλλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω στόχευσης πρωτεΐνες σηματοδότησης όπως Ρ53, FOXO3a, Notch-1, Hsp90 και STAT3 [17-22]. Withaferin Μια θεραπεία οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, αυξημένο οξειδωτικό στρες αντιδραστική [23-26], η αναστολή της οδού της JAK /STAT [27], η αναστολή της αγγειογένεσης [28], και τροποποιημένο σχήμα κυττάρου και συμπεριφορά [29]. Withaferin Α κατέχει επίσης ισχυρή αντι-επεμβατική δραστηριότητα, η οποία θα μπορούσε ενδεχομένως να οφείλεται στην αλληλεπίδρασή της με την φιλο-μεταναστευτικών πρωτεΐνη βιμεντίνη.

βιμεντίνη είναι τύπου ΙΙΙ ενδιάμεσο πυράκτωσης και κλασική δείκτη πρωτεΐνης EMT [30]. Αν και βιμεντίνη λειτουργίες για τη διατήρηση της κυτταρικής δομής, είναι επίσης μια εξαιρετικά δυναμική πολυμερές που συναρμολογεί και dissembles σε ένα κινητικό κύτταρο. Όταν τα κύτταρα υφίστανται EMT, η έκφραση βιμεντίνη είναι αυξημένη και αυτό πιστεύεται ότι παρέχει τα κύτταρα με ένα πιο μεσεγχυματικά, προ-κινητικό φαινότυπο [31]. Ο ακριβής ρόλος της βιμεντίνης κατά τη διάρκεια της EMT και η ανάπτυξη είναι ασαφής, δεδομένου ότι ένα μοντέλο νοκ-άουτ vimentin ποντίκι δεν δείχνουν σοβαρή αναπτυξιακές ανωμαλίες [32]. Πρόσθετες μελέτες όμως έκανε να πάει για να δείξει ότι αυτά τα ποντίκια είχαν απομειωθεί ινοβλαστών επούλωση των πληγών, και μια μειωμένη ικανότητα να συνάπτει ένα δίκτυο κολλαγόνου [33].

Withaferin Ένα προτείνεται να συνδεθεί με vimentin μέσα από μια ομοιοπολική τροποποίηση της κυστεΐνης 328 [34], που οδηγούν σε αλλαγές βιμεντίνη μορφολογία και φωσφορυλίωση [29]? Ωστόσο, άλλα στοιχεία δείχνουν ότι η μετάλλαξη της κυστεΐνης 328, δεν έχει επίπτωση Withaferin Α-επαγόμενη αναστολή βιμεντίνη [29]. Όταν χορηγήθηκε ενδοπεριτονικά (ΙΡ), Withaferin Α αναστέλλει αποτελεσματικά τη μετάσταση του καρκίνου του μαστού και έχει σχεδόν καμία παρατηρήσιμη τοξικότητα [35].

Λιγότερο είναι γνωστά για τη δράση κατά των όγκων του Withaferin Ένα απόσπασμα μητρικής ρίζας, WRE . Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρούνται στην ανάπτυξη του όγκου, του κυτταρικού κύκλου, και της αγγειογένεσης με κατεργασία WRE [36-40] μαζί με ανοσοτροποποιητικές επιδράσεις σε κόλον και καρκίνο του πνεύμονα [41,42]. Παρ ‘όλα αυτά, μελέτες που συγκρίνουν άμεσα WRE να Withaferin Α δεν έχουν πραγματοποιηθεί, και αντι-μεταστατική δράση του δεν έχει μελετηθεί καλά. Επιπλέον, WRE διαθέτει αρκετά πλεονεκτήματα σε σχέση Withaferin Α, δεδομένου ότι μπορεί να χορηγείται από το στόμα σε μια κάψουλα και οι δραστικές withanolides θα μπορούσαν να έχουν φαρμακολογική συνέργεια? Ως εκ τούτου, θελήσαμε να καθοριστεί η αντι-μεταστατική αποτελεσματικότητα του WRE τυποποιηθεί (sWRE) προς το καθαρό δραστικό συστατικό, Withaferin Α, στον καρκίνο του μαστού. Δείξαμε ότι sWRE μπορούν να αναστείλουν ανθρώπινου καρκίνου του μαστού κύτταρο εισβολή

in vitro

και μετάσταση στα δύο μοντέλα ποντικών αλλομοσχεύματος και ξενομοσχεύματος καρκίνου του μαστού, παρόμοιο με το καθαρό μικρό μόριο Withaferin Α sWRE επάγει βιμεντίνη αναδιοργάνωση και μορφολογικές κυτταρικές αλλαγές στο ανθρώπινο κύτταρα καρκίνου του μαστού και, το σημαντικότερο, αναστέλλει την επαγωγή ΕΜΤ σε φυσιολογικά ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα μαστού. Τα αποτελέσματά μας ρίξει φως σχετικά με τις δυνατότητες των sWRE ως νέου συμπληρωματική εναλλακτική ιατρική χρησιμοποιείται ως αντι-μεταστατική προληπτική θεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού υψηλού κινδύνου.

Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

WFA αγοράστηκε από Chromadex (Irvine, CA) και WRE παρασχέθηκε από πρασινάδα Επιστημών (Noblesville, ΙΝ) με το πιστοποιητικό ανάλυσης δηλώνοντας ότι είναι απαλλαγμένο από βαρέα μέταλλα, βακτήρια και μύκητες. Το αντίσωμα έναντι βιμεντίνης αγοράστηκε από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ), Ε-καδερίνης από BD Biosciences (Bedford, ΜΑ), ινονεκτίνη από Abcam (Cambridge, ΜΑ), και GAPDH από τη Cell Signaling (Beverly, ΜΑ).

παρασκευή sWRE

100% αιθανόλης θερμάνθηκε στους 60 ° C και στη συνέχεια αναμιγνύεται με WRE με τη συγκέντρωση 250mg /ml για 30 λεπτά σε ένα γυάλινο ποτήρι. Αποσταγμένο H

2O προστέθηκε τότε αργά να μειωθεί η συγκέντρωση αιθανόλης στο 90%, και η ανάδευση συνεχίστηκε για άλλα 30 λεπτά. Το μίγμα στη συνέχεια στροβιλίστηκε στις 4000 rpm σε μια φυγόκεντρο για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και το υπερκείμενο συλλέχθηκε. Το υπερκείμενο στη συνέχεια πέρασε ένα φίλτρο 0,22 μm, κλασματοποιήθηκε και διατηρήθηκε στους -80 ° C για μελλοντική χρήση.

Κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

Ανθρώπινο MDA-MB-231 (ATCC # ΗΤΒ -26), MCF-7 (# ΗΤΒ-22) και T47D (# ΗΤΒ-133) κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Hs578-T, HCC1806 και MDA-MB-468 κυτταρικές γραμμές καρκίνου του ανθρώπινου μαστού παρασχέθηκαν από τον Dr. Ο, Regan (Πανεπιστήμιο Emory [45]). Ανθρώπινα ΜΟΡ10Α μαστική επιθηλιακή κυτταρική γραμμή που παρέχεται από τον Δρ Vertino (Πανεπιστήμιο Emory [45]). Ποντικού καρκινώματος μαστού 4Τ1 κύτταρα παρασχέθηκαν από τον Dr. Dewhirst (Πανεπιστήμιο Duke [35,45]). T47D και HCC1806 αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% FBS. MDA-MB-231, MCF-7, Hs578-T, MDA-MB-468 και 4Τ1 αναπτύχθηκαν σε DMEM 10% FBS. κύτταρα ΜΟΡ10Α αναπτύχθηκαν σε DMEM /F12 συμπληρωμένο με 5% FBS, 20 ng /ml EGF, 0,5 μg /ml υδροκορτιζόνη, 100 ng /ml τοξίνης χολέρας, και 10 μg /ml ινσουλίνη. Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε ένα υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Δοκιμασία κυτταροτοξικότητας

Η Promega CellTiter 96

® υδατικό μη ραδιενεργού Δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων (MTS) πραγματοποιήθηκε για τον προσδιορισμό του

in vitro

κυτταροτοξικότητα της sWRE. Εν συντομία, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων όλη τη νύκτα και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με sWRE στην ενδεικνυόμενη συγκέντρωση για 72 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με προσδιορισμό της απορρόφησης στα 490nm όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή (Promega, Madison, WI). Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκφράστηκε ως:

ομάδας exp /A

έλεγχος X 100.

In vitro επούλωσης της πληγής

δοκιμασία

Μια κυτταρική μετανάστευση δοκιμασία τραυματίζοντας διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [43 ]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6 φρεάτια πλάκας σε 100% συρροή. Μετά από τραυματισμό με ένα ρύγχος πιπέτας, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και προστέθηκαν νέα μέσα με την αντίστοιχη συγκέντρωση του sWRE. Τα κύτταρα στη συνέχεια αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C. Εικόνες από κύτταρα που λαμβάνονται σε χρόνο 0 και 24 ώρες με μια Ολύμπου IX51 Widefield μικροσκόπιο (Κέντρο Valley, PA) σε 5x μεγέθυνση με μια κάμερα CCD Hamamatsu Orca ER.

Matrigel δοκιμασία εισβολής

τηλέφωνα εισβολή αναλύθηκε με τη χρήση της Roche xCelligence RTCA DP (Real-Time Analyzer τηλέφωνα Διπλή πλάκα) μέσο (Indianapolis, IN). ΫΜΕΜ με 10% FBS προστέθηκε στον κάτω θάλαμο ενός CIM-Plate 16. 250 μg /χιλιοστόλιτρο Matrigel (BD Biosciences) πολυμερίστηκε στα φρεάτια του άνω θαλάμου για 1 ώρα στους 37 ° C. Άνευ ορού μέσο προστίθεται στην κορυφή του θαλάμου, επωάστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C, και λήφθηκε μια μέτρηση υποβάθρου. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις sWRE σε μέσο ελεύθερο ορού για όλη τη νύχτα. Αυτά τα κύτταρα στη συνέχεια προστέθηκαν στην κορυφή του θαλάμου και η πλάκα επωάστηκε σε 37 ° C με τον αναγνώστη πλάκας xCelligence. μετρήσεις σύνθετης αντίστασης έγιναν στην κάτω καλά και η αύξηση της σύνθετης αντιστάσεως συσχετίζεται με αύξηση του αριθμού των κυττάρων μετανάστευσαν. Αλλαγές στην αντίσταση, η οποία αντικατοπτρίζεται από τις τιμές του δείκτη κυτταρικής εισβολής, παρακολουθήθηκαν επί τουλάχιστον 24 ώρες.

κηλίδωση Western

επίπεδα πρωτεΐνης στα κυτταρολύματα ήταν μέτρου χρησιμοποιώντας μια πρότυπη δοκιμασία BCA. Κυτταρολύματα σε ρυθμιστικό δείγματος διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα 10% SDS-PAGE, και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Bio-Rad, Hercules, CA). Μετά τον αποκλεισμό με 5% χωρίς λιπαρά TBST που περιέχει γάλα, οι μεμβράνες επωάστηκαν ξεχωριστά με αντισώματα προς βιμεντίνης, E-cadherin, φιμπρονεκτίνη, και GAPDH σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με υπεροξειδάση horseradish συζευγμένη δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα. Οι ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας Amersham ECL Plus αντιδραστήρια και στη συνέχεια εκτέθηκε σε φιλμ.

συνεστιακή απεικόνιση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες και κατεργάζεται με sWRE για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιείται και υφίσταται επεξεργασία για μικροσκοπία ανοσοφθορισμού όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35]. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα πρωτογενές αντι-βιμεντίνη αντίσωμα και δευτερογενή Alexa 488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού IgG. Οι καλυπτρίδες τοποθετήθηκαν σε πλάκες και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας Zeiss LSM 510 META ομοεστιακό μικροσκόπιο με ένα αντικειμενικό έλαιο 40Χ Σχέδιο Neofluar (ΝΑ 1,3).

Real-time PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα με τη χρήση του RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) και προκατεργάστηκαν με ϋΝάση Ι cDNA στη συνέχεια συντέθηκε χρησιμοποιώντας τυχαίους εκκινητές εξαμερών και MMLV- αντίστροφης μεταγραφάσης. Target-ειδικοί εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για την ενίσχυση του cDNA εις τριπλούν χρησιμοποιώντας ένα μίγμα αντιδράσεως το οποίο περιείχε 1 μΙ του κατάλληλα αραιωμένου δείγματος cDNA, 0.2μmol /l εκκινητών και 12.5 μΙ IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). 18S rRNA ενισχύθηκε από τα ίδια δείγματα ως εσωτερικός έλεγχος. Η αντίδραση υποβλήθηκε σε θερμή εκκίνηση για 3 λεπτά στους 95 ° C και 40 κύκλους των 95 ° C, 10 s? 55 ° C (18S) ή 63 ° C (vimentin), 30 sec. Εκκινητές για ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR ήταν για vimentin: 5 ‘AATGGCTCGTCACCTTCGTGAA3’ και 5 ‘CAGATTAGTTTCCCTCAGGTTCAG3 »και για το 18S, 5’ G3 GAGGGAGCCTGAGAAACG» και 5

Τρισδιάστατο δοκιμασία σφαιροειδές εισβολή »GTCGGGAGTGGGTAATTT GC3»

Η

αγαρόζης-επικαλυμμένες πλάκες έγιναν από τη φόρτωση κάθε καλά με 0,75% αγαρόζη σε DMEM με 10% FBS. Μετά ζελατινοποίηση, τα κύτταρα ΜΟΡ10Α προστέθηκαν στα φρεάτια και επωάστηκαν στους 37 ° C. σφαιροειδή κυττάρων που σχηματίζεται μέσα σε 3-5 ημέρες. 5-10 σφαιροειδή αναμίχθηκαν με Matrigel σε DMEM ή DMEM συν sWRE. Το μίγμα τοποθετήθηκε στο μέσο ενός 35 mm τρυβλία απεικόνισης πιάτο με ένα # 1.5 καλυπτρίδα (MatTek Corporation) και στη συνέχεια στριμώχνεται στην κορυφή με ένα επιπλέον καλυπτρίδα. Ο δίσκος κατόπιν τοποθετήθηκε σε επωαστή 37 ° C για 30 λεπτά για να επιτρέψει για τον πολυμερισμό Matrigel, προστέθηκε στη συνέχεια 2 ml ϋΜΕΜ με 10% FBS. Το πιάτο μεταφέρθηκε στο ζωντανό κύτταρο PerkinElmer Ultraview ERS γυρίζοντας δίσκο ομοεστιακό μικροσκόπιο [44] και οι εικόνες αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας αντικειμενικά 20Χ Zeiss (NA 0,75) κάθε 20 λεπτά για 24 ώρες με μία κάμερα Hamamatsu Orca ER.

Σε vivo sWRE μελέτη τοξικότητας

Οκτώ εβδομάδων θηλυκά ποντίκια Balb /c αγοράστηκαν από Harlan και στεγάστηκαν στην εγκατάσταση Μοντέλα Winship Καρκίνου των ζώων σύμφωνα με το εγκεκριμένο πρωτόκολλο IACUC μας. Τα ποντίκια διατηρούνται σε ομάδες των πέντε ανά κλουβί και τράφηκαν με δίαιτα ελέγχου AIN76A και νερό

κατά βούληση

. Τα ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες από 3 ποντικούς ανά ομάδα και αντιμετωπίζονται με από του στόματος καθετηριασμό είτε με έκδοχο (9% αιθανόλη) ή όχημα που περιέχει sWRE στις 4, και 8 mg /kg σωματικού βάρους, 3 φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Τα ποντίκια σωματικού βάρους καταγράφηκε κάθε φορά μετά από του στόματος καθετηριασμό. Μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και τα όργανα (καρδιά, πνεύμονες, ήπαρ, σπλήνα και νεφρά) συλλέχθηκαν και αποστέλλονται για παθολογική ανάλυση. Τοξικές επιδράσεις αξιολογήθηκαν με τυφλό παθολόγο κτηνίατρο με βάση την παρουσία φλεγμονής, νέκρωση και ίνωση χρησιμοποιώντας μια κλίμακα από φυσιολογικά (1+) έως μέτρια (3+).

μοντέλο καρκινώματος μαστού

Όλες οι μελέτες του ποντικιού διεξήχθησαν σύμφωνα με εγκεκριμένο πρωτόκολλο του Πανεπιστημίου Θεσμική Επιτροπή Φροντίδα και Χρήση των ζώων Emory μας. Οκτώ εβδομάδες θηλυκά ποντίκια Balb /c διαιρέθηκαν τυχαία σε 4 ομάδες με 10 ποντικούς σε κάθε ομάδα. 10

6 4Τ1 κύτταρα σε PBS εγχύθηκαν υποδορίως εντός του μαστικού στρώματος λίπους του κάθε ποντικού. Μία εβδομάδα μετά την ένεση, sWRE δόθηκαν από του στόματος καθετηριασμό είτε με όχημα ή έκδοχο που περιέχει sWRE σε 1, 4, και 8 mg /kg σωματικού βάρους 3 φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Withaferin Α ενδοπεριτοναϊκώς με διάλυση σε 10% DMSO, 20% Cremophor-EL και 50% PBS σε 1, 4, και 8 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου καταγράφηκε πριν διασωλήνωση χρησιμοποιώντας δαγκάνες με όγκος = (πλάτος)

2 χ μήκος /2. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας και μεταστατικών οζιδίων του πνεύμονα μετρήθηκαν υπό ανατομικό μικροσκόπιο. Για Η &? Χρώση Ε, ο πνεύμονας και πρωτογενούς όγκου από το όχημα και sWRE-ποντίκια με αγωγή σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένου φορμαλίνη, υποβάλλονται σε επεξεργασία, ενσωματωμένο σε παραφίνη, και τεμαχίστηκαν σε πάχος 5 μm. Αντιπροσωπευτικές τομές όγκου από τον έλεγχο του οχήματος, sWRE-αγωγή, και Withaferin Α-αγωγή ποντικούς υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για Η &? Ε χρώση

ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου του μαστού μοντέλο

Όλες οι μελέτες ποντικού πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με. εγκεκριμένο πρωτόκολλο του Πανεπιστημίου Θεσμική Επιτροπή Φροντίδα και Χρήση των ζώων Emory μας. Οκτώ εβδομάδες παλιά θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών Foxn1nu αγοράστηκαν από Harlan και στεγάστηκαν στην εγκατάσταση Μοντέλα Winship Cancer ζώων. Οι ποντικοί κρατήθηκαν σε ομάδες των πέντε ανά κλουβί και τράφηκαν με δίαιτα ελέγχου AIN76A και νερό κατά βούληση. Τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 7 ομάδες με 10 ποντικούς σε κάθε ομάδα και 10

6 MDA-MB-231 κύτταρα σε PBS εγχύθηκαν υποδορίως εντός του μαστικού στρώματος λίπους του κάθε ποντικού. Μία εβδομάδα μετά την ένεση, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με όχημα (9% αιθανόλη), όχημα που περιέχει sWRE σε 1, 4, και 8 mg /kg από του στόματος καθετηριασμό, ή ενδοπεριτοναϊκά ένεση με Withaferin Α διαλύθηκε σε 10% DMSO, 20% Cremophor-EL και 50% PBS σε 1, 4, και 8 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Ο όγκος του όγκου καταγράφηκε πριν καθετήρα στομάχου. Τα ποντίκια θανατώθηκαν μετά από 4 εβδομάδες θεραπείας και μεταστατικών οζιδίων του πνεύμονα μετρήθηκαν υπό ανατομικό μικροσκόπιο. Για Η &? Ε χρώση, ο πνεύμονας και ο όγκος από το όχημα και sWRE-ποντίκια με αγωγή σταθεροποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη ρυθμισμένου φορμαλίνη, υποβάλλονται σε επεξεργασία, ενσωματώθηκαν σε παραφίνη και τεμαχίσθηκαν σε πάχος 5 μm. Αντιπροσωπευτικές τομές όγκου από τον έλεγχο και sWRE αγωγή ποντίκια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την H & amp?. Χρώσης Ε

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας GraphPad Prism για Windows (έκδοση 5). Η μονόδρομη ANOVA διεξήχθη για να συγκριθεί η μέση τιμή των οζιδίων του πνεύμονα μεταξύ των πειραματικών ομάδων. Γραμμικό μοντέλο μικτά αποτελέσματα χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθούν οι μέσοι όγκοι των όγκων μεταξύ των ομάδων. Οι τιμές των p & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικές

Αποτελέσματα

WRE Τυποποίησης, Διαλυτότητα, και κυτταροτοξικότητα

WRE σκόνη διαλύθηκε σε H

2O ή 90% αιθανόλη ( EtOH) σε διαφορετικές συγκεντρώσεις για να προσδιοριστεί βέλτιστες συνθήκες για την τυποποίηση WRE (sWRE) προς την καθαρή μικρό μόριο Withaferin Α Η συγκέντρωση του Withaferin Α σε κάθε σκεύασμα sWRE μετρήθηκε με HPLC (Σχήμα 1Α) και το ποσοστό ανάκτησης των Withaferin Α μετά solubulization ήταν υπολογίζεται για κάθε δείγμα (Εικόνα 1Β). Το περιεχόμενο του Withaferin Α σε σύγκριση με άλλα withanolides χρησιμοποιώντας HPLC φαίνεται στον Πίνακα 1. Κατά sWRE σε 250mg /ml διαλύθηκε σε ύδωρ, το Withaferin ποσοστό ανάκτησης ήταν 4%. Το μεγαλύτερο ποσοστό ανάκτησης του Withaferin Α σε νερό ήταν 16%, που παρατηρείται σε μία συγκέντρωση έναρξης 10 mg /ml sWRE. Σε αντίθεση, όταν σκόνη WRE διαλύθηκε σε 90% EtOH ο Withaferin Ένα ποσοστό ανάκτησης κυμαίνονταν από 80-92%. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εκ νέου διαλυτοποίηση του sWRE σε 90% EtOH είναι σαφώς ανώτερη από ότι σε H

2O. Για να εκτιμηθεί η μακροπρόθεσμη σταθερότητα του διαλύματος αποθέματος WRE σε 90% EtOH, η ανάλυση HPLC έγινε σε WRE μετά από 6 και 12 μήνες αποθήκευσης στους -80 ° C. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι περίπου το 90% της αρχικής Withaferin Α μπορεί να ανιχνευθεί μετά από 6 μήνες, και περίπου 80% μετά από 12 μήνες (Εικόνα 1 C, D).

sWRE σκόνη διαλύθηκε σε διαφορετικούς διαλύτες και τη συγκέντρωση ( Α) και του ποσοστού ανάκτησης (Β) του Withaferin Α σε sWRE μετρήθηκε με HPLC. Η σταθερότητα των Withaferin Α σε sWRE (90% διάλυμα απόθεμα EtOH) την πάροδο του χρόνου παρουσιάζεται σε ένα γράφημα ράβδων με το απόλυτο (C) και σχετική (D) Withaferin μια συγκέντρωση.

Η Withanolides

Συγκέντρωση (mg /ml)

Ποσοστό (%)

Withaferin A5.8879.03Withanoside V0.3564.7812-Deoxywithastramonolide1.0614.25Withanolide A0.1361.83Withanolne0.01370.18Total Withanolides7.44100.00Table 1. Withanolides στην WRE με HPLC.

CSV Λήψη CSV

για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξικότητα, κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού υποβλήθηκαν σε θεραπεία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Withaferin Α-τυποποιημένη WRE (sWRE) για 24 και 72 ώρες (Σχήμα 2Α, Β). Μεταξύ των έξι κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, τέσσερις (MDA-MB-468, HCC 1806, Hs587-T, και MDA-MB-231) είναι τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές [45]. Δεδομένου Withaferin Α είναι μια βιμεντίνη στόχευση παράγοντας [30,34], βιμεντίνη έκφραση μαζί με άλλους δείκτες EMT αξιολογήθηκαν στις κυτταρικές γραμμές. Δύο από τα τέσσερα τριπλά αρνητικά κυτταρικές γραμμές, (Hs578-Τ και MDA-MB-231) ήταν βιμεντίνη-θετικά και όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές ήταν βιμεντίνη αρνητικά. Αυτές βιμεντίνη θετικές κυτταρικές σειρές παρουσίασαν επίσης επαγωγή ΕΜΤ αφού εμφανίζεται απώλεια Ε-καδερίνης και ήταν θετικός φιμπρονεκτίνης (Σχήμα 2C). Είναι ενδιαφέρον, διαφορετική ευαισθησία στο sWRE παρατηρήθηκε στις έξι κυτταρικές σειρές, όπου οι δύο πιο ευαίσθητα κυτταρικές σειρές, Hs578-T και MDA-ΜΒ 231 ήταν βιμεντίνη-θετικά με 72 ωρών IC

50 από 0,5 μΜ και 0,4μΜ αντίστοιχα (Σχήμα 2Β). Οι vimentin-αρνητικές κυτταρικές σειρές είχε IC

δεκαετίας του ’50, που κυμαίνονταν από 1.2 μm έως 4.0μM. Για να διερευνήσει αυτό, δοκιμασίες κυτοτοξικότητας διεξήχθησαν σε ισογονιδιακών έλεγχο και βιμεντίνης siRNA απεμπλουτισμένου ΜΟΑ-ΜΒ 231 κυττάρων. Σε αυτήν την περίπτωση, βιμεντίνη εξαντληθεί κύτταρα εμφανίζουν μικρή μείωση στην sWRE κυτταροτοξικότητα σε σύγκριση με ισογενετικών κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2D).

(Α και Β) γραμμικά γραφήματα που δεικνύουν την επιβίωση% των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού έξι κατεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις sWRE για 24 (Α) και 72 (Β) ώρες. (C) κηλίδα Western που δείχνει δείκτες EMT σε διαφορετικές γραμμές καρκίνου του μαστού. Τα τριπλά αρνητικό καρκίνο του μαστού κυτταρικές γραμμές που επισημαίνονται με αστερίσκο. (D) (αριστερά) στύπωμα Western που δείχνει την επιτυχή εξάντληση βιμεντίνη siRNA (δεξιά) δοκιμασία Cytotoxciity χρησιμοποιώντας sWRE σε ισογονιδιακών έλεγχο και βιμεντίνης siRNA εξαντλημένα κύτταρα.

Η

sWRE αναστέλλει κινητικότητα καρκινικών κυττάρων μαστού και εισβολή, και διαταράσσει βιμεντίνης μορφολογία

Έχουμε δείξει στο παρελθόν την Withaferin Α αναστέλλει τον καρκίνο του μαστού κυτταρική κινητικότητα και τη μετάσταση [35]? Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί εάν sWRE δείχνει αντι-επεμβατική αποτελεσματικότητα. Η επίδραση της sWRE επί του κυττάρου κινητικότητα της τριπλής αρνητικών καρκινικών κυττάρων του μαστού (ανθρώπινα ΜϋΑ-ΜΒ-231 και 4Τ1 ποντικού) ελέγχθηκε με τη χρήση ενός τραύματος δοκιμασία επούλωσης. WRE αναστέλλει την κυτταρική κινητικότητα σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από 24 ώρες κατεργασίας σε 0,5 μΜ σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 3Α, Β). Ένα εκτεταμένο πείραμα σε χαμηλότερες δόσεις σε ΜΟΑ-ΜΒ 231 κύτταρα δείχνει την αναστολή της κυτταρικής κινητικότητας σε 0.25 μΜ, καθώς και (Σχήμα S1). Στη συνέχεια θέλησε να καθορίσει πώς sWRE επιπτώσεις της κινητικότητας των κυττάρων όταν vimentin πρωτεΐνη είναι απούσα. Αυτό το πείραμα πρώτη απόπειρα σε κύτταρα καρκινώματος μαστού MCF7 468 και MDA ΜΒ, και τα δύο από τα οποία δεν έχουν ανιχνεύσιμα βιμεντίνη με κηλίδωση Western? Ωστόσο, σε αυτές τις περιπτώσεις, τα κύτταρα ήταν επίσης δεν κινητικά έτσι δεν θα μπορούσε να πραγματοποιηθεί το πείραμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αντ ‘αυτού, χρησιμοποιήσαμε την κυτταρική γραμμή πνευμονικού επιθηλίου, BEAS-2Β, η οποία στερείται βιμεντίνη (Σχήμα S1-Β) και δείχνει κάποια κινητικότητα. sWRE είχε 24 ώρες αντι-πολλαπλασιαστική IC

50 2.9μM και 48 ώρες IC

50 1,9 μΜ (Σχήμα S1-C). Σε μια δοκιμασία τραυματισμό, χαμηλότερες δόσεις sWRE (0,125 έως 1 μΜ) κάτω από το IC

50 είχε σχεδόν καμία επίπτωση στην κυτταρική κινητικότητα (Εικόνα S1-D). Δεν ήταν μέχρι τη θεραπεία με 2 μΜ sWRE το οποίο είναι κοντά στο 24 hr αντι-πολλαπλασιαστική IC

50, δεν παρατηρούμε αισθητή αναστολή της κινητικότητας (Σχήμα S1-D).

(Α και Β) των κυττάρων τραυματισμό δοκιμασία στο (Α) MDA-MB-231 και (Β) 4Τ1 κύτταρα επεξεργασμένα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις sWRE για 24 ώρες. (Γ και Δ) Γραμμή γράφημα που δείχνει τον ρυθμό της κυτταρικής εισβολής μέσω Matrigel ενσωματωμένο σε ένα θάλαμο Boyden σε (C) MDA-MB-231 και 4Τ1 κύτταρα επεξεργασμένα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις sWRE (D). (Ε) Ομοεστιακή ανοσοφθορισμού απεικόνιση βιμεντίνης (πράσινο), ακτίνη (κόκκινο), και ϋΑΡΙ (κυανό) σε κύτταρα MDA-MB-231 υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 9% έλεγχο EtOH, 0.5 μΜ ή 1.0 μΜ sWRE.

Η

Το αντι-επεμβατική δραστικότητα της sWRE ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα πραγματικό χρόνο δοκιμασίας εισβολή Matrigel σε θάλαμο Boyden. sWRE ήταν και πάλι σε θέση να αναστείλει σημαντικά την κυτταρική διείσδυση στις δύο κυτταρικές σειρές σε δόσεις τόσο χαμηλές όσο 0.25 μΜ σε 4Τ1 και 0.5 μΜ σε MDA-MB-231 κύτταρα (Σχήμα 3C, D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι sWRE αναστέλλει τον κυτταρικό κινητικότητα και είναι αντι-επεμβατική σε τριπλή αρνητικά κύτταρα καρκίνου του μαστού.

Από Withaferin Α αναστέλλει vimentin [30,34], ερευνήσαμε αν sWRE έχει παρόμοια ικανότητα vimentin διαταραχές. Vimentin ανοσοφθορισμού στον έλεγχο MDA-MB-231 κύτταρα δείχνουν ότι vimentin είναι δικτυωμένη σε όλη την άτρακτο σχήματος κυτταρόπλασμα? Ωστόσο, κατά την αγωγή sWRE (0,5 μΜ και 1,0 μΜ) για 16 ώρες, τα κύτταρα δεν ήταν τόσο επιμήκεις και το δίκτυο βιμεντίνης καταργήθηκε (Σχήμα 3Ε). Αντ ‘αυτού, βιμεντίνη συσσωρευτεί ως περιπυρηνική δέσμη στα περισσότερα κύτταρα, τα οποία είναι παρόμοια με την επίδραση της καθαρής Withaferin A [35]. Επιπλέον, sWRE δεν μειώθηκε επίπεδα ολικής κυτταρικής πρωτεΐνης 48 ώρες της θεραπείας (Σχήμα S2), γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτό δεν οφείλεται σε ελάττωμα στο σύνολο της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Ως εκ τούτου, με βάση αυτές τις παρατηρήσεις συμπεραίνουμε ότι sWRE διαθέτει επίσης vimentin ανασταλτική δράση σε χαμηλές δόσεις.

sWRE αποτρέπει ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT

Από vimentin διαδραματίζει καίριο ρόλο στην EMT, θέλαμε να δοκιμάσει αν sWRE θα μπορούσε να αναστείλει EMT και EMT που προκαλείται από την κινητικότητα στον καρκίνο του μαστού. Για να ελεγχθεί αυτό, χρησιμοποιήσαμε κύτταρα ΜΟΡ10Α, όπου η θεραπεία με 4 ng /ml ΤΟΡβ προκαλεί αυτά τα κύτταρα να υποστούν EMT, όπως εκτιμήθηκε από την αύξηση του σημειωτές mesenychmal βιμεντίνη και ινονεκτίνη, και την απώλεια του επιθηλιακού δείκτη, E-cadherin [8,9 ]. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι sWRE αναστέλλει ΜΟΡ10Α κινητικότητα σε μία δοκιμασία επούλωσης τραύματος με ΤΟΡβ (Σχήμα 4C) σε δόσεις παρόμοιες με εκείνες που χρησιμοποιούνται στην 4Τ1 και σειρές MDA-MB-231cell (Σχήμα 3). Για την εκτίμηση πως sWRE επιπτώσεις ΕΜΤ, τα κύτταρα ΜΟΡ10Α υποβλήθηκαν σε αγωγή με ΤΟΡβ παρουσία sWRE ή Withaferin A. TGFβ μόνος προκαλούμενη βιμεντίνη και πρωτείνη φιμπρονεκτίνη έκφραση και μειωμένη Ε-καδερίνης επίπεδα πρωτεΐνης που δείχνει την επιτυχή επαγωγή EMT. Σε αντίθεση, η αγωγή με 500ηΜ sWRE ή 500 ηΜ Withaferin Α ανέστειλε ισχυρά ΤΟΡβ-επαγόμενη EMT κρατώντας βιμεντίνη και ινονεκτίνης σε επίπεδα προ της επαγωγής και την αύξηση των επιπέδων της Ε-καδερίνης (Εικόνα 4Α, Β). Για να προσδιοριστεί εάν αυτό συμβαίνει στο μεταγραφικό επίπεδο, σε πραγματικό χρόνο PCR της μεταγραφής βιμεντίνη διεξήχθη και τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι TGFβ αυξημένη mRNA βιμεντίνη όπως αναμενόταν, αλλά sWRE δεν είχε επίδραση βιμεντίνη επίπεδα mRNA (Εικόνα 4D), παρόμοια με αυτή που παρατηρήθηκε με τη χρήση Withaferin A [30]. Συνεπώς, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι sWRE δεν αναστέλλει την έκφραση βιμεντίνη σε επίπεδο mRNA, αλλά μάλλον στο επίπεδο της πρωτεΐνης.

(Α) Western στύπωμα της βιμεντίνης σε TGFβ1-διεγερμένα κύτταρα ΜΟΡ10Α σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις sWRE. (Β) στύπωμα Western του βιμεντίνης, ινωδονεκτίνη, και Ε-καδερίνης σε TGFβ1 διεγερμένα κύτταρα ΜΟΡ10Α σε επεξεργασία με 500ηΜ sWRE ή Withaferin Α (Γ) Η μετανάστευση των κυττάρων σε προσδιορισμό επούλωσης πληγών με αυξανόμενες συγκεντρώσεις WRE. (D) Σχετική βιμεντίνη επίπεδα mRNA ανιχνεύεται με PCR πραγματικού χρόνου σε TGFβ1-διεγερμένα κύτταρα ΜΟΡ10Α σε επεξεργασία με 500ηΜ sWRE ή WFA. (Ε) ζωντανές εικόνες πάροδο του χρόνου κυττάρων του ΜΟΡ10Α 3D σφαιροειδή ενσωματωμένα σε Matrigel και διεγείρονται με TGFβ1. Κυττάρων υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 9% έλεγχο EtOH, ή 100ηΜ ή 500ηΜ sWRE.

Η

Οι μελέτες αυτές ήταν συνέχεια μετακόμισε σε ένα μοντέλο σφαιροειδές της εισβολής για να καθορίσει εάν sWRE αναστέλλει EMT που προκαλείται από την εισβολή. Σε αυτό το μοντέλο, ΤΟΡβ επάγεται ισχυρά εισβολή στο εξωκυτταρικό πλέγμα Matrigel χρησιμοποιώντας απεικόνιση ζωντανών κυττάρων να απεικονίσει εισβολή (Σχήμα 4Ε, Ταινία S1)? Ωστόσο, κατά την αγωγή με δόσεις τόσο χαμηλές όσο 100 ηΜ sWRE, εισβολή ήταν ανέστειλε ισχυρά (Σχήμα 4Ε, Ταινία S2). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι μπορεί να αναστείλει sWRE ΕΜΤ και ΕΜΤ-προκαλούμενη κινητικότητα και εισβολή.

sWRE in vivo τοξικότητα

Για να μελετηθεί η αντι-μεταστατική αποτελεσματικότητα του sWRE

in vivo

, τοξικότητα sWRE πρώτη φορά αξιολογήθηκε σε κανονικούς θηλυκά ποντίκια BALB /c. Οι ποντικοί έλαβαν είτε 4 ή 8 mg /kg sWRE σε 9% EtOH και η μέση αύξηση του σωματικού βάρους μετά από 35 ημέρες σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από την ομάδα ελέγχου δόθηκε 9% EtOH μόνο του (Σχήμα 5Α). Μετά από τέσσερις εβδομάδες θεραπείας, η ιστολογία της καρδιάς, πνευμόνων, ήπατος, σπλήνα και τα νεφρά βαθμολογήθηκαν για ίνωση, νέκρωση και φλεγμονή. Ιστολογική δεδομένα δεν δείχνουν σημαντική διαφορά μεταξύ sWRE αγωγή και των ομάδων ελέγχου οχήματος (Σχήμα 5Β, C).

(Α) Σχετική σωματικό βάρος σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με φορέα, ή sWRE σε 4 mg /kg και 8 mg /kg. (Β) Η ιστολογική διαβάθμιση της φλεγμονής, ίνωσης, και νέκρωση σε όργανα από ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με φορέα (9% EtOH) ή sWRE σε 8mg /kg. (C) Εκπρόσωπος εικόνες της H & amp? Ε χρώση ιστολογικών τομών

Η

sWRE αντι-μεταστατική αποτελεσματικότητα

Για να προσδιοριστεί η αντι-μεταστατική αποτελεσματικότητα των sWRE και συγκρίνετέ το με Withaferin Α σε ένα. μοντέλο ποντικού, χρησιμοποιήθηκε το μοντέλο μεταστατικού καρκινώματος μαστού ποντικού 4Τ1. Αυτό το μοντέλο αναπτύσσεται μεταστατικές αλλοιώσεις στον πνεύμονα, το ήπαρ, και σπλήνα 4-6 εβδομάδες μετά την έγχυση των κυττάρων εντός του μαστικού στρώματος λίπους. Οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε 4 ομάδες με 10 ποντικούς σε κάθε ομάδα, και sWRE δόθηκε από του στόματος καθετηριασμό και Withaferin Α με ε.π. ένεση σε 1, 4, και 8 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. επιλέχθηκε Το εύρος της δόσης με βάση το προηγούμενο πείραμα τοξικότητα sWRE στον ποντικό BALB /c (Σχήμα 5). Σε όλες τις δόσεις, πρωταρχικός όγκος του όγκου μειώθηκε μετά από 36 ημέρες θεραπείας με sWRE ή Withaferin Α (Σχήμα 6Α, Β). Εκπρόσωπος ακαθάριστα δείγματα των πρωτοπαθών όγκων δείχνουν ότι τόσο sWRE και Withaferin Μια όγκοι αντιμετωπίζονται ήταν μικρότερες (Σχήμα 6C). Είναι σημαντικό ότι, ο αριθμός των μεταστατικών οζιδίων του πνεύμονα μειώθηκε σημαντικά τόσο 4 και 8 mg /kg ομάδες στην sWRE και Withaferin Α ποντίκια με αγωγή (Σχήμα 6D, Ε, και τα παραδείγματα στο Σχήμα 6G). Η &?. Ε χρώση επιβεβαίωσε την παρουσία μικρο-μεταστατικές αλλοιώσεις στον πνεύμονα (Σχήμα 6F)

(Α και Β) Ο μέσος όγκος του όγκου σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 1, 4, 8 mg /kg του (Α) sWRE ή (Β) Withaferin Α (WFA) (* ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο). (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του πρωτογενούς όγκου σε sWRE ή WFA αγωγή ποντικούς. (Δ και Ε) Μπαρ γράφημα που δείχνει το μέσο αριθμό των μεταστατικών οζιδίων του πνεύμονα σε (D) sWRE ή (Ε) WFA αγωγή ποντίκια (* ρ & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο). (F) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε εικόνες χρώσης που δείχνει την ιστολογία των μεταστατικών οζιδίων σε πνεύμονα ποντικού? δύο παραδείγματα που φαίνονται. (G) Αντιπροσωπευτικές εικόνες οζιδίων του πνεύμονα μεταστατικών (μαύρα βέλη) σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με έκδοχο ελέγχου (9% EtOH) ή sWRE ή WFA σε 8mg /kg.

Η

Για να δοκιμαστεί περαιτέρω η αντι-μεταστατική αποτελεσματικότητα του sWRE, ένα παρόμοιο πείραμα χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος με ανθρώπινο μεταστατικό καρκίνο του μαστού κύτταρα MDA-MB-231 διεξήχθη. Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως εντός του μαστικού στρώματος λίπους των θηλυκών αθυμικών γυμνών ποντικών. Τα ποντίκια χορηγήθηκαν sWRE από του στόματος καθετηριασμό και Withaferin Ένα από ε.π. ένεση σε συγκέντρωση 1, 4, και 8 mg /kg 3 φορές την εβδομάδα για 4 εβδομάδες. Πρωτογενής όγκος του όγκου αναστάλθηκε από sWRE σε 4 και 8 mg /kg δόσεις.