Abstract

LIV-1, ένα μεταφορέας ψευδάργυρος, είναι ένα μόριο τελεστής κατάντη από διαλυτά αυξητικούς παράγοντες. Αυτή η πρωτεΐνη έχει δειχθεί ότι προάγει επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) στον ανθρώπινο παγκρεατικό, μαστού, και κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Παρά την εμπλοκή της LIV-1 σε ανάπτυξη και μετάσταση του καρκίνου, δεν έχει υπάρξει καμία μελέτη για τον προσδιορισμό του ρόλου της LIV-1 σε εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, δεν υπήρξε σαφής οριοθέτηση του μοριακού μηχανισμού υποκείμενες LIV-1 λειτουργία σε καρκινικά κύτταρα. Στην παρούσα ανακοίνωση, βρήκαμε αυξημένη έκφραση LIV-1 σε καλοήθεις, PIN, πρωτοβάθμιας και των οστών μεταστατικού καρκίνου του ανθρώπινου προστάτη. Χαρακτηρίσαμε το μηχανισμό με τον οποίο LIV-1 οδηγεί EMT ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη σε ένα μοντέλο καρκίνου του προστάτη μετάσταση στα οστά των ανδρογόνων καρκίνο του προστάτη ανθεκτικού κύτταρα (ARCaP). LIV-1, όταν υπερεκφράζεται σε ARCaP

E (παράγωγο κύτταρα ARCaP με επιθηλιακά φαινότυπο) κύτταρα, που προωθείται EMT ανεπανόρθωτα. LIV-1 υπερεκφράζεται ARCaP

E κύτταρα είχαν αυξημένα επίπεδα του ΗΒ-EGF και μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) δραστηριότητες 2 και ΜΜΡ 9 πρωτεολυτικό ένζυμο, χωρίς να επηρεάζει την ενδοκυτταρική συγκέντρωση του ψευδαργύρου. Η ενεργοποίηση των MMPs είχε ως αποτέλεσμα την αποβολή της ηπαρίνης δεσμεύσεως του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (ΗΒ-EGF) από ARCaP

E κύτταρα που προκάλεσε συστατικός υποδοχέας του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) φωσφορυλίωση και κατάντη εξωκυτταρικό σήμα ρυθμίζεται κινάσης (ERK) σηματοδότησης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι LIV-1 εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη, όπως μια ενδοκυτταρική στόχος της σηματοδότησης υποδοχέα αυξητικού παράγοντα που προώθησε ΕΜΤ και τον καρκίνο της μετάστασης. LIV-1 θα μπορούσε να είναι ένας ελκυστικός θεραπευτικός στόχος για την εξάλειψη της προϋπάρχουσας ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη και των οστών και μεταστάσεις μαλακών ιστών

Παράθεση:. Lue HW, Yang Χ, Wang Ε, Qian W, Xu RZH, Lyles R, et al. (2011) LIV-1 προάγει τον καρκίνο του προστάτη Τα επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση και τη μετάσταση μέσω HB-EGF Περικοπή και EGFR-διαμεσολαβούμενη ERK σηματοδότησης. PLoS ONE 6 (11): e27720. doi: 10.1371 /journal.pone.0027720

Επιμέλεια: Wafik Σ El-Deiry, Penn State Hershey Ινστιτούτο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 22, Ιουνίου του 2011? Αποδεκτές: 23 Οκτ 2011? Δημοσιεύθηκε: 16 Νοεμβρίου του 2011

Copyright: © 2011 Lue et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις έρευνας 2PO1CA098912 και 5RO1CA122602 (LWKC) των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας /Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (https://www.nih.gov) και W81XWH-07-0172 (LWKC) του Υπουργείου άμυνας των Ηνωμένων Πολιτειών (https://cdmrp.army.mil/pcrp). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

LIV-1, μία πρωτεΐνη κυτταρικής επιφάνειας και ένας υποψήφιος μεσολαβητής του αυξητικού παράγοντα-προκάλεσε μόριο σηματοδότησης, έχει συνδεθεί με πολλές σημαντικές βιολογικές διεργασίες χρησιμεύοντας ως μεταφορέας για τον ψευδάργυρο και άλλα ιόντα [1], [ ,,,0],2], [3], [4], [5]. Ως πρωτότυπο του LIV-1 υποοικογένεια των ΗΠΑ ταχυδρομικός μέταλλο μεταφορέων [5], [6], LIV-1 μετοχές δευτερεύουσα δομή με φερμουάρ μεταφορείς και μπορεί να έχει τη δυνατότητα να μεταφέρει μεταλλικά ιόντα. LIV-1 δείχθηκε να είναι ένας μεσολαβητής καθοδικά από μετατροπέα σήματος και ενεργοποιητής της μεταγραφής 3 (STAT3) και σαλιγκάρι, συνεργαζόμενοι με σαλιγκάρι στην καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου επιθηλιακών δείκτη Ε-καδερίνης (Ε-CAD) [7]. LIV-1 αποδείχθηκε επίσης να είναι ένας που αλληλεπιδρά εταίρος για τον υποδοχέα οιστρογόνου (ER) σε ορμόνη-ευαίσθητους ιστούς [3], [8]. Στο ER-θετικό ZR-75-1 κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού, LIV-1 μεταγραφή διεγείρεται από οιστρογόνα [9]. Σε όγκους του μαστού, LIV-1 έκφραση συνδέεται με την κατάσταση των οιστρογονικών υποδοχέων [10], [11], και συσχετίζεται θετικά με την εξάπλωση του καρκίνου στην περιφερειακή λεμφαδένες [12]. Στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, η έκφραση του LIV-1 δείχθηκε να είναι υψηλότερη σε όγκο από τους φυσιολογικούς ιστούς? Μεσολάβηση RNAi καταστολή της LIV-1 ανέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, σχηματισμό αποικιών, και μείωσε το μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα των κυττάρων HeLa [13]. LIV-1 έχει επίσης αναφερθεί να είναι υψηλά σε κλινικές παγκρεατικό καρκίνωμα και επαγόμενη EMT σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [14]. Σε ψάρι zebra, LIV-1 είναι απαραίτητη για την πυρηνική εντόπιση του σαλιγκαριού, έναν παράγοντα μεταγραφής κύριος προώθηση επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ), προκαλώντας μετανάστευση κυττάρων γαστριδίου οργάνωση [15]. LIV-1 έτσι αποτελεί υποχρεωτικό συν-παράγοντας που ρυθμίζει γονίδια που σχετίζονται ΕΜΤ-[14], [15], [16].

Το δυναμικό διαγνωστική και προγνωστική αξία της LIV-1 σε ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη δεν κατέστη διερευνώνται. Δεδομένου ότι ο ψευδάργυρος παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της προστάτη ομοιόστασης των επιθηλιακών κυττάρων [17], και σαλιγκάρι αποτελεί βασικό παράγοντα μεταγραφής έλεγχο του καρκίνου του προστάτη κυτταρικών ΕΜΤ [18], [19], [20], LIV-1 μπορεί να είναι ένας ενεργός συμμετέχων σε η προώθηση της ΕΜΤ κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη και μετάσταση στα οστά. Σε αυτή τη μελέτη, προσδιορίσαμε το επίπεδο της LIV-1 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη και κλινικά δείγματα ιστών για τον καθορισμό της σχέσης μεταξύ LIV-1 και του προστάτη εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση. Το μοντέλο εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη ανθρώπινων κυττάρων ARCaP χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί ο ρόλος του LIV-1. Η μελέτη μας διαπίστωσε ότι LIV-1 υπερέκφραση προωθεί ΕΜΤ κυττάρων του καρκίνου του προστάτη και διευκολύνει τη μετάσταση του στα οστά και μαλακούς ιστούς. Περαιτέρω μηχανιστική έρευνα αποκάλυψε ότι LIV-1 υπερέκφραση μπορούσε upregulate HB-EGF και ΜΜΡ2 και έκφραση ΜΜΡ9. Το τελευταίο θα μπορούσε να ενζυμικά διασπούν δεσμευμένο σε μεμβράνη HB-EGF, για να παράγουν διαλυτά HB-EGF που μόνιμα ενεργοποιημένη EGFR μέσω της αυξημένης φωσφορυλίωσης του EGFR και κατάντη σηματοδότησης ERK του. Τα αποτελέσματα από αυτή τη μελέτη δείχνουν ότι αφύσικα αυξημένη έκφραση LIV-1 είναι ένας δείκτης της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη, και ενεργοποιημένα LIV-1 είναι υπεύθυνη για συστατική ενεργοποίηση του EGFR που κινεί EMT. LIV-1 θα μπορούσε να είναι ένας ελκυστικός νέος θεραπευτικός στόχος για την αναστολή της ΕΜΤ καρκίνου του προστάτη και των οστών και μεταστάσεις των μαλακών ιστών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Όλες οι εργασίες των ζώων διεξήχθη σύμφωνα με τις σχετικές εθνικές και διεθνείς κατευθυντήριες οδηγίες, και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Emory University School of Medicine (άδεια αριθμό 254-2008).

Οι κυτταρικές σειρές και καλλιέργειας κυττάρων

Ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη ARCaP

Ε και ARCaP

κύτταρα Μ (παράγωγο κύτταρα ARCaP με επιθηλιακών και μεσεγχυματικών φαινότυπο, αντίστοιχα) ιδρύθηκαν το εργαστήριο μας [21]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Τ-μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) συμπληρωμένο με 5% ορό εμβρύου μόσχου (FBS, Atlanta Biologicals, Lawrenceville, GA). Ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα ΗΕΚ293 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Invitrogen) συμπληρωμένο με 10% FBS. RPMI-1640 αγοράστηκε από την Invitrogen (Carlsbad, CA). Όλα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκαν με πενικιλίνη (100 U /ml) και στρεπτομυκίνη (100 μg /ml). Οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα συμπληρωμένη με 5% CO

2.

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι LIV-1 παρήχθη στο εργαστήριο μας. Κουνέλια ανοσοποιήθηκαν με τυπικό πρωτόκολλο ανοσοποίησης με συζευγμένο πεπτίδιο KLH-CPDHDSDSSGKDPRNS, που αντιστοιχεί στα κατάλοιπα 146-161 της πρωτεΐνης LIV-1 (αριθμός πρόσβασης GenBank NM_012319). Ελήφθη αίμα 2 εβδομάδες μετά την τέταρτη ώθηση και IgG καθαρίστηκαν και δοκιμάστηκαν για ειδική ανοσολογική αντιδραστικότητα. Πολυκλωνικό αντίσωμα προς Ε-καδερίνης (Ε-cad), μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι βιμεντίνης και φωσφο-EGFR αντίσωμα αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Το μονοκλωνικό αντίσωμα προς Ν-καδερίνης (Ν-CAD) και EGFR ήταν από BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Αντισώματα προς ρ44 /42 ΜΑΡ κινάσης και οι φωσφορυλιωμένες ισομορφές ήταν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Το μονοκλωνικό αντίσωμα προς β-ακτίνη ήταν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Ο ινσουλινοειδής αυξητικός παράγοντας-1 (IGF-1) και ο αυξητικός παράγοντας μετασχηματισμού-β1 (ΤΟΡ-β1) αγοράστηκαν από Diagnostic Systems Laboratories (Webster, ΤΧ). επιδερμικός αυξητικός παράγοντας (EGF) ήταν από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Tyrphostin AG1478, U0126 και ΜΜΡ2 /9 αναστολέα III ελήφθησαν από Alomone Labs (Jerusalem, Israel), Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ), και Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία), αντίστοιχα.

Επιμόλυνση

περιοχή κωδικοποίησης για την ανθρώπινη LIV-1 πλήρους μήκους cDNA κλωνοποιήθηκε και επιβεβαιώθηκε με προσδιορισμό της αλληλουχίας του DNA. Το cDNA στη συνέχεια κλωνοποιήθηκε καθοδικά από έναν πρώιμο υποκινητή του κυτταρομεγαλοϊού στον φορέα έκφρασης pcDNA3.1 θηλαστικού /V5-His (Invitrogen). ΗΕΚ293 και ARCaP

E κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων 24 ώρες πριν από την επιμόλυνση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 4 μg του κατασκευάσματος έκφρασης LIV-1 χρησιμοποιώντας 8 μΐ Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Για να απομονωθούν κλώνοι που υπερεκφράζουν σταθερά LIV-1, επιμολυσμένα ARCaP

E κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με G418 (600 μg /ml) 2 ημέρες μετά την επιμόλυνση. Τέσσερις ξεχωριστοί κλώνοι που υπερεκφράζουν πρωτεΐνη LIV-1 (LIV # 8, # 12, # 14 και # 17) και δύο κλώνοι επιμολύνθηκαν με φορέα μάρτυρα (CON1 και con2) χρησιμοποιήθηκαν για τις μελέτες.

siRNA knockdown

LIV-1 siRNA αγοράστηκε από την Invitrogen. ARCaP

Μ κυττάρων σπάρθηκαν σε 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων για 24 ώρες. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 2.5 μΐ 20 μΜ LIV-1 siRNA ή ίση ποσότητα της καθολικής ελέγχου siRNA, με τη χρήση 8 μl Λιποφεκταμίνη 2000 ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

ημι-ποσοτική ανάλυση έκφρασης με αλυσιδωτή αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-PCR)

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini ( Qiagen, Valencia, CA). Από κάθε δείγμα, ίση ποσότητα RNA (2 μα) χρησιμοποιήθηκε στο πρώτου κλώνου αντίδραση σύνθεσης cDNA με το Superscript First-Strand kit cDNA Synthesis (Invitrogen). Ίσοι όγκοι cDNA (3 μl) από κάθε αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση PCR χρησιμοποιώντας ζεύγη εναρκτήρα ολιγονουκλεοτιδίου ειδική γονιδιακή: 5′-GCAATGGCGAGGAAGTTATCT-3 ‘και 5′-CTATTGTCTCTAGAAAGTGAG-3′ για LIV-1? 5’-TGCCCAGAAAATGAAAAAGG-3 ‘και 5′-GTGTATGTGGCAATGCGTTC-3′ για το E-CAD? ? 5’-CCATCACTCGGCTTAATGGT-3 ‘και 5′-GATGATGATGCAGAGCAGGA-3′ για την Ν-CAD? 5’-CGAAAGGCCTTCAACTGCAAAT-3 ‘και 5′-ACTGGTACTTCTTGACATCTG-3′ για σαλιγκάρι? 5’-TGCCCGGCGGAATCTCCTGA-3 ‘και 5′-GATGCAGGAGGGAGCCCGGA-3′ για HB-EGF? 5’-GCTGTCTGCGTGGTGGTGCT -3 ‘και 5′-TGGTGTGGTGGGTCCAGGGC -3 »για το ΕΤΠ? και 5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3 ‘και 5′-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’ για GAPDH. Οι αντιδράσεις ξεκίνησαν με επώαση 4 λεπτά στους 94 ° C, ακολουθούμενη από 30 κύκλους στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 55 ° C για 30 δευτερόλεπτα, και 72 ° C για 1 λεπτό. Η αντίδραση ολοκληρώθηκε με επέκταση 7 λεπτά στους 70 ° C για 7 λεπτά. PCR προϊόντα έγιναν ορατά μετά από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,2% και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο (0,5 μg /ml).

κηλίδωση Western

Cells σε 80% συρροή υποβλήθηκαν σε λύση σε ένα ολοκυτταρικό ρυθμιστικού λύσης όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. Τα προϊόντα λύσης επωάστηκαν σε πάγο για 30 λεπτά και φυγοκεντρήθηκε στις 10.000 rpm στους 4 ° C για 10 λεπτά. Από κάθε δείγμα, 35 μg πρωτεΐνης στο υπερκείμενο επιλύθηκε με SDS-PAGE και στυπώθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (BioRad, Hercules, CA), το οποίο μπλοκαρίστηκε σε 5% αποβουτυρωμένο γάλα σε PBST (137 mM NaCl, 12 mM φωσφορικό άλας, 2.7 mM KCI, και 0.1% Tween 20) σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι μεμβράνες στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές σε PBST και επωάστηκαν με δευτερογενές αντίσωμα χρένο συζευγμένο με υπεροξειδάση για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά από πέντε πλύσεις σε PBST, ειδικά σήματα ανιχνεύθηκαν με επώαση της μεμβράνης με αντιδραστήριο ECL (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Μέτρηση ενδοκυτταρική συγκέντρωση του ψευδαργύρου

Δύο μέθοδοι χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί ενδοκυτταρική συγκέντρωση του ψευδαργύρου. Για την παρασκευή δειγμάτων για την δοκιμασία συνολικά ενδοκυτταρικά ψευδαργύρου από το επαγωγικά συζευγμένου φασματομετρία μάζας πλάσματος (ICP-MS), καλλιεργημένα κύτταρα σε 80% συρροή θρυψινοποιήθηκαν και πλύθηκαν σε PBS, και μετά επωάστηκαν σε 300 μΐ 70% νιτρικού οξέος στους 37 ° C για 2 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε 2% νιτρικό οξύ και υποβλήθηκε σε ICP-MS με ένα όργανο Varian. Μία πρότυπη καμπύλη δημιουργήθηκε με διαδοχικές αραιώσεις προτύπων μέσου ψευδαργύρου. Για την παρασκευή δειγμάτων για την δοκιμασία ενδοκυτταρική ασταθή ψευδαργύρου με φθορισμομετρική μέθοδο, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 3 χ 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων την ημέρα πριν τη μέτρηση. Τα κύτταρα φορτώθηκαν με 2 μΜ FluoZIN-3 ΑΜ (Invitrogen) για 1 ώρα σε Ορίί-ΜΕΜ που περιέχει 0.02% Pluronic F127 (Invitrogen). Μετά την πλύση σε PBS, τα φορτωμένα κύτταρα επωάστηκαν σε δείκτη-free Opti-ΜΕΜ για 30 λεπτά. Φθορισμού της FluoZin-3 μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ΡΕ Victor

3 V ανάγνωσης πλάκας.

επούλωση των πληγών Ξυστό

δοκιμασία

ARCaP

Μ κύτταρα επιμολυσμένα παροδικά με LIV-1 siRNA ή καθολική ελέγχου siRNA χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό μεταναστευτική συμπεριφορά. Τα κύτταρα απαλά και αργά γδαρμένο με ένα ρύγχος πιπέτας 10 μl σε ολόκληρο το κέντρο των καλά 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Μετά το ξύσιμο, το καλά απαλά πλύθηκαν δις με μέσο για την απομάκρυνση των αποσπασμένων κυττάρων. Το καλά αναπληρώθηκε με νωπό μέσο. Φωτογραφίες ελήφθησαν 48 ώρες μετά το ξύσιμο. Πολλαπλές απόψεις κάθε καθώς ήταν τεκμηριωμένες, και τρία ανεξάρτητα πειράματα.

μετανάστευση Trans-καλά και εισβολή δοκιμασίες

Για να εκτελέσετε μια δοκιμασία μετανάστευσης trans-καλά, 2.5 × 10

4 κύτταρα στον άνω θάλαμο των πλακών transwell 24 φρεατίων 8 μm μεγέθους πόρων (BD Biosciences) επωάστηκαν για 16 ώρες σε πλήρες μέσο το οποίο προστέθηκε στον κάτω θάλαμο. Τα κύτταρα στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη και χρωματίζονται με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες. Τα κύτταρα που δεν μετανάστευσαν στο εσωτερικό του θαλάμου αφαιρέθηκαν από επιχρισμάτων. Κρυσταλλικό ιώδες για τα μεταναστευτικά κύτταρα διαλυτοποιήθηκε σε ρυθμιστικό Sorenson του (0.1 Μ κιτρικό νάτριο και 50% αιθανόλη, ρΗ 4,2) και μετρήθηκε για απορρόφηση στα OD

590. Η δοκιμασία εισβολή έγινε με χρήση θαλάμων εισβολή BD BIOCOAT Matrigel (BD Biosciences? 8-μm μέγεθος πόρων). Χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες διαδικασίες που περιγράφονται παραπάνω, εκτός από τα φίλτρα προ-επικαλυμμένες με 100 μΙ Matrigel σε αραίωση 1:04 σε RPMI-1640.

Αξιολόγηση των ογκογόνων και μεταστατικών δυναμικά

Η λειτουργική ρόλοι των LIV-1 σε σχηματισμό όγκων του προστάτη και τη μετάσταση αξιολογήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [23]. Για την αξιολόγηση των τοπικών ανάπτυξης όγκου, 4-εβδομάδων αθυμικά αρσενικούς ποντικούς (Ncr-ηυ /ηυ, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Frederick, MD) εμβολιάστηκαν υποδόρια με ARCaP

E κύτταρα (1 χ 10

6 σε 50 μl PBS) σταθερώς μεταγωγή με LIV-1. διάσταση του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κατά τις ημέρες 23, 32, 43, και 50 μετά την ένεση, και ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε ως μήκος Χ πλάτος Χ ύψος × 0,5236 [24]. Για να αξιολογηθεί μεταστάσεις καρκίνου, αθυμικούς αρσενικά ποντίκια εμβολιάστηκαν intracardiacally με ARCaP

E κύτταρα (2 χ 10

6 σε 100 μΙ PBS) σταθερώς μεταγωγή με LIV-1 στα αριστερά κοιλία. Τα ζώα παρατηρήθηκαν για 4 μήνες για την ανάπτυξη μεταστατικών βλαβών. οστικές μεταστάσεις καταγράφηκαν από ακτινογραφία ακτίνων Χ και μεταστάσεις μαλακών ιστών επιβεβαιώθηκε με ιστοπαθολογική

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) των μικροσυστοιχιών ιστού (TMA)

Οι κανονικές και νοσούντων ιστών του προστάτη που αναλύθηκαν ήταν από.: 1) Ένα custom-made TMA με φυσιολογικούς ιστούς του προστάτη από 4 υγιείς άνδρες? συμφωνημένα καρκίνο, καλοήθεις και ιστούς PIN από περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη 12? συμφωνημένα καλοήθεις και καρκινικούς ιστούς από τις 11 περιπτώσεις? συμφωνημένα PIN και τον καρκίνο, από την 1η περίπτωση? καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) από τις 2 περιπτώσεις? και του καρκίνου του προστάτη οστική μετάσταση από περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη 3. 2) Ένα custom-made ΤΜΑ αποτελείται από 47 οστά ιστών μετάσταση από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη 11. 3) Τέσσερα TMAs που το καθένα περιέχει 66 περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη και της καλοήθους διαταραχές προστάτη (US Biomax. Rockville, MD).

Το πρωτόκολλο IHC για την αξιολόγηση γονιδιακής έκφρασης έχει αναφερθεί [22]. Εν συντομία, τα δείγματα αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν και υποβλήθηκε σε αντιγόνο ανάκτηση. Μετά ενδογενούς υπεροξειδάσης μπλοκαρίσματος, τα δείγματα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα στους 4 ° C όλη τη νύχτα, ακολουθούμενη από μία επώαση 30 λεπτών με αντιδραστήριο DakoCytomation EnVision + HRP. Σήματα ανιχνεύθηκαν με προσθήκη διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο και αιματοξυλίνη αντικηλίδωση με. Προ-ανοσοποίηση ορός κουνελιού χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. χρώση IHC βαθμολογήθηκε από δύο ερευνητές ανεξάρτητα βασίζεται σε τέσσερις χρώση εντάσεις από 0 έως +++ όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22].

Ζελατίνη zymography

Όλα τα αντιδραστήρια ζυμογραφία ζελατίνης αγοράσθηκαν από την Invitrogen. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 ελεύθερο ορού για 24 ώρες και ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε. Πρωτεΐνης στο μέσο συμπυκνώθηκε με AmiconUltracel 30 KDa φίλτρου (Millipore, Billerica, ΜΑ). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (10 μg /δείγμα) αναμίχθηκαν με 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος Novex Τπδ-Γλυκίνη SDS, και κλασματοποιήθηκε σε μια πηκτή 10% ζελατίνη υπό μη αναγωγικές συνθήκες. Η πηκτή στη συνέχεια επωάστηκε στους 37 ° C σε ρυθμιστικό διάλυμα αναδιάταξης για 30 λεπτά και στην ανάπτυξη ρυθμιστικού διαλύματος επί 30 λεπτά. Τέλος, η πηκτή χρωματίστηκε σε SimplyBlue SafeStain, και ζώνες που αντιπροσωπεύουν τη δραστικότητα ζελατινάσης των ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 είχαν ποσοτικοποιηθεί.

Ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (

ELISA

) για ΗΒ-ΕΟΡ

τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI1640 ελεύθερο ορού για 24 ώρες. Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και αναλύθηκε για συγκέντρωση HB-EGF με το κιτ Human HB-EGF Duoset ELISA (R &? D Systems), σύμφωνα με το προτεινόμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα από τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκε εις τριπλούν.

Η στατιστική ανάλυση

Για να αναλυθεί η πιθανή συσχέτιση της LIV-1 πρωτεϊνικής έκφρασης και του προστάτη εξέλιξης του καρκίνου από την κανονική /καλοήθη, προστατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία (ΡΙΝ ), εντοπισμένο πρωτογενούς καρκίνου, σε μετάσταση των οστών, το επίπεδο έκφρασης LIV-1 χωρίστηκε σε δύο κατηγορίες: χρώση ένταση των υψηλών (3) έναντι μέσου σε null (2 έως 0, αντίστοιχα). Η μη παραμετρική δοκιμασία Kruskal Wallis χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της ισότητας των διαμέσους πληθυσμού μεταξύ του καρκίνου του προστάτη προόδους της κανονικής /καλοήθη, PIN, πρωτοπαθή καρκίνο και μετάσταση στα οστά. Αυτή η δοκιμή είναι ισοδύναμα με την παραμετρική δοκιμή ANOVA χρησιμοποιείται όταν υπάρχουν περισσότερες από δύο ομάδες που συγκρίνονται. Η μη παραμετρική δοκιμασία Mann-Whitney εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό της ισότητας των διαμέσους πληθυσμού ανάμεσα σε δύο ακολουθίες του καρκίνου, 1) μετάσταση στα οστά έναντι εντοπισμένο καρκίνο? και 2) μετάσταση στα οστά εναντίον καλοήθη, PIN και τα πρωτογενή εντοπισμένο καρκίνο. Η δοκιμή αυτή είναι ισοδύναμη με την παραμετρική δοκιμή t χρησιμοποιείται όταν υπάρχουν μόνο δύο ομάδες που συγκρίνονται. Λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να διαμορφώσει τη σχέση ανάμεσα στη δυαδική σκορ Gleason, που χωρίστηκαν σε δυαδικές μεταβλητές καλά διαφοροποιημένα (GI≤6) έναντι μέτριας έως χαμηλής διαφοροποίησης (GI≥7) καρκίνο του προστάτη. SAS και Minitab χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την ανάλυση.

Αποτελέσματα

Το ανθρώπινο κύτταρα καρκίνου του προστάτη ARCaP καθιερώθηκαν στο εργαστήριο μας [21] μπορούν να προωθηθούν εύκολα να υποστούν EMT σε απόκριση σε διαλυτούς παράγοντες και πρωτεΐνες μήτρας που υπάρχει στο μικροπεριβάλλον του όγκου [20], [25], [26], [27]. Για να διαλευκανθεί ο μηχανισμός ρύθμισης μοριακού EMT, επιθηλιακά ARCaP

E αναλύθηκε για διαφορική έκφραση γονιδίων σε απόκριση προς διαλυτούς παράγοντες, σε σύγκριση με ARCaP

M ομόλογό της, η οποία εμφανίζεται ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά. LIV-1 ήταν ένα από τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια εντοπίζονται [27]. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο της LIV-1 στη ρύθμιση της ΕΜΤ σε κύτταρα ARCaP να εκτιμηθεί ο πιθανός μηχανισμός του LIV-1 δράση για την προώθηση της οστικής καρκίνου του προστάτη και μεταστάσεις μαλακών ιστών.

LIV-1 συμμετείχε στην προώθηση της EMT στο μοντέλο των κυττάρων ARCaP

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν ότι ARCaP

E κύτταρα υποβλήθηκαν σε EMT όταν έλαβαν θεραπεία με διαλυτό παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των IGF-1, EGF, TGF-β1 και β-2 μικροσφαιρίνη (β -2M) [20], [25], [26], [27]. Στην παρούσα μελέτη, όταν ARCaP

E κύτταρα επεξεργάστηκαν είτε με ΤΟΡ-β1 ή IGF-1, μία επαγωγή LIV-1 έκφραση ανιχνεύθηκε τόσο από RT-PCR και κηλίδωση Western αναλύσεις (Σχήμα 1Α). Όταν διαφορετικές συγκεντρώσεις του IGF-1 προστέθηκαν στο μέσο επαγωγής, η ανταπόκριση των LIV-1 έκφραση βρέθηκε να είναι εξαρτώμενη από τη δόση (Σχήμα 1Α). IGF-1 που προκαλείται LIV-1 έκφραση σε ARCaP

E κύτταρα εμφανίστηκαν ταυτόχρονα με ένα διακόπτη της μορφολογίας των κυττάρων και την έκφραση του γονιδίου προς μεσεγχυματικά φαινότυπο,

δηλαδή

, η απώλεια του σφιχτά κόλλα πολωμένου επιθηλιακά μορφολογία να γίνουν χαλαρά διεσπαρμένα ινοβλαστικά κύτταρα με αυξημένη έκφραση του Ν-CAD και βιμεντίνης, αλλά μειωμένη έκφραση της Ε-cad, ένα σήμα κατατεθέν συγκρατείται από πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 1Β). Ενεργοποιείται η έκφραση LIV-1 φαίνεται να συμβαίνουν ταυτόχρονα με τη μετάβαση της ARCaP

E για να ARCaP

Μ, μια παραλλαγή ARCaP μεσεγχυματικά [21].

Ο ρόλος της LIV-1 αξιολογήθηκε με άλλαξε τους έκφρασης κατά τη διάρκεια της EMT. Α, ARCaP

E κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία επί 48 ώρες με αυξητικούς παράγοντες για την επαγωγή EMT. RT-PCR και κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκαν για να δείξουν αυξημένη έκφραση LIV-1 (αριστερό πάνελ), και της ανταπόκρισης δόσης της έκφρασης (δεξί πάνελ). Β, κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει ΕΜΤ-σαν εκφραστική αλλαγές στην αγωγή ARCaP

E κύτταρα. C, μεσεγχυματικά κύτταρα παρόμοια ARCaP

Μ κυττάρων υποβλήθηκαν σε siRNA knockdown για LIV-1 έκφρασης για 48 ώρες. RT-PCR και κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση εκφραστική αλλαγές αντανακλούν αντιστροφή του ΕΜΤ στα επεξεργασμένα κύτταρα. Α, την επούλωση των πληγών Ξυστό και φρεατίων εισβολή δοκιμασίες χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των μεταναστευτικών και επεμβατική συμπεριφορά σε siRNA αντιμετωπίζονται ARCaP

Μ κυττάρων. * Υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε σύγκριση με τον κλώνο ελέγχου CON1 (Ρ & lt? 0,05). Ε, ARCaP

E κύτταρα επιμολύνθηκαν με LIV-1 κατασκεύασμα έκφρασης. RT-PCR και κηλίδωση Western διεξήχθησαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση για να ανιχνεύσει αλλαγές εκφραστική αντανακλώντας ΕΜΤ-σαν γεγονότα. GAPDH χρησίμευσε ως εσωτερικός έλεγχος για τις αντιδράσεις RT-PCR, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης σε κηλίδωση Western.

Η

Για να καθορίσει το ρόλο του LIV-1 στη μεσολάβηση EMT, έχουμε παροδικά μειωμένη το επίπεδο LIV-1 στο μεσεγχυματικά-όπως ARCaP

M κύτταρα με siRNA knockdown. ARCaP

M κύτταρα κατεργασμένα με ειδικό LIV-1 siRNA έδειξαν σημαντικά μειωμένη LIV-1 μεταγραφές (Σχήμα 1 C). Σημαντικά, τα κατεργασμένα κύτταρα έδειξαν μειωμένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών Ν-cad και σαλιγκάρι, αλλά αυξημένη έκφραση του γονιδίου Ε-CAD τόσο RT-PCR και κηλίδωση Western αναλύσεις (Εικόνα 1 C). Επιπλέον, ARCaP

Μ κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με ειδικά LIV-1 siRNA παρουσίασαν πολύ μειωμένη μεταναστευτικών και επεμβατική ικανότητα στο μηδέν επούλωση της πληγής και επικοινωνούντα δοκιμασίες εισβολής (Σχήμα 1D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι LIV-1 έκφραση συνδέεται με EMT και μειωμένη LIV-1 έκφραση που οδηγεί σε μεσεγχυματικά σε επιθηλιακό μετάβαση (ΚΟΑ), μια αντιστροφή της EMT. Η παρουσία του LIV-1 φάνηκε να απαιτείται για την διατήρηση ενός φαινοτύπου μεσεγχυματικών.

επόμενο εξετάστηκε εάν αυξημένα LIV-1 σε επιθηλιακά-όπως ARCaP

E κύτταρα θα είναι επαρκής για να κινήσει EMT, όπως αξιολογείται με μοριακές αναλύσεις. Μετά από παροδική επιμόλυνση με μια κατασκευή έκφρασης LIV-1, ARCaP

E κύτταρα εξετάστηκαν τόσο από RT-PCR και κηλίδωση Western δοκιμασίες για την έκφραση της ΕΜΤ-σχετίζεται δείκτες. Η επιμολυσμένα ARCaP

E κύτταρα εμφανίζονται σημαντικά αυξημένες LIV-1 (Σχήμα 1 Ε), η οποία συνοδεύεται από αυξημένη Ν-CAD και σαλιγκάρι, αλλά μειωμένη έκφραση Ε-cad. Αυτές οι εκφραστικές αλλαγές ήταν σε συμφωνία με αυτές που παρατηρούνται σε παράγοντα ανάπτυξης που προκαλείται EMT (Εικόνα 1Β). Τα αποτελέσματα από LIV-1 siRNA νοκ ντάουν και μελέτες υπερέκφραση LIV-1 στην ARCaP

M και ARCaP

E κύτταρα πρότεινε ότι LIV-1 εξυπηρετεί ένα βασικό ρυθμιστή της EMT σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη.

Παραγωγή και ο χαρακτηρισμός των πολύκλωνων αντισωμάτων με την ανθρώπινη LIV-1

για να αξιολογηθεί εάν LIV-1 έκφραση συνδέεται με την κλινική πρόοδο του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη, θέσαμε πολυκλωνικά αντισώματα με ανοσοποίηση κουνελιών με ένα ΚΕΗ-συζευγμένου LIV-1 πεπτίδιο. Ιδιαιτερότητα της LIV-1 αντισώματα επιβεβαιώθηκε με στύπωση Western των ολικών κυττάρων εκχυλίσματα από κύτταρα που υπερεκφράζουν εξωγενή LIV-1. Από τα κύτταρα ΗΕΚ293 παροδικά επιμολυσμένα με LIV-1, παρατηρήσαμε μία μόνο ανοσο-αντιδρώσα πρωτεΐνη LIV-1, σε 110 kDa (Εικόνα 2Α). Από το υπολογισμένο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης LIV-1 είναι 90 kDa [5], το διαφορικό 20 kDa μεταξύ της ανιχνεύονται και οι προβλεπόμενες μεγεθών πιθανόν αποδίδεται σε Ν-συνδεδεμένη γλυκοζυλίωση της πρωτεΐνης LIV-1, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [5]. Είναι σημαντικό ότι, το σήμα που ανιχνεύεται από τα αντισώματα LIV-1 καταργήθηκε όταν τα αντισώματα προ-προσροφηθεί με το LIV-1 πεπτίδιο που χρησιμοποιείται στην ανοσοποίηση. Επιπλέον, η αυξημένη ένταση σήματος ανιχνεύθηκε στο ARCaP

E κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με την κατασκευή έκφρασης LIV-1, ενώ η μείωση του σήματος παρατηρήθηκε σε ARCaP

M κύτταρα που κατεργάζονται με μια παροδική LIV-1 φορέα knockdown στο τόσο κηλίδωση Western και δοκιμασίες IHC (Σχήμα 2Β και 2C). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξε ότι τα αντισώματα LIV-1 που παράγεται θα μπορούσε να ανιχνεύσει ειδικά πρωτεΐνη LIV-1, η οποία τροποποιήθηκε στις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν.

Τα παραγόμενα αντισώματα προς LIV-1 υποβλήθηκαν σε επικύρωσης για ειδικότητα. Α, κύτταρα ΗΕΚ293 παροδικά επιμολυσμένα με την κατασκευή έκφρασης LIV-1 υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western ανάλυση με τα αντισώματα να LIV-1 (άνω πάνελ). Εξειδίκευσης αντισώματος προσδιορίστηκε με προ-απορρόφηση του αντισώματος με το πεπτίδιο ανοσοποίησης (μεσαίο πλαίσιο). Β, ARCaP

E κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το κατασκεύασμα έκφρασης LIV-1 για την υπερέκφραση LIV-1 και ARCaP

Μ κυττάρων με το ειδικό siRNA για την καταστολή της έκφρασης LIV-1. Στα ανώτερα 2 πάνελ, κηλίδωση Western Διεξήχθη 48 ώρες αργότερα με τα αντισώματα να LIV-1. Στις κατώτερες 2 πάνελ, αυτά τα κύτταρα εξετάσθηκαν με RT-PCR για να επιβεβαιωθεί η έκφραση LIV-1. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος σε κηλίδωση Western και GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για την ανάλυση RT-PCR. C, IHC διεξήχθη για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω LIV-1 Ab εξειδίκευση σε ARCaP

E κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με την κατασκευή έκφρασης LIV-1 και ARCaP

Μ κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με το ειδικό siRNA (200 Χ).

Σταθερή LIV-1 υπερέκφραση επαγόμενη EMT στην ARCaP

E κύτταρα

Μετά την παροδική εξουδετέρωση του LIV-1 στην ARCaP

κύτταρα Μ, μια αναμενόμενη αναστροφή των μεσεγχυματικών κυττάρων ινοβλαστικών σχήμα σε επιθηλιακά μορφολογία παρατηρήθηκε. Αυτές οι μορφολογικές διακόπτες ήταν εύκολα ανιχνεύσιμες από τις αλλαγές έκφρασης γονιδίου (Σχήμα 1 C). Σε αντίθεση, παροδικά υπερεκφράζουν LIV-1 στην ARCaP

E κύτταρα δεν προκάλεσε μετάβαση μεσεγχυματικά μορφολογικά, παρά τις συντονισμένες εκφραστική αλλαγές ενδεικτικές της EMT (Σχήμα 1Ε). Εμείς υποψία ότι η έλλειψη μορφολογικές μεταβολές μπορούν να αποδοθούν με τη φύση της παροδική επιμόλυνση. Κατά συνέπεια, σταθερή ARCaP

E κλώνοι αποδείχθηκαν να αξιολογηθεί κατά πόσον LIV-1 είναι ένας κρίσιμος ρυθμιστής συνδέεται με μορφολογικές καθώς εκφραστική και συμπεριφορική μετάβαση από μια επιθηλιακή προς έναν φαινότυπο μεσεγχυματικά.

Απομονώσαμε 4 ARCaP

E κλώνοι (LIV # 8, 12, 14 και 17) που εκφράζουν σταθερά υψηλά επίπεδα πρωτεΐνης LIV-1, όπως ανιχνεύεται με Western κηλίδωση (Σχήμα 3Α). Δύο κλώνοι ελέγχου (CON1 και con2) απομονώθηκαν επίσης από την επιμόλυνση με τον φορέα ελέγχου. Οι αυτοί που υπερεκφράζουν LIV-1 έδειξε χαρακτηριστική ΕΜΤ-όπως εκφραστικής αλλαγές, με μειωμένη έκφραση Ε-CAD αλλά αυξήθηκε Ν-CAD και εκφράσεις Σαλιγκάρι (Σχήμα 3Α). Σημαντικά, όλοι οι κλώνοι έδειξαν αξιοσημείωτα αλλάξει την κυτταρική μορφολογία: αντί του μικρού μεγέθους κυψέλης με λιθόστρωτα σχήμα που μοιάζει με σφικτά διατεταγμένα διακυτταρική επαφή χαρακτηριστική του επιθηλιακού κυττάρου που ομοιάζει ARCaP

Ε, και οι τέσσερις κλώνοι προσαρμόζονται αξιοσημείωτα αλλαγμένη μορφολογία εμφανίζοντας μια απώλεια ενδοκυτταρικής επαφής και τυπικά ατρακτοειδή μορφολογία μεσεγχυματικών κυττάρων (Σχήμα 3Β). Η μετάβαση μορφολογικά ήταν μόνιμη και μη αναστρέψιμη, εξακολουθούν να υπάρχουν μετά από περισσότερα από 30 περάσματα σε συνεχή καλλιέργεια, ενώ οι δύο φορέα-επιμολυσμένων κλώνων παρέμεινε επιθηλιακών κυττάρων-όπως. Φαίνεται ότι σταθερή LIV-1 υπερέκφραση θα μπορούσε να φέρει στο προσκήνιο τόσο μορφολογικές και βιοχημικές μετάβαση EMT. LIV-1 είναι επομένως ένας ισχυρός υποκινητής του ΕΜΤ σε ARCaP

E κύτταρα.

ARCaP

E κλώνοι που υπερεκφράζουν LIV-1 εμφανίζεται ΕΜΤ-όπως αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, κυτταρική μορφολογία και συμπεριφορά. Α, και οι τέσσερις LIV-1 που υπερεκφράζουν ARCaP

E κλώνων έδειξε ΕΜΤ-όπως εκφραστικές τροποποιήσεις όπως ανιχνεύεται με κηλίδωση Western, ενώ οι δύο κλώνοι φορέα ελέγχου (1 και 2) που διατηρούνται επιθηλιακή προφίλ έκφρασης κυττάρων-παρόμοια. Β, κυτταρική μορφολογία των LIV-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν έδειξε αξιοσημείωτες αλλαγές από τους κλώνους ελέγχου (200 Χ). C, LIV-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν (LIV # 8 και LIV # 14 συγκρίθηκαν με κλώνους φορέα ελέγχου 1 και 2 και γονικών ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κυττάρων για αλλαγμένη μεταναστευτικών δυνατότητα σε επικοινωνούντα προσδιορισμούς. Κάθε αποτέλεσμα είναι η μέση ± τυπική απόκλιση ενός τριπλούν προσδιορισμού. D, το LIV-1 που υπερεκφράζουν # 8 και # 14 κλώνοι σε σύγκριση με κλώνους φορέα ελέγχου 1 και 2 και της γονικής ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κυττάρων για αλλαγμένη διεισδυτικότητα. * δηλώνει στατιστική σημαντικότητα σε σχέση με τον κλώνο ελέγχου CON1 (

P

& lt? 0,05).

η

Τα αποτελέσματα της LIV-1 στις αλλαγές συμπεριφοράς αξιολογήθηκαν για την προώθηση της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής σε δοκιμασίες θάλαμο Boyden. Ενώ ο έλεγχος νεο επιμολυσμένα ARCaP

E κλώνους έδειξε παρόμοια μετανάστευση και την εισβολή των δυνατοτήτων που μιμούνται στενά εκείνες των γονικών ARCaP

E κύτταρα, επανέλαβε αναλύσεις αποκάλυψαν ότι LIV-1 υπερέκφραση ανατίθενται αυξήθηκε σημαντικά μεταναστευτικά ικανότητα (Σχήμα 3C) και επιθετική πιθανότητα να διεισδύει εξωκυτταρικές μήτρες (Σχήμα 3D). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την ιδέα ότι τα αυξημένα επίπεδα LIV-1 προωθούν την κινητικότητα και επεμβατική συμπεριφορές των κυττάρων καρκίνου του προστάτη.

LIV-1 σχηματισμός υπερέκφραση προωθείται όγκου του προστάτη και απομακρυσμένων μεταστάσεων

in vivo

Εξετάσαμε το ρόλο της LIV-1 εκφράζεται σταθερά σε ARCAP

E κύτταρα στη ρύθμιση μετέπειτα ογκογόνο και μεταστατικό συμπεριφορές σε ποντίκια. Συγκρίναμε τις τοπικές και απομακρυσμένες μεταστατική ανάπτυξη των ARCaP

E όγκων με πρωτόκολλα υποδόρια και ενδοκαρδιακή ενοφθαλμισμό των νεοπλασματικών κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21], [23].

Μετά την υποδόρια εμφύτευση, LIV-1 που υπερεκφράζουν κλώνων που επάγεται ένα παρόμοια συχνότητα εμφάνισης σχηματισμού όγκων στους ελέγχους φορέα-επιμολυσμένα, κάθε ομάδα που έχει 6 όγκους από ένα σύνολο 8 εμβολιασμούς.