Αφηρημένο

Τα εξωκυττάρια μήτρα (ECM) αναδιαμόρφωση είναι ένα βασικό συστατικό της κυτταρικής μετανάστευσης και τη μετάσταση του όγκου, και έχει συσχετιστεί με την εξέλιξη του καρκίνου. Παρά τη σημασία της αναδιαμόρφωσης της μήτρας, συστηματική και ποσοτικές μελέτες σχετικά με τη διαδικασία έχουν σε μεγάλο βαθμό λείπει. Επιπλέον, παραμένει ασαφές αν η διακοπή τάσεως χαρακτηριστικό ομοιόσταση κακοήθειας είναι λόγω των διαταραγμένων αρχικά ECM και ιστών ιδιότητες, ή με την μεταβολή του ιστού από τα κύτταρα του όγκου. Να διερευνήσει αυτές τις ερωτήσεις, μελετήσαμε την αναδιαμόρφωση της μήτρας από δύο διαφορετικές καρκίνου του προστάτη κυτταρικές σειρές σε ένα τρισδιάστατο σύστημα κολλαγόνου. Πάνω από μία εβδομάδα, θα παρακολουθούνται οι διαρθρωτικές αλλαγές σε πήγματα ποικίλου περιεχομένου κολλαγόνου χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία ανάκλασης και ποσοτική ανάλυση εικόνας, παρακολούθηση μετρήσεις του κλάσματος ινιδίων, το μέγεθος των πόρων, και το μήκος των ινών και διάμετρο. Τα πήγματα που σπάρθηκαν χωρίς κύτταρα (έλεγχος), κύτταρα LNCaP και DU-145 κύτταρα ποσοτικά σύγκριση. Πηκτώματα με υψηλότερη περιεκτικότητα σε κολλαγόνο είχε αρχικά μικρότερα μεγέθη πόρου και υψηλότερα κλάσματα ινιδίου, όπως αναμενόταν. Ωστόσο, με την πάροδο του χρόνου, LNCaP- και DU-145-κατοικείται μήτρες έδειξε διαφορετικές δομικές ιδιότητες σε σύγκριση τόσο με το άλλο και με τα τζελ ελέγχου, με τα κύτταρα LNCaP που εμφανίζεται να ευνοεί μικροπεριβάλλοντα με κλάσματα χαμηλότερη ινών κολλαγόνου και μεγαλύτερο πόρους από ό, τι DU-145 κύτταρα. Εμείς θέτουμε ότι η προτίμηση των κυττάρων DU-145 »για πυκνότερα μήτρες οφείλεται στην υψηλότερη εισβολής τους και πρωτεολυτική δυνατότητες. Αναστολή πρωτεασών μήτρας είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη κλάσματα ινιδίων για την υψηλή συγκέντρωση πήγματα σπάρθηκε με τύπο είτε κύτταρο, υποστηρίζοντας την υπόθεση μας. νέα ποσοτικά αποτελέσματα μας μετρήστε τη δυναμική της αναδιαμόρφωσης γέλης σε τρεις διαστάσεις και δείχνουν ότι τα κύτταρα του καρκίνου του προστάτη αναδιαμορφώσει ECM τους κατά συνεργικό τρόπο που εξαρτάται από τις δύο αρχικές ιδιότητες μήτρα, καθώς και διεισδυτικότητα τους

Παράθεση:. Harjanto D , Maffei JS, Zaman ΜΗ (2011) Ποσοτική Ανάλυση της Επίδρασης του Καρκίνου της διεισδυτικότητας και κολλαγόνο Συγκέντρωση σε 3D Matrix αναδιαμόρφωση. PLoS ONE 6 (9): e24891. doi: 10.1371 /journal.pone.0024891

Επιμέλεια: Mário Α Barbosa, Instituto de Engenharia Biomedica, Πανεπιστήμιο του Πόρτο, Πορτογαλία

Ελήφθη: 28 Απριλίου, 2011? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 27η Σεπτεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Harjanto et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς Αναγνωρίζετε υποστήριξη από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (1R01CA132633). DH υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών Μεταπτυχιακή Έρευνα Fellowship. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι περισσότεροι καρκίνοι, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη, μόνο να αποβεί μοιραία στιγμή που τα καρκινικά κύτταρα έχουν κάνει μετάσταση σε μακρινές περιοχές [1]. μετάστασης του καρκίνου περιλαμβάνει τη μετανάστευση των κυττάρων από τον αρχικό μάζα του όγκου διαμέσου της βασικής μεμβράνης και χαλαρό συνδετικό ιστό στο αίμα ή το λεμφικό σύστημα. καρκινικά κύτταρα, στη συνέχεια, εξαγγειώνονται από το κυκλοφορικό σύστημα για να βρουν το δρόμο τους σε νέους ιστούς. Κατά τη διάρκεια της μεταστάσεως, τα κύτταρα αλληλεπιδρούν με το εξωκυτταρικό πλέγμα (ECM), ένα περίπλοκο δίκτυο των γλυκοζαμινογλυκανών, πρωτεϊνών προσκόλλησης, και δομικές ίνες, όπως το κολλαγόνο. Πολλές ιδιότητες της ECM, συμπεριλαμβανομένων της δομής πλέγματος [2], [3] μηχανική, και διαστάσεων [4], έχουν δειχθεί ότι επηρεάζουν την κυτταρική συμπεριφορά. Τα κύτταρα in vivo συνήθως περιβάλλεται από όλες τις πλευρές από την ECM, δείχνοντας ιστοειδική μηχανικές και δομικές ιδιότητες. Κατά συνέπεια, είναι σημαντικό να μελετηθεί κύτταρα σε συντονίσιμα τρισδιάστατη συστήματα (3D), η οποία καλύτερα μιμούνται τις φυσιολογικές συνθήκες από ό, τι επίπεδη, ιδιαίτερα άκαμπτα υποστρώματα.

Ένα κρίσιμο στάδιο κατά τη διάρκεια in vivo κυτταρική μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση είναι αναδιαμόρφωση της μήτρας. Matrix πρωτεόλυση είναι ιδιαίτερα σημαντικό για τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 3D, δεδομένου ότι είναι πιο πιθανό να εμποδίζεται στερεοχημικά από το να κινείται από τα κύτταρα σε επίπεδα υποστρώματα. Κατά συνέπεια, έχει δειχθεί ότι αναστέλλουν μεταλλοπρωτεάσες μήτρας (MMPs) μειώνει την ταχύτητα των κυττάρων και επιμονή σε 3D μήτρες, αλλά δεν μπορεί να μεταβάλλει σημαντικά την κίνηση των καρκινικών κυττάρων σε 2D υποστρώματα [5], [6]. έκφραση της ΜΜΡ επίσης συχνά αυξάνει κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του καρκίνου [7], γεγονός που υποδηλώνει ότι οι προηγμένες καρκινικά κύτταρα αναδιαμορφώσει πιο ενεργά τη μονάδα ECM για να διευκολύνει τη μετάσταση. ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 έχουν ταυτοποιηθεί ως σημαντικοί MMPs εμπλέκονται σε μεταστατικό καρκίνο του προστάτη [8]. Τα κύτταρα μπορούν επίσης να χρησιμοποιήσουν τα μηχανήματα ακτινομυοσίνης τους για να τραβήξει από την μήτρα να ευθυγραμμίσει ίνες [9] – [11]

Ενώ η αναδιαμόρφωση της μήτρας είναι μια σημαντική διαδικασία, λίγες μελέτες έχουν προσπαθήσει να το μελετήσουν άμεσα.. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει η κατανόηση πώς αναδιαμόρφωση δυναμικά μεταβάλλει τη δομή του ECM. Ένα εργαλείο που έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη δομής ECM είναι συνεστιακή μικροσκοπία ανάκλασης (CRM). CRM συλλέγει φως που ανακλάται από ίνες ECM, που επιτρέπει την 3D δομική ανακατασκευή της μήτρας. Ενώ η πρόσφατη εργασία δείχνει ότι το CRM είναι τυφλή σε ίνες προσανατολισμένες προς την κατεύθυνση του προσπίπτοντος φωτός, με αποτέλεσμα την υπερεκτίμηση του μεγέθους των ματιών του δικτύου [12], CRM είναι ακόμα μια ευρέως χρησιμοποιούμενη τεχνική, παρέχοντας ενημερωτικό δεδομένα που μπορούν να αποτελέσουν τη βάση για συγκριτικές μελέτες. CRM έχει χρησιμοποιηθεί προηγουμένως για τη μελέτη δομή του κολλαγόνου [13] – [16], ινιδιογένεσης [17], και πώς τα κύτταρα αλληλεπιδρούν με το ECM [18], [19]. Δυστυχώς, πολλές από τις μελέτες στις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-μήτρας ήταν αρκετά ποιοτικές, και έχουν ακόμη να παρέχει μια άμεση σύγκριση μεταξύ της ικανότητας εισβολής του κυττάρου, αρχική συγκέντρωση κολλαγόνου, και /ή τις αλλαγές στη δομή πάροδο του χρόνου.

στο έγγραφο αυτό, έχουμε ως στόχο να απαντήσει σε όλα αυτά τα ερωτήματα ποσοτικά. Έχουμε διερευνήσει τρόπους μήτρα δομικές ιδιότητες, όπως ποσοτικοποιούνται με ανάλυση εικόνας των δεδομένων CRM, αλλάζουν με την πάροδο του χρόνου για να αξιολογήσει ECM αναδιαμόρφωση από τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη σε ένα σύστημα 3D γέλη κολλαγόνου, μεταβάλλοντας τη συγκέντρωση του κολλαγόνου για να προσδιοριστεί η επίδραση της αρχικής δομής ECM και μηχανική . Η συμπεριφορά αναδιαμόρφωσης για τον καρκίνο κυτταρικές σειρές δύο προστάτη, LNCaP και DU-145, συγκρίνονται. LNCaP κύτταρα είναι μια σχετικά αργά αυξάνεται, ευαίσθητο σε ανδρογόνο κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από ένα μεταστατικό βλάβη στα οστά [20]. Οι DU-145 κύτταρα που αναπτύσσονται ταχύτερα, ανδρογόνο-αναίσθητη, και προέρχεται από ένα μεταστατικό βλάβη στον εγκέφαλο [21]. Ένας αριθμός μελετών έχουν δείξει ότι DU-145 κύτταρα είναι πιο δραστήρια επεμβατική από κύτταρα LNCaP [22] – [25]. Από το έργο αυτό, είμαστε σε θέση να αποκτήσουν ποσοτική εικόνα για το πώς δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές όγκων διαφορετικής εισβολής αναδιαμορφώσει τη μήτρα σε 3D περιβάλλοντα. Τα αποτελέσματά μας παρέχει μια νέα εικόνα για τη δυναμική των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-μήτρας από τη σκοπιά της μήτρας.

Αποτελέσματα

Τζελ ποικίλης συγκέντρωση κολλαγόνου δείχνουν διαφορετικές μηχανικές και δομικές ιδιότητες

Για να ληφθεί μια γραμμή βάσης για σύγκριση, μελετήθηκαν 3D πήγματα διαφόρων συγκεντρώσεων κολλαγόνου (2, 3, ή 4 mg /ml) που δεν εμβολιάστηκαν με κύτταρα (που προσδιορίζονται ως «καμία κύτταρο» κατάσταση). Ρεομετρία διεξήχθη για να αξιολογηθεί η αρχική δυσκαμψία των πηκτωμάτων. Όπως ήταν αναμενόμενο, ο συντελεστής διάτμησης αυξάνει με συγκέντρωση κολλαγόνου, που κυμαίνονται από -200 έως 550 Pa για 2 έως 4 mg /ml πηκτώματα (Εικόνα 1Α), αποδίδοντας τα αποτελέσματα συγκρίσιμα με εκείνα που αναφέρθηκαν από άλλες ομάδες χρησιμοποιώντας μία παρόμοια τεχνική πήκτωση [26].

(

Α

) μέτρο διάτμησης σαν συνάρτηση της συγκέντρωσης κολλαγόνου για τζελ χωρίς κύτταρα. Οι ράβδοι σφάλματος: τυπική απόκλιση. CRM εικόνων για πήγματα χωρίς κύτταρα για την (

B

) 2 mg /ml? (

C

) 3 mg /ml? και (

D

) 4 mg /ml. (

E

) CFM και CRM επικάλυψης DU-145 κύτταρα (πράσινο) σε 3 mg /ml κολλαγόνου (λευκό) 5 ημέρες μετά την σπορά. Κλίμακα bar για εικόνες CRM: 30 μm

Η

Για τη δομική ανάλυση, CRM στοίβες εικόνα αποκτήθηκαν για τις ποικίλες τζελ κολλαγόνου 1, 3, 5, και 7 ημέρες μετά τη σπορά.. Αντιπροσωπευτικά εικόνες CRM από τους τρεις τύπους των πηκτών που φαίνεται στο Σχήμα 1Β-D. Σε αυτή τη μελέτη, οι δομικές παράμετροι ενδιαφέροντος είναι το κλάσμα των ινών κολλαγόνου περιοχής καταλαμβάνουν (αναφέρεται ως «κλάσμα ινιδίου»), το μέγεθος των πόρων, και η διάμετρος των ινών και το μήκος. Αυτές οι παράμετροι επιλέχθηκαν ως trackable, φυσιολογικά σχετικές μετρήσεις της αναδιαμόρφωσης της μήτρας. Ποιοτικά, είναι προφανές ότι υψηλότερη συγκέντρωση αποτελέσματα κολλαγόνου σε πηκτώματα που είναι περισσότερο πυκνοκατοικημένες με ίνες, καταλήγοντας σε μικρότερα μεγέθη πόρων. Ποσοτική ανάλυση εικόνας επιβεβαιώνει αυτές τις παρατηρήσεις, όπως υψηλότερο κλάσμα ινιδίων (Σχήμα 2Α) και μικρότερο μέγεθος πόρων (Σχήμα 2Β) παρατηρείται με υψηλότερες συγκεντρώσεις κολλαγόνου. Γενικά, δεν υπάρχει σημαντική μεταβολή συναρτήσει του χρόνου για την πυκνότητα ινιδίων και το μέγεθος πόρων (Σχήμα S1) για τις πηκτές κάθε ειδικού συγκέντρωση κολλαγόνου, όπως θα αναμενόταν με την απουσία της αναδιαμόρφωσης μήτρας.

(

Μια

) κλάσμα Ινιδίου? και (

Β

) το μέγεθος των πόρων, μία εβδομάδα μετά τη σπορά. Για πηκτές κύτταρο-seeded, τα δεδομένα από την κυτταρική περιοχές που παρουσιάζονται.

Η

LNCaP κύτταρα και DU-145 κύτταρα αναδιαμορφώσει τη μήτρα σε διακριτές τρόπους εξαρτάται από την αρχική συγκέντρωση κολλαγόνου

Gels ποικίλης συγκέντρωση κολλαγόνου (2, 3, 4 mg /ml) στη συνέχεια σπάρθηκε με φθορισμό βαμμένα κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Για την οπτικοποίηση των χρωματισμένων κυττάρων, συνεστιακή μικροσκοπία φθορισμού (CFM) πραγματοποιήθηκε σε συνδυασμό με το CRM. Μια αντιπροσωπευτική εικόνα παρουσιάζεται στο Σχήμα 1Ε, δείχνοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι σαφώς προσκολλημένο σε ένα 3D δίκτυο ινών κολλαγόνου.

Όπως και με τις πηκτές ελέγχου, γέλες κύτταρο-seeded απεικονίστηκαν 1, 3, 5, και 7 ημέρες μετά την επίστρωση για να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τη δυναμική της αναδιαμόρφωσης της μήτρας. Για να κατανοήσουμε το βαθμό που αναδιαμόρφωση της μήτρας συμβαίνει σε παγκόσμιο επίπεδο έναντι αμέσως τοπικών στα κύτταρα, οι περιοχές του πηκτώματος που σε ένα δεδομένο χρονικό σημείο που περιέχονται κυττάρων (που προσδιορίζονται ως «κυτταρική περιοχές»), καθώς και περιοχές που δεν είχαν καταληφθεί από κύτταρα (που προσδιορίζονται ως «μη κυτταρικό περιοχές «) απεικονίστηκαν. Διαφορετικές περιοχές Έγινε δειγματοληψία μεταξύ χρονικών σημείων ώστε να μην μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι μια δεδομένη περιοχή ήταν (ή δεν ήταν) καταλαμβάνεται από τα κύτταρα κατά τη διάρκεια του πειράματος ως κύτταρα είναι κινητά. Παρ ‘όλα αυτά, είναι ενδιαφέρον να δούμε ότι ενώ πηκτές ελέγχου δείχνουν διαφορετικές δομικές ιδιότητες σε σύγκριση με τους σπόρους γέλες, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στο κλάσμα των ινιδίων και μέγεθος πόρων από τα μη κυτταρικά και κυτταρικών περιοχών σε πηκτώματα σπέρνονται με κύτταρα LNCaP σε 2 mg /ml κολλαγόνου συγκέντρωση πάροδο του χρόνου (Σχήμα 3). Αυτή είναι η περίπτωση για τις δύο κυτταρικές γραμμές και για όλες τις συγκεντρώσεις γέλη σε οποιοδήποτε δοθέν χρονικό σημείο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι αναδιαμόρφωση μήτρας λαμβάνει χώρα σε παγκόσμια κλίμακα, ειδικά όταν η μήτρα εμβολιάζεται με σχετικά υψηλή πυκνότητα των κυττάρων, όπως είναι η περίπτωση εδώ

(

A

) Ινιδίου κλάσμα.? και (

Β

) το μέγεθος των πόρων, με την πάροδο του χρόνου. Κυτταρική περιοχές σπέρνονται τζελ περιέχει κύτταρα? ακυτταρικού περιοχές που δεν το κάνουν.

Η

Όταν τα κύτταρα LNCaP και DU-145 κύτταρα καλλιεργούνται σε κολλαγόνο, υπάρχει μια σαφής αλλαγή στο κλάσμα ινίδια και το μέγεθος των πόρων σε σύγκριση με την καμία προϋπόθεση κυττάρων (Σχήμα 2). Μία εβδομάδα μετά τη σπορά, σε σύγκριση με τις γέλες ελέγχου, και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσιάζουν υψηλότερη περιεκτικότητα σε ινίδια κολλαγόνου σε ml γέλες 2 mg /και μικρότερους πόρους. (Συγκριτικά στοιχεία για τη μεταβολή στις ιδιότητες μήτρα για σπάρθηκαν πήγματα πάροδο του χρόνου μπορεί να φανεί στο Σχήμα S2.) DU-145 κύτταρα φαίνεται να καταθέσει σημαντικά περισσότερο κολλαγόνο από τα κύτταρα LNCaP σε πηκτές 2 mg /ml. Στην υψηλότερη συγκέντρωση κολλαγόνου γέλες, η συμπεριφορά των δύο κυτταρικών σειρών αποκλίνει περισσότερο. Σε σύγκριση με τις γέλες ελέγχου, τα κύτταρα DU-145 δεν φαίνεται να μεταβάλλει σημαντικά το περιβάλλον τους, ενώ τα 3 mg /ml και 4 mg /ml πηκτώματα LNCaP-seeded παρουσιάζει σημαντικά χαμηλότερο κλάσματα ινιδίων και αντίστοιχα μεγαλύτερο πόρους. Τα προφίλ μήκους ίνας και της διαμέτρου και για τις δύο κυτταρικές σειρές είναι πολύ συγκρίσιμο με αυτό που παρατηρείται στην κατάσταση όχι κύτταρο (Σχήμα 4). Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι στις πηκτές 2 mg /ml, περισσότερο από μια διαφορά σε αυτές τις ιδιότητες των ινών παρατηρήθηκε ό, τι σε υψηλότερες πυκνότητες κολλαγόνου, με LNCaP-seeded γέλες δείχνουν ελαφρώς στενότερο, μικρότερο ινίδια. LNCaP κύτταρα φαίνεται να ευνοούν περιβάλλοντα με περίπου ~ 20% πληρότητα του κολλαγόνου, ενώ DU-145 κύτταρα ευνοούν πυκνότερο μικροπεριβάλλοντα με ινίδια πληρότητας των περιπ.25-30% ως τα κλάσματα ινίδια για όλες τις τρεις συγκεντρώσεις κολλαγόνου δοκιμαστεί φαίνεται να συγκλίνουν για να γύρω από αυτές τις αξίες πάνω η πορεία των πειραμάτων

διαμέτρους ινών για (

Α

) 2 mg /ml.? (

C

) 3 mg /ml? και (

E

) 4 mg /ml. μήκη ινών για (

B

) 2 mg /ml? (

D

) 3 mg /ml? και (

F

) 4 mg /ml. Η γ-άξονας δείχνει το δεκαδικό κλάσμα των ινών με δεδομένη διάμετρο ή μήκος, όπως συμβαίνει στις άλλες γραφικές παραστάσεις του προφίλ ινών (βλέπε επίσης Σχήμα S1c-F).

Η

κύτταρα LNCaP και DU- 145 κύτταρα επιδεικνύουν διαφορετικά επίπεδα της πρωτεολυτικής ενεργότητας, και η αναστολή της δραστηριότητας αυτής μεταβάλλει τη συμπεριφορά αναδιαμόρφωση μήτρα παρατηρήθηκε

Για να εκτιμηθεί άμεσα την πρωτεολυτική δραστηριότητα και η διεισδυτικότητα των δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές πιο άμεσα, ζυμογραφία πηκτώματος διεξήχθη. Όπως αναμένεται από προηγούμενες μελέτες [22] – [25], DU-145 κύτταρα φαίνεται να είναι πολύ πιο επεμβατική, δείχνουν υψηλότερα επίπεδα πρωτεόλυση από δραστικών ΜΜΡ-2 και της ενεργού ΜΜΡ-9 από κύτταρα LNCaP (Σχήμα 5). Η αυξημένη εισβολής των DU-145 κύτταρα μπορεί να ευθύνεται για την ανοχή τους πιο πυκνά ινώδη μικροπεριβάλλοντα κολλαγόνου

(

Α

) Ζελατίνη ζυμόγραμμα.? και (

B

) ποσοτικοποιούνται δεδομένα, με τον αριθμό pixel της περιοχής του πρωτεολυτική δραστικότητα επί της γέλης κανονικοποιηθεί από την πυκνότητα των κυττάρων που χρησιμοποιούνται στο πείραμα. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν το τυπικό σφάλμα.

Η

Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έναν αναστολέα ΜΜΡ ευρέος φάσματος, Marimastat, το οποίο αναστέλλει τη δραστηριότητα του MMP-1, 2, 3, 7, 9, και 12 [27 ], χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία κύτταρα εμβολιάζονται σε πηκτώματα κολλαγόνου ποικίλης συγκέντρωσης. Μόλις ΜΜΡ δραστικότητα αναστάλθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, τα κλάσματα ινιδίων των γελών 4 mg /ml πολύ μειωμένο από ό, τι παρατηρήθηκε στα πηκτώματα σπέρνονται με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 6), ακόμη και πτώση κάτω από αυτό που παρατηρήθηκε στις πηκτές ελέγχου. Το αποτέλεσμα αυτό υποστηρίζει την υπόθεσή μας ότι η αυξημένη δραστηριότητα ΜΜΡ μπορεί να επιτρέπει στα κύτταρα να συνεχίσουν να αναπτύσσονται και να ευδοκιμούν σε ιδιαίτερα ινώδη μικροπεριβάλλοντα. Ελλείψει τέτοιας δραστηριότητας, τα κύτταρα αναδιαμορφώσει τη μήτρα για να φιλοξενήσει καλύτερα τροποποιημένο ανάγκες τους.

Ινιδίου κλάσματα από την κυτταρική περιοχές του τζελ μετριέται σε 3 ημέρες μετά τη σπορά για τζελ σπάρθηκε με (

Α

) LNCaP κύτταρα? και (

Β

) DU-145 κύτταρα.

Η

Συζήτηση

Matrix αναδιαμόρφωση είναι ένα βασικό βήμα στην κυτταρική μετανάστευση, την εισβολή και τη μετάσταση. Μια ποσοτική κατανόηση του πώς καρκινικών κυττάρων σε διάφορα στάδια εξέλιξης της νόσου αλλάξει μικροπεριβάλλοντα τους είναι ζωτικής σημασίας για μια ολοκληρωμένη κατανόηση της εξέλιξης της νόσου και θεραπευτική παρέμβαση. Εδώ έχουμε εξετάσει πόσο δομή μήτρας εξελίσσεται συναρτήσει του χρόνου χρησιμοποιώντας ποσοτική CRM, μελετώντας 3D μήτρες κολλαγόνου διαφόρων συγκεντρώσεων σπάρθηκε με δύο προστάτη καρκινικές κυτταρικές σειρές ποικίλης διεισδυτικότητας.

Βρήκαμε ότι γελών κολλαγόνου χωρίς κύτταρα παρουσίασαν ένα υψηλότερο συντελεστή διάτμησης και επέδειξε μικρότερο μέγεθος πόρων και υψηλότερο κλάσμα ινιδίων με αυξανόμενη συγκέντρωση κολλαγόνου όπως αναμένεται. Το κλάσμα ινιδίου και το μέγεθος πόρων αυτών των πηκτών ελέγχου δεν άλλαξε σημαντικά με το χρόνο. Έχουμε, επίσης, ήταν σε θέση να αποδείξει ότι τα κύτταρα LNCaP και DU-145 κύτταρα είναι ενεργά αναδιαμόρφωση περιβάλλον τους. Μετά από μία εβδομάδα, και οι δύο τύποι κυττάρων αύξησε το κλάσμα των ινιδίων και μείωσε το μέγεθος των πόρων των πηγμάτων 2 mg /ml σε σύγκριση με τον έλεγχο. Εν τω μεταξύ, σε 4 mg /ml πήγματα, κύτταρα τροποποιημένα των μητρών για τη μείωση κλάσμα ινιδίων και την αύξηση του μεγέθους των πόρων. Οι διαρθρωτικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν ήταν ανιχνεύσιμα πάνω από ένα χρονικό διάστημα αρκετών ημερών και βρέθηκαν να συμβεί σχετικά ομοιόμορφα σε όλες τις μήτρες, καθώς δεν υπήρχε καμία διαφορά μεταξύ της μη κυτταρικό και κυτταρική περιοχές της LNCaP- ή DU-145-seeded τζελ.

Αποδείχθηκε επίσης ότι τα κύτταρα LNCaP και DU-145 κύτταρα αναδιαμορφώσει τη μήτρα στο ευδιάκριτους τρόπους, πράγμα που σημαίνει ότι διαφορετικοί τύποι κυττάρων ευνοούν διαφορετικούς τύπους μικροπεριβάλλοντα και θα τους αναδιαμορφωθεί ανάλογα για να ταιριάζει με τις ανάγκες τους. Κατά μέσο όρο, τα κύτταρα LNCaP φάνηκε να ευνοεί χαμηλότερη περιεκτικότητα σε κολλαγόνο και υψηλότερα μεγέθη πόρων από DU-145 κύτταρα. 2 mg ml τζελ /κολλαγόνου σπάρθηκε με κύτταρα LNCaP εμφανίζουν μικρότερες, στενότερες ίνες κατά μέσο όρο από τον έλεγχό τους και DU-145 ομολόγους. Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις, τα προφίλ των ινών για κάθε συγκέντρωση κολλαγόνου για τις τρεις συνθήκες (έλεγχος, LNCaP, και DU-145) ήταν λιγότερο διακριτές, υποδεικνύοντας ότι είναι η οργάνωση της μήτρας και όχι η δομή του ατόμου ινίδια κολλαγόνου ίδιοι που είναι διαφορετική μεταξύ των διαφορετικών συνθηκών gel.

Προς τα πάνω ρυθμισμένη αναδιαμόρφωση της μήτρας είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό των όγκων. Αναδιαμόρφωση περιλαμβάνει την εναπόθεση νέων ECM, η υποβάθμιση των υφιστάμενων συστατικά της μήτρας, και την ευθυγράμμιση των ινών. Εναπόθεση των νέων ECM δεν μπορεί να αναμένεται σε μικροπεριβάλλοντα όγκου όπως θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι τα κύτταρα σε 3D πίνακες θα προτιμούσε να ασχοληθεί με λιγότερα εμπόδια στερεοχημικές στην εισβολή. Ωστόσο, το ενδιάμεσο μάλλον παρά πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις προσδέματος ECM έχει αποδειχθεί ότι είναι η βέλτιστη για τη μετακίνηση των κυττάρων λόγω της ανάγκης να εξισορροπηθούν έλξη και προσκόλληση δυνάμεις [28]. Οι ιστολογικές μελέτες έδειξαν ότι κακοήθεις ιστούς δείχνουν επίσης αυξημένη εναπόθεση κολλαγόνου [29]. Πρόσφατα έχει αποδειχθεί ότι διηθητικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων LNCaP, παράγουν ένα κολλαγόνο τύπου Ι που είναι ανθεκτική σε ΜΜΡ-αποικοδόμηση και διευκολύνει πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση [30]. Στα πηκτώματα 2 mg /ml κολλαγόνου ειδικά τότε, εναπόθεση ECM μπορεί να είναι σημαντική για την κυτταρική προσκόλληση και την κίνηση, εξηγώντας την αυξημένη περιεκτικότητα κολλαγόνου παρατηρήθηκε παρουσία των κυττάρων.

Αντίθετα, όταν τα καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζουν πυκνά δίκτυα του ECM όπως η βασική μεμβράνη, η αυξημένη πρωτεόλυση μήτρας και ευθυγράμμιση των ινών γίνεται κρίσιμη για την κίνηση των κυττάρων. βιοψίες καρκίνος του προστάτη εμφανίζουν υψηλότερα επίπεδα ΜΜΡ από τους φυσιολογικούς ιστούς [29]. Είναι πιθανό ότι DU-145 κύτταρα δεν αναδιαμορφώσει τα σχετικά πυκνά 3 και 4 mg /ml μήτρες κολλαγόνου στο μεγαλύτερο βαθμό με τα κύτταρα LNCaP αφού DU-145 κύτταρα είναι πιο επεμβατική [22] – [24] και εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα των MMPs, συμπεριλαμβανομένων ΜΤ1-ΜΜΡ [23], και είναι, κατά συνέπεια, πιο ικανή να κινείται μέσα όπως πυκνά περιβάλλοντα. LNCaP κύτταρα πρέπει να οργανώσει τη μήτρα από την επιλεκτική αποσύνθεση ή την ευθυγράμμιση ινών με τη χρήση μηχανημάτων ακτινομυοσίνης τους να επιτύχουν μεγαλύτερα μεγέθη πόρων. Από το κολλαγόνο μπορεί να διευκολύνει εκτός του ότι είναι ένα εμπόδιο για τη μετανάστευση εισβολής και του πολλαπλασιασμού [30], DU-145, ως το πιο επεμβατικές κυτταρική σειρά, είναι καλύτερα προσαρμοσμένη σε μια πιο βαριά ινώδη gel.

Όταν MMPs ήταν ανέστειλε στις δύο κυτταρικές σειρές, διαπιστώνουμε ότι η προτίμηση των κυττάρων για πυκνότερα μήτρες ήταν ταυτόχρονα μειώνεται, καθώς τα κλάσματα ινιδίου σε 4 mg /ml πηκτώματα σπάρθηκε με Marimastat-επεξεργασμένα κύτταρα ήταν πολύ χαμηλότερα από ό, τι σε γέλες σπάρθηκε με μη επεξεργασμένα κύτταρα. Η πτώση ήταν ιδιαίτερα δραματική για τζελ εμβολιάστηκε με DU-145 κύτταρα, το πιο επεμβατικές κυτταρική σειρά. Αυτό υποδεικνύει ότι η ενεργός MMPs είναι ένας σημαντικός παράγοντας στον καθορισμό πώς τα κύτταρα να αναδιαμορφώσει τη μήτρα, και ότι η αυξημένη δραστηριότητα ΜΜΡ δεν μπορεί να οδηγήσει απλώς σε μειωμένη περιεκτικότητα ECM όπως θα περίμενε κανείς. Αντίθετα, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ΜΜΡ μπορεί πραγματικά να οδηγήσει σε πιο ινώδη μικροπεριβάλλοντα. Αυτό υποδηλώνει ότι οι MMPs μπορεί να επηρεάσει μήτρα αναδιαμόρφωση μέσω εναλλακτικών οδών, εκτός από απλά υποβάθμιση της μήτρας. Πράγματι, έχουν MMPs εμπλέκονται σε γέλη συστολή [31], με αναστολή ΜΜΡ με αποτέλεσμα τη μείωση της συστολής πηκτής κολλαγόνου [32]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι η ΜΜΡ αποτελέσματα αναστολή σε μειωμένη σύνθεση κολλαγόνου [33], [34], η οποία μπορεί επίσης να εξηγήσει την συνολική μείωση των κλασμάτων των ινιδίων παρατηρήθηκε στα πειράματά μας θεραπεία Marimastat.

Η προτίμηση του μη επεξεργασμένου DU-145 κύτταρα για περισσότερο κολλαγόνο-πλούσιο περιβάλλοντα είναι επίσης σύμφωνη με την παρατήρηση ότι οι ιστοί σκληραίνουν κατά τη διάρκεια του καρκίνου εξέλιξης [35], [36]. Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε ότι το περιεχόμενο κολλαγόνου συσχετίζεται καλά με μέτρο διάτμησης. Ως εκ τούτου, σημειώστε ότι DU-145-τροποποιημένο περιβάλλοντα, η οποία έδειξε υψηλότερη μέση κλάσματα ινίδια, είναι πιο σκληρή κατά μέσο όρο από τα LNCaP-τροποποιημένων μητρών. Ωστόσο, παραμένει ασαφές εάν η αυξημένη ακαμψία είναι μια αιτία της ανάπτυξης του καρκίνου ή είναι αντί ένα αποτέλεσμα της εξέλιξης του καρκίνου. Τα στοιχεία μας εδώ δείχνει προς την κατεύθυνση του τελευταίου. Η εργασία αυτή υποστηρίζει την επικρατούσα θεωρία της διακοπής της τάσεως ομοιόσταση ως ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του κακοήθους φαινοτύπου [35], [37]. Θα πρέπει να τονιστεί, ωστόσο, ότι στη μελέτη μας, συγκρίναμε τις επιδράσεις της αναδιαμόρφωσης μόνο δύο διαφορετικές κυτταρικές σειρές. Πολύ περισσότερο έργο σύγκριση των αναδιαμόρφωση επιπτώσεις της ένα ευρύ φάσμα των καρκινικών κυτταρικών σειρών είναι απαραίτητο να είναι σε θέση να κάνουν τη γενική δήλωση ότι πιο πολύ διηθητικού καρκίνου προτιμούν υψηλότερες μικροπεριβάλλοντα πυκνότητας. Θα ήταν επίσης ενδιαφέρον να δούμε αν και πόσο μη-καρκινικά κύτταρα (δηλαδή τα βλαστικά κύτταρα ή ινοβλάστες για εφαρμογές μηχανικής ιστών) επιδεικνύουν διαφορετική δραστηριότητα αναδιαμόρφωση.

Σε γενικές γραμμές, τα αποτελέσματα μας παρέχει μία νέα ποσοτική εικόνα της εξέλιξης αναδιαμόρφωση της μήτρας και δυναμική και να προσφέρει μια άμεση σύγκριση της αναδιαμόρφωσης μήτρα για δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη διακριτές. Ελπίζουμε ότι τα αποτελέσματά μας θα οδηγήσει σε νέες γραμμές έρευνας σχετικά με τη δυναμική της αναδιαμόρφωσης της μήτρας και μελλοντικά πειράματα θα συνεχίσει να συγκρίνει τα δύο πώς οι δομικές και μηχανικές ιδιότητες του τζελ κολλαγόνου κυττάρων σπάρθηκε εξελίσσονται με το χρόνο, χρησιμοποιώντας καρκινικών και μη καρκινικών κυτταρικών τύπων. Μια τέτοια έρευνα θα παράσχει περαιτέρω και χρειάζονται απεγνωσμένα πληροφορίες για την κατανόηση, τη διαχείριση και την καταπολέμηση της μετάστασης.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρική καλλιέργεια

Δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη, LNCaP και DU-145 (και τα δύο από την ATCC, Manassas, VA), μελετήθηκαν. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 και DU-145 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα Ρ12Κ. Και οι δύο τύποι μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ν /ν ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% ν /ν πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη (10.000 IU /mL πενικιλλίνη? 10.000 μg /mL στρεπτομυκίνη) (όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας από την ATCC). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 σε έναν επωαστήρα. Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μm CellTracker ™ Orange CMRA (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για κύτταρα σε εναιώρημα πριν από κολλαγόνο σπορά. Μόλις σπάρθηκαν σε κολλαγόνο, τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσα αντιβιοτικό χωρίς συμπληρωμένο με 10% FBS.

Παρασκευή πηγμάτων κολλαγόνου

Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε 3D κολλαγόνου τύπου Ι (BD Biosciences, San Jose, CA) σε μια τελική πυκνότητα 200.000 κύτταρα /mL. Για πηκτώματα με κύτταρα, το διάλυμα μήτρα κολλαγόνου αποτελούνταν από LNCaP ή κυττάρων DU-145 εναιωρείται στα κατάλληλα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ν /ν FBS, και ίσος όγκος κολλαγόνου και διαλύματος εξουδετέρωσης (100 mM ρυθμιστικού HEPES (Fisher Scientific, Pittsburgh , ΡΑ) σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS), ρΗ 7.3), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38]. Τζελ χωρίς κύτταρα παρασκευάστηκαν με τον ίδιο τρόπο εκτός του ότι ο όγκος κυτταρικού εναιωρήματος αντικαταστάθηκε με τα μέσα ενημέρωσης. Η τελική συγκέντρωση κολλαγόνου κυμαινόταν από 2, 3, και 4 mg /mL. Ο συνολικός όγκος κάθε διαλύματος γέλης ήταν 1 ml. Το διάλυμα μήτρας αφέθηκε να πήξει σε ένα γυάλινο πυθμένα πιάτο 35 mm (MatTek, Ashland, ΜΑ) στους 37 ° C και 5% CO

2 σε έναν επωαστήρα για 2 ώρες πριν 2 κ.εκ. 10% ν /ν FBS προστέθηκε συμπλήρωμα από τα μέσα ενημέρωσης. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε δύο έως τρεις ημέρες. Τα πηκτώματα παρασκευάζονται εις τριπλούν για κάθε κατάσταση.

Ρεομετρία

Οι μηχανικές ιδιότητες των πηκτωμάτων διαφόρων περιεκτικότητας σε κολλαγόνο (2, 3, 4 mg /ml) αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας rheometry. Εν συντομία, τα διαλύματα κολλαγόνου χωρίς κύτταρα (σύνθεση όπως περιγράφηκε προηγουμένως) έχουν μορφή γέλης απευθείας στο ροόμετρο (ΤΑ Instruments AR2000 Rheometer) στους 37 ° C για 30 λεπτά. Αμέσως μετά ζελατινοποίηση, οι μετρήσεις ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα σχήμα κώνου γεωμετρία, ταλάντωση 0,1-10 Hz σε ροπή 0,1 μn * m. μετρήθηκαν τρία δείγματα για κάθε κατάσταση. Ένα κατάλληλο νόμος εφαρμόσθηκε ισχύς στα δεδομένα για να ληφθεί μια τιμή για το χύδην αποθήκευση και μέτρο ελαστικότητας στους 10 Hz.

συνεστιακή μικροσκοπία

Για να εκτιμηθεί η μικροδομή των γελών, CRM διεξήχθη χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης (Ολύμπου FV1000) με ένα φακό εμβάπτιση σε νερό 60 × 1.2 NA. Το κολλαγόνο τοποθετήθηκαν σε γυάλινο πυθμένα πιάτα ήταν ενθουσιασμένοι με χαμηλή ένταση 488 nm λέιζερ και φωτός μεταξύ 485-495 nm φως συλλέχθηκαν. Εικόνες αποκτήθηκαν τουλάχιστον 100 μm εντός του πήγματος να αποφεύγονται οι ανεπιθύμητες άκρη. Για τα πήγματα ελέγχου που δεν εμβολιάστηκαν με κύτταρα, τρία 30 μm στοίβες με 0.5 μm πάχους τομές λήφθηκαν από τυχαία επιλεγμένες περιοχές στη γέλη 1, 3, 5, και 7 ημέρες μετά την επιμετάλλωση. Σε κάθε χρονικό σημείο, για κάθε τζελ που σπάρθηκε με κύτταρα, τρεις στοίβες ελήφθησαν σε περιοχές που περιέχουν κύτταρα και τρεις στοίβες ελήφθησαν σε περιοχές που δεν περιέχουν κύτταρα (δηλαδή δεν είχε τα κύτταρα εντός 10 μm πάνω, κάτω, ή πλαγίως). Περιοχές με και χωρίς κύτταρα εντοπίστηκαν εκτελώντας μικροσκόπιο φθορισμού συνεστιακή (CFM) ταυτόχρονα με CRM. Για CFM, ένα λέιζερ 543 nm χρησιμοποιήθηκε με τις ρυθμίσεις για τα φάσματα διέγερσης /εκπομπής του Alexa Fluor 546. Στο κυψελοειδές περιοχές, μια εικόνα CFM των κυττάρων ελήφθη παράλληλα με την CRM εικόνα της δομής του κολλαγόνου. Οι ίδιες ρυθμίσεις μικροσκοπίου χρησιμοποιήθηκαν για κάθε απόκτηση για να εξασφαλιστεί ότι τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα.

Ανάλυση εικόνας

δεδομένων

Πρώτες CRM αναλύθηκε για την απόκτηση του κολλαγόνου διαρθρωτικές παραμέτρους. Οι ίδιες ρυθμίσεις επεξεργασίας χρησιμοποιήθηκαν από εικόνα σε εικόνα για να διασφαλιστεί η συνοχή. κλάσμα ινιδίων και μέγεθος πόρων ελήφθησαν με ImageJ (ΝΙΗ, Bethesda, MD). Εν συντομία, 2D εικόνες από κάθε στοίβα ήταν δυαδικοποιημένων, με τις ίνες κολλαγόνου που υποδεικνύεται από μαύρα εικονοστοιχεία. Τα δυαδική εικόνες στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό του κλάσματος που καταλαμβάνεται από το κολλαγόνο, παρόμοιο με αυτό που έχει αναφερθεί στο παρελθόν [39]. μέγεθος πόρων μετρήθηκε με την εκπόνηση τρεις γραμμές (οριζόντια, κάθετη και διαγώνια, αποφεύγοντας τα κύτταρα όταν ήταν παρόντες) σε όλη την δυαδική εικόνα στο κέντρο της κάθε στοίβας, και χρησιμοποιώντας τη λειτουργία προφίλ οικόπεδο στο ImageJ. Ένα σενάριο γράφτηκε σε Matlab (MathWorks, Natick, ΜΑ) για να υπολογίζουν την απόσταση μεταξύ των ινών κολλαγόνου από αυτά τα δεδομένα προφίλ. Αυτό πάλι είναι παρόμοιο με αυτό που έχει πραγματοποιηθεί πριν από την [40].

διάμετρο και μήκος προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας Imaris (Bitplane, Αγίου Παύλου, MN). Μια πρόχειρη μάσκα επιφάνεια αρχικά από τον πρωτογενή δεδομένα του CRM, από την οποία δημιουργήθηκε μια λεία επιφάνεια. Τα αντικείμενα που δημιουργήθηκαν με αποτέλεσμα την ομαλή επιφάνεια εκπροσωπείται κάθε ένα ινίδια κολλαγόνου και στατιστικά στοιχεία σχετικά με την ακτίνα και το μισό μήκος κάθε ινίδια ήταν έξοδο.

Ποσοτική ζελατίνη zymography

Η ζελατίνη zymography χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνουν τη δραστηριότητα ΜΜΡ μεταξύ των κυττάρων γραμμών. Τόσο LNCaP και DU-145 κύτταρα επιστρώθηκαν και αναπτύχθηκαν σχεδόν σε συρροή πριν από την επώαση με μέσα απαλλαγμένα ορού επί 24 ώρες. Media εκχυλίζεται από καλλιέργειες, και συμπυκνώθηκαν μέσω υπερφυγοκέντρηση επί 30 λεπτά (10 kDa αποκοπής). Τα δείγματα στη συνέχεια αναμίχθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli φόρτωσης χωρίς αναγωγικό μέσο και υποβάλλεται σε ζελατίνη ζυμογραφία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [41]. Εν συντομία, τα δείγματα φορτώθηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου συμπολυμερισμένο με 0,1% ζελατίνη και υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση. Τα πήγματα στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ένα υδατικό διάλυμα που περιέχει 2.5% Triton-X100 να μετουσιωθεί των πρωτεϊνών, που ακολουθείται από εξισορρόπηση σε μια αναπτυσσόμενη ρυθμιστικό διάλυμα (50 mM Tris, ρΗ 7.8, 200 mM NaCl, 5 mM ΟαΟ

2, 0,02% Brij- 35) και μετέπειτα επώαση στους 37 ° C για 20 ώρες. Οι πηκτές χρωματίστηκαν τελικά και αποχρωματίζονται με Coomassie blue. Μετά την αφαίρεση της χρώσης, οι γέλες ξηράνθηκαν όλη τη νύχτα χρησιμοποιώντας κιτ ξήρανση γέλη (Promega, Madison, WI). Οι περιοχές των πρωτεολυτική δραστηριότητα εκφράζεται ως σαφείς ζώνες έναντι χρωματισμένο φόντο. εικόνες gel υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ImageJ και κατώφλι για την απόκτηση κατάλληλων τιμών pixel τόσο για ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 ακολούθησε με κανονικοποίηση από την αρχική συγκεντρώσεις κυττάρων. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν.

μελέτες αναστολής ΜΜΡ

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πηκτές ποικίλης περιεκτικότητας σε κολλαγόνο (2, 3, και 4 mg /ml) σε 12 φρεατίων γυάλινο πυθμένα ( MatTek). Ο συνολικός όγκος του καθενός από αυτά τα μικρότερα γελών ήταν 0,5 ml. Κάθε γέλη υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μΜ Marimastat (Tocris, Ellisville, ΜΟ) σε 1 mL 10% FBS-συμπληρωμένο μέσο 2 ώρες μετά την αρχική ζελατινοποίησης και τοποθετούνται στον επωαστήρα. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με 100 μΜ Marimastat σε 10% FBS-συμπληρωμένο μέσο κάθε 24 ώρες. Τα πηκτώματα παρασκευάζονται εις τριπλούν. CFM και CRM πραγματοποιήθηκε 1 και 3 ημέρες μετά την σπορά. επεξεργασία εικόνας έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.

Η στατιστική ανάλυση

Δεδομένου ότι κανένα από τα διαρθρωτικά στοιχεία CRM ακολούθησε κανονικές κατανομές, όπως εκτιμάται από οικόπεδα QQ, 95% διαστήματα εμπιστοσύνης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας bootstrapping από τουλάχιστον 5.000 προσομοιώσεις. Η προκατάληψη-διορθώνονται, επιταχύνθηκε ο αλγόριθμος χρησιμοποιήθηκε. Η ανάλυση διεξήχθη με Matlab. Οι μπάρες σφάλματος για όλες τις γραφικές παραστάσεις είναι διαστήματα εμπιστοσύνης 95%, εκτός εάν σημειώνεται διαφορετικά.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

διαρθρωτικών παραμέτρων για τζελ χωρίς κύτταρα. (

Α

) κλάσμα Ινιδίου και (

Β

) το μέγεθος των πόρων διαχρονικά και για τις τρεις συγκεντρώσεις πηκτής. (

C

) διάμετροι των ινών και (

D

) μήκη ινών για 2 mg /ml κολλαγόνου πάροδο του χρόνου. (

E

) διαμέτρους Ινών και (

F

) μήκη ινών την ημέρα 7 για όλες τις συγκεντρώσεις τζελ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0024891.s001

(ΔΕΘ )

Εικόνα S2.

διαρθρωτικά παραμέτρους για τις κυτταρικές περιοχές του DU-145 κύτταρα και τα κύτταρα LNCaP σε σύγκριση με την κατάσταση χωρίς κυψελίδα πάροδο του χρόνου. κλάσμα ινιδίων για το (

A

) 2 mg /ml? (

C

) 3 mg /ml? και (

E

) 4 mg /ml. Το μέγεθος πόρου για το (

B

) 2 mg /ml? (

D

) 3 mg /ml? και (

F

) 4 mg /ml

doi:. 10.1371 /journal.pone.0024891.s002

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να αναγνωρίσω τη βοήθεια του Phil Allen, PhD, για την τεχνογνωσία μικροσκοπία, και Kaethe Beck, με την ανάπτυξη της ρουτίνας επεξεργασίας εικόνας Imaris. Είμαστε επίσης ευγνώμονες για τα μέλη του εργαστηρίου μας για την οξυδερκή σχόλια και προτάσεις σε όλη αυτή τη μελέτη.