Αφηρημένο

Η πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών παραμένει φτωχή, κυρίως λόγω της επιθετικής εξέλιξης του καρκίνου. Από επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) είναι ένας σημαντικός μηχανισμός που μεσολαβούν εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων, με στόχο την διαδικασία EMT με πιο αποτελεσματικό και λιγότερο τοξικές ενώσεις για την αναστολή της μετάστασης έχει μεγάλη θεραπευτική αξία για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Έχουμε βρει για πρώτη φορά ότι ο ginsenoside 20 (S) -Rg3, ένα φαρμακολογικά δραστικό συστατικό της παραδοσιακής κινεζικής βότανο

Panax ginseng

, ισχυρά μπλοκ υποξία προκαλούμενη ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

in vitro

και

in vivo

. Μηχανιστικές μελέτες επιβεβαιώνουν τον τρόπο δράσης του 20 (S) -Rg3, η οποία μειώνει την έκφραση της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα 1α (HIF-1α) με την ενεργοποίηση του μονοπατιού ουβικουϊτίνης-πρωτεασώματος για την προώθηση της αποδόμησης HIF-1α. Μία μείωση σε HIF-1α με τη σειρά του οδηγεί σε πάνω ρύθμιση, μέσω μεταγραφικής καταστολής του σαλιγκαριού, του επιθηλιακού κυττάρου-ειδικό δείκτη Ε-καδερίνης και κάτω ρύθμιση του κυττάρου-ειδικό βιμεντίνη δείκτη μεσεγχυματικά υπό συνθήκες υποξίας. Είναι σημαντικό, 20 (S) -Rg3 αναστέλλει αποτελεσματικά EMT σε γυμνά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού καρκίνου των ωοθηκών, υπόσχεται ένα νέο θεραπευτικό μέσο για αντικαρκινική θεραπεία

Παράθεση:. Liu Τ, Zhao L, Zhang Υ, Chen W, Λιου D, Χου H, et al. (2014) Ginsenoside 20 (S) -Rg3 Στόχοι HIF-1α προς Block προκαλείται από υποξία μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος σε κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 9 (9): e103887. doi: 10.1371 /journal.pone.0103887

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, Πανεπιστήμιο του Πετς Ιατρική Σχολή, την Ουγγαρία

Ελήφθη: 31 Οκτώβρη του 2013? Αποδεκτές: 4 του Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 8 του Σεπτέμβρη του 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30973429). Ο χρηματοδότης δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών, τα υπάρχοντα κυρίως με τη μορφή του επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών (EOC), είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια [1], [2]. Το χαμηλό ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών συνδέεται με φαύλο φύση της εισβολής και της μετάστασης. Μεταξύ των κρίσιμων συνεισφέροντες στο επεμβατική και μεταστατικό ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών είναι η υποξία του μικροπεριβάλλον του όγκου [3], [4], η οποία μεσολαβεί κυττάρου όγκου εισβολή και μετάσταση μέσω σταθεροποίηση της υποξίας-διεγέρσιμο παράγοντα-1 άλφα (HIF-1α) [5], [6].

νορμοξικά κύτταρα, HIF-1α υδροξυλιώνεται από μια οικογένεια υδροξυλασών προλίνης (PHD1-3) στους Pro402 και Pro564, οδηγώντας σε μια διαμορφωτική αλλαγή που προωθεί δεσμευτικός HIF-1α με την πρωτεΐνη νοη Hippel Lindau (VHL) – ένα συστατικό του μεγάλου συμπλόκου λιγάση Ε3 ουμπικουιτίνης που μεσολαβεί αποικοδόμηση του πρωτεασώματος του HIF-1α [7], [8]. Υπό υποξικές συνθήκες, τα χαμηλά επίπεδα οξυγόνου αποκλείουν προλίνη υδροξυλίωση, η οποία οδηγεί σε σταθεροποίηση HIF-1α και στην συνέχεια σχηματισμό ενός ετεροδιμερούς με εκφράζουν συντακτικά HIF-1β. Ο βιοδραστικός HIF-1 διμερές ρυθμίζει, ως ένας παράγοντας μεταγραφής, την έκφραση ενός ευρέος φάσματος των γονιδίων που εμπλέκονται όχι μόνο σε κυτταρικό κύκλο, απόπτωση [9], η αγγειογένεση [10], [11] και το μεταβολισμό [12] σε απάντηση της περιβάλλον υποξίας, αλλά και σε μια κυτταρική διαδικασία που ονομάζεται επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης (EMT) [13] – [15]

εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην εμβρυϊκή ανάπτυξη, EMT έχει βρεθεί αργότερα να συμμετέχουν ενεργά στη διαδικασία. καρκίνος εισβολή και μετάσταση [16], [17]. Κατά τη διάρκεια της ΕΜΤ κύτταρα διεργασία υφίστανται μετάπτωση από μία πολωμένη επιθηλιακά φαινότυπο σε ένα φαινότυπο μεσεγχυματικά [18], ένα βιολογικό σύμβαμα που χαρακτηρίζεται από αλλαγή κυτταρικής μορφολογίας από ένα σχήμα πλακόστρωτο σε διεσπαρμένη ινοβλαστοειδή σχήμα, απώλεια επιθηλιακών δεικτών κυτταρικής πρωτεΐνης-ειδικά και απόκτηση των μεσεγχυματικών κυττάρων-συγκεκριμένες ιδιότητες, και ενισχυμένη κυτταρική κινητικότητα και εισβολή. Ενώ μια ποικιλία παραγόντων που περιλαμβάνουν αυξητικούς παράγοντες και ένα υποξικό μικροπεριβάλλον καταδεικνύονται ως επαγωγείς του EMT, πολλοί παράγοντες μεταγραφής όπως Σαλιγκάρι επιβεβαιώθηκε ως σημαντικοί μεσολαβητές της ΕΜΤ [19]. EMT καταστέλλει επιθηλιακών κυττάρων-ειδικού Ε-καδερίνης, μέσω της δράσης των διαφόρων μεσολαβητών, που οδηγεί στην απώλεια της κορυφής-βασικής διασταύρωση προσκόλληση πολικότητα και κυττάρου-κυττάρου, και up-ρυθμίζει μεσεγχυματικών κυττάρων-ειδική βιμεντίνη [20] με αποτέλεσμα την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και κυτταρικής κινητικότητας απορρόφηση. Οι εκδηλώσεις αυτές αποτελούν τα βασικά χαρακτηριστικά της EMT σε μοριακό επίπεδο. Αξίζει να σημειωθεί, ΕΜΤ εμπλέκεται επίσης στην αντοχή φαρμάκου αντικαρκινικές και παρεμποδίζει την αποτελεσματική θεραπευτική παρέμβαση των καρκίνων σε προχωρημένο στάδιο [21]. Προφανώς, με στόχο τη διαδικασία EMT θα παράσχει μια νέα ιδέα για τη θεραπεία του καρκίνου, ειδικά για τον καρκίνο των ωοθηκών έναν όγκο που εμφανίζει μια ισχυρή δυνατότητα να κάνουν μετάσταση.

Ginsenosides είναι τα φαρμακολογικά ενεργά συστατικά του

Panax ginseng

[22] που έχει από καιρό χρησιμοποιηθεί ως μια παραδοσιακή κινεζική ιατρική για γαληνικά ή αναρρωτικές σκοπούς [23], [24]. Μέχρι σήμερα, περισσότεροι από 40 ενώσεις ginsenoside έχουν εντοπιστεί [25]. Μερικά από αυτά, Rg1, RG3, Rh1 και Rh2, για παράδειγμα, δείχνουν την ισχυρή αντικαρκινική δραστηριότητα [24], [26] – [28]. Ginsenoside RG3, ένα βιοδραστικό εκχυλίσματα

Panax ginseng

, έχει διάφορες ιατρικές επιδράσεις, όπως αντι-όγκου [29] – [32], αντι-οξειδωτικό, ιδιότητες αντι-φλεγμονής [33], [34], αναστέλλοντας ουλή υπερπλασία του δέρματος [35] και την αγγειογένεση [36]. Επιπλέον, τα στερεοϊσομερή 20 (R) -Rg3 και 20 (S) είναι -Rg3 δύο οπτικώς ενεργά χειρομορφικά μόρια που διαφέρουν ως προς τον προσανατολισμό της ομάδας υδροξυλίου (ΟΗ) επί άνθρακα-20 [24]. Παρά το γεγονός ότι και οι δύο έχουν αναφερθεί ότι αναστέλλουν μετάσταση όγκου [30], stereospecifity του RG3 φαίνεται να συνδέεται με βιοδραστικότητες τους. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε ανακαλύψει για πρώτη φορά ότι 20 (S) -Rg3 αναστέλλει αποτελεσματικά υποξία προκαλούμενη ΕΜΤ ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, όχι μόνο

in vitro

αλλά και σε γυμνά μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού, υπόσχεται μια νέα φυσικό μέσο για τη θεραπεία του καρκίνου του αντι-ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Ναρκωτικών και αντισώματα

20 (S) -Rg3 και 20 (R) -Rg3 ελήφθησαν από Tasly Φαρμακευτική Εταιρεία (Tianjin, Κίνα), και η καθαρότητα ήταν ≥99% όπως προσδιορίζεται με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC). στερεοϊσομερή RG3 διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) σε ένα διάλυμα 4 mg /ml απόθεμα και αποθηκεύτηκαν στους -20 ° C. Κλάσματα του διαλύματος αποθέματος προστέθηκαν απευθείας στο μέσο καλλιέργειας

Χρησιμοποιήθηκαν τα ακόλουθα αντισώματα:. Αντίσωμα κουνελιού για βιμεντίνη, VHL, αντίσωμα ποντικού σε β-ακτίνη (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA), κουνέλι αντίσωμα για Ε-καδερίνη (Bioworld Technology, Louis Park, ΜΝ, USA), αντίσωμα ποντικού σε HIF-1α (Abcam Inc., Cambridge, ΜΑ, USA), αντίσωμα προβάτου προς PHD1 (R &? D Systems Inc., Minneapolis, ΜΝ , USA), αντίσωμα κουνελιού με σαλιγκάρι (Abnove, Ταϊπέι, την Κίνα). Υπεροξειδάση της ραπανίδας (HRP) ανοσοσφαιρίνης συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-ποντικού (IgG), κατσίκα αντι-ποντικού IgG και IgG αντι-προβάτου κουνελιού (Pierce, Rockford, IL, USA), HRP-Polymer αντι-Ποντικού /Rabbit IHC Kit (Fuzhou Maixin Βιολογίας & ΣΙΑ ΕΠΕ, Fouzhou, Fujian, Κίνα)

Οι κυτταρικές σειρές και τον πολιτισμό

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 ελήφθη από την Σαγκάη κυττάρων Τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα), 3AO αγοράστηκε από την Shandong Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Jinan, Κίνα) .Cells διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (GIBCO, Grand Island, NY, USA) κάτω από ορθοξικές συνθήκες (21% O

2, 5% CO

2, 37 ° C, 100% υγρασία) για 24 ώρες πριν από την περαιτέρω επεξεργασία. Για την επαγωγή υποξία, τα κύτταρα επωάστηκαν σε 1% O

2, 5% CO

2, 94% Ν

2, 37 ° C, 100% υγρασία σε θάλαμο HF100 υποξία (Heal Force, το Χονγκ Κονγκ , Κίνα) για άλλες 24 ώρες με ή χωρίς έκθεση σε 80 μg /ml του 20 (S) -Rg3 (για SKOV3) ή 160 μg /ml του 20 (S) -Rg3 (για 3AO), ή 80,160 ή 320 μg /ml του 20 (R) -Rg3 (για κύτταρα SKOV3 και 3AO).

Κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια πυκνότητα 5000 κυττάρων ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων σε 200 μλ του RPMI 1640 που περιέχει 10% ορό νεογέννητου μόσχου (NBS). Μετά την επώαση 24h, αυξανόμενες συγκεντρώσεις του 20 (S) -Rg3 και 20 (R) -Rg3 προστέθηκαν. 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- διφαινυλτετραζόλιο βρωμίδιο (ΜΤΤ) δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν μετά από 24 ώρες και 48 ώρες θεραπείας, αντίστοιχα. 20 μΐ 5 mg /ml ΜΤΤ προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C που ακολουθείται από την προσθήκη 150 μΙ DMSO. Οι τιμές απορρόφησης μήκος κύματος 570 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός πολύτροπη EnSpire (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, USA). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τρεις φορές.

αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης σε πραγματικό χρόνο (PCR)

Ολικό RNA εξήχθη από καλλιεργημένα κύτταρα χρησιμοποιώντας RNAfast 200 (Fastagen Biotech Co. Ltd. , Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η συγκέντρωση του RNA και η καθαρότητα προσδιορίστηκαν σε ένα φασματοφωτόμετρο υν (BioRad Inc., Hercules, CA, USA) με την αναλογία απορρόφησης 260 nm απορρόφηση και 260/280 nm, αντίστοιχα. σύνθεση cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας RevertAid σύνθεση πρώτου κλώνου cDNA Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, ΜΑ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 25 ° C για 5 λεπτά, που ακολουθείται από 42 ° C για 60 λεπτά και 70 ° C για 5 λεπτά. Τα cDNA φυλάχθηκαν στους -80 ° C για μεταγενέστερη χρήση. Ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR διεξήχθη σε ένα σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο CFX-96 (Bio Rad, Hercules, CA, USA) χρησιμοποιώντας SYBR Green Master Mix (Takara Βιοτεχνολογία Co Ltd., Dalian, Κίνα). Για κανονικοποίηση, χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο β-ακτίνης. Οι συνθήκες κύκλων είχαν ως εξής: αρχική μετουσίωση στους 95 ° C για 30 s, που ακολουθείται από 40 κύκλους των 95 ° C για 5 s και 60 ° C για 31 s. Κάθε μέτρηση διεξήχθη εις τριπλούν, και μάρτυρες χωρίς πρόπλασμα συμπεριλήφθηκαν για κάθε δοκιμασία. Μετά την PCR, ανάλυση καμπύλη διαστάσεως έγινε. έκφρασης σε σχέση γονιδίου υπολογίζονται αυτόματα χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Όλα τα εναύσματα ολιγονουκλεοτιδίων σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Σαγκάη Shenggong βιοτεχνολογικές Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Οι ακόλουθες αλληλουχίες εκκινητών χρησιμοποιήθηκαν: HIF-1α-εμπρός, 5′-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3 ‘? HIF-1α-αντίστροφη, 5’-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3 ‘? PHD1-εμπρός, 5’-AGGCTGTCGAAGCATTGGTG-3 ‘? PHD1- αντίστροφη, 5’-GGGATTGTCAACGTGCCTTAC-3 ‘? PHD2-εμπρός, 5’-AAGCCCAGTTTGCTGACATT-3 ‘? PHD2-αντίστροφη, 5’-TTACCGACCGAATCTGAAGG-3 ‘? PHD3-εμπρός, 5’-AGCCCATTTTTGCCAGACTCC-3 ‘? PHD3-αντίστροφη, 5’-GATTTCAGAGCACGGTCAGTC-3 ‘? VHL-εμπρός, 5’-GCAGGCGTCGAAGAGTACG-3 ‘? VHL- αντίστροφη, 5’-CGGACTGCGATTGCAGAAGA-3 ‘? Σαλιγκάρι-προς τα εμπρός, 5’-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3 ‘? Snail- αντίστροφη, 5’-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3 ‘? β-ακτίνη προς τα εμπρός, 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3 ‘? β-actin- αντίστροφη, 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 ‘.

Western Blot

συνολικής κυτταρικής πρωτεΐνης εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν με λύση κυττάρων σε ρυθμιστικό RIPA επί πάγου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με απόξεση και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες μικροφυγοκέντρου. Τα δείγματα για λίγο σε επεξεργασία με υπερήχους και φυγοκεντρήθηκαν στις 12.000 rpm για 30 λεπτά για να απομακρυνθούν τα αδιάλυτα υπολείμματα. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Δοκιμασίας Πρωτεΐνης Bradford γρήγορης εκκίνησης (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Οι πρωτεΐνες έβρασαν πριν διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε ηλεκτροφόρηση νάτριο δωδεκυλο θειικού -πολυακρυλαμιδίου γέλης (SDS-PAGE) πηκτώματα και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (Pall Life Science, ΝΥ, USA) χρησιμοποιώντας ένα υγρό συσκευή διαμεμβράνης (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ , ΗΠΑ). Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα, ανιχνεύθηκαν όλη τη νύχτα με πρωτεύον αντίσωμα (Ε-καδερίνης 1:500, βιμεντίνη 1:2000, β-ακτίνη 1:1000, HIF-1α 1:500, PHD1 1:2000, VHL 1:1000) σε TBST και ακολούθησε επώαση με κατάλληλες υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο (κατσίκας αντι-ποντικού /κουνελιού IgG 1:2000, IgG κουνελιού αντι-προβάτου 1:1000) όπως υποδεικνύεται. αντιδραστήριο ECL (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη των κηλίδων. Όλες οι τιμές ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη.

πληγών επούλωσης δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων 24 ώρες πριν από τη θεραπεία. Οι μονοστιβάδες γδαρμένο με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl και πλένονται με μέσο χωρίς ορό για να αφαιρέσετε τα αποκολλημένα κύτταρα. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε μέσο χωρίς ορό κάτω από νορμοξία, υποξία ή υποξία με την παρουσία του 20 (S) -Rg3 για 24 ώρες, αντίστοιχα. Οι τραυματίες περιοχές στη συνέχεια απεικονίστηκαν μετά από επώαση για μια προκαθορισμένης περιόδου.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Κύτταρα (1 χ 10

5 /φρεάτιο) σε 100 μΙ μέσου χωρίς ορό προστέθηκαν σε millicells με μέγεθος 8 μm πόρου (Millipore Co., Bedford, ΜΑ, USA), εισάγεται εντός φρεάτια που περιέχουν RPMI 1640 με 20% ορό εμβρύου μόσχου ως χημειοτακτικός παράγοντας. Μετά από 24 ώρες επώαση, τα κύτταρα που παραμένουν στην άνω επιφάνεια του φίλτρου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα, και τα μεταναστευτικά κύτταρα στερεώθηκαν με 5% γλουταρική διαλδεΰδη που ακολουθείται από χρώση Giemsa για ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων. Οι αριθμοί των κυττάρων που μεταναστεύουν σε τρία πεδία υψηλής ισχύος των κάτω επιφανειών των μεμβρανών μετρήθηκαν. Τουλάχιστον τρία πηγάδια μετρήθηκαν ανά πείραμα.

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) νοκ ντάουν

Νοκ ντάουν της PHD1 και VHL πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση ειδικών siRNA που αγοράζονται από GenePharma Company (Σαγκάη, Κίνα). Ακολουθίες siRNAs είναι ως ακολούθως: siPHD1-A, 5′-GCAUCACCUGUAUCUAUUATT-3 ‘? siPHD1-Β, 5’-CCAACAUCGAGCCACUCUUTT-3 ‘? siPHD1-C, 5’-GCUAGCAUCAGGACAGAAATT-3 ‘? siVHL-Α, 5’-CCACCCAAAUGUGCAGAAATT-3 ‘? siVHL-Β, 5’-GUCUCAUUCUCAGAGUAAATT-3 ‘? siVHL-C, 5’-AACUGAAUUAUUUGUGCCAUCTT-3 ‘. Ένα κωδικοποιημένο siRNA (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘) χρησιμοποιήθηκε σε παράλληλα πειράματα ως αρνητικός έλεγχος. siRNAs επιμολύνθηκαν σε κύτταρα SKOV3 και 3AO σε 40-50% συμβολή με siRNA αντιδραστηρίου επιμόλυνσης (Roche, Indianapolis, ΙΝ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Αποτελεσματική siRNAs σαρώθηκαν σύμφωνα με τα αποτελέσματα του πραγματικού χρόνου RT-PCR μετά από 48 ώρες επώασης και με κηλίδα western μετά από 72 ώρες, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, οι αποτελεσματικές siRNAs διαμολύνθηκαν σε κύτταρα και επωάστηκαν για 24 ώρες και ακολούθησε επαγωγή υποξία, με ή χωρίς 20 (δ) -Rg3 θεραπεία για άλλες 24 ώρες. Η επίδραση της PHD1 και VHL σιωπή στην καταστολή του HIF-1α με 20 (S) -Rg3 αξιολογήθηκε σε επίπεδο πρωτεΐνης.

λουσιφεράσης ανταποκριτής

δοκιμασία

Αφού σπάρθηκαν πάνω σε πλάκες 24 φρεατίων για 24 ώρες, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με Ε-καδερίνης λουσιφεράσης προαγωγού πλασμίδιο αναφοράς pGL2Basic-Ε-cadK1 (Addgene, Cambridge, MA, USA) και τον φορέα phRL-ΤΚ (Promega, Madison, WI, USA). 24 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 (S) -Rg3 σε υποξικά ρυθμίσεις για 24 ώρες με normoxically καλλιεργημένο επιμολυσμένο κύτταρο ως έλεγχος. Το κυτταρόλυμα συλλέχθηκε 24 ώρες αργότερα και η δραστικότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε με ένα φωτόμετρο (Promega, Madison, WI, USA) χρησιμοποιώντας το Dual-Luciferase Reporter System (Promega, Madison, WI, USA). δραστικότητα λουσιφεράσης E-cadherin ομαλοποιήθηκε με εκείνη της λουσιφεράσης της Renilla. Τα αποτελέσματα ελήφθησαν από τρία ανεξάρτητα πειράματα και κάθε δοκιμασία που περιέχουν τριπλούν πηγάδια.

Μελέτες σε ζώα

Η φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας του Πρώτου συνδεδεμένες νοσοκομείο, και ήταν προσκολλημένη με τις θεσμικές κατευθυντήριες γραμμές και ηθικά πρότυπα. Και οι έξι εβδομάδων BALB /c θηλυκά γυμνά ποντίκια στεγάστηκαν σε εγκαταστάσεις φράγματος SPF κάτω από ένα κύκλο φωτός /σκότους 12 ωρών φωτός. Ζωικά σωματικά βάρη και υποδόριου όγκου κάθετες διάμετροι καταγράφηκαν κάθε δύο ημέρες. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν σύμφωνα με τον τύπο V = 0,5236 × (L × W

2) (V: ο όγκος του όγκου, L: το μήκος, W: πλάτος).

Για το πείραμα του υποδόριου ξενομοσχεύματος, τα κύτταρα SKOV3 τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε PBS σε μια τελική συγκέντρωση 2 × 10

7 κύτταρα /ml. 2 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως στο πλευρό των ποντικών. 10 ημέρες αργότερα, γυμνά ποντίκια τυχαιοποιήθηκαν σε ομάδα θεραπείας (η = 4) και την ομάδα ελέγχου (n = 4). Ποντίκια στα δύο αυτά ομάδα υποβλήθηκαν σε αγωγή με ενδοφλέβιες ενέσεις είτε 5 mg /kg του 20 (S) -Rg3 ή ίσο όγκο PBS στην φλέβα ουράς κάθε δεύτερη ημέρα που ακολουθεί. Μετά από 30 ημέρες για τις πειραματικές θεραπείες, οι ποντικοί υποβλήθηκαν σε ευθανασία με CO

2 ασφυξία. δείγματα όγκου συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 24 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, εγκλεισμένα σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και για ανοσοϊστοχημική ανάλυση.

Για ενδοπεριτοναϊκή μοντέλο ξενομοσχεύματος, τα κύτταρα SKOV3 θρυψινοποιήθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε PBS σε μια συγκέντρωση 1 × 10

8 /ml. Ποντικοί εμβολιάστηκαν με 1 × 10

7 κύτταρα στην κοιλιακή κοιλότητα κατά την ημέρα 0. Από την ημέρα 1, 5 mg /kg του 20 (S) -Rg3 (ομάδα θεραπείας, η = 7) ή ίσο όγκο PBS (έλεγχος ομάδα, η = 7) εγχύθηκε μέσω φλέβα της ουράς κάθε δεύτερη μέρα. Οι ποντικοί παρατηρούνταν καθημερινά και θυσιάστηκαν μετά από 30 ημέρες. Οι νεκροψίες πραγματοποιήθηκαν, διαδίδονται οι όγκοι ανατμήθηκαν από ποντικούς, και ασκητικό υγρό συλλέχτηκε. Μετρήθηκαν Συνολικό βάρος όγκου και του όγκου της ασκιτικό υγρό σε κάθε ποντίκι. Όλα τα περιεχόμενα του πειράματος σε ζώα έχουμε αναφέρει εδώ είναι σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές φθάνουν.

Ανοσοϊστοχημεία

Ιστολογική διαφάνειες παρασκευάστηκαν από τα κομμάτια ιστού καρκίνου των ωοθηκών εγκλεισμένα σε παραφίνη. Δείγματα αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε μια σειρά φθίνουσα αλκοόλη που ακολουθείται από θερμαίνονται σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού (ρΗ 6,0) σε ατμιστή για 1.5 λεπτά για να ανακτήσετε αντιγονικές θέσεις πρόσδεσης. Ανίχνευση αντιγόνων διεξήχθη χρησιμοποιώντας την επώαση με τα πρωτογενή αντισώματα (Ε-καδερίνης 1:200, βιμεντίνη 1:400, HIF-1α 1:200), για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση με HRP-επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα ( MaxVision HRP-Polymer αντι-Ποντικού /Rabbit IHC Kit, 1:200) σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και η χρωματική ανάπτυξη με DAB. Τα αρνητικά δείγματα ελέγχου επωάζονται σε PBS χωρίς το πρωτογενές αντίσωμα κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Τα πλακίδια με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν σε μια σειρά αύξουσα αλκοόλη και τοποθετημένα για ανάλυση. Ψηφιακές εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα Olympus ΒΗ-2 μικροσκόπιο (Τόκιο, Ιαπωνία) που έχουν εγκατασταθεί με τη φωτογραφική μηχανή DeltaPix και το λογισμικό (Maalov, Δανία).

Η στατιστική ανάλυση

Οι στατιστικές διαφορές προσδιορίζονται από δύο ουρά

t-test

ή τεστ rank-sum Wilcoxon (μόνο για τον όγκο των ασκίτη). Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS (Chicago, IL, USA). Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές (*) σε

P

& lt? 0.05 και άκρως σημαντική (**) σε

P

& lt?. 0.01 για όλες τις συγκρίσεις

Αποτελέσματα

20 (S) -Rg3, αλλά όχι 20 (R) -Rg3, μπλοκ υποξία προκαλούμενη EMT σε SKOV3 και 3AO καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα

Εξετάσαμε πρώτα την επίδραση του 20 (S) -Rg3 και 20 (R) -Rg3 στην κυτταρική βιωσιμότητα των δύο ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών γραμμών ωοθηκών SKOV3 και 3AO σε μια σειρά από δοκιμασίες ΜΤΤ. Οι δομές των 20 (S) -Rg3 και 20 (R) -Rg3 δείχθηκαν στο Σχήμα S1-A. 20 (S) -Rg3 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, προκαλώντας IC

50 (ανασταλτική συγκέντρωση στην οποία το 50% βιωσιμότητα κυττάρου αναστέλλεται) τιμές των 146,8 και 242,6 μg /ml, αντίστοιχα, για SKOV3 και κύτταρα 3AO 24 h (ή 48 ώρες) μετά την αγωγή (Σχήμα S1-Β.). Αντίθετα, 20 (R) -Rg3 δεν έδειξε εμφανή παρεμπόδιση του πολλαπλασιασμού των δύο κυτταρικών τύπων σε συγκεντρώσεις μέχρι 640 μg /ml (Σχήμα S1 AC).

Εξετάσαμε επόμενο την ικανότητα των 20 (S) -Rg3 και 20 (R) -Rg3 να επηρεάζουν υποξία προκαλούμενη EMT. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Α, όταν εκτίθεται σε 1% O

2 για 24 ώρες και SKOV3 και τα κύτταρα 3AO υποβλήθηκαν EMT χαρακτηρίζεται από μια αλλαγή μορφολογία των κυττάρων από το σφιχτό-ενώνονται πλακόστρωτα-όπως εμφάνιση σε μια διαχωρισμένη άξονα-όπως το σχήμα. Η αλλαγή αυτή συνοδεύεται από μια σημαντική ρύθμιση προς τα κάτω της επιθηλιακής δείκτη Ε-καδερίνης και μια έντονη ανοδική ρύθμιση των μεσεγχυματικών βιμεντίνης δείκτη όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση κηλίδας Western (Εικ. 1Β). Η επεξεργασία των κυττάρων SKOV3 και 3AO με 20 (S) -Rg3 σε 80 μg /ml, 160 μg /ml, αντίστοιχα, εμπόδισε αποτελεσματικά την μορφολογική αλλαγή που σχετίζεται με υποξία προκαλούμενη EMT (Εικ. 1Α), συνεπής με αυξημένο επίπεδο της Ε -cadherin και ένα μειωμένο επίπεδο βιμεντίνης υπό συνθήκες υποξίας (Εικ. 1Β). Σε αντίθεση, η αγωγή των SKOV3 με 20 (R) -Rg3 σε 80 μg /ml και 160 μg /ml, αντίστοιχα, απέτυχε να διασώσει τα κύτταρα από το να υποστούν EMT (Εικ. 1Α), όπως αποδεικνύεται από αμετάβλητα επίπεδα Ε-καδερίνης και βιμεντίνη υπό υποξικές συνθήκες καλλιέργειας (Σχ. 1 C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι 20 (S) -Rg3 μπλοκαριστεί υποξία προκαλούμενη EMT, κινητικότητα κυττάρου αξιολογήθηκε στην επούλωση των πληγών και

in vitro δοκιμασίες

μετανάστευση. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α και Β, ενώ η υποξία σαφώς προωθείται κινητικότητα των κυττάρων και το κλείσιμο των πληγών, οι επιδράσεις αυτές ήταν σε μεγάλο βαθμό εξουδετερώνεται από την κατεργασία των κυττάρων SKOV3 και 3AO με 20 (S) -Rg3.

(Α) Τα κύτταρα πρώτα καλλιεργήθηκαν σε κοινή προϋπόθεση για 24 ώρες. Για την επαγωγή υποξία in vitro, SKOV3 και 3AO κύτταρα επωάστηκαν σε ένα θάλαμο υποξίας 1% O

2, 5% CO

2 και 94% Ν

2 για άλλες 24 ώρες χωρίς (υποξία) ή με RG3 (υποξία + RG3) στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση για 24 ώρες. Οι έλεγχοι καλλιεργήθηκαν υπό νορμοξικές συνθήκες (νορμοξία) για 24 ώρες. εικόνες των κυττάρων συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (100 ×). (Β) Οι πρωτεΐνες των κυττάρων που εκτίθενται σε νορμοξία, υποξία και υποξία συν 20 (S) -Rg3 συλλέχθηκαν και η έκφραση Ε-καδερίνης και βιμεντίνης εξετάστηκαν με κηλίδα western, χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. μείωση υποξία πρωτεΐνη Ε-καδερίνης και να αυξήσει πρωτεΐνη βιμεντίνη, η οποία αναστρέφεται από 20 (S) -Rg3 συν-θεραπεία. (Γ) Η επίδραση του 20 (R) -Rg3 στην έκφραση των δεικτών ΕΜΤ σε κύτταρα SKOV3. Δεν παρατηρήθηκαν επίδραση του 20 (R) -Rg3 στην έκφραση των δεικτών ΕΜΤ υποξία προκαλούμενη. Όλες οι θεραπείες σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Η

(Α) κινητικότητα κυττάρων ανιχνεύεται με δοκιμασία επούλωσης πληγών. Τα κύτταρα επωάστηκαν κάτω από νορμοξικές συνθήκες για 24 ώρες που ακολουθείται από το ξύσιμο του στρώματος σε συρροή κυττάρων και εκθέτοντας σε νορμοξία, υποξία ή υποξία συν 20 (S) -Rg3 για άλλες 24 ώρες, αντίστοιχα. Το κλείσιμο του μηδέν παρακολουθήθηκε κατά την διάρκεια 24 h και φωτογραφίες παρουσιάστηκαν σε 0 ώρες και 24 ώρες μετά το ξύσιμο. κινητικότητα (Β) κυττάρων εξετάζεται από το

in vitro

δοκιμασία μετανάστευσης. Normoxically καλλιεργημένα κύτταρα σπάρθηκαν σε millicells, ακολουθούμενη από επώαση για 24 ώρες κάτω από νορμοξία, υποξία ή υποξία συν 20 (S) -Rg3, αντίστοιχα. Ο αριθμός των κυττάρων που διήλθε μέσω της μεμβράνης ανά 20 × μεγεθύνεται φακό μετρήθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν για να αντιπροσωπεύουν τις ικανότητες μετανάστευση των κυττάρων. Όλες οι θεραπείες σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως το μέσο ± SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01,

t-test

Η

Στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας σε μεγάλο βαθμό. δείχνουν ότι 20 (S) -Rg3, αλλά όχι 20 (R) -Rg3, είναι ικανή να ανατρέψει υποξία προκαλούμενη αλλαγές EMT στην κυτταρική μορφολογία, δείκτες κυττάρων, και την κινητικότητα των κυττάρων, υπογραμμίζοντας το δυναμικό του λειτουργία ως ένας αναστολέας της υποξίας που επάγεται EMT και EMT μεσολάβηση μετάσταση του καρκίνου.

20 (S) -Rg3 μειώνει HIF-1α έκφραση μέσω της προώθησης του HIF-1α αποδόμηση πρωτεΐνης σε ένα PHD1 /VHL /πρωτεασώματος με τρόπο που εξαρτάται

Για να κατανοήσουμε καλύτερα το μοριακούς μηχανισμούς με τους οποίους 20 (S) -Rg3 μπλοκ υποξία προκαλούμενη EMT στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών, αναλύσαμε την έκφραση του HIF-1α, ένα κρίσιμο ρυθμιστή του ΕΜΤ, τόσο στο επίπεδο μεταγραφής και μεταφράσεως. Όταν καλλιεργούνται παρουσία 1% O

2 για 24 ώρες επίπεδο πρωτεΐνης HIF-1α ανυψώθηκε σε κύτταρα SKOV3 και 3AO, ενώ το επίπεδο του mRNA HIF-1α επηρεάστηκε ελάχιστα. Η επεξεργασία των κυττάρων με 20 (S) -Rg3 σε άλλα ταυτόσημο υποξική ρυθμίσεις αξιοσημείωτα κατέστειλε την έκφραση του HIF-1α σε επίπεδο πρωτεΐνης με το επίπεδο mRNA αμετάβλητη, δείχνοντας ότι HIF-1α ήταν μετα-μεταγραφικά ρυθμίζεται από 20 (S) -Rg3 ( Σχ. 3Α και Β).

(Α) ολικό RNA από κύτταρα που εκτίθενται σε φυσιολογική οξυγόνωση, υποξία ή υποξία συν 20 (S) -Rg3, αντίστοιχα, για εκχυλίστηκαν 24 ώρες. Σε πραγματικό χρόνο προσδιορισμούς RT-PCR διεξήχθησαν για να αναλύσει επίδραση του 20 (S) -Rg3 σε επίπεδο mRNA HIF-1α, και δεν ανιχνεύθηκαν αλλαγές. (Β) Κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες κάτω από νορμοξία, υποξία ή υποξία συν 20 (S) -Rg3, αντίστοιχα, παρακολουθήθηκαν με κηλίδα western για έκφραση των HIF-1α. 20 (S) -Rg3 παρενέβαινε με υποξία προκαλούμενη HIF-1α αύξησης. (Γ) MG132 μπλοκάρει την επίδραση αναστολής της 20 (S) -Rg3 σε επίπεδο πρωτεΐνης HIF-1α. HIF-1α πρωτεϊνικά επίπεδα συγκρίθηκαν μεταξύ υποξικών κυττάρων, υποξικά κύτταρα συν-επεξεργασία με 20 (S) -Rg3, και τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 20 μΜ MG132 για 30 λεπτά που ακολουθείται από έκθεση σε υποξία και 20 (S) -Rg3 για 24 ώρες. (D) Κύτταρα που εκτίθενται σε νορμοξία, υποξία και υποξία με την παρουσία του 20 (S) -Rg3, αντίστοιχα, αξιολογήθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR για μεταγραφή του PHD1, PHD2, PHD3 και VHL. Μετά από 20 (S) -Rg3 θεραπείας, η μεταγραφή του PHD1 και VHL γονίδια, τα οποία μειώθηκαν κάτω από υποξία, αυξήθηκαν και στις δύο κύτταρα SKOV3 και 3AO. (Ε) εκχυλισμάτων πρωτεΐνης από επεξεργασμένα κύτταρα εξετάστηκαν με κηλίδα western για έκφραση PHD1 και VHL, με πρωτεΐνη από normoxically καλλιεργημένα κύτταρα ως έλεγχος και β-ακτίνη ως έλεγχος φόρτωσης. PHD1 και VHL μειώθηκε σε υποξικά κύτταρα. 20 (S) -Rg3 ανακτηθεί έκφρασή τους κάτω από συνθήκες υποξίας. Όλες οι θεραπείες σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως το μέσο ± SD. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt?. 0.01,

t-test

Η

Από HIF-1α μείωση της πρωτεΐνης ήταν στενά συνδεδεμένη με αποικοδόμηση πρωτεΐνης μέσω της οδού ουμπικιτίνης-πρωτεασώματος, οι 26S πρωτεασώματος αναστολέας πρωτεάσης ειδικής MG132 χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί κατά πόσο 20 (S) -Rg3 προωθείται αποικοδόμηση του πρωτεασώματος του HIF-1α. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3C, προεπεξεργασία του 20 μΜ MG132 για 30 λεπτά κάτω από συνθήκες υποξίας αποκατασταθεί HIF-1α πρωτεΐνης σε κύτταρα SKOV3 και 3AO επεξεργάστηκε με 20 (S) -Rg3, καταδεικνύοντας ότι 20 (S) -Rg3 κάτω ρυθμισμένα HIF-1α στο πρωτεόσωμα εξαρτώμενο τρόπο. Ως μέλη της οικογένειας PHD και της πρωτεΐνης VHL γνωστών παραγόντων που μεσολαβούν ουμπικιτίνης /πρωτεασώματος εξαρτώμενη αποδόμηση HIF-1α, την επίδραση της 20 (S) -Rg3 σχετικά με τα επίπεδα mRNA του PHD1, PHD2, PHD3 και VHL εξετάστηκε περαιτέρω. Σε πραγματικό χρόνο τα δεδομένα PCR έδειξαν ότι η υποξία σταθερά κάτω-ρυθμίζονται PHD1, PHD3 και VHL (Εικ. 3D). Αυτή η επίδραση της υποξίας, ειδικά σε PHD1 και VHL, όμως, ανατράπηκε με 20 (S) -Rg3 στα δύο κύτταρα SKOV3 και 3AO. Όπως αναμενόταν, τα επίπεδα πρωτεΐνης PHD1 και VHL ήταν σε μεγάλο βαθμό αποκατασταθεί, όπως ήταν η περίπτωση για mRNA, μετά την επεξεργασία των κυττάρων SKOV3 και 3AO με 20 (S) -Rg3 να εξουδετερώσει υποξία μεσολάβηση κάτω ρύθμιση PHD1 και πρωτεϊνών VHL (Σχ. 3Ε).

για να διευκρινιστεί περαιτέρω τους ρόλους των PHD1 και VHL στην διαμεσολάβηση της δραστικότητας του 20 (S) -Rg3 σε σχέση με αποικοδόμηση HIF-1α, SKOV3 και 3AO κύτταρα μετάγονται με siRNA-PHD1 (siPHD1) ή siRNA-VHL (siVHL). Στηριζόμενη σε πραγματικό χρόνο PCR και κηλίδος western, επιλέξαμε δύο πιο αποτελεσματικά siRNA για φίμωση PHD1 (siPHD1-Α και siPHD1-Β) και VHL (siVHL-Β και siVHL-C), αντίστοιχα (Εικόνα S2), που ακολουθείται από διέγερση υποξία και 20 (S) -Rg3 θεραπεία. Όπως προσδιορίζεται με κηλίδα western, knock-down του PHD1 ή VHL ανέστειλε την επίδραση προ-αποικοδόμηση 20 (S) -Rg3 επί HIF-1α (Σχ. 4Α και Β), με την επίδραση της siPHD1 περισσότερο σημαντική από εκείνη των siVHL επί HIF -1α ανάκτηση πρωτεΐνης. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι 20 (S) -Rg3 μπλοκάρει υποξία προκαλούμενη ΕΜΤ των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με την ενεργοποίηση του PHD1- VHL- μονοπάτι ουβικουϊτίνης /πρωτεασώματος για τη διευκόλυνση της HIF-1α αποικοδόμηση.

Επίδραση του PHD1 ( Α) και VHL (Β) σιωπή στο 20 (S) -Rg3-κατέστειλε HIF-1α. SKOV3 και 3AO κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά για 24 ώρες με siPHD1 ή siVHL, ακολουθούμενη από επώαση κάτω από συνθήκες υποξίας για άλλες 24 ώρες. Το επίπεδο πρωτεΐνης του PHD1, VHL και HIF-1α στη συνέχεια ανιχνεύεται με χρήση western blot. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Η

20 (S) -Rg3 καταργεί υποξία που προκαλείται μεταγραφική καταστολή της E-cadherin μέσω καταστολής σαλιγκάρι

Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας EMT, E-cadherin συνήθως καταστέλλεται από καταστολείς της μεταγραφής του, συμπεριλαμβανομένης σαλιγκάρι που η ίδια έχει μεταγραφικά ενεργοποιείται από HIF-1. Για να κατανοήσουν καλύτερα πώς 20 (S) -Rg3 εμπόδισε υποξία που προκαλείται από κάτω ρύθμιση της E-cadherin, διερευνήθηκε η επίδραση του 20 (S) -Rg3 στο σαλιγκάρι. Αντιστροφής μεταγραφή αποτελέσματα της PCR κατέδειξε ότι η υποξία προκάλεσε δραστική αύξηση του σαλιγκαριού mRNA, το οποίο προφανώς ανεστάλη από 20 (S) -Rg3 (Εικ. 5Α). Κατά συνέπεια, η αυξητική ρύθμιση του σαλιγκαριού πρωτεΐνης που διεγείρεται από την υποξία ήταν σοβαρά εξασθενημένη με 20 (S) -Rg3 θεραπεία (Εικ. 5Β).

(Α) κύτταρα SKOV3 καλλιεργήθηκαν σε κανονική κατάσταση για 24 ώρες, και στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν σε 21% O

2 (νορμοξία) ή 1% O

2 (υποξία) ή 1% O

2 και 80 μg /ml 20 (S) -Rg3 (υποξία + 20 (S) -Rg3) για άλλες 24 ώρες. Σαλιγκάρι mRNA προσδιορίστηκε με RT-PCR με β-ακτίνη ως ένα εσωτερικό έλεγχο, και τυποποιηθεί κατά το επίπεδο που υπάρχει στο normoxically καλλιεργημένα κύτταρα. Η έκφραση του σαλιγκαριού αυξήθηκε σε επίπεδο mRNA σε κύτταρα SKOV3 μετά από διέγερση υποξία για 24 ώρες. 20 (S) -Rg3 θεραπεία κατήργησε Σαλιγκάρι αυξορρύθμιση που προκαλείται από υποξία. (Β) Τα κυτταρικά εκχυλίσματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδος για να ανιχνεύσει το επίπεδο της πρωτεΐνης σαλιγκάρι, και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Χαμηλό επίπεδο σαλιγκάρι πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε normoxically καλλιεργημένα κύτταρα, ενώ σαλιγκάρι πρωτεΐνη ήταν αυξημένη σε υποξικά κύτταρα. 20 (S) -Rg3 μειωμένη προκαλούμενη από υποξία έκφραση σαλιγκάρι. (C) Δοκιμασία λουσιφεράσης σε κύτταρα SKOV3 και 3AO. δραστικότητα προαγωγού Ε-καδερίνης ήταν σημαντικά μειωμένη σε υποξικά κύτταρα. Μειώσεις στη δραστικότητα προαγωγού Ε-καδερίνης αντιστράφηκαν με 20 (S) -Rg3 συν-θεραπεία. Δραστηριότητα του υποκινητή Ε-καδερίνης λουσιφεράση πυγολαμπίδας κατασκευάσματα ομαλοποιήθηκε με εκείνη ενός συνεπιμολύνθηκαν

Renilla

κατασκεύασμα λουσιφεράσης. Όλες οι θεραπείες σε αυτό το σχήμα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν, και οι τιμές παρουσιάζονται ως μέσο ± SD τριών πειραμάτων. *

P

& lt? 0,05, **

P

& lt? 0,01, για

t-test

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το εάν η καταστολή. του σαλιγκαριού με 20 (S) -Rg3 ήταν υπεύθυνη για την ανάκτηση της Ε-καδερίνης υπό συνθήκες υποξίας, ένας προσδιορισμός διπλής λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Ένα E-cadherin προαγωγού-λουσιφεράσης κατασκεύασμα ανταποκριτή και ένας φορέας εσωτερικού ελέγχου ικανά να εκφράζουν λουσιφεράση της Renilla συν-επιμολύνθηκαν μέσα στα κύτταρα. Η υποξία βρέθηκε να καταστήσει απώλεια σχεδόν 50% της έντασης του σήματος της λουσιφεράσης και στα δύο κύτταρα SKOV3 και 3AO, ενώ το 20 (S) -Rg3 κατέστειλε υποξική αποτελέσματα και προκάλεσε σημαντική αύξηση στην ένταση της λουσιφεράσης (Σχ. 5C). Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι 20 (S) -Rg3 μπλοκάρει υποξική αναστολή της δραστηριότητας προαγωγού Ε-cadherin.

20 (S) -Rg3 αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών και EMT

in vivo

Η < Όπως φαίνεται στο Σχ.