Αφηρημένο

Ογκογόνες, ενεργοποιώντας μεταλλάξεις στο

KRAS

μυημένος καρκίνο του παγκρέατος. Υπάρχουν, ωστόσο, δύο άλλοι

Ras

μέλη της οικογένειας,

ΕΡΑ

και

HRAs

, το οποίο μπορεί να ενεργοποιηθεί με την παρουσία των ογκογόνων

Kras

. Ο ρόλος αυτών των άγριου τύπου

Ras

πρωτεΐνες στον καρκίνο παραμένει ασαφής, δεδομένου ότι διαταραχή τους έχει αποδειχθεί ότι ενισχύει ή να αναστέλλει την ογκογένεση, ανάλογα με τα συμφραζόμενα. Όπως ο καρκίνος του παγκρέατος είναι εξαρτάται κρίσιμα από

Ras

σηματοδότησης, δοκιμάσαμε και τώρα αναφέρουν ότι η απώλεια του

HRAs

αυξάνει το φορτίο του όγκου και μειώνει την επιβίωση σε ένα ογκογόνο

Kras

καθοδηγούμενου παγκρέατος μοντέλο ποντικού αδενοκαρκίνωμα. Οι επιδράσεις αυτές εντοπίστηκαν στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παγκρέατος, γεγονός που υποδηλώνει ότι άγριου τύπου

HRAs

μπορεί να καταστείλει την έναρξη των όγκων. Σε φυσιολογικά κύτταρα, ενεργοποιημένα

Ras

μπορεί να καταστείλει τον πολλαπλασιασμό μέσω μηχανισμών ρ53-εξαρτώμενη. Θεωρούμε ότι ο όγκος κατασταλτική δράση του

HRAs

εξουδετερωθούν σε ένα ομόζυγο μεταλλαγμένο υπόβαθρο p53. Ως εκ τούτου, η απώλεια του άγριου τύπου

HRAs

προωθεί τα πρώτα στάδια του καρκίνου του παγκρέατος σε p53-εξαρτώμενο τρόπο

Παράθεση:. Weyandt JD, Lampson BL, Tang S, M Mastrodomenico, Cardona DM, Μετρητής CM (2015) Άγρια-Type

HRAs

Καταστέλλει τα πρώτα στάδια της ογκογένεσης σε ένα γενετικά τροποποιημένο μοντέλο ποντικού του καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 10 (10): e0140253. doi: 10.1371 /journal.pone.0140253

Επιμέλεια: Henrik Einwaechter, Klinikum rechts der Isar der TU München, Γερμανία

Ελήφθη: 27 του Φεβρουαρίου του 2015? Αποδεκτές: 23 Σεπτεμβρίου, 2015? Δημοσιεύθηκε: 9 Οκτ. 2015

Copyright: © 2015 Weyandt et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου των ΗΠΑ (https://www.cancer.gov) CA123031 επιχορήγησης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

εκτιμάται ότι περίπου το 1,5% των Αμερικανών θα αναπτύξουν καρκίνο του παγκρέατος, κυρίως

σ

ancreatic

δ

uctal

μια

εξουδετέρωσης των NO

γ

arcinoma (PDAC). Η συντριπτική πλειοψηφία αυτών των ατόμων θα υποκύψει σε αυτή την ασθένεια, με ποσοστό πενταετούς επιβίωσης των μόλις 6,7% [1]. Έτσι, είναι κρίσιμης σημασίας για τη διαλεύκανση των υποκείμενων μονοπάτια σηματοδότησης αυτόν τον εξαιρετικά θανατηφόρο καρκίνο. Ενεργοποίηση μεταλλάξεις στο

KRAS

είναι η πιο κοινή γενετική αλλαγή που βρέθηκαν σε ανθρώπινο PDAC, όντας παρούσα σε πάνω από το 90% όλων των περιπτώσεων. Στην πραγματικότητα, η οδός Ras Υποστηρίζεται να συμμετέχει σε ουσιαστικά όλα PDAC [2].

KRAS

, και τα άλλα μέλη της οικογένειας Ras

NRAS

και

HRAS

, κωδικοποιούν εξαιρετικά συναφή μικρής GTPases. Κανονικά, η διέγερση των παραγόντων ανταλλαγής νουκλεοτιδίου γουανίνης [GEFs] προάγει τη μετατροπή του Ras από μια ανενεργή, κατάσταση ΑΕΠ δεσμευμένο σε ένα ενεργό, GTP-δεσμευμένη κατάσταση. Ras-GTP δεσμεύει και ενεργοποιεί πρωτεΐνες τελεστές που εμπλέκουν το ΜΑΡΚ, ΡΙ3Κ, RalGEF, και άλλα μονοπάτια σηματοδότησης που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη και την επιβίωση. πρωτεΐνες ΟΤΡάσης ενεργοποίησης (με κενά), στη συνέχεια, να ενισχύσει την υδρόλυση του GTP και να επανέλθει Ras πίσω σε μια ανενεργή κατάσταση [3].

Οι σωματικές μεταλλάξεις που εντοπίστηκαν στο

KRAS

γονίδιο αδρανοποιήσουν την ενδογενή ή με δυνατότητα GAP διεγείρεται δραστικότητα ΟΤΡάσης της κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα συστατικώς GTP-δεσμευμένη και ενεργοποιημένων Kras [3]. Εκτός από το ότι ανιχνεύεται συνήθως σε PDAC [2], αυτές οι μεταλλάξεις βρίσκονται επίσης στα πρώτα στάδια της νόσου [4] και, όταν εισάγεται στο μυϊκό

Kras

γονίδιο, να προκαλέσει το στάδιο του καρκίνου του παγκρέατος νωρίς ότι μπορεί να πρόοδο στην ειλικρινή PDAC [5]. Ως εκ τούτου, ογκογόνων μεταλλάξεων στο

KRAS

πιστεύεται ότι είναι οι μεταλλάξεις οδηγού σε PDAC.

Αν και η συμμετοχή των ογκογόνων μεταλλαγμένη μορφή του Kras στον καρκίνο του παγκρέατος περιγράφεται καλά, τα υπόλοιπα άγριου πληκτρολογήστε ισομορφές Ras μπορεί επίσης να ενεργοποιηθεί. Οι πρώτες νότες από αυτή την άποψη ήταν τα ευρήματα που στοχεύουν στον αρνητικό RasGAP ρυθμιστή στη μεμβράνη του πλάσματος [6] ή τη μείωση άγριου τύπου έκφρασης ΕΡΑ [7] βρεγμένο ογκογόνο σηματοδότηση HRAs. Πράγματι, άγριου τύπου ΕΡΑ και HRAs έχουν βρεθεί να ενεργοποιηθεί κατάντη των ογκογόνων Kras κατά τρόπο εξαρτάται από

S

-nitrosylation [8] ή την έκφραση του GEF γιο-of-sevenless [SOS] [9 ]. Επιπλέον, οι πρωτεΐνες Ras άγριου τύπου εξακολουθούν να είναι ευαίσθητα σε ενεργοποίηση από παράγοντες ανάπτυξης, ακόμη και με την παρουσία του ογκογόνου Kras [10].

πρωτεΐνες Ras Αγρίου τύπου μπορεί να έχει αποκλίνουσες επιπτώσεις ανάλογα με τη ρύθμιση. Από τη μια πλευρά, μπορούν να αναστέλλουν ογκογένεση. Συγκεκριμένα, ογκογόνος Ras μπορούν να οδηγήσουν ένα γηρασμένα αναστολή της ανάπτυξης όταν εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα [11] και αναστέλλει το σχηματισμό όγκων [12], υποδηλώνοντας έναν ρόλο κατασταλτικό όγκου για τον άγριου τύπου Ras πρωτεϊνών. Σε συμφωνία, καρκινογόνο που προκαλείται από ογκογόνους μεταλλάξεις σε

Kras

ή

HRAs

στον πνεύμονα και του δέρματος όγκους ποντικών συχνά συνοδεύεται από απώλεια της αμοιβαίας αλληλόμορφο αγρίου τύπου [13-15]. Ομοίως, η απώλεια ετεροζυγωτίας του ογκογόνου

RAS

γονίδιο έχει αναφερθεί σε ανθρώπινους καρκίνους [16]. Επιπλέον, τα ποντίκια που στερούνται ένα αλληλόμορφο του άγριου τύπου

Kras

[15], ή και τα δύο αλληλόμορφα του είτε

HRAs

ή

ΕΡΑ

, να αναπτύξουν πιο

Kras

μετάλλαξη-θετικούς όγκους του πνεύμονα [17]. Ένας ρόλος όγκου-κατασταλτικό για άγριου τύπου

ΕΡΑ

παρατηρήθηκε επίσης σε ένα μοντέλο ποντικού του θυμικού λεμφωμάτων οδηγείται από ογκογόνο

ΕΡΑ

[18]. Έτσι, οι πρωτεΐνες Ras άγριου τύπου μπορεί να είναι κατασταλτικό του όγκου, ειδικά σε ρυθμίσεις πρόωρης ογκογένεσης.

πρωτεϊνών Ras άγριου τύπου μπορούν επίσης να τονώσουν την ογκογένεση. Συγκεκριμένα, τα ποντίκια που στερούνται ένα ή και τα δύο αλληλόμορφα του άγριου τύπου

HRAs

ή

ΕΡΑ

αναπτύξει λιγότερες καρκινογόνες ουσίες που προκαλείται από

HRAs

της μετάλλαξης-θετικούς όγκους του δέρματος [17]. Χτύπημα κάτω την έκφραση των πρωτεϊνών Ras άγριου τύπου [8, 19], ή τη μείωση της ενεργοποίησης τους με eNOS [8] ή SOS [9], αναστέλλει την κυτταρική βιωσιμότητα, μετασχηματισμός, και /ή ογκογόνο αύξηση του

KRAS

μετάλλαξη-θετικών ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Αντιστρόφως, η διέγερση των πρωτεϊνών Ras άγριου τύπου με EGF προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αυτών [10]. Έτσι, ιδιαίτερα σε μοντέλα της πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου, οι πρωτεΐνες Ras άγριου τύπου μπορεί να ενισχύσει την ογκογένεση.

Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες Ras άγριου τύπου μπορεί να ενεργοποιηθεί κατάντη των ογκογόνων Kras, ακόμη να οδηγήσει σε αντίθετα αποτελέσματα στην ογκογένεση, ανάλογα με ο πλαίσιο αυτό, είναι σημαντικό να εξεταστεί ο ρόλος τους στον καρκίνο πιο συχνά συνδέεται με

KRAS

μεταλλάξεις, δηλαδή του παγκρέατος. Έτσι, αξιολόγησε το αποτέλεσμα της διάρρηξη του ενδογενούς, φυσικού τύπου

HRAS

γονίδιο για την ανάπτυξη των ογκογόνων

Kras

καθοδηγούμενου ογκογένεση στο πάγκρεας των ποντικών. Αναφέρουμε ότι η απώλεια του άγριου τύπου

HRAs

προωθεί την ογκογένεση σε αυτό το μοντέλο, προτείνοντας ένα ρόλο κατασταλτικό όγκου για άγριου τύπου

HRAs

στα πρώτα στάδια του καρκίνου του παγκρέατος.

Υλικά και Μέθοδοι

ποντίκι μοντέλα καρκίνου του παγκρέατος

Kras

LSL-G12D /+

,

Trp53

LSL-R172 /+

, και

PDX-1-Cre

TG /+

ποντίκια ελήφθησαν από Jackson Labs και ως ένα είδος δώρο από David Kirsch.

HRAs

– /-

ποντίκια ήταν ένα είδος δώρο από το NCI και Eugenio Santos.

Kras

LSL-G12D /+

? HRAs

+/-

και

PDX-1-Cre

TG /+

? HRAs

+/-

ποντίκια είχαν εκτραφεί για να δημιουργήσει

HRAs

+ /+

και

HRAs

– /-

KC (

LSL-Kras

G12D /+

? PDX-1-Cre

TG /+

) των αδερφών.

Kras

LSL-G12D/+

;Trp53

LSL-R172/+

;Hras

+/+

και

PDX-1-Cre

TG /+

? HRAs

+ /+

ποντίκια είχαν εκτραφεί για να δημιουργήσει

HRAs

+ /+

KPC (

LSL-Kras

G12D/+

;Trp53

LSL-R172/+

;Pdx-1-Cre

tg/+

) ποντίκια.

Kras

LSL-G12D/+

;Trp53

LSL-R172/+

;Hras

-/-

και

PDX-1-Cre

TG /+

? HRAs

– /-

ποντίκια είχαν εκτραφεί για να δημιουργήσει

HRAs

– /-

KPC ποντίκια.

Kras

LSL-G12D/+

;Trp53

LSL-R172/+

;Hras

+/+

και

PDX-1-Cre

TG /+

? Trp53

LSL-R172 /+

? HRAs

+ /+

ποντίκια είχαν εκτραφεί για να δημιουργήσει

HRAs

+ /+

KPPC (

LSL-Kras

G12D /+

? Trp53

LSL-R172 /LSL-R172H

? PDX-1-Cre

TG /+

) ποντίκια.

Kras

LSL-G12D/+

;Trp53

LSL-R172/+

;Hras

-/-

και

PDX-1-Cre

TG /+

? Trp53

LSL-R172 /+

? HRAs

– /-

ποντίκια είχαν εκτραφεί για να δημιουργήσει

HRAs

– /-

KPPC ποντίκια. Οι περιγραφόμενες ποντικοί παρακολουθήθηκαν για την υγεία και το βάρος τρεις φορές την εβδομάδα και υποβλήθηκαν σε ευθανασία είτε υποδεικνυόμενες σταθερά χρονικά σημεία ή κατά τη συμπλήρωση μιας παραμέτρου νεκρότητα. τελικά σημεία νεκρότητα ορίστηκαν ως η απώλεια βάρους που υπερβαίνει το 15% του συνολικού σωματικού βάρους, ενδείξεις κοιλιακής ασκίτη ή οίδημα, ή τα σημάδια του πόνου ή δυσφορίας. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις στον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Ένα πρωτόκολλο για τη μελέτη αυτή έχει εγκριθεί ρητώς από τη Φροντίδα και Χρήση Επιτροπής Θεσμικών των ζώων στο Πανεπιστήμιο Duke (A279-13-11 πρωτόκολλο).

κυτταρικές σειρές Ποντίκι PDAC

παγκρέατος ιστού του όγκου από τρία

HRAs

+ /+

και τρεις

HRAs

– /-

KPC ποντίκια κιμά σε κολλαγενάση V (Sigma-Aldrich ) για 30 λεπτά στους 37 ° C, και η προκύπτουσα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Τροποποιημένο κατά Dulbecco Eagle του Media (ϋΜΕΜ) + 10% FBS για τουλάχιστον 4 περάσματα.

Ποσοτικοποίηση των κανονικών παγκρεατικών περιοχής κυψελοειδή

Το ποσοστό της κανονικής περιοχής acinar ποσοτικοποιήθηκε σε 8 και 36 εβδομάδα Time σημεία σε KC ποντίκια σε μία τυφλή μελέτη 4-5 τυχαίως επιλεγμένα πεδία υψηλής ισχύος του Η Tr

p

53

LSL-R172H/+

;Pdx-1-

C

re

tg/+

[KPC] ρύθμιση [24]. Αυτά τα ποντίκια βασίζονται στην KC γενετικό υπόβαθρο, αλλά περιέχει ένα επιπλέον επαγώγιμο κυρίαρχο-αρνητικό

Trp53

R172H

αλληλόμορφο, το οποίο προωθεί PDAC που μοιάζει με παθολογικά την ανθρώπινη ασθένεια [24]. Ομάδες των 45

HRAs

+ /+

και 23

HRAs

– /-

KPC ποντίκια δημιουργήθηκαν και ελέγχονται τακτικά . Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία φτάνοντας τελικά σημεία ευθανασίας νεκρότητα να καθορίσει τη διάρκεια ζωής τους. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι η μέση επιβίωση στο

HRAs

+ /+

KPC ποντίκια ήταν 183 ημέρες, αλλά 141 ημέρες στο

HRAs

– /-

KPC ποντίκια, μια σημαντική μείωση των σχεδόν το ένα τέταρτο στο

HRAs

– /-

KPC ποντίκια (Σχήμα 1 Ε). Έτσι, η απώλεια του άγριου τύπου

HRAs

όχι μόνο ενισχύει νωρίς ογκογόνο

Kras-

οδηγείται παγκρέατος ογκογένεση, αλλά συνδέεται επίσης με τη μείωση της διάρκειας ζωής σε ποντίκια ανάπτυξη PDAC.

Αύξηση του αριθμού των θηλώματα δέρματος σε περίπτωση απουσίας του άγριου τύπου

HRAs

η

Εκτός από PanIN βλάβες, KC ποντίκια είναι επιρρεπείς να αναπτύξουν θηλώματα του δέρματος στο πρόσωπο και αιδοίου ιστούς λόγω έκφραση της Cre από

PDX-1

σε αυτούς τους ιστούς [5, 25-27]. Η ανάπτυξη των θηλωμάτων στα ίδια ποντίκια KC παρέχει ένα καλά ελεγχόμενο σύστημα για την αξιολόγηση του ρόλου του άγριου τύπου HRAS σε ένα δεύτερο ανεξάρτητο τύπο ιστού [25]. Για το σκοπό αυτό, θα παρακολουθείται ο αριθμός των θηλωμάτων του προσώπου αναπτύσσονται σε ομάδες των 24

HRAs

+ /+

και 27

HRAs

– /-

KC ποντίκια. Οπτικός έλεγχος αποκάλυψε μια προφανή αύξηση του αριθμού των βλαβών του προσώπου (Σχήμα 2Α) των θηλωμάτων παθολογίας (Σχήμα 2Β) στο

HRAs

– /-

KC ποντίκια. Ποσοτικοποίηση αποκάλυψε ότι υπήρχε κατά μέσο όρο 0,7 θηλώματα /ποντίκι στο

HRAs

+ /+

KC ομάδα, αλλά 2,5 με το

HRAs

– /-

KC ομάδα, μια σημαντική αύξηση σχεδόν 4 φορές σε

HRAs

– /- ποντίκια

KC (Σχήμα 2C). Επιπλέον, ενώ μόνο περίπου το ήμισυ του

HRAs

+ /+

KC ποντίκια ανέπτυξαν μια θηλωμάτων από το καταληκτικό σημείο της μελέτης, όλα τα

HRAs

– /-

KC ποντίκια ανέπτυξαν τουλάχιστον ένα θηλωμάτων (Εικ 2Δ). PCR του DNA από ένα υποσύνολο αυτών των θηλωμάτων αποκάλυψε την αναμενόμενη ανασυνδυασμού του

LSL-Kras

G12D

αλληλόμορφο (S1 Σχήμα). Ίσως το πιο αποκαλυπτικό, ο μέσος χρόνος όταν οι βλάβες αυτές εμφανίστηκε για πρώτη φορά στο

HRAs

+ /+

KPC ποντίκια ήταν 123 ημέρες, αλλά 80,5 ημέρες στο

HRAs

– /-

KPC ποντίκια, σημαντική μείωση 42,5 ημέρες στο

HRAs

– /-

KPC ποντίκια (Σχήμα 2D). Ομοίως, του αιδοίου θηλώματα εμφανίστηκε επίσης, κατά μέσο όρο, 8 ημέρες νωρίτερα στο

HRAs

– /-

KPC ποντίκια (Σχήμα 2Ε). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι η απώλεια της HRAs προάγει ογκογόνο Kras με γνώμονα την ογκογένεση του δέρματος, ενδεχομένως σε πολύ πρώιμο στάδιο, όπως η έναρξη

(Α) Εκπρόσωπος φωτογραφία (λευκό βέλος) και (Β) H Trp53

LSL-R172H/LSL-R172H

;Pdx-1-Cre

tg/+

(KPPC) φόντο υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε ένα σταθερό χρονικό σημείο 14 ημερών από την ηλικία, και η ποσότητα του φυσιολογικού ιστού acinar παραμένει στο πάγκρεας αξιολογήθηκε (Εικόνα 4C). Ποσοτικοποίηση των H & amp? Ε χρώση παγκρεατικών τομών δεν αποκάλυψε καμία σημαντική διαφορά στην ποσότητα του φυσιολογικού ιστού που απομένει ανάμεσα στις δύο ομάδες (Εικ 4D). Ομάδες των 20

HRAs

+ /+

και 11

HRAs

– /- ποντίκια

KPPC είχαν επίσης τη δυνατότητα με την ηλικία μέχρι τελικά σημεία νεκρότητα, αποκαλύπτοντας μια σχεδόν ταυτόσημη μέση επιβίωση 50 και 47,5 ημέρες αντίστοιχα (Σχήμα 4Ε).