Αφηρημένο

πρωτεϊνών FOXO είναι σημαντικοί ρυθμιστές στον κυτταρικό μεταβολισμό και αναγνωρίζονται ως κόμβοι σε πολλαπλά μονοπάτια σηματοδότησης, και κυρίως εκείνες που αφορούν PI3K /AKT και mTOR. πρωτεΐνες FOXO λειτουργούν κυρίως ως παράγοντες μεταγραφής, αλλά η πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι κυτοσολικά FoxO1 συμμετέχει στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώνουμε ότι του κυτταροπλάσματος FoxO1 διεγείρει την κυτταρική πράγματι αυτοφαγία σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές, και ότι ρυθμίζει όχι μόνο τα βασικά αυτοφαγία, αλλά και εκείνη που προκαλείται από ραπαμυκίνη και ότι σε απάντηση θρεπτικών στέρηση. Τα ευρήματα αυτά δείχνουν τη σημασία της FoxO1 στη ρύθμιση του μεταβολισμού των κυττάρων ανεξάρτητη από τη λειτουργία παράγοντα μεταγραφής του. Σε αντίθεση με FoxO1, βρίσκουμε τα στενά συνδεδεμένες FOXO3a είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της αυτοφαγία σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές, μία προηγουμένως μη αναγνωρισμένη λειτουργία για αυτή την πρωτεΐνη, διαφορετική από τη λειτουργία του σε καλοήθεις ινοβλαστών και μυϊκών κυττάρων. Η επαγωγή της αυτοφαγία από το νοκ ντάουν της FOXO3a διαπιστώθηκε ότι δεν πρέπει να προκαλείται μέσω της καταστολής της mTORC1 σηματοδότησης? μάλλον, ο ρυθμιστικός ρόλος του FOXO3a στην αυτοφαγία ήταν αποφασισμένος να είναι μέσω της ικανότητάς του να μεταγραφικά καταστείλει FoxO1. Αυτή η περίπλοκη αλληλεπίδραση των FoxO1 και FOXO3a προτείνει μια σύνθετη checks- και τα υπόλοιπα-σχέση μεταξύ FOXO3a και FoxO1 στη ρύθμιση του μεταβολισμού αυτοφαγία και κυττάρων

Παράθεση:. Zhu WL, Tong Η, Teh JT, Wang Μ (2014) Forkhead Box πρωτεΐνη O3 Μεταγραφή Factor ρυθμίζει αρνητικά Autophagy σε ανθρώπινα κύτταρα του καρκίνου από ανασταλτικός Forkhead κουτί πρωτεΐνης O1 Έκφραση και κυτοσολίων συσσώρευση. PLoS ONE 9 (12): e115087. doi: 10.1371 /journal.pone.0115087

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: 17 του Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 18, Νοεμ 2014? Δημοσιεύθηκε: 29 Δεκεμβρίου 2014

Copyright: © 2014 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από τον Οργανισμό για την Επιστήμη, την Τεχνολογία και Έρευνας (A * STAR) και του Εθνικού Συμβουλίου Ιατρικής Έρευνας της Σιγκαπούρης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η αυτοφαγία είναι μια εξαιρετικά συντηρημένη κυτταρική διαδικασία, κεντρικής σημασίας για την αντιμετώπιση των κυττάρων με τη διατροφή /ενέργειας, καθώς και την κατάσταση του αυξητικού παράγοντα [1], [2]. Κατάλληλα, ένα από τα σημαντικότερα ανάντη ρυθμιστές της αυτοφαγία είναι ΡΙ3Κ-ΑΚΤ mTOR σηματοδότηση, αισθητήρες για τη διέγερση αυξητικού παράγοντα, αμινοξέων και τα επίπεδα ενέργειας των κυττάρων που αποτελούν τον πυρήνα της κυτταρικής ανάπτυξης και του πολλαπλασιασμού [3] – [5]. Πράγματι, αυτοφαγία ρυθμίζεται παράλληλα με τον κυτταρικό μεταβολισμό και τον πολλαπλασιασμό, σχηματίζοντας μια ολοκληρωμένη απάντηση στις εξωτερικές και εσωτερικές συνθήκες. Για παράδειγμα, όταν τα επίπεδα θρεπτικών ουσιών και της ενέργειας αντιληπτή ως χαμηλή, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και αναβολική δραστηριότητα μείωσης ενώ αυτοφαγία αυξήσεις για την παροχή ενέργειας και μακρομορίων για βασικές κυτταρικές λειτουργίες [6]. Ενώ η αναστολή της αυτοφαγία μπορεί να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο, η παρατεταμένη διέγερση υπερβολική καταβολική δραστικότητα, όπως αυτοφαγία, μπορεί επίσης να οδηγήσει σε κυτταρικό θάνατο? και οι δύο από αυτές τις διαδικασίες μπορούν να αξιοποιηθούν ως νέες προσεγγίσεις για τη θεραπεία του καρκίνου [7] – [10]. Ως εκ τούτου, μια εις βάθος κατανόηση της ρύθμισης αυτοφαγία σε διαφορετικά πλαίσια των κυττάρων είναι σημαντική για τον προσδιορισμό των πιθανοτήτων θεραπευτικό χειρισμό αυτής της διαδικασίας.

Forkhead κουτί πρωτεΐνη O μεταγραφικών παραγόντων (FoxOs) είναι εξελικτικά συντηρημένες πρωτεΐνες που καταλαμβάνουν ρυθμιστικές κόμβους σε πολλαπλές μονοπάτια σημαντικό για την κυτταρική απόκριση σε εξωτερική ενέργεια, τη διατροφή, και διεγέρσεις αυξητικός παράγοντας σηματοδότησης. Ως εκ τούτου, είναι που εμπλέκονται στη ρύθμιση αναβολικές και καταβολικές καταστάσεις των κυττάρων, και την ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, και οι αποφάσεις κυτταρικό θάνατο [11] – [17]. Δεν είναι εκπληκτικό, επομένως, ότι η δυσλειτουργία αυτών των πρωτεϊνών επιπτώσεις σε παθολογικές διεργασίες όπως ο διαβήτης, η γήρανση και ο καρκίνος [12], [16] – [19].

οι πρωτεΐνες FOXO αναφερθεί ότι είναι ρυθμιστές της κυτταρικής αυτοφαγία, μια διαδικασία που είναι στενά συνδεδεμένο με το αναβολικό /καταβολική κατάσταση του κυττάρου. Πολλαπλές μελέτες έχουν προτείνει ότι FOXO3a ιδίως προάγει την έκφραση των γονιδίων αυτοφαγία, οδηγώντας σε αυξημένη autophagy [20] – [22]. Αυτά και άλλα ευρήματα έχουν οδηγήσει στην αντίληψη ότι FOXO πρωτεΐνες γενικά είναι ενεργοποιητές του autophagy μέσω της λειτουργίας τους ως παράγοντες μεταγραφής [23], [24]. Κατά την άποψη αυτή, οι λειτουργίες των διαφορετικών πρωτεϊνών FOXO θεωρείται παρόμοια και η επικάλυψη όσον αφορά την προώθηση της αυτοφαγία, με τη λογιστική διανομή ιστών για διαφορετικές επιπτώσεις τους σε συγκεκριμένα πλαίσια των κυττάρων. Ένα σημαντικό σημείο εστίασης της ρύθμισης των πρωτεϊνών FOXO έχει σε κυτταρικό εντοπισμό τους, η οποία αντιστρεπτά ρυθμίζεται από μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις τους, κυρίως, ότι φωσφορυλίωσης [25] – [28], και ακετυλίωση [29], [30] σε ανταπόκριση σε περιβαλλοντικά ερεθίσματα. Αυτές οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις είναι στενά συνδεδεμένο με το κυτταρικό εντοπισμό των πρωτεϊνών FOXO και τις αλληλεπιδράσεις τους με τελεστές, και ως εκ τούτου θεωρούνται ότι είναι σημαντικά στην ρύθμιση του επιπέδου των δραστηριοτήτων αυτών των πρωτεϊνών [31], [32]. Μάλιστα, πρόσφατα ευρήματα έχουν δείξει ότι του κυτταροπλάσματος FoxO1 μπορεί να προωθήσει την αυτοφαγία, ως απάντηση σε διατροφικά στρες, με άμεση αλληλεπίδραση με ATG7, αποδεικνύοντας τις περίπλοκες ρόλους αυτής της ομάδας πρωτεϊνών στη ρύθμιση αυτοφαγία [33].

Ήταν πρόσφατα ανέφεραν ότι FOXO3a μπορεί να προωθήσει FoxO1 εξαρτώμενη αυτοφαγία σε ανθρώπινα εμβρυϊκά νεφρικά κύτταρα και ινοβλάστες ποντικού εμβρυϊκά, η οποία διαμεσολαβείται από FOXO3a πάνω ρύθμιση της ΡΙ3Κ της καταλυτικής υπομονάδος, μετέπειτα ενεργοποίηση ΑΚΤ και αυξημένη κυτοσολικά διανομή FoxO1 [34]. Αντίθετα, βρήκαμε ότι αναστέλλει FOXO3a, παρά ενισχύει, αυτοφαγία σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές καρκίνου. Περαιτέρω, FOXO3a καταστολή της αυτοφαγία φαίνεται να διαμεσολαβείται από τα κάτω ρύθμιση της μεταγραφής του FoxO1, παρέχοντας νέα εικόνα για τους τρόπους FOXO3a και FoxO1 μπορούν να αλληλεπιδρούν και να ασκήσει αντίθετες επιπτώσεις στην κυτταρική αυτοφαγία. Τα ευρήματα αποκάλυψαν μια απρόσμενη ρόλο της FOXO3a στην αυτοφαγία, και υπογραμμίζουν την πολυπλοκότητα των FOXO σηματοδότησης και βιολογικές επιπτώσεις της σε διαφορετικά πλαίσια των κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια και αντισώματα

Τα αντισώματα που αναγνωρίζουν ανθρώπινα GAPDH, FoxO1 (C29H4), FOXO3a (75D8), π-4EBP1 (Τ37 /46), π-S6 (S240 /244), Atg5, Σημαία, και ιστόνης Η3 ήταν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ)? Αντισώματα για LC3 (APG8A) ήταν από Abgent (San Diego, CA). Το κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ήταν από τη Roche (Βασιλεία, Ελβετία). Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη ελήφθησαν αρχικά από την American Type Culture Collection.

Κυτταρική καλλιέργεια και φαρμακευτική θεραπεία

Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C με 5% CO

2 σε DMEM (Invitrogen, North Andover, μΑ) συμπληρωμένο με 10% FBS (Hyclone, Novato, CA), 50 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (Invitrogen). Πρόσθετες θεραπεία με διαφορετικές αναστολείς, όπως ραπαμυκίνη (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ), κυκλοεξιμίδη (Sigma-Aldrich), και χλωροκίνη (Sigma-Aldrich) διεξήχθησαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS? Οι λεπτομέρειες της κάθε συνθήκη θεραπείας σημειωθεί στο αντίστοιχο σχήμα μύθο. Για διαφορετική μεταχείριση πείνα, τα κύτταρα του πολιτισμού στον ορό δωρεάν, ή D-γλυκόζης χωρίς μέσο, ​​αντίστοιχα.

siRNAs, εκκινητές και πλασμίδια

siRNA-1 της FoxO1 (5′-UUG UAC ΑΓΓ UGU CUU CAC UUG GGU C-3 ‘), siRNA-1 της FOXO3a (5′-AUU GAC CAA ACU UCC CUG Ουυ ΑΓΓ C-3′) και siRNA της Atg5 (5’-AUU CCA UGA Ουυ UCC GAU UGA UGG C -3 ‘) αγοράστηκαν από την Invitrogen? siRNA-2 του FoxO1 (5’-ACA UGC UCA GCA GAC AUC UGC AGU U-3 ‘) [35] και FOXO3a (5′-GAG CUC UUG GUG GAU CAU C-3′) [36] συντέθηκε από Sigma- Aldrich. Οι πρόσθιοι και αντίστροφοι εκκινητές για Real-time PCR ήταν: FoxO1, 5’-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3 ‘και 5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′? FOXO3a, 5’-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3 ‘και 5′-TCGTCCTGGACTTCATCCA AC-3′? Atg4c, 5’-GCAGGAGATTGGTATGGACCAGCT-3 ‘και 5′-GGATGCCTT GCTTCTTCAACTGCT-3′? LC3, 5’-AGACCTTCAAGCAGCGCCG-3 ‘και 5′-ACACTGACAATTTCATCCCG-3′? ATG7, 5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3 ‘και 5′-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3′? Atg12, 5’-TCTATGAGTGTTTTGGCAGTG-3 ‘και 5′-ATCACATCTGTTAAGTCTCTTGC-3′? BNIP3, 5’-GCCCGGGATGCAGGAGGAGA-3 ‘και 5′-GAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′? 18S, 5’-AAGTTCGACCGTCTTC TCAGC-3 ‘και 5′-GTTGATTAAGTCCCTGCCCTTTG-3’. Flag-FoxO1 [37] και Flag-FOXO3a [38] πλασμίδια έκφρασης αγοράστηκαν από Addgene (Cambridge, ΜΑ). Flag-FoxO1-ΔDB (διαγραφή των υπολειμμάτων 208-220 του FoxO1) και Flag-FOXO3a-3A (αλανίνη υποκατάσταση του Thr 32, Ser 253 και Ser 315 της FOXO3a) πλασμίδια έκφρασης κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας QuikChange II τοπο-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene , Santa Clara, CA). Flag-FOXO3a (R), το οποίο είναι πρωτεΐνη FOXO3a ευρύ τύπος κωδικοποιείται από cDNA ανθεκτικά σε siFoxO3a χρησιμοποιήσαμε στην μελέτη, δημιουργήθηκε με μετάλλαξη οκτώ siRNA-1 της FOXO3a στόχευσης ζεύγη βάσεων στο πλασμίδιο άγριου τύπου Flag-FOXO3a χρησιμοποιώντας QuikChange ΙΙ Ιστοσελίδα-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Όλα τα πλασμίδια επαληθεύτηκαν με καθορισμό αλληλουχίας DNA. Το πλασμίδιο συνεζευγμένον φθορίζον mRFPGFP-LC3 ήταν ένα δώρο από τον Dr. Tamotsu Yoshimori [39].

Η επιμόλυνση με siRNA ή έκφραση φορέων

Οι επιμολύνσεις έγιναν χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) με βάση το πρωτόκολλο του κατασκευαστή ? τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επιθυμητό θεραπείες για 24-48 ώρες μετά την επιμόλυνση, όπως περιγράφεται στις αντίστοιχες λεζάντες σχήμα.

κυτοσόλιο-πυρήνα κλασματοποίησης

Τα συλλεγμένα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε ψυχρό ρυθμιστικό διάλυμα (100 mM Tris- HCl ρΗ 7,6, 15 mM Mg (OAc)

2, 10 mM KOAc, 10 mM PMSF, 0,5% ΝΡ40, 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης) και αφέθηκε επί πάγου για 20 λεπτά, πριν από την φυγοκέντρηση στα 2500

g

για 5 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο κλάσμα συλλέχθηκε ως το κυτταροπλασματικό εκχύλισμα. Το σφαιρίδιο πλύθηκε μία φορά με το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα πριν ανασταλεί στους 4 ° C σε ρυθμιστικό πυρήνες λύει (100 mM Tris-HCl ρΗ 7.6, 42 mM NaCl, 50 mM EDTA, 10 mM PMSF, 2% SDS, 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης ). Μετά από 10 λεπτά επώαση επί πάγου, το εναιώρημα υποβλήθηκε σε υπερήχους για 3 λεπτά σε πάγο πριν τη φυγοκέντρηση στα 12.000

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο κλάσμα συλλέχθηκε ως πυρηνικό εκχύλισμα.

Ανοσοκηλίδωση και Ανάλυση

Cells υποβληθεί στην επεξεργασία που αναφέρεται στο κατάλληλο σχήμα λεζάντα συλλέχθηκαν, λύθηκαν, και η συγκέντρωση της πρωτεΐνης προσδιορίζεται σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, και ανάλυση ανοσοστυπώματος εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας μια βελτιωμένη διαδικασία χημειοφωταύγειας (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

συνεστιακής απεικόνισης και ανάλυσης

Τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη , που ακολουθείται από διαπερατοποίηση με ψυχρή μεθανόλη. Για τα κύτταρα πέρασαν από επισήμανσης ανοσοφθορισμού, τα σταθερά, διαπερατά κύτταρα επωάστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού (5% φυσιολογικό ορό αίγας, 0,3% Triton Χ-100 σε PBS) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από επώαση σε κατάλληλα αραιωμένο αντίσωμα σε αντίσωμα ρυθμιστικού αραίωσης (1% BSA, 0.3% Triton Χ-100 σε PBS) όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν τρεις φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με είτε FITC-κατσίκας αντι-κουνελιού (1:1000) ή Rhodamine-κατσίκας αντι-ποντικού IgG δευτερογενή αντισώματα (1:1000), ανάλογα με την περίπτωση, σε ρυθμιστικό αραίωσης αντισώματος για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Όλα τα ομοεστιακό εικόνες ελήφθησαν με ένα φακό Carl Zeiss LSM 710 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Oberkochen, Γερμανία). δεδομένα απεικόνισης αναλύθηκαν με Metamorph Λογισμικό Ανάλυσης (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). αποτελεσματικότητα colocalization της mRFP με εκείνη των σημάτων φθορισμού GFP μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Ποσοτική PCR δοκιμασία

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν στο νοκ ντάουν siRNA ή γονιδιακή υπερέκφραση πρωτόκολλα συλλέχθηκαν σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Ακολούθως, πρώτου κλώνου cDNA συντέθηκε υπό πρότυπες συνθήκες με την Superscript πρώτου κλώνου System Synthesis (Invitrogen). Ποσοτική PCR διεξήχθη με CFX96 System Real-Time (Bio-Rad, Hercules, CA). Η ποσότητα της μεταγραφής ομαλοποιήθηκε με το επίπεδο των ριβοσωμικών πρωτεϊνών 18S.

Η ανάλυση των δεδομένων

Οι στατιστικές διαφορές αξιολογήθηκαν από

t

test του Student. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε ρ & lt? 0,05 (*) και

σ

& lt? 0.01 (**)

Αποτελέσματα

FOXO3a ρυθμίζει αρνητικά την αυτοφαγία, σε αντίθεση με FoxO1. η οποία προωθεί την αυτοφαγία

Πολλές αναφορές έχουν αποδείξει την εμπλοκή των πρωτεϊνών FOXO στη ρύθμιση αυτοφαγία, αλλά η ακρίβεια του παρόντος κανονισμού και τους ρόλους διαφορετικές πρωτεΐνες FOXO μπορεί να παίξει σε αυτή τη διαδικασία, ιδιαίτερα οι ρόλοι των διαφόρων πρωτεϊνών FOXO σε διαφορετικές πλαίσιο των κυττάρων, απαιτεί περαιτέρω διευκρίνιση. Καταστολή των επιπέδων FoxO1 στον προστάτη καρκινικά κύτταρα PC3 με siRNA νοκ ντάουν ανέστειλε την κυτταρική αυτοφαγία, τόσο υπό βασικές συνθήκες και ότι προκαλείται από ραπαμυκίνη (Εικ. 1Α) ή ορού και στέρηση γλυκόζης (Εικ. 1Β). Δύο siRNAs που στοχεύουν FoxO1 καταστέλλεται αυτοφαγία στα κύτταρα PC3, όπως εκτιμήθηκε από τα επίπεδα LC3-ΙΙ, γεγονός που υποδηλώνει ένα στόχο συγκεκριμένο αποτέλεσμα αυτής της ρύθμισης (Εικ. 1Γ). Αυτά τα δεδομένα συμφωνούν με την ιδέα ότι FoxO1 είναι ένας θετικός ρυθμιστής της autophagy [23], [33], [34]. Για να διερευνήσουν το ρόλο της FOXO3a σε κύτταρα PC3, παρόμοιες μελέτες πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση siRNA που στοχεύει FOXO3a. Απροσδόκητα, ένα αντίθετο αποτέλεσμα παρατηρήθηκε μετά την καταστολή της έκφρασης FOXO3a? siRNAs που στοχεύουν FOXO3a ενισχυμένη βασική autophagy καθώς και εκείνη που επάγεται από ραπαμυκίνη, μετρούμενη με λιπιδιωμένης επίπεδα LC3 (Σχ. 1D). Αυτή η μείωση της έκφρασης FOXO3a ενισχυθεί περαιτέρω autophagy επάγεται είτε με ορό ή ασιτία γλυκόζης (Σχ. 1Ε), γεγονός που υποδηλώνει μια γενική εμπλοκή FOXO3a στη ρύθμιση της αυτοφαγία σε απόκριση σε σήματα διατροφή και την ανάπτυξη σε καρκίνο PC3 κύτταρα. Η επαγωγή της αυτοφαγία από καταστολής FOXO3a επικυρώθηκε με δύο FOXO3a στοχεύουν τα siRNA (Σχ. 1F), μειώνοντας την πιθανότητα αυτό να είναι ένα αποτέλεσμα εκτός στόχου. Προηγούμενες μελέτες σε μυοσωληνάρια και ινοβλάστες έχουν δείξει ότι FOXO3a παίζει σημαντικούς ρόλους στην προώθηση αυτοφαγία [20], [34]? Ως εκ τούτου, το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει πολύπλοκο και κυττάρων πλαίσιο-συγκεκριμένοι ρόλοι των FOXO3a στη ρύθμιση της αυτοφαγία. Φαινόταν πιθανό ότι υπάρχουν σαφείς διαφορές μεταξύ των μυών και ινοβλάστες και τα επιθηλιακά προέρχονται από τα καρκινικά κύτταρα στον παρόντα κανονισμό. Για να προσδιορίσετε αν το εκπληκτικό αρνητική ρύθμιση της αυτοφαγία από FOXO3a περιορίστηκε σε καρκίνο του προστάτη PC3 κύτταρα, εξετάσαμε την επίδραση της FOXO3a αποσιώπηση σε HCT116 του παχέος εντέρου και MDA-MB-231 καρκίνου του μαστού κυτταρικές σειρές. Παρόμοια με την παρατήρηση σε κύτταρα PC3, knockdown του FOXO3a οδήγησε σε ανύψωση LC3-ΙΙ σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχ. 2Α), γεγονός που αποδεικνύει αυτή η αρνητική ρύθμιση του autophagy με FOXO3a δεν περιορίζεται σε μία μόνο κυτταρική σειρά καρκίνου.

(Α) Ανοσοστύπωμα ανάλυση των προϊόντων λύσης από κύτταρα PC3 επιμολυσμένα με έλεγχο siRNA (siLuc) ή εν FoxO1 στόχευση (siFoxO1), με ή χωρίς ραπαμυκίνης θεραπεία. Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA για 48 ώρες πριν την μετέπειτα επεξεργασία με DMSO, 20 ηΜ ή 100 nm ραπαμυκίνη (Rap) για 24 ώρες πριν από την συγκομιδή και την επεξεργασία. (Β) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με την υποδεικνυόμενη siRNA για 48 ώρες πριν από την αλλαγή μέσου, οπότε τα κύτταρα υποβλήθηκαν στις υποδεικνυόμενες συνθήκες ανάπτυξης? Αυτές οι συνθήκες είναι DMEM με την παρουσία (Normal) ή απουσία 10% FBS (ορός -), ή σε περίπτωση απουσίας του D-γλυκόζης (με 10% FBS), όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 6 ώρες μετά την έκθεση σε αυτές τις συνθήκες, και επεξεργάστηκαν για ανάλυση ανοσοστυπώματος του υποδεικνύουν πρωτεϊνών. (C) Νοκ ντάουν της FoxO1 με δύο στοχεύουν τα siRNA καταστέλλει αυτοφαγία στα κύτταρα PC3. (D, E, F) απεικονίζουν παρόμοιες διαδικασίες μελέτης (Α, Β, Γ), αλλά με siRNAs που στοχεύουν FOXO3a σε κύτταρα PC3. Όλα τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

(Α) PC3, MDA-MB-231, και τα κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA (siLuc) ή ότι η στόχευση FOXO3a (siFoxO3a). Ακολούθως, αυτά τα κύτταρα εκτέθηκαν για τον έλεγχο του οχήματος ή 50 μΜ χλωροκίνη 72 ώρες μετά την επιμόλυνση για 3 ώρες πριν από την παρασκευή προϊόντων λύσης κυττάρου για ανάλυση ανοσοστυπώματος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. (Β) Ομοεστιακή μικροσκόπιο των MDA-MB231 κυττάρων που εκφράζουν σταθερά παράλληλα φθορίζον mRFP-GFP-LC3 μετά την επιμόλυνση από οποιοδήποτε έλεγχο ή FOXO3a siRNA. Εικόνες ελήφθησαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση των αναφερόμενων siRNA. (Γ) Η ποσοτική ανάλυση των εικόνων από το πείραμα που παρουσιάζεται στον πίνακα Β χρησιμοποιώντας λογισμικό MetaMorph να καθοριστεί ο μέσος αριθμός των RFP-θετικών σωματίδια ανά κύτταρο στον έλεγχο (siLuc) και siFoxO3a επεξεργασμένα κύτταρα. (Δ) Ανάλυση Κοινός εντοπισμός του RFP και GFP από πείραμα που περιγράφεται στον πίνακα B για να εκτιμήσει την πρόοδο αυτοφαγικά. RFP και GFP colocalization υποδεικνύεται από Pearson Συντελεστές αναλύθηκε με το λογισμικό ImageJ. Σε αμφότερα τα (Γ) και (Δ), & gt? 50 κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε κατάσταση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± S.E.M. ( «**»,

ρ

& lt? 0,01), και οι λεπτομερείς μέθοδοι περιγράφονται στην Πειραματικές Διαδικασίες. (Ε) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου (siLuc) ή ότι η στόχευση Atg5 (siAtg5), FOXO3a (siFoxO3a), ή συνδυασμός και των δύο, όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση και τα λύματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση.

Η

Το πρότυπο των επιπέδων LC3-Ι και LC3-ΙΙ από μόνη της δεν είναι επαρκής για να απεικονίσουν την πραγματική διαδικασία αυτοφαγία, είτε ως αυξημένη κίνηση του autophagy ή μειωμένη εξέλιξη του αυτοφαγία στο σύστημα λυσοσωμική αποικοδόμηση μπορεί να οδηγήσει στην αύξηση των επιπέδων LC3-ΙΙ. Να διευκρινιστεί ο ρόλος της FOXO3a σε αυτή τη διαδικασία, προσδιορίσαμε την επίδραση της FOXO3a σιγαστήρα στην πραγματική ροή αυτοφαγία χρησιμοποιώντας δύο προσεγγίσεις. Μία προσέγγιση που εμπλέκονται κατεργασία των κυττάρων με χλωροκίνη παρουσία FOXO3a knockdown, η οποία διεξήχθη σε όλες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του τρία, δηλαδή PC3, MDA-MB-231 και τα κύτταρα HCT116. Καταστολή FOXO3a ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση της LC3-ΙΙ σε αυτά τα κύτταρα? και η προσθήκη χλωροκίνης αυξήθηκε περαιτέρω τα επίπεδα LC3-ΙΙ, γεγονός που υποδηλώνει ότι η καταστολή FOXO3a αυξημένη LC3-ΙΙ μέσω της επαγωγής αυτοφαγία (Εικ. 2Α). Η δεύτερη προσέγγιση περιλάμβανε την μέτρηση της προόδου της αυτοφαγοσώματα στην όξινη autophagolysosomes με συνεστιακή απεικόνιση. MDA-MB-231 κύτταρα που σταθερώς εκφράζουν την πρωτεΐνη παράλληλα φθορισμού mRFP-GFP-LC3 επιμολύνθηκαν με FOXO3a siRNA ή ελέγχουν siRNA? Στη συνέχεια, εξετάστηκε συν-εντοπισμός της GFP με RFP, ένας δείκτης της autophagosome-λυσοσώματος σύντηξης και την υποβάθμιση των πρωτεϊνών, [39]. φθορισμός GFP είναι ασταθής σε όξινες συνθήκες? Ως εκ τούτου, η απώλεια του πράσινου φθορισμού που παρατηρείται ως μετεγκατάστασης του RFP από GFP παρακολουθεί την αύξηση της οξύτητας στην αυτοφαγοσώματα όπως εξελίσσονται σε autophagolysosomes. Σε αυτό το σύστημα, FOXO3a φίμωση όχι μόνο οδήγησε σε αύξηση LC3 θετικές εστίες, αλλά και σε σημαντική μείωση της GFP συν-εντοπισμό με RFP, αντανακλώντας την κατάσταση της αυξημένης ροής αυτοφαγία (Σχ. 2Β, 2C, 2D). Περαιτέρω, siRNA μεσολαβεί μείωση των επιπέδων Atg5 ανέστειλε αυτοφαγία προκαλείται από FOXO3a νοκ ντάουν (Σχ. 2Ε), παρέχοντας ενδείξεις ότι η καταστολή της FOXO3a προώθηση της επαγωγής αυτοφαγία σε ένα τρόπο που εξαρτάται από Atg5. Αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν σαφώς ότι, ενώ FoxO1 προωθεί αυτοφαγία, όπως αναμενόταν, FOXO3a ρυθμίζει αρνητικά τη διαδικασία σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα, παίζει απέναντι ρόλο.

Για να ελεγχθεί περαιτέρω η υπόθεση ότι FOXO3a είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα γραμμές, μια μελέτη διάσωση ειδικού στόχου διεξήχθη σε κύτταρα PC3 με έκτοπη έκφραση της FOXO3a (R), το οποίο κωδικοποιεί την ίδια αλληλουχία πρωτεΐνης όπως άγριου τύπου FOXO3a αλλά περιείχε σιωπηλές μεταλλάξεις καθιστά ανθεκτικά στο FOXO3a siRNA. Η ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως έδειξε ότι η εκτοπική έκφραση του FOXO3a (r) κατέστειλε τόσο τη βασική όσο και την αυτοφαγία autophagy που προκαλείται από FOXO3a knockdown, σε σύγκριση με εκείνη στα κύτταρα που εκφράζουν τον έλεγχο φορέα (Σχ. 3Α). Αξίζει να σημειωθεί, η έκφραση μιας μορφής FOXO3a, που ονομάζεται FOXO3a-3A (δε μπορεί να φωσφορυλιώνονται από την ΑΚΤ), το οποίο εντοπίζεται αποκλειστικά στον πυρήνα [20], ανέστειλε την αυτοφαγία όσο άγριου τύπου FOXO3a που εντοπίζεται τόσο στον πυρήνα και σε κυτταροδιάλυμα (Σχ. 3Β). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι FOXO3a ρυθμίζει αρνητικά autophagy μέσα από την πυρηνική της, πιθανότατα μεταγραφική λειτουργία

(Α) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν είτε με έλεγχο siRNA ή ότι FOXO3a στόχευσης.? κάθε ομάδα κυττάρων ήταν επίσης συν-επιμολυσμένα είτε με φορέα ελέγχου έκτοπη έκφραση ή εν ρητή FOXO3a (r). Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν για ανοσοστύπωμα 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. (Β) PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με 3 διαφορετικά πλασμίδια έκφρασης, τα οποία είναι φορέας-Flag ελέγχου, σημαία-FOXO3a ή Flag-FOXO3a-3Α, αντίστοιχα? κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση για ανάλυση ανοσοστυπώματος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών.

Η

ρύθμιση FOXO3a του autophagy διαμεσολαβείται από FoxO1

Διαπιστώθηκε ότι knockdown του FOXO3a οδήγησε σε μια αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης FoxO1 (Σχ. 4Α), αυξάνοντας την πιθανότητα ότι FoxO1 διαμεσολαβεί στην επαγωγή αποτέλεσμα autophagy από καταστολή FOXO3a. Για να διερευνηθεί η σχέση μεταξύ FoxO1 και FOXO3a στη ρύθμιση της αυτοφαγία, έχουμε ταυτόχρονα κατέστειλε την έκφραση αυτών των δύο πρωτεϊνών. Ταυτόχρονη νοκ ντάουν της FoxO1 όχι μόνο ανέστειλε βασική αυτοφαγία, όπως αναμενόταν, αλλά και κατάργησε εντελώς την ανύψωση του αυτοφαγία προκαλείται από FOXO3a νοκ ντάουν (Σχ. 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι FoxO1 είναι απαραίτητη για την επαγωγή αυτοφαγία που προκύπτουν από την καταστολή FOXO3a. Επιμόλυνση από δύο διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν FOXO3a τόσο οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης FoxO1 (Εικ. 4Β), τα οποία καθιστούν την πιθανότητα των επιπτώσεων off-στόχο των siRNAs ένα απίθανο σενάριο. Συνεπής με την επίδραση στα επίπεδα της πρωτεΐνης, η εκτίμηση της μεταγραφής με πραγματικού χρόνου PCR έδειξε μια αύξηση της έκφρασης FoxO1 με FOXO3a νοκ ντάουν (Εικ. 4C), γεγονός που υποδηλώνει ότι FOXO3a ρυθμίζει μεταγραφικά επίπεδο FoxO1. Επιπλέον, η θεραπεία των κυττάρων με κυκλοεξιμίδιο ταυτόχρονα με FOXO3a knockdown εξαλειφθεί η αύξηση του επιπέδου της πρωτεΐνης FoxO1 (Εικ. 4D), παρέχοντας περαιτέρω απόδειξη για FOXO3a ρύθμιση της έκφρασης, όχι σταθερότητα του FoxO1. Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά υποστηρίζουν τα συμπεράσματα ότι η αύξηση των FoxO1 προκύπτει από FOXO3a νοκ ντάουν είναι πιθανόν το αποτέλεσμα της αυξημένης μεταγραφής και σύνθεσης των FoxO1.

(Α) PC3 κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA για λουσιφεράσης (siLuc) , FoxO1 (siFoxO1), ή FOXO3a (siFoxO3a), ή συνδυασμούς, όπως υποδεικνύεται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, και προϊόντα λύσης κυττάρου σε επεξεργασία για ανάλυση ανοσοστυπώματος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. (Β) FOXO3a νοκ ντάουν με δύο FOXO3a στόχευση siRNA για να τονίσει τον αντίκτυπο στο επίπεδο της πρωτεΐνης FoxO1. (C) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση των επιπέδων FoxO1 και FOXO3a mRNA σε έλεγχο siRNA (γκρι) ή FOXO3a siRNA (μαύρο) επιμολυσμένων κυττάρων. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επεξεργασία 48 ώρες μετά την επιμόλυνση? 18S ριβοσωμικό RNA αναλύθηκε ως μάρτυρας κανονικοποίηση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. ( «**»,

σ

& lt? 0,01). (D) Κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή FOXO3a siRNA όπως υποδεικνύεται. Μετά από 48 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με έλεγχο DMSO ή 10 μg /ml κυκλοεξιμιδίου επί 24 ώρες όπως υποδεικνύεται πριν από τη συγκομιδή για την ανάλυση ανοσοστυπώματος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. Ο λόγος FoxO1 /GAPDH για κάθε κατάσταση είναι όπως παρουσιάζονται μετά την ποσοτικοποίηση μπάντα από ImageJ. (Ε) σε πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση του ενδογενούς επιπέδου έκφρασης FoxO1 σε κύτταρα PC3 επιμολυσμένα είτε με πλασμίδιο ελέγχου (vector) ή ότι εκφράζουν FOXO3a (R)? σε κάθε ομάδα του πλασμιδίου επιμολυσμένα κύτταρα, είτε ελέγχου siRNA ή FOXO3a siRNA ήταν ταυτόχρονα εισάγεται. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για παρασκευή του RNA και Q-PCR ανάλυση 72 ώρες μετά την επιμόλυνση? επίπεδα μεταγραφής FoxO1 αναλύθηκαν, όπως περιγράφεται στις Πειραματικές Διαδικασίες. 18S χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος κανονικοποίηση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. ( «**»,

σ

& lt? 0,01). Όλα τα πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το δυναμικό αρνητική μεταγραφική ρύθμιση της FoxO1 από FOXO3a, εκτιμήσαμε την επίδραση της FOXO3a υπερέκφραση σε ενδογενή μεταγραφή FoxO1. Όταν εισαχθούν μέσα σε κύτταρα PC3, παρατηρήθηκε άμεση επίδραση των FOXO3a (R) επί της έκφρασης FoxO1, με ή χωρίς ταυτόχρονη knockdown του FOXO3a. Η ανασταλτική δράση του FOXO3a (R) επί της βασικής έκφρασης FoxO1 ήταν μέτρια, αλλά σημαντική. Σε αντίθεση, η εισαγωγή FOXO3a (r) σχεδόν εξαλειφθεί πλήρως η αύξηση του FoxO1 μεταγραφής που προκαλείται από FOXO3a siRNA, φέρνοντας πίσω στο εγγύς βασικό επίπεδο (Εικ. 4Ε). Αυτή η μελέτη FOXO3a διάσωσης παρέχει άμεσες αποδείξεις για FOXO3a αναστολή της FoxO1 μεταγραφής στα κύτταρα PC3. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι FOXO3a ρυθμίζει αρνητικά την κυτταρική autophagy με αναστολή της μεταγραφής του FoxO1, θετικός ρυθμιστής της κυτταρικής αυτοφαγία και το μεταβολισμό.

Ανύψωση σε κυτοσολικά FoxO1, που προκύπτουν από την καταστολή FOXO3a, επάγει autophagy

είναι καθιερωμένη ότι FoxO1 ρυθμίζει θετικά αυτοφαγία από την αύξηση της μεταγραφής ορισμένων γονιδίων αυτοφαγία [23], [24]. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν παράσχει πειστικές αποδείξεις ότι του κυτταροπλάσματος FoxO1 προωθεί την αυτοφαγία ανεξάρτητα από τη μεταγραφή κανονιστικής δραστηριότητας της [33], [34]. Αυτή η τρέχουσα μελέτη μέχρι σήμερα έχει δείξει ότι η καταστολή της FOXO3a αύξησε την μεταγραφή και το συνολικό επίπεδο FoxO1protein, η οποία είναι η αιτία των αυξημένα αυτοφαγία. Δεν είναι σαφές, ωστόσο, εάν αυτό FoxO1 εξαρτώμενη αυτοφαγία οφείλεται κυρίως στην πυρηνική ή κυτοσολικά λειτουργία του. Επιδιώκουμε να ορίσετε αυτή την ερώτηση χρησιμοποιώντας μερικές διαφορετικές προσεγγίσεις. Κλασματοποίηση του λύματος κυττάρων PC3 παρακάτω νοκ ντάουν της FOXO3a αποκάλυψε μια σημαντική αύξηση της κυτοσολικής FoxO1, ενώ η ποσότητα των πυρηνικών FoxO1 παραμένουν αμετάβλητες (Εικ. 5Α). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι η αυξημένη FoxO1 που προκύπτει από την καταστολή FOXO3a συσσωρεύεται κυρίως στο κυτταρόπλασμα. Θεωρούμε ότι αυτό κυρίως κυτοσολικές ανύψωση FoxO1 ήταν η πιθανή ένοχος για την ενεργοποίηση αυτοφαγία παρακάτω FoxO3 νοκ ντάουν, σύμφωνα με ορισμένες πρόσφατες εκθέσεις [33], [34]. Σύμφωνα με την μελέτη κλασμάτωσης, RT-PCR ποσοτικοποίηση γνωστών γονιδίων στόχων FOXO εμπλέκονται σε αυτοφαγία, όπως Atg4c, ATG7, LC3, Atg12, και BNIP3, δεν έδειξαν σημαντική αύξηση στην έκφραση κατά την FOXO3a knockdown παρόλο FoxO1 ανυψώθηκε όπως αναμενόταν (Σχ . 5Β)

(Α) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με siRNA για λουσιφεράση (-) ή FOXO3a (siFoxO3a) όπως υποδεικνύεται, και συλλέχθηκαν για ανάλυση ανοσοστυπώματος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών 72 ώρες μετά την επιμόλυνση.? βλέπε Πειραματικές Διαδικασίες για λεπτομέρειες. Ιστόνης Η3 και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης για τα πυρηνικά και κυτοσολικά πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Οι αναλογίες ποσότητα μπάντα, FoxO1 /GAPDH και FoxO1 /ιστόνης Η3, για κάθε κατάσταση ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ImageJ. (Β) σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR για τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των υποδεικνυόμενων γονιδίων autophagy σχετίζονται 48 ώρες μετά την διαμόλυνση των PC3 κυττάρων με έλεγχο siRNA (μαύρο) ή δύο διαφορετικά siRNAs που στοχεύουν FOXO3a (φως και σκούρο γκρι, αντίστοιχα). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.D. (C, D) Πάνω-έκφραση μιας συνάρτησης μεταγραφής ανενεργό /κυτοσολική μορφή FoxO1, FoxO1-ΔDB, αυξάνει την αυτοφαγία. Οι ποσότητες των LC3 θετικών κυστιδίων τόσο PC3 (πίνακας C) και Η1299 (πίνακας D) κύτταρα σε σύγκριση με τον ίδιο ανάλυση μεταξύ Flag-FoxO1-ΔDB υπερεκφράζουν κύτταρα και un-επιμολυσμένα κύτταρα. FITC και ροδαμίνη ετικέτα δευτερογενή αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των αντι-LC3 ή αντι-Flag ετικέτα, αντίστοιχα. Το επίπεδο autophagy σε κάθε πληθυσμό κυττάρου ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό MetaMorph? τα δεδομένα παρίστανται γραφικώς στη δεξιά πλευρά εκάστου πίνακα. & Gt? 50 κύτταρα αναλύθηκαν για κάθε κατάσταση. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες ± S.E.M. ( «**»,

ρ

& lt? 0,01).

Η

Για να εκτιμηθεί άμεσα την επίπτωση της κυτοσολικής FoxO1 επί αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα PC3, έχουμε εισαχθεί σε κύτταρα ένα φορέα έκφρασης που περιέχει flag-tagged FoxO1 τροποποιηθεί ώστε να έχει μια δεσμευτική ελαττωματικό DNA μετάλλαξη, FoxO1-ΔDB [33]. Η FoxO1-ΔDB έτσι εκφράζεται είναι μη λειτουργικό ως παράγοντας μεταγραφής και, κατά τρόπο ενδιαφέροντα, εντοπισμένη σχεδόν αποκλειστικά στο κυτοσόλιο. Σε αμφότερες κύτταρα PC3 (Εικ. 5C) και Η1299 κύτταρα (Σχ. 5D), Flag-FoxO1-ΔDB πρωτεΐνη αποκλειστικά εντοπίζεται στην κυτοσόλη, όπως αναμένεται [33] και Flag-FoxO1-ΔDB κύτταρα που εκφράζουν (κόκκινο) είχαν σημαντικά υψηλότερο επίπεδο της αυτοφαγοσώματα από εκείνη των μη-επιμολυσμένα κύτταρα. ανάλυση εικόνας έδειξε στατιστικά σημαντική αύξηση των autophagosome στα κύτταρα που εκφράζουν cytosolically εντοπισμένη FoxO1. Αυτά τα δεδομένα παρέχουν άμεση απόδειξη για να υποστηρίξει την άποψη ότι η κυτοσολική συσσώρευση FoxO1 σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα προωθεί πράγματι αυτοφαγία, ανεξάρτητα από την πυρηνική λειτουργία του.

Κυτοσολικά FoxO1 μεσολάβηση επαγωγή της αυτοφαγία είναι ανεξάρτητη από την καταστολή της δραστηριότητας mTORC1

mTORC1 είναι ένα καλά αναγνωρισμένο αισθητήρα για τη διατροφή και αυξητικό παράγοντα σηματοδότηση? αναστέλλει αυτοφαγία ως απάντηση στην σηματοδότηση της ανάπτυξης. Ως εκ τούτου, εξετάσαμε τη δράση της mTORC1 σηματοδότησης όταν η έκφραση FoxO1 ή FOXO3a καταστέλλεται με siRNA. FOXO3a νοκ ντάουν οδήγησε σε σημαντική αύξηση των αυτοφαγία, όπως φαίνεται παραπάνω? καμία σημαντική αλλαγή του τρόπου διεξαγωγής των φωσφο-4EBP1 και φωσφο-S6 παρατηρήθηκαν σε κύτταρα με FOXO3a knockdown ενώ autophagy αξιοσημείωτα επάγεται (Εικ. 6Α, DMSO), γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση του autophagy επάγεται από FOXO3a knockdown δεν ήταν πιθανό μέσω αναστολής του mTORC1 . Αξίζει να σημειωθεί, FoxO1 knockdown μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση των αυτοφαγία συνοδεύτηκε από την αναστολή της mTORC1 σηματοδότησης, βασίζεται τόσο φωσφο-4EBP1 και φωσφο-S6 μοτίβα (Εικ. 6Β, DMSO), το οποίο υποστήριξε επίσης την άποψη ότι η ρύθμιση FOXO της αυτοφαγία ήταν δεν διαμεσολαβείται μέσω του κλασικού σηματοδότησης mTORC1 σε αυτήν την περίπτωση.

(Α) κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με siRNAs που στοχεύουν FOXO3a όπως υποδεικνύεται. Μετά 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κατεργασία ραπαμυκίνης για 24 ώρες πριν από την επεξεργασία για την ανάλυση ανοσοστυπώματος των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. (Β) κύτταρα PC3 υποβλήθηκαν σε παρόμοια μελέτη όπως περιγράφεται στο (Α), εκτός από siRNA που στοχεύει FoxO1 χρησιμοποιήθηκε όπως υποδεικνύεται. Όλα τα πειράματα έχουν πραγματοποιηθεί τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η αλληλεπίδραση μεταξύ mTOR σηματοδότησης και FOXO ρυθμιζόμενων αυτοφαγία, συνδυάσαμε είτε FOXO3a ή FoxO1 νοκ ντάουν με τη θεραπεία με ραπαμυκίνη σε κύτταρα PC3.