Αφηρημένο

BPR0L075 [6-μεθοξυ-3- (3 ‘, 4′, 5’-τριμεθοξυ-βενζοϋλο) -1 η-ινδόλη] είναι ένα νέο αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακο με αντι-όγκου και αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα

σε vitro

και

in vivo

. Securin απαιτείται για τη σταθερότητα του γονιδιώματος, και εκφράζεται σε αφθονία στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα, προάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την καρκινογένεση. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι BPR0L075 επάγεται αποδοτικά κυτταρικό θάνατο ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου HCT116 που έχουν υψηλότερα επίπεδα έκφρασης του securin. Η κυτταροτοξικότητα της BPR0L075 ήταν εξασθενημένος σε ισογονιδιακές securin-null κύτταρα HCT116. BPR0L075 απάντηση που προκαλείται από βλάβη στο DNA, G

2 /M σύλληψη, και την ενεργοποίηση του οδοφράγματος της συναρμολόγησης ατράκτου σε κύτταρα HCT116. Είναι ενδιαφέρον, BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση της securin. BPR0L075 απόσυρση οδήγησε σε υποβάθμιση της securin, μιτωτική έξοδο και μιτωτική καταστροφή, που ήταν εξασθενημένα στην securin-null κύτταρα. Η αναστολή της cdc2 μειώθηκε securin φωσφορυλίωση, G

2 /M σύλληψη και τον κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από BPR0L075. Επιπλέον, BPR0L075 προκάλεσε κυτταρικό θάνατο μέσω μιας κασπάσης-ανεξάρτητου μηχανισμού και την ενεργοποίηση της JNK και της p38 ΜΑΡΚ μονοπάτια. Αυτά τα ευρήματα που παρέχονται αποδείξεις για πρώτη φορά ότι θεραπεία BPR0L075 είναι ευεργετική για τη θεραπεία ανθρώπινων ορθοκολικών όγκων με υψηλότερα επίπεδα securin. Έτσι, προτείνουμε ότι τα επίπεδα έκφρασης των securin μπορεί να είναι ένας παράγοντας πρόβλεψης για εφαρμογή σε αντικαρκινική θεραπεία με BPR0L075 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Παράθεση:. Tseng HH, Chuah ΟΥ, Γιανγκ μμ, Chen CT, Chao JC, Lin MD, et al. (2012) Securin Ενισχύει τις αντικαρκινικές επιδράσεις του 6-μεθοξυ-3- (3 ‘, 4′, 5’-τριμεθοξυ-βενζοϋλο) -1 Η-ινδόλη (BPR0L075) σε κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 7 (4): e36006. doi: 10.1371 /journal.pone.0036006

Επιμέλεια: Regine Schneider-Stock, Ινστιτούτο Παθολογίας, Γερμανία

Ελήφθη: 23 Δεκέμβρη, 2011? Αποδεκτές: 29 του Μαρτίου 2012? Δημοσιεύθηκε: 26, Απριλίου του 2012

Copyright: © 2012 Tseng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αριθμούς Grant : Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο, την Ταϊβάν (NSC 99 έως 2314-B-320-004-my3). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

οι μικροσωληνίσκοι αποτελούν ένα συστατικό του κυτταρικού σκελετού και αποτελούνται από α-τουμπουλίνης και β-τουμπουλίνης heterdimers [1]. Οι μικροσωληνίσκοι είναι ιδιαίτερα σημαντικό σε μίτωση και την κυτταρική διαίρεση, και αυτό σήμαινε ότι μικροσωληνίσκοι έχουν γίνει στόχος για αντικαρκινικά φάρμακα [2], [3]. Σύμφωνα με διάφορες θέσεις σύνδεσης τουμπουλίνης, τα αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακα κατατάσσονται σε τρεις κατηγορίες: η περιοχή πακλιταξέλη, η περιοχή αλκαλοειδές vinca, και ο τομέας colchicines. Κατά των μικροσωληνίσκων φάρμακα θα μπορούσαν να προκαλέσουν είτε σταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων, όπως φαίνεται με πακλιταξέλη, ή αποσταθεροποίηση, όπως φαίνεται με βινβλαστίνη και κολχικίνη [4]. BPR0L075 [6-μεθοξυ-3- (3 ‘, 4′, 5’-τριμεθοξυ-βενζοϋλο) -1 Η- ινδόλη], ένα κομπρεταστατίνη Α-4 (CA-4) ανάλογο, το οποίο προέρχεται από το δέντρο της Νότιας Αφρικής

Combretum caffrum

, είναι μια νέα συνθετική αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακο που αναστέλλει τον πολυμερισμό της τουμπουλίνης με σύνδεση προς τον τομέα κολχικίνη [5], και εγκρίθηκε από το FDA των ΗΠΑ για τη φάση 1 κλινικών δοκιμών το 2010. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναφέρει ότι BPR0L075 εξασκεί όχι μόνο αντι-μιτωτικές και αντι-όγκου δραστηριότητες αλλά και αντι-αγγειογενετική δραστηριότητα

in vitro

και

in vivo

[6], [7].

Η μιτωτική καταστροφή είναι μια μορφή κυτταρικού θανάτου που προκύπτει από ανώμαλη μίτωση [8]. Μπορεί να προκληθεί από φάρμακα που επηρεάζουν τη σταθερότητα των μικροσωληνίσκων, διάφορα αντικαρκινικά φάρμακα, ιονίζουσα ακτινοβολία και μιτωτικό ανεπάρκεια που επάγεται από το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου ελάττωμα [8], [9]. Επιπλέον, μιτωτική καταστροφή μπορεί να είναι κασπάσης-εξαρτώμενη ή-ανεξάρτητο [10]. Βιοχημικές λειτουργίες της μιτωτικής καταστροφής είναι παρατεταμένη οδοφράγματος συναρμολόγηση ατράκτου (SAC) σηματοδότησης, ανώμαλα επίπεδα της κυκλίνης Β1, και τη σηματοδότηση μέσω Cdk1 [11]. Ο κυτταρικός θάνατος που προκλήθηκε από μιτωτική καταστροφή θα μπορούσε να συμβεί κατά τη διάρκεια ή μετά τη μίτωση [12]. Αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακα, όπως η docetaxel και κομπρεταστατίνη-Α4 προφάρμακο (CA4P), να προκαλέσουν καρκίνο κυτταρικό θάνατο μέσω μιτωτικής καταστροφής [13], [14]. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν έναν δυνητικό ρόλο της BPR0L075 στην επαγωγή μιτωτική καταστροφή σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Το αν ή όχι μιτωτική καταστροφή που προκαλείται από κατεργασία BPR0L075 συμβάλλει θάνατο των καρκινικών κυττάρων είναι άξια έρευνας.

Securin, επίσης γνωστή ως η υπόφυση όγκου γονιδίου μετασχηματισμού (PTTG1), απομονώθηκε για πρώτη φορά από κύτταρα υπόφυσης αρουραίου καρκινικά [15] . Securin είναι ένα πολυ-λειτουργικής πρωτεΐνης που ρυθμίζει αδελφή χρωματίνης διαχωρισμό στην μίτωση [16], την επιδιόρθωση του DNA [17], τη μεταγραφή γονιδίων [18], το μεταβολισμό και την ανάπτυξη των οργάνων [19] – [21]. Σε φυσιολογικό ιστό, securin έκφραση είναι υψηλή στους όρχεις και χαμηλή σε θύμο, κόλον και το λεπτό έντερο [22]. Σε αντίθεση, securin έχει αναγνωριστεί ως ένα ογκογονίδιο και ένα δείκτη της ικανότητας εισβολής λόγω υπερέκφραση του σε μία ποικιλία όγκων [23], και έχει βρεθεί να ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων και την καρκινογένεση [24], [25]. Σε προηγούμενες μελέτες μας, αντικαρκινικούς παράγοντες όπως οξαλιπλατίνη και fisetin δείχθηκε ότι επάγουν το θάνατο των καρκινικών κυττάρων μέσω της ρύθμισης προς τα κάτω της έκφρασης securin [26] – [28]. BPR0L075 διαθέτει αντι-καρκινική και αντι-angiogeneic δραστηριότητες αναστέλλοντας την λειτουργία των μικροσωληνίσκων, ειδικά στην μετάφαση να μετάβαση ανάφαση στη μίτωση [6], [7]. Securin είναι επίσης μια πρωτεΐνη που εμπλέκεται στον έλεγχο της μετάφασης-ανάφαση μετάβασης και ανάφαση έναρξη. Ωστόσο, η αποτελεσματικότητα των BPR0L075 σε ασθενείς με καρκίνους υψηλά εκφράζουν securin είναι ακόμα άγνωστη.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε το ρόλο της securin σε παρεμβολή με την ευαισθησία να BPR0L075 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα και έδειξε για πρώτη φορά ότι η φωσφορυλίωση και την αποσταθεροποίηση του securin ενισχύει την ευαισθησία στην μικροσωληνίσκων de-σταθεροποιητική ένωση BPR0L075 σε HCT116 ανθρώπινου ορθοκολικού καρκινικά κύτταρα. Εμείς επεξηγηθεί περαιτέρω των μοριακών μηχανισμών του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από BPR0L075 σε κύτταρα HCT116. Τα ευρήματά μας υποδεικνύουν ότι securin φαίνεται να είναι ένας κατάλληλος στόχος για την κλινική θεραπεία BPR0L075.

Αποτελέσματα

Οι αντικαρκινικές επιδράσεις του BPR0L075 συσχετίστηκαν με τα επίπεδα έκφρασης των securin σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα

Για να ερευνηθεί ο ρόλος των securin στις αντικαρκινικές επιδράσεις της BPR0L075, διαφόρων ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων με διαφορετικά securin επίπεδα έκφρασης, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα κυττάρων (Α549), τα ανθρώπινα κύτταρα του μαστού (MCF-7 και MDA-MB-231), μελάνωμα ( MDA-MB-435) και του παχέος εντέρου κύτταρα (HCT116), χρησιμοποιήθηκαν (Εικ. 1Α). Μετά τη θεραπεία με BPR0L075 για 24 ώρες, η κυτταρική βιωσιμότητα αυτών αναστέλλεται αποτελεσματικά. Μεταξύ αυτών, HCT116 κυττάρων με το υψηλότερο επίπεδο έκφρασης securin παρουσίασαν την μεγαλύτερη ευαισθησία σε BPR0L075 (Εικ. 1Β). Για να εξακριβωθεί ο ρόλος του securin στην κυτταροτοξικότητα BPR0L075, κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με BPR0L075 και η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάστηκε στη συνέχεια με τη δοκιμασία ΜΤΤ. Όπως ήταν αναμενόμενο, η κυτταροτοξικότητα της BPR0L075 μειώθηκε σε κύτταρα HCT116 securin-null (Εικ. 1 C), υποδεικνύοντας ότι η έκφραση securin ενίσχυσε τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της BPR0L075.

(Α) Τα επίπεδα securin σε Α549, MCF- 7, MDA-MB-231, κύτταρα HCT116 MDA-MB-435 και χαρακτηρίστηκαν με ανάλυση κηλίδος Western. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις BPR0L075 για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εξετάσθηκε με τη δοκιμασία ΜΤΤ. (Γ) Η κυτταρική βιωσιμότητα του securin-αγρίου τύπου και -null κύτταρα HCT116 μετρήθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. ρ & lt? 0,01 (**) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ BPR0L075-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων. p & lt? 0,01 (##) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ securin-άγριου τύπου και -null κύτταρα HCT116

Η

Απώλεια securin έκφρασης εξασθενεί την κυτταροτοξικότητα της BPR0L075 μέσω μειώσεων των G

2 /. Μ σύλληψη και απόπτωση σε HCT116 κύτταρα ορθοκολικού καρκίνου

Για τον περαιτέρω χαρακτηρισμό του ρόλου της securin σε BPR0L075 επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. BPR0L075 βρέθηκε να επάγει G

2 /M σύλληψης (Εικ. 2Α) και την απόπτωση (Σχ. 2Β) σε κύτταρα HCT116, η οποία εξασθένισε σε securin-null κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, κολχικίνη επαγόμενη G

2 /Μ σύλληψης ήταν επίσης μειωμένη σε κύτταρα HCT116 securin-null (Εικ. 2Α), ενώ σισπλατίνη προκάλεσε παρόμοιες κλάσματα απόπτωσης σε securin-αγρίου τύπου και -null κύτταρα HCT116 (Σχ. 2Β ). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι securin απαιτείται ειδικά για τις αντικαρκινικές επιδράσεις των φαρμάκων μικροσωληνίσκων στόχευσης.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 έως 80 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. (Α) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα ποσοστά του G

2 /M κύτταρα ποσοτικά. (Β) Cell απόπτωση προσδιορίστηκε με διπλή χρώση αννεξίνης-ν /ΡΙ. Τα αποπτωτικά κύτταρα ποσοτικοποιήθηκαν με δύο αννεξίνης-ν θετικών και Annexin-V /ΡΙ διπλών θετικών κυττάρων. p & lt? 0.01 (**) δείχνει μια σημαντική διαφορά σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα δείγματα. p & lt? 0,01 (##) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ securin-άγριου τύπου και -null κύτταρα HCT116

Η

Securin ενισχυμένη BPR0L075 επαγόμενη απόκριση βλάβης του DNA και το σημείο ελέγχου συναρμολόγηση ατράκτου σε κύτταρα HCT116

.

Αντικαρκινικό παραγόντων μπορεί να προκαλέσει βλάβες στο DNA των καρκινικών κυττάρων και, κατά συνέπεια, να ενεργοποιήσετε σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου, που οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου, και επιτρέπει στα κύτταρα να επισκευάσει πριν από την είσοδο μίτωση. Αν τα κύτταρα αποτυγχάνουν να επισκευάσει, κυτταρικό θάνατο μέσω απόπτωσης θα προκύψουν [29], [30]. γ-H2AX θεωρείται ως ένα σημείο ελέγχου Συντελεστής συντήρησης και αποφωσφορυλίωση της επιτρέπει την επανάληψη του κυτταρικού κύκλου μετά από βλάβη του DNA επιδιορθώνεται [31]. Για να διερευνηθεί αν BPR0L075 προκάλεσε μια απόκριση βλάβης DNA σε κύτταρα HCT116, τα επίπεδα πρωτεΐνης του γ-Η2ΑΧ μετά από θεραπεία BPR0L075 αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας στύπωμα Western. BPR0L075 έκφραση επάγεται γ-Η2ΑΧ τόσο securin-αγρίου τύπου και -null HCT116 κύτταρα (Σχ. 3Α). Σε απόκριση σε βλάβη του DNA, δύο ξεχωριστές καταρράκτες κινάσης σηματοδότησης, το ΑΤΜ /Chk2 και ATR /Chk1 μονοπάτια, ενεργοποιούνται [32]. Τα επίπεδα της φωσφορυλίωσης της Chk1 και Chk2 ήταν αυξημένα με κατεργασία BPR0L075 τόσο securin-αγρίου τύπου και -null κύτταρα HCT116. Επιπλέον, η ενεργοποίηση των Chk1 και Chk2 ήταν υψηλότερη στα κύτταρα securin-άγριου τύπου από ό, τι στα κύτταρα HCT116 securin-null μετά τη θεραπεία BPR0L075 (Εικ. 3Α).

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10~80 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. (Α) Τα επίπεδα του γ-Η2ΑΧ, φωσφο-Chk1, φωσφο-Chk2, σύνολο Chk1 και Chk2 αναλύθηκαν με κηλίδα Western σε BPR0L075 επεξεργασμένο securin-άγριου-τύπου και -null κύτταρα HCT116. (Β) Τα επίπεδα του securin, φωσφο-H3 (Ser10), κυκλίνη Β1, φωσφο-cdc2 (Thr161) και η συνολική cdc2 έχουν εξακριβωθεί με ανάλυση Western blot.

Η

Η επεξεργασία των κυττάρων με αναστολείς μικροσωληνίσκων αποτελέσματα στην ενεργοποίηση του οδοφράγματος συναρμολόγησης μιτωτικής ατράκτου (SAC), που οδηγεί σε μιτωτική σύλληψη πριν ανάφαση [33]. Εκτός αυτού, η ενεργοποίηση του SAC αναστέλλει επίσης την ανάφαση προαγωγής σύμπλοκο /κυκλόσωμα (APC /C), που οδηγεί στη σταθεροποίηση της securin και κυκλίνης B1 [34]. Για να διαλευκανθεί αν BPR0L075 ενεργοποιημένα SAC, κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε αγωγή με BPR0L075 και τα επίπεδα έκφρασης του SAC σχετίζονται δείκτες μιτωτική όπως φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10), κυκλίνη Β1, και φωσφο-cdc2 (Thr161) εξετάστηκαν. Αυτές οι μιτωτικές δείκτες προκλήθηκαν σε τόσο securin-αγρίου τύπου και -null κύτταρα HCT116 (Σχ. 3Β). Ωστόσο, η έκταση της ενεργοποίησης SAC ήταν χαμηλότερη σε securin-null κύτταρα (Σχ. 3Β). Επιπλέον, η έκφραση φωσφο-securin προκλήθηκε με περισσότερο από 10 ηΜ BPR0L075 σε κύτταρα HCT116 άγριου τύπου (σχ. 3Β), η οποία συσχετίζεται με την αύξηση του G

2 /M σύλληψης (Εικ. 2Α). Securin είναι εμπλουτισμένο σε G2 /M φάση και αποικοδομείται μετά μιτωτική έξοδο [35]. Σταθερά, η securin έκφραση μειώθηκε κατά 10 ηΜ BPR0L075, στην οποία /δεν συνέβη G2 Μ σύλληψης (Εικ. 2Α και 3Β). Ως εκ τούτου, BPR0L075 προκαλούμενη βλάβη του DNA και SAC, η οποία μπορεί να ενισχυθεί με την παρουσία του securin σε κύτταρα HCT116.

BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση securin και επηρεάζεται η σταθερότητα της μιτωτικής ρυθμιστικών μορίων σε κύτταρα HCT116

σημειώθηκε ότι securin έτεινε να είναι σημαντικά band-μετατοπίστηκε μετά την επεξεργασία BPR0L075 σε κύτταρα HCT116 (Σχ. 3Β). Για να διερευνηθεί κατά πόσον η ζώνη μετατόπισης του securin ήταν αποτέλεσμα της φωσφορυλίωσης της, BPR0L075 επεξεργασμένα εκχυλίσματα πρωτεΐνης επωάζονται με αλκαλική φωσφατάση (ΑΡ) και στη συνέχεια αναλύθηκαν με western blot. Το μετατόπισης ζώνης του securin μειώθηκε κατά ΑΡ (Σχ. 4Α), γεγονός που υποδηλώνει ότι BPR0L075 επαγόμενη securin φωσφορυλίωση. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω αυτό το φαινόμενο, αρκετά φάρμακα κατά των μικροσωληνίσκων, συμπεριλαμβανομένου κολχικίνη, πακλιταξέλη, και βινβλαστίνη, χρησιμοποιήθηκαν για να επάγουν μιτωτική σύλληψη. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Β, η θεραπεία με αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακα οδήγησε επίσης σε μετατόπισης ζώνης του securin. Περιέργως, ένα ενδιάμεσο ταινία που μεταναστεύει (όπως υποδεικνύεται από αστερίσκο) του securin παρατηρήθηκε σε BPR0L075 επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 4Β). Δεδομένου ότι έξι θέσεις φωσφορυλίωσης για securin έχουν εντοπιστεί [36], η ζώνη αυτή μπορεί να αποτελέσει μια παροδική υποφωσφορυλιωμένη μορφή securin. Πράγματι, ένας

in vitro

securin δοκιμασία φωσφορυλίωσης δείχνει δύο βραδύτερη ζώνες μετανάστευση φωσφορυλιωμένου securin [37].

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 20 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. Κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε δοκιμασία αλκαλικής φωσφατάσης και τα επίπεδα των securin προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western. (Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 έως 80 ηΜ BPR0L075, κολχικίνη, πακλιταξέλη και βινμπλαστίνη για 24 ώρες. (Γ και Δ) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς MG132 /κυκλοεξιμιδίου για 2 έως 24 ώρες μετά από 24 ώρες θεραπείας BPR0L075. Τα κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για κυκλίνη Β1, φωσφο-H3 (Ser10) και securin.

Η

Η σταθερότητα του securin εξαρτάται από την κατάσταση φωσφορυλίωσης του. Υπερφωσφορυλιωμένη μορφές καταστρέφονται ταχύτατα μέσω του συμπλέγματος /F-box πρωτεΐνης Skp1 /Cul1 (ΕΕΤ) Ε3 λιγκάσης της ουμπικουϊτίνης [38]. Για να εξεταστεί κατά πόσον BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση securin επηρεάζεται η σταθερότητα της πρωτεΐνης του, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20 ηΜ BPR0L075 για 12 ώρες και στη συνέχεια ανακτάται σε μέσο που περιέχει είτε το MG132 αναστολέα πρωτεασώματος ή την κυκλοεξιμίδιο αναστολέα πρωτεϊνικής σύνθεσης (CHX) για 2-24 ώρες. Διαπιστώθηκε ότι, μετά BPR0L075 απόσυρσης, η φωσφορυλιωμένη μορφή securin αποικοδομήθηκε γρήγορα, και η προσθήκη του MG132 μπλοκαριστεί αποδόμησης του (Εικ. 4C). Σε αντίθεση, η υποφωσφορυλιωμένη μορφή securin αυξήθηκε κατά τη διάρκεια της ανάκτησης των κυττάρων, η οποία θα μπορούσε να μπλοκαριστεί από κατεργασία CHX (Εικ. 4D), υποδεικνύοντας ότι securin εκ νέου συντίθεται μετά την ανάκτηση από BPR0L075. Ο ρυθμός αποδόμησης του securin ήταν παρόμοια με εκείνη των άλλων μιτωτικών ρυθμιστικών μορίων συμπεριλαμβανομένων κυκλίνης Β1 και φωσφο-ιστόνης Η3 σε κύτταρα HCT116 άγριου τύπου (σχ. 4C και 4D). Είναι ενδιαφέρον ότι η συσσώρευση του φωσφο-ιστόνης Η3 ήταν υψηλότερη σε MG132-αγωγή securin-null κύτταρα (Σχ. 4C), και οι μειώσεις της κυκλίνης Β1 και φωσφο-ιστόνης Η3 ήταν χαμηλότερες σε CHX-αγωγή securin-null κύτταρα (Σχ. 4D ). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θεραπεία BPR0L075 που προκαλείται από την αστάθεια της μιτωτικής ρυθμιστικών μορίων παρουσία securin.

BPR0L075 προκαλείται από μιτωτική καταστροφή στα κύτταρα HCT116

Η μιτωτική καταστροφή είναι μια μορφή κυτταρικού θανάτου κατά τη διάρκεια ή μετά την ανώμαλη μίτωση [8]. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση της securin, η οποία μπορεί να αποσταθεροποιήσει μιτωτική ρυθμιστικών μορίων και, κατά συνέπεια, την προώθηση μιτωτική καταστροφή στα κύτταρα HCT116. Για την αντιμετώπιση αυτής της δυνατότητας, securin-αγρίου τύπου και -null κύτταρα HCT116 σε επεξεργασία με 20 ηΜ BPR0L075 για 12 ώρες ανακτήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας για 12-96 ώρες, και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης στη συνέχεια αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, μετά BPR0L075 την αφαίρεση, το G

2 /Μ κλάσμα μειώθηκε και εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου επαναλήφθηκε σε securin-αγρίου τύπου και -null HCT116 κύτταρα (Σχ. 5Α). Ωστόσο, οι μειώσεις της G

2 /Μ κλάσματος σε κύτταρα securin-άγριου τύπου ήταν πιο σημαντική από ό, τι εκείνα των securin-null κυττάρων, η οποία αντικατοπτρίζεται από τις αυξήσεις των G

0 /G

κύτταρα 1 και S φάση σε κύτταρα άγριου τύπου (Εικ. 5Α). Επιπλέον, οι αυξήσεις στην υπο-G

1 κλάσμα ήταν επίσης υψηλότερη σε κύτταρα securin-άγριου-τύπου (Εικ. 5Α), υποδηλώνοντας ότι η έκφραση securin προωθούνται μιτωτική καταστροφή στα κύτταρα HCT116. Επιπλέον, η κυτταρική απόπτωση μετά BPR0L075 απόσυρση αναλύθηκε με αννεξίνη V /διπλή χρώση ΡΙ. Σταθερά, περισσότερο κυτταρικής απόπτωσης σε κύτταρα securin-άγριου τύπου προκλήθηκε μετά την ανάκτηση των κυττάρων για 24 ώρες (Εικ. 5Β και 5C).

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 20 ηΜ BPR0L075 για 12 ώρες και BPR0L075 απόσυρση για 12 έως 96 ώρες. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Β και C) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με BPR0L075 για 24 ώρες και BPR0L075 απόσυρση ή καμία αναστολή για 24 ώρες. Το ποσοστό των νεκρών κυττάρων (Αννεξίνη θετικές και αννεξίνη /ΡΙ διπλό θετικό) προσδιορίστηκαν με Annexin-V χρώση /ΡΙ. ρ & lt? 0,01 (**) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ BPR0L075-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων. p & lt? 0,01 (##) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ securin-άγριου τύπου και -null κύτταρα HCT116

Η

BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση της securin, G

2 /M σύλληψη και κυτταροτοξικότητα μέσω ενός. cdc2 (CDK1) εξαρτώμενο μονοπάτι

Securin φωσφορυλιώνεται από cdc2 (CDK1) [39]. Για να διερευνηθεί αν σηματοδότηση cdc2 είναι υπεύθυνη για την BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση της securin, παρακολουθήθηκαν τα αποτελέσματα της cdc2, CDK και ειδικοί αναστολείς cdc25 (alsterpaullone, purvalanol ή NSC 663284, αντιστοίχως) επί BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση της securin. Η φωσφορυλίωση του securin μερικώς μειώθηκε κατά αναστολείς cdc2 /CDK (Σχ. 6Α). Επιπλέον, δείξαμε επίσης ότι η αναστολή της cdc2 ή CDK μειωμένη BPR0L075 επαγόμενη G

2 /M σύλληψη και την κυτταροτοξικότητα σε κύτταρα HCT116 securin-άγριου-τύπου (Εικ. 6Β και 6C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι σε απάντηση στη θεραπεία BPR0L075, cdc2 φωσφορυλιωμένη securin, οδηγώντας σε υψηλότερες G

2 /M σύλληψη και διευκολύνοντας έτσι την κυτταροτοξικότητα της BPR0L075 στα κύτταρα HCT116.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με NSC663284, alsterpaullone και purvalanol για 2 ώρες πριν από την έκθεση σε 20 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. (Α) Τα επίπεδα του securin, φωσφο-cdc2 (Thr161), φωσφο-H3 (Ser10) και η συνολική cdc2 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (Β) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής. (Γ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. p & lt? 0.01 (**) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ alsterpaullone (0,5 μΜ), Purvalanol (0,5 μΜ) και BPR075 (20 nM) μόνο σε σύγκριση με τον έλεγχο. p & lt? 0,01 (##) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ BPR0L075 μόνο και προ-θεραπεία με alsterpaullone και purvalanol

Η

BPR0L075-κυτταρικό θάνατο που επάγεται μέσω της ενεργοποίησης της JNK και μονοπάτια ΜΑΡΚ p38 και caspase-. ανεξάρτητος μηχανισμός σε HCT116 κύτταρα

σε απάντηση σε εξωτερικές πιέσεις ή ζημιές, τα κύτταρα ενεργοποιούν συνήθως τα μονοπάτια ΙΝΚ ή ρ38 ΜΑΡΚ, που οδηγεί σε κυτταρικό θάνατο [40], ή η οδός ΕΚΚ για την επιβίωση [41]. Έχει αναφερθεί ότι η ενεργοποίηση της ρ38 ΜΑΡΚ ή αναστολή της ERK εμπλέκεται στην απόπτωση που επάγεται από το αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακο νοκοδαζόλη μόνη ή συνδυασμό με paclitaxel [42], [43]. Για την αντιμετώπιση του ρόλου της ΜΑΡΚ σε BPR0L075 κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κύτταρα HCT116 securin-άγριου τύπου, οι ενεργοποιήσεις των p38 ΜΑΡΚ, JNK και ERK αναλύθηκαν με western blot. Η ΜΑΡΚ ρ38, JNK και ERK οδοί ενεργοποιούνται από BPR0L075 (Σχ. 7Α). Ειδικοί αναστολείς του ρ38 ΜΑΡΚ, JNK και ERK (SB2021900, SP600125 και U0126, αντίστοιχα) μπλοκάρει την BPR0L075 επαγόμενη ενεργοποίηση (Σχ. 7Β και 7C). Ωστόσο, η αναστολή της ΜΑΡΚ p38, JNK και ERK μονοπάτια δεν επηρέασε BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση του securin (Σχ. 7Β και 7C). Επιπλέον, μόνο SP600125 ανέστειλε BPR0L075 επαγόμενη φωσφο-ιστόνης Η3 (Εικ. 7Β).

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με 0 έως 80 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. Τα επίπεδα φωσφο-ρ38, -JNK1 /2, και -ERK1 /2, και το συνολικό ρ38, JNK1 /2 και ERK1 /2 προσδιορίσθηκαν με στύπωση Western. (Β και C) Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με SB202190, SP600125 και U0126 για 2 ώρες πριν από την έκθεση σε 20 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. Τα επίπεδα φωσφο-ρ38, -JNK1 /2, -ERK1 /2, -cdc2 (Thr161), και -H3 (Ser10), και το σύνολο των ρ38, JNK1 /2, ERK1 /2 και cdc2 αναλύθηκαν με κηλίδα Western. (Δ) Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ. (Ε και F) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με z-VAD-fmk για 2 ώρες, στη συνέχεια εκτέθηκαν σε 20 ηΜ BPR0L075 για 24 ώρες. Τα επίπεδα φωσφο-ρ38, -ERK1 /2, και -H3 (Ser10), και το σύνολο των p38, ERK1 /2 και securin αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. ρ & lt? 0,01 (**) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ BPR0L075-επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων. p & lt? 0,01 (##) δείχνει μια σημαντική διαφορά μεταξύ BPR0L075 μόνο και προ-θεραπεία με SB202190 και SP600125

Η

αναλυθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα των αναστολέων ΜΑΡΚ για BPR0L075 επαγόμενη κυτταροτοξικότητα με τη δοκιμασία ΜΤΤ.. Η θεραπεία με SB202190, SP600125 ή U0126 μόνη της δεν επηρέασε την επιβίωση των κυττάρων σε κύτταρα HCT116 (Εικ. 7d). Επιπλέον, SB202190 και SP600125 ήταν σε θέση να διασώσουν τα κύτταρα από BPR0L075 επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Σχ. 7D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι οι ενεργοποίηση του ΜΑΡΚ ρ38 και ΙΝΚ πορείες που απαιτούνται για BPR0L075 κυτταρικό θάνατο που επάγεται σε κύτταρα HCT116. Για να διερευνηθεί περαιτέρω αν η ενεργοποίηση της κασπάσης εμπλέκεται σε BPR0L075-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο, η κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων σε προεπεξεργασία με τηγάνι αναστολέα κασπάσης, Ζ-VAD-fmk, σε συνδυασμό με θεραπεία BPR0L075 αναλύθηκε με ανάλυση ΜΤΤ. Βρήκαμε ότι η αναστολή της κασπάσης δεν επηρέασε την βιωσιμότητα των κυττάρων μετά την κατεργασία BPR0L075 (Εικ. 7Ε). Επιπλέον, BPR0L075 επαγόμενη ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ p38 και μονοπάτια ERK, καθώς και η φωσφορυλίωση της ιστόνης securin και Η3, δεν επηρεάστηκαν. Τα αποτελέσματα αυτά υποδηλώνουν ότι BPR0L075 κυτταρικό θάνατο που επάγεται μέσω ενός κασπάσης-ανεξάρτητο μονοπάτι σε κύτταρα HCT116.

Συζήτηση

Securin, ένα ογκογονίδιο, υπερεκφράζεται σε διάφορους καρκινικά κύτταρα και είναι υπεύθυνη για την προώθηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και ογκογένεση [24], [25]. Προηγουμένως, έχει αναφερθεί ότι τα επίπεδα securin ρυθμίζονται προς τα κάτω σε HCT116 κυτταρικό θάνατο που επάγεται από χημειοθεραπευτικά φάρμακα [26], [44], υποδηλώνοντας ότι θα μπορούσε να είναι ένας στόχος για θεραπεία του καρκίνου. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι η κυτταροτοξικότητα του αντι-μικροσωληνίσκων BPR0L075 φάρμακο συσχετίστηκε θετικά με τα επίπεδα έκφρασης του securin σε διάφορα καρκινικά κύτταρα. Securin φωσφορυλιώθηκε με επεξεργασία με BPR0L075 καθώς και άλλα αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακα συμπεριλαμβανομένων κολχικίνες, πακλιταξέλη, και βινμπλαστίνη, σε κύτταρα HCT116. Η συσσώρευση φωσφορυλιωμένων securin συνοδευόταν από υψηλότερη G2 /M σύλληψη και κυτταροτοξικότητα. Η φωσφορυλίωση της securin οδηγεί σε περαιτέρω αποσταθεροποίηση της και στη συνέχεια προωθεί την μιτωτική έξοδο και μιτωτική καταστροφή των κυττάρων HCT116. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι securin είναι ένας σημαντικός στόχος για τις αντικαρκινικές δράσεις της BPR0L075 σε ανθρώπινα ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα.

Η μιτωτική καταστροφή θα μπορούσε να προκληθεί από φάρμακα που στοχεύουν μικροσωληνίσκους ή να επηρεάσει την εξέλιξη της μίτωσης [8], [9 ]. Πολλοί διαφορετική μοίρα των κυττάρων θα μπορούσε να προκληθεί από μιτωτική καταστροφή. Κατ ‘αρχάς, τα κύτταρα μπορεί να πεθάνουν χωρίς μιτωτική έξοδο. Δεύτερον, μετά μιτωτική έξοδο και την επίτευξη της G1 φάσης, κύτταρα υφίστανται κυτταρικό θάνατο ή γήρανση [12]. Έχει αναφερθεί ότι η docetaxel, έναν παράγοντα σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων, επάγει κυτταρικό θάνατο μέσω μιτωτικής καταστροφή σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού [14]. Επιπλέον, ένας άλλος παράγοντας σταθεροποίησης μικροσωληνίσκων, κομπρεταστατίνη Α4-προφάρμακο (CA4P), προκαλεί μιτωτική καταστροφή μετά μιτωτική σύλληψη στη χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία κύτταρα [13]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι BPR0L075 που προκαλείται πιο εκτεταμένη θάνατο των κυττάρων μετά την απόσυρση του φαρμάκου στα κύτταρα HCT116 securin-άγριου τύπου σε σχέση με securin-null κύτταρα. Επιπλέον, πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι η παρατεταμένη μιτωτική σύλληψη που επάγεται από αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακα θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε περισσότερο κυτταρικό θάνατο [45]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η θεραπεία BPR0L075 για 12 έως 24 ώρες επάγεται περισσότερο κυτταρικό θάνατο μετά την απόσυρση BPR0L075 σε σύγκριση με τη θεραπεία για 4 ή 8 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι BPR0L075 που προκαλείται μιτωτική καταστροφή μέσω της επαγωγής της παρατεταμένης μιτωτική σύλληψη στο ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Θεραπεία

Νοκοδαζόλη προκαλεί μιτωτική σύλληψη και φωσφορυλίωση των securin σε HCT116 και τα κύτταρα U2OS [46]. Σταθερά, σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε ότι BPR0L075 και άλλα αντι-μικροσωληνίσκων φάρμακα προκαλούμενη securin φωσφορυλίωση σε κύτταρα HCT116. Έχει αναφερθεί ότι securin φωσφορυλιώνεται από cdc2 (cdk1) [39]. ΜΑΡΚ κινάσης προκαλεί επίσης securin φωσφορυλίωση και ρυθμίζει μετενεργοποίησης λειτουργία του [47]. Σε απόκριση σε βλάβη του DNA, securin φωσφορυλιώνεται από ΟΝΑ-ΡΚ (DNA-εξαρτώμενη πρωτεϊνική κινάση), η οποία συμβάλλει στην παρεμπόδιση της αδελφής χρωματίνης διαχωρισμού [17], [48]. Όπως φαίνεται από τα αποτελέσματα μας, BPR0L075 επαγόμενη φωσφορυλίωση της securin ανεστάλη εν μέρει μόνο από cdc2 /ειδικός αναστολέας CDK. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι BPR0L075 που προκαλείται securin φωσφορυλίωση εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης cdc2. Ως εκ τούτου, μπορεί να υπάρχουν και άλλες κινάσες οι οποίες επάγουν τη φωσφορυλίωση της securin. Ωστόσο, BPR0L075 που προκαλείται από την ενεργοποίηση της ΜΑΡΚ κινασών δεν συμμετείχε στην φωσφορυλίωση της securin. Ως εκ τούτου, προτείνουμε ότι BPR0L075 επάγει κυτταρικό θάνατο μέσω της ΜΑΡΚ p38 και μονοπάτια ΙΝΚ, η οποία είναι ανεξάρτητη της φωσφορυλίωσης του securin.

Securin έχει αναφερθεί να αλληλεπιδρά με την πρωτεΐνη επιδιόρθωσης του DNA Κυ70. Όταν τα κύτταρα υποστούν βλάβες στο DNA, DNA-PK φωσφορυλιώνει securin να προκαλέσει διακοπή του κυτταρικού κύκλου. Στη συνέχεια, η αλληλεπίδραση της securin και Κυ70 καταστέλλεται, απελευθερώνοντας έτσι Κιι70 να προωθήσει την επιδιόρθωση του DNA [17], [48]. Σε αντίθεση, securin υπερέκφραση μπορεί να καθυστερήσει την εξέλιξη της μίτωσης και διαχωρισμό χρωματίδων αδελφή διάρκεια βλάβης του DNA μέσω της αναστολής της Κιι70 [48]. Στη μελέτη μας, BPR0L075 προκαλούμενη υψηλότερη G

2 /M σύλληψης σε κύτταρα HCT116 securin-άγριου τύπου σε σχέση με securin-null κύτταρα, γεγονός που υποδηλώνει ότι μια μεγαλύτερη ικανότητα επισκευής και αυξημένη ενεργοποίηση σημείου ελέγχου προκλήθηκαν με την παρουσία του securin, η οποία μπορεί να αποτέλεσμα από την φωσφορυλίωση και αποσταθεροποίηση της securin με BPR0L075.

Έκφραση securin έχει βρεθεί σε διάφορους καρκίνους να συσχετίζεται με φτωχή κλινική έκβαση [49], [50]. Σε αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι BPR0L075 που προκαλείται από βλάβες στο DNA και διαμορφώνεται μιτωτική ρυθμιστικά μόρια για την ενεργοποίηση του άξονα σημείο ελέγχου συναρμολόγησης σε κύτταρα HCT116. Μετά BPR0L075 απόσυρση, τα κύτταρα του G

2 /M κλάσμα υποβλήθηκε σε μιτωτική καταστροφή, η οποία ενισχύεται από φωσφορυλίωση και αποσταθεροποίηση του securin. Επιπλέον, BPR0L075 προκάλεσε κυτταρικό θάνατο μέσω ενός κασπάσης-ανεξάρτητου μηχανισμού και την ενεργοποίηση των JNK και ρ38 μονοπατιών ΜΑΡΚ (Εικ. 8). Αυτά τα ευρήματα που παρέχονται αποδείξεις για πρώτη φορά ότι θεραπεία BPR0L075 είναι ευεργετική για τη θεραπεία ανθρώπινων ορθοκολικών όγκων με υψηλότερα επίπεδα securin. Όπως BPR0L075 εγκρίθηκε από το FDA των ΗΠΑ για τη φάση 1 κλινική δοκιμή σε 2010, τα επίπεδα έκφρασης του securin θα μπορούσε να είναι ένας παράγοντας πρόβλεψης για την απόφαση της προτεραιότητας αντικαρκινική θεραπεία χρησιμοποιώντας BPR0L075 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν επίσης ότι η στόχευση securin μπορεί να είναι μια κατάλληλη στρατηγική για να διευρύνουν την κλινική χρήση της BPR0L075 για διάφορους καρκίνους που υπερεκφράζουν securin.

BPR0L075 προκαλείται από βλάβες του DNA, οδηγώντας σε ενεργοποίηση Chk1 /Chk2, αναστολή της δραστηριότητας Cdk1 και G2 σύλληψη . Είναι διαμορφωμένο επίσης Cdk1-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση των μιτωτικών ρυθμιστικών μορίων για την ενεργοποίηση του οδοφράγματος συγκρότημα ατράκτου, η οποία εξασθενημένη παρουσία securin. Μετά BPR0L075 απόσυρση, τα κύτταρα του G

2 /M κλάσμα υποβλήθηκε σε μιτωτική καταστροφή, η οποία ενισχύεται από φωσφορυλίωση και αποσταθεροποίηση του securin. Επιπλέον, BPR0L075 προκάλεσε κυτταρικό θάνατο μέσω μιας κασπάσης-ανεξάρτητου μηχανισμού και την ενεργοποίηση της JNK και της p38 ΜΑΡΚ μονοπάτια.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Η ένωση BPR0L075 ήταν συντίθενται στο Τμήμα Βιοτεχνολογίας και Φαρμακευτικής Έρευνας, Εθνικό Σύστημα Υγείας Ερευνητικά Ινστιτούτα, Zhuman, Ταϊβάν, ROC. BPR0L075, ένα λευκό στερεό, ελήφθη σε μία απόδοση 72% από 6-μεθοξυϊνδόλιο και 3,4,5-τριμεθοξυβενζοϋλο χλωρίδιο και διαλύθηκε σε διμεθυλοσουλφοξείδιο. Ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ? Ρ4170), 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) 2,5- βρωμιούχο διφαινυλτετραζόλιο (ΜΤΤ? M5655), colchicines (C9754) και purvalanol (P4484) αγοράστηκαν από την Sigma Chemical Co. Αντισώματα ειδικά να ERK (C14), ρ38α (C-20) και JNK (C-17) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology. Αντι-φωσφο-ιστόνης H2A.X (Ser139) (# 05-636) και φωσφο-ιστόνης Η3 (Ser10) (# 05-806) αντισώματα αγοράστηκαν από Upstate. Anti-securin (ab-3305) αντίσωμα αγοράστηκε από Abcam. Anti-cdc2 (Ab-1) αντίσωμα αγοράστηκε από Oncogene Sciences Προϊόντα. Αντι-ακτίνης αντισώματος (MAB1501) αγοράστηκε από την Chemicon International. Φωσφο-cdc2 (Thr161) (# 9114) φωσφογλυκόζης Chk1 (Ser345) (# 2341), φωσφο-Chk2 (Thr68) (# 2661) φωσφογλυκόζης SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185) (# 9251), φωσφο- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204) (# 9106), φωσφο-ρ38 ΜΑΡ κινάση (Thr180 /Tyr182) (# 9211), Chk1 (# 2345), και Chk2 (# 2662) αντισωμάτων αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology. Η κυκλίνη Β1 (Ab-2) και ρ21 (Ab-1) αντισώματα, NSC663284 (# 217692), alsterpaullone (# 12