Abstract

καρκίνος του παχέος εντέρου είναι η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο που σχετίζονται με την world– την κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο του παχέος εντέρου είναι ηπατικές μεταστάσεις, οι οποίες μπορούν να θεραπευτούν με απομονωμένο ηπατική αιμάτωση (IHP) . Ψάχνοντας για τις πιο κλινικά σχετικές προσεγγίσεις για την αγωγή του παχέος μεταστατική νόσο με απομονωμένες ηπατική αιμάτωση (IHP), αναπτύξαμε την εφαρμογή της οξαλιπλατίνης ταυτόχρονα με υπερθερμία και εξανθρωπισμένα υποδοχέα θανάτου 4 (DR4) mapatumumab αντίσωμα (Χάρτης), και διερευνήθηκαν των μοριακών μηχανισμών του αυτό θεραπεία πολυτροπικότητα σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές CX-1 και HCT116 καθώς και του ανθρώπινου καρκίνου του κόλου βλαστικών κυττάρων TU-12, TU-21 και TU-22. Δείξαμε εδώ, σε αυτή τη μελέτη, ότι η συνεργιστική δράση της πολυτροπικότητας θεραπεία απόπτωση εξηρτάτο και ενεργοποιημένη κασπάση σηματοδότησης θανάτου μέσω τόσο της εξωγενούς αποπτωτικό μονοπάτι και ενδογενούς οδού. σηματοδότηση θανάτου ενεργοποιήθηκε από το c-Jun Ν-τερματικής κινάσης (JNK) σηματοδότησης, που οδήγησε σε φωσφορυλίωση της Bcl-xL σε σερίνη 62, μειώνοντας την αντι-αποπτωτική δραστηριότητα της Bcl-XL, το οποίο συνέβαλε στην ενδογενή οδό. Η προς τα κάτω ρύθμιση της κυτταρικής FLICE ανασταλτικής πρωτεΐνης μακριά ισομορφή (c-FLIP

L) στην εξωγενή οδό επιτεύχθηκε μέσω ουβικουϊτινίωσης στο υπόλειμμα λυσίνης (Κ) 195 και αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Η υπερέκφραση του c-FLIP

L μεταλλαγμένο (K195R) και Bcl-xL μετάλλαγμα (S62A) κατήργησε εντελώς την συνεργική δράση. Η επιτυχής έκβαση αυτής της μελέτης υποστηρίζει την εφαρμογή της στρατηγικής της πολυτροπικότητας σε ασθενείς με ορθοκολικό ηπατικές μεταστάσεις που αποτυγχάνουν να ανταποκριθούν στις τυποποιημένες χημειοραδιοθεραπεία που στοχεύει κυρίως το μιτοχονδριακό αποπτωτικό μονοπάτι

Παράθεση:. Song Χ, Kim SY, Lee YJ ( 2013) Αποδεικτικά στοιχεία για δύο τρόπων Synergistic επαγωγή της απόπτωσης από Mapatumumab και οξαλιπλατίνη σε Συνδυασμό με Υπερθερμία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (8): e73654. doi: 10.1371 /journal.pone.0073654

Επεξεργαστής: Raffaele Μια Calogero, Πανεπιστήμιο του Τορίνο, Ιταλία

Ελήφθη: May 31, 2013? Αποδεκτές: 30 Ιουλ 2013? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το ακόλουθο κείμενο επιχορήγησης: NCI ταμείο επιχορήγησης (CA140554). Το έργο αυτό χρησιμοποίησε το Μηχανισμό UPCI Core και υποστηρίχθηκε εν μέρει από το βραβείο P30CA047904. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνος του παχέος εντέρου, η οποία προκαλεί περίπου το 10% των θανάτων από καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες, είναι η τρίτη κύρια αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στον κόσμο? θάνατος συνήθως προκύπτει από την ανεξέλεγκτη μεταστατική νόσο. Δυστυχώς, μόνο το 10-15% της αρχικής του παχέος ηπατικές μεταστάσεις θεωρούνται χειρουργήσιμη [1,2]. Οι ανεγχείρητο περιπτώσεις της νόσου του ήπατος μεταστατικού μπορεί να αντιμετωπιστεί με την απομονωμένη ηπατική αιμάτωση (IHP), η οποία περιλαμβάνει μια μέθοδο της πλήρους αγγειακά απομόνωση του ήπατος για να καταστεί δυνατή η θεραπεία της πολυτροπικότητας των όγκων του ήπατος [3-6].

Mapatumumab (Χάρτης) είναι ένα πλήρως ανθρώπινο IgG1 αγωνιστικού μονοκλωνικό αντίσωμα το οποίο στοχεύει αποκλειστικά και ενεργοποιεί τον υποδοχέα θανάτου 4 (DR4) με υψηλή εξειδίκευση και συγγένεια [7-9]. Εν συντομία, Χάρτης δεσμεύεται με την κυτταρική επιφάνεια των DR4 και ενεργοποιεί την εξωγενή αποπτωτικό μονοπάτι, κυρίως μέσω της ενεργοποίησης του προ-αποπτωτικών εκκινητή κασπάσης-8. Ωστόσο, μελέτες φάσης ΙΙ έδειξαν μικρή ή καθόλου κλινική δράση της μονοθεραπείας Χάρτης σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του παχέος εντέρου πυρίμαχο ή μη-μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα [10,11]. Αρκετά δυνατό μοριακοί μηχανισμοί έχουν προταθεί συμπεριλαμβανομένων μετάλλαξη /ελαττώματα υποδοχείς θανάτου, το συγκρότημα σηματοδότησης που επάγει θάνατο, capsases, προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών ή υπερέκφραση των αντι-αποπτωτικών μορίων [12-14]. Έτσι, υπάρχει μια συνεχιζόμενη και σημαντική ανάγκη για την ανάπτυξη που εφαρμόζονται στρατηγικές για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα Χάρτης του.

υπερθερμία, μια θεραπεία που χρησιμοποιείται συχνά με απομονωμένο ηπατική αιμάτωση (IHP), μεγιστοποιεί ζημιά όγκου, διατηρώντας ταυτόχρονα τον περιβάλλοντα φυσιολογικό ιστό [5, 6,15]. Η οξαλιπλατίνη, ένα κοινά χρησιμοποιούμενο χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, πιστεύεται ότι προκαλεί κυτταρικό θάνατο κυρίως δια της επαγωγής πλατίνα-DNA προϊόντος προσθήκης [3,16-18]. Έχουμε προηγουμένως αναπτύξει μια θεραπεία πολυτροπικότητα χρησιμοποιώντας οξαλιπλατίνη προκατεργασίας σε συνδυασμό με Χάρτης και υπερθερμία για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου του ανθρώπου [19]. Ωστόσο, IHP παρέχοντας υψηλές δόσεις χημειοθεραπείας ή θεραπείας με βιολογικό απαιτεί περιφερειακό τυποποιημένη τεχνική λειτουργική, συνεχή διεγχειρητική παρακολούθηση διαρροών, και ένα εξωτερικό κύκλωμα φλεβο-φλεβική παράκαμψη [20]. Έτσι οξαλιπλατίνη προεπεξεργασία δεν είναι εφικτό στο πλαίσιο της διαδικασίας της IHP στις κλινικές, και όλα τα στοιχεία της διαδικασίας πολυτροπικότητας πρέπει να εκτελούνται ταυτόχρονα.

Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε το θεραπευτικό δυναμικό της κλινικά σχετικές πρόγραμμα θεραπείας της πολυτροπικότητας οξαλιπλατίνη και υπερθερμία σε συνδυασμό με Χάρτης για ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές του κόλου και καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα. Αναφέρουμε εδώ ότι η θεραπεία πολυτροπικότητα μπορεί να ευαισθητοποιήσει ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου προς Χάρτης απόπτωση που επάγεται με πολλαπλούς μοριακούς μηχανισμούς δράσης μέσω τόσο της εγγενούς αποπτωτικό μονοπάτι και την εξωγενή οδό.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές καλλιέργειες

Ανθρώπινο καρκίνωμα παχέος κύτταρα CX-1, που ελήφθησαν από τον Dr. JM Jessup (National Institutes of Health) [21], καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco BRL) που περιέχει εμβρυϊκό βόειο 10% ορού (HyClone). Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές HCT116 ορθοκολικό καρκίνωμα ευγενώς από τον Dr. Β Vogelstein (Johns Hopkins University) καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy 5Α (Gibco-BRL) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου [22]. Ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου, TU-22, TU-12 και TU-21 [23], καθορίστηκαν από τον Dr. Ε Lagasse (Πανεπιστήμιο του Pittsburgh) και καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 μέσο (Gibco BRL) που περιέχει βόεια εμβρυϊκό 0,5% ορού (HyClone) και 1% ινσουλίνη, τρανσφερρίνη, σελήνιο και (ITS, Fisher Scientific). Όλα τα κύτταρα διατηρούνται σε 37 ° C υγροποιημένο επωαστή με 5% CO

2

οξαλιπλατίνη, MG132, κυκλοεξιμίδιο (CHX) και αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ ελήφθησαν.

Αντιδραστήρια και αντισώματα

από την Sigma Chemical Co. Mapatumumab (Χάρτης) ήταν από Human Genome Sciences (Rockville, MD, USA). αναστολέα JNK (SP6001125) και G418 ήταν από την Calbiochem. Anti-Flag, αντι-κασπάση 8, αντι-κασπάση 9, αντι-κασπάση 3, αντι-ουβικιτίνης, αντι-PARP, αντι-φωσφορυλιωμένες ΙΝΚ /JNK και αντι-Bcl-xL αντίσωμα ήταν από τη Cell Signaling. Anti-π-Bcl-xL (S62) αντίσωμα ήταν από την Chemicon /Millipore. αντίσωμα αντι-FLIP (NF6) ήταν από την Enzo Επιστημών Ζωής. Αντι-ακτίνης αντίσωμα ήταν από τη Santa Cruz.

Θεραπεία

Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42

° C) υπό την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη για 1 ώρα, και στη συνέχεια, επωάζονται στους 37

° C για 3 ώρες ή 23 ώρες. Για υπερθερμία, τα κύτταρα σφραγίστηκαν με παραφίλμ και τοποθετήθηκαν σε ένα λουτρό κυκλοφορούντος ύδατος (Thomas Scientific), η οποία διατηρήθηκε εντός 0,02

° C της επιθυμητής θερμοκρασίας.

Παροδική επιμόλυνση και σταθερή διαμόλυνση

Για παροδική επιμόλυνση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000 (Invitrogen), και υποβλήθηκαν σε αγωγή 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για σταθερή διαμόλυνση, τα κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά HA-Bcl-xL άγριου τύπου (WT) ή μεταλλαγμένης τύποι παρασκευάστηκαν με επιμόλυνση κυττάρων CX-1 με HA-Bcl-xL-WT, HA-Bcl-xL-S62A (Ser62Ala), και HA-Bcl-xL-S62D (Ser62Asp) και διατηρήθηκαν σε 500 μg /ml G418. CX-1-Bcl-xL κύτταρα S62A επιμολύνθηκαν με Plenti-Flag-FLIP

L και σταθεροί κλώνοι επιλέχθηκαν με blasticidin (10 μg /ml). Πισίνες από 3 κλώνους χρησιμοποιήθηκαν στο πείραμα.

MTS [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -5- (3-καρβοξυμεθοξυφαινυλ) -2- (4-σουλφοφαινυλο) -2Η- τετραζολίου, MTS] δοκιμασίες

μελέτες MTS πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του One Λύση Promega CellTiter 96 υδατικά κυττάρων Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (Promega). κύτταρα CX-1 αναπτύχθηκαν σε επικαλυμμένες τον πολιτισμό των πλακών 96-φρεατίων ιστού και επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Αποτελέσματα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με το διάλυμα μεθοθειϊκό /φαιναζίνης MTS για 1 ώρα στους 37 ° C. Η απορρόφηση στα 490 nm προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη ανοσορροφητική πλάκα προσδιορισμού συνδεδεμένου με ένζυμο.

δέσμευσης αννεξίνης V

Τα κύτταρα θερμάνθηκαν σε απουσία ή παρουσία Χάρτης και συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, πλύθηκαν με ελεύθερο ορού μέσο ελεύθερο, και αιωρούνται σε ρυθμιστικό δέσμευσης (αννεξίνης V-FITC Χρώση Kit, PharMingen). Αυτό το κυτταρικό εναιώρημα χρωματίστηκε με αντίσωμα και ΡΙ ποντικού αντι-ανθρώπινης αννεξίνης V και αναλύθηκαν αμέσως με κυτταρομετρία ροής.

Ποσοτική ανάστροφης μεταγραφής-αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-PCR) ανάλυση

Ολικό RNA εκχυλίζεται και καθαρίζεται από καλλιεργημένα κύτταρα με τη χρήση του RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το RNA ποσοτικοποιήθηκε με προσδιορισμό της απορρόφησης στα 260 nm. Δύο μ§ ολικού RNA από κάθε δείγμα μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας το υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Inc.) σε έναν όγκο 20 μΙ. Ποσοτική PCR (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας Applied Biosystems απογραφή ανιχνεύσεις TaqMan (20Χ Primer Probe mix) που αντιστοιχεί σε CASP8 και FADD-όπως ρυθμιστής απόπτωσης (CFLAR? Δοκιμασία ID Hs00153439_m1), και αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH? Δοκιμασία ID Hs02758991_g1 ). Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με 2 Χ TaqMan καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems) σε ένα Applied Biosystems StepOne Plus Real-Time PCR System σύμφωνα με πρότυπα πρωτόκολλα.

Ανοσοκαταβύθιση

Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν σε CHAPS ρυθμιστικού λύσης με κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Calbiochem). 0,5-1 mg του προϊόντος λύσης επωάστηκε με 1,5 μg αντι-Flag /ουβικιτίνης αντίσωμα ή IgG κουνελιού (Santa Cruz) στους 4

° C όλη τη νύκτα, ακολουθούμενο από την προσθήκη σφαιριδίων πρωτεΐνης Α-αγαρόζης (Santa Cruz) και περιστροφή σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες που ακολουθείται από ανάλυση ανοσοαποτύπωσης.

ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση

τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης Laemmli και έβρασε για 10 λεπτά. Η περιεκτικότητα σε πρωτείνη μετρήθηκε με Αντιδραστήριο BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA), διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης. Η μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μπλοκαρίστηκε με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε PBS-Tween-20 (0,1% ν /ν) για 1 ώρα και επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Υπεροξειδάση χράνου συζευγμένη αντι-κουνέλι ή αντι-ποντικού IgG χρησιμοποιήθηκε σαν το δευτερογενές αντίσωμα. Ανοσοδραστικών πρωτεϊνών οπτικοποιήθηκε με το πρωτόκολλο χημειοφωταύγειας (ECL, Amersham, Arlington Heights, IL, USA). Οι πυκνότητες των ζωνών αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Gel-Pro εφαρμογή από το Media Κυβερνητικής. Μερικές από τις κηλίδες Western στα ίδια πλαίσια δεν παρήχθησαν από τις ίδιες κηλίδες και απογυμνώθηκαν και ξαναϊχνηθετούνται με αντίσωμα αντι-ακτίνης για την ομαλοποίηση για τις διαφορές στο φορτίο πρωτεΐνης για να εξασφαλιστεί η ίση φόρτωση πρωτεϊνών.

[

35S ] μεθειονίνη ενσωμάτωση ανάλυση

τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο που περιέχει 4 μCi [

35S] -L-μεθειονίνη και εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42

° C) υπό την παρουσία /απουσία οξαλιπλατίνη (10 μg /ml) για 1 ώρα, και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37

° C για 3 ώρες. Τα κύτταρα διαλυτοποιούνται με 1 ml 0,25 Ν ΝαΟΗ και εντελώς λύθηκαν με σιφωνισμό ήπια. [

35S] μεθειονίνη ενσωμάτωση αναλύθηκε με Wallac 1409 Liquid Scintillation Counter (PerkinElmer, ΜΑ, USA). [

35S] -L-μεθειονίνη επίπεδα ενσωμάτωσης υπολογίστηκαν με ομαλοποίηση του [

35S] -L-μεθειονίνη κρούσεις ανά λεπτό, διορθωμένη για μη ειδική φόντο, με τα συνολικά επίπεδα της πρωτεΐνης.

Site- κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση

Lys 106 έως Arg (K106R) και K195R μεταλλάξεις του πλασμιδίου pCR3.V64-Met-Flag-FLIP

L, το οποίο ήταν ένα δώρο από τον Δρ Jurg Τσχοπ (Πανεπιστήμιο της Λωζάννης), εισήχθησαν στο c-FLIP γονίδιο

L χρησιμοποιώντας πλήρως συμπληρωματικά μεταλλαξογόνα εκκινητήρια μόρια (QuickChange τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση kit από Agilent Technologies). Οι ακόλουθες μεταλλαξογένεση ολιγονουκλεοτίδια χρησιμοποιήθηκαν: 5′-νόημα GAGATTGGTGAGGATTTGGATAGATCTG-ATGTGTCCTCATTAAT-3 ‘και 5′-αντινόημα ATTAATGAGGACACATCAGATCTAT-CCAAATCCTCACCAATCTC-3′ για K106R μεταλλαγμένο, αίσθηση 5’-CAAGCAGCAATCCA-AAAGAGTCTCAGGGATCCTTCAAAT-3 ‘και 5’-αντινόημα ATTTGAAGGATCCCTGAG-ACTCTTTTGGATTGCTGCTTG -3 ‘για K195R μεταλλαγμένα. Οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με ανάλυση αλληλουχίας.

Στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Graphpad Instat 3 λογισμικό (GraphPad Software). Δεδομένα που δείχνει συγκρίσεις μεταξύ δύο ομάδες αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία t του Student. Συγκρίσεις ανάμεσα σε περισσότερα από δύο ομάδες έγιναν χρησιμοποιώντας ANOVA με την κατάλληλη δοκιμασία post hoc. Η στατιστική σημαντικότητα είναι σημειωμένα με αστερίσκους (*, p & lt? 0,05 και **, p & lt? 0,01).

Αποτελέσματα

Η θεραπεία πολυτροπικότητα οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία ενεργοποιεί τόσο ενδογενείς και εξωγενείς πορείες στην ανθρώπινου παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα

σε αυτή τη μελέτη, προσπαθήσαμε να αναπτύξουν κλινικά σημαντική θεραπεία πολυτροπικότητα για τον ορθοκολικό μεταστατική νόσο η οποία μπορεί να αντιμετωπιστεί με IHP. Οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται περιλαμβάνουν: την ανθρώπινη παχέος μεταστατικό HCT116 καρκινώματος και CX-1 κύτταρα, και τα ανθρώπινα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου, Tu-12, Tu-21 και Tu-22, τα οποία ιδρύθηκαν από τον Δρ Ε Lagasse (Πανεπιστήμιο του Πίτσμπουργκ) από το ήπαρ των ασθενών με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου και καλλιεργήθηκαν εντός των διόδων 10-30 [23]. Καρκίνος βλαστικά κύτταρα (CSC) είναι σε θέση να αυτο-ανανέωση, είναι ογκογόνα, και είναι ικανά να παράγουν τα ετερογενή καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που περιλαμβάνουν τον όγκο. CSC δεν θα πρέπει να συνδέονται μόνο με την έναρξη και την ανάπτυξη του όγκου, αλλά είναι πιθανό να είναι υπεύθυνη για μετάσταση, καθώς [24,25]. Για να διερευνηθεί η επίδραση της θεραπείας πολυτροπικότητας της οξαλιπλατίνης /Χάρτης /υπερθερμία που προκαλείται κυτταροτοξικότητα, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με δοκιμασία MTS. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α και 1Β, συνεργική επίδραση παρατηρήθηκε σε οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία σε σύγκριση με οποιαδήποτε άλλη απλή θεραπεία ή δι-θεραπεία σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Ρ & lt? 0,01). Εικόνα 1C δείχνει σαφώς ότι συνεργιστική επαγωγή της αποπτωτικό θάνατο κατά τη διάρκεια της θεραπείας με οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου βλαστικών κυττάρων TU-12, TU-21 και Tu-22 (Σχήμα 1 F). Αυτά τα συνεργιστικά αποτελέσματα ήταν λόγω της αύξησης στην ενεργοποίηση των κασπασών (Εικόνα 1D). Το Σχήμα 1D δείχνει ότι 100 ng /ml Χάρτης οδήγησε σε μια μικρή ποσότητα της κασπάσης 8 και 3 ενεργοποίηση, και επομένως η διάσπαση PARP (το σήμα κατατεθέν χαρακτηριστικό της απόπτωσης). Είναι ενδιαφέρον, υπερθερμία προώθησε την ενεργοποίηση της κασπάσης 8, ενώ η οξαλιπλατίνη προωθείται κασπάσης 9 ενεργοποίησης. Επιπλέον, η συνεργιστική δράση της θεραπείας πολυτροπικότητας μπλοκαρίστηκε από Ζ-IETD-FMK (κασπάση 8 αναστολέα), Ζ-LEHD-FMK (κασπάσης 9 αναστολέα), και Ζ-DEVD-FMK (κασπάσης 3 αναστολέα) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές ( Σχήμα 1Ε), υποδεικνύοντας ότι και οι δύο οδοί έπαιξε σημαντικό ρόλο στην συνεργική επίδραση της θεραπείας πολυτροπικότητα.

(Α, Β) CX-1 και HCT116 κύτταρα εκτέθηκαν σε φυσιολογική θερμοκρασία ή hyperthermic (42 ° C) συνθήκες για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη και στη συνέχεια επωάστηκαν για 23 ώρες στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασία MTS. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από εις τριπλούν πειράματα. Asterisk ** αντιπροσωπεύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (P & lt? 0,01). κύτταρα (C) CX-1 εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42 ° C) για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη και στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα βάφτηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) -Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). Η απόπτωση ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής. (Δ) Μετά την επεξεργασία, τη διάσπαση της κασπάσης 8, της κασπάσης 9, κασπάσης 3, ή PARP ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ίση ποσότητα των πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα. (Ε) CX-1 και HCT116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 20 μΜ Ζ-IETD-FMK (κασπάση 8 αναστολέα), Ζ-LEHD-FMK (κασπάσης 9 αναστολέα), και Ζ-DEVD-FMK (κασπάσης 3 αναστολέα) για μmin ακολουθούμενη από οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία και την διάσπαση της PARP ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. (F) ανθρώπινου κόλον καρκινικά βλαστικά κύτταρα, TU-12, TU-21 και TU-22, εκτέθηκαν σε φυσιολογική θερμοκρασία ή hyperthermic (42 ° C) συνθήκες για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνης στην υποδεικνυόμενη συγκέντρωση και στη συνέχεια επωάζονται για 23 ώρες στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. PARP ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

δόσης απαντήσεις των οξαλιπλατίνη και υπερθερμία για Χάρτης απόπτωση

Παρατηρήσαμε ότι οι δόσεις Χάρτης και οξαλιπλατίνη αυξημένη, κασπάσης 8/9 /3 ενεργοποίηση και διάσπαση PARP ενισχύθηκαν, υποδεικνύοντας ότι η συνεργιστική δράση της πολυτροπικότητας θεραπεία επαγόμενης απόπτωσης ήταν δοσοεξαρτώμενη (Εικόνα 2Α). Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι τόσο οι ενδογενείς και εξωγενείς αποπτωτικών οδών συμμετείχαν στην συνεργική επίδραση της θεραπείας πολυτροπικότητα. Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν σε HCT116 κύτταρα (Σχήμα 2Β).

(Α) CX-1 και (Β) κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42 ° C) για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη και επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. Μετά τη θεραπεία, η διάσπαση της κασπάσης 8, της κασπάσης 9, κασπάσης 3, ή PARP ανιχνεύθηκε με ανοσοκηλίδωση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ίση ποσότητα των πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα. (C) CX-1 κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42 ° C) για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία 100 ng /ml Χάρτης και 10 μg /ml οξαλιπλατίνη και στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C υπό την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα ανοσοστυπώθηκαν με αντι-φωσφο-ΙΝΚ /JNK, αντι-φωσφο-Bcl-xL /Bcl-xL και αντι-FLIP αντισώματα. (D) CX-1 κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42 ° C) για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης (100 ng /ml-1,000 ng /ml) και οξαλιπλατίνη (10 μg /ml-100 μg /ml) και επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. Μετά τη θεραπεία, φωσφο-ΙΝΚ /JNK, φωσφο-Bcl-xL /Bcl-xL και FLIP

L ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ίση ποσότητα των πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα. (Ε) κύτταρα HCT116 εκτέθηκαν σε υπερθερμία (42 ° C) για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης (10 ng /ml-100 ng /ml) και οξαλιπλατίνη (10 μg /ml-100 μg /ml) και, στη συνέχεια, επωάστηκαν για 3 ώρες στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη. Μετά τη θεραπεία, φωσφο-ΙΝΚ /JNK, φωσφο-Bcl-xL /Bcl-xL και FLIP

L ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ίση ποσότητα των πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα.

Η

ενεργοποίηση της JNK θεραπεία που προκαλείται από πολυτροπικότητα, Bcl-xL φωσφορυλίωση και μείωση της C-FLIP

επίπεδο L

Για την περαιτέρω κατανόηση των μηχανισμών του πώς οι ενδογενών και εξωγενών οδών συμμετείχαν στο πολυτροπικότητα θεραπεία απόπτωση, εξετάσαμε Bcl-xL, καθώς και c-FLIP. Το Σχήμα 2C δείχνει ότι δεν υπήρξε καμία αλλαγή στην ποσότητα των Bcl-xL πρωτεΐνη, αλλά η φωσφορυλίωση της Bcl-xL αυξήθηκε δραματικά, που συνοδεύεται από φωσφορυλίωση JNK. Επιπλέον, το επίπεδο του c-FLIP

L μειώθηκαν σημαντικά κατά τη διάρκεια της θεραπείας πολυτροπικότητα σε κύτταρα CX-1. Το σχήμα 2D δείχνει ότι JNK ενεργοποιήθηκε και Bcl-xL φωσφορυλιώθηκε στη σερίνη 62 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα CX-1. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο του c-FLIP

L μειωθεί δραματικά όταν η οξαλιπλατίνη συνδυάστηκε με υπερθερμία. Παρόμοια δεδομένα ελήφθησαν σε κύτταρα HCT116 (Σχήμα 2Ε).

Η κινητική της θεραπείας πολυτροπικότητα σε CX-1 και τα κύτταρα HCT116

Παρατηρήσαμε ότι η επίδραση της θεραπείας πολυτροπικότητας αυξήθηκε καθώς ο χρόνος προχωρούσε σε CX-1 (Σχήμα 3Α) και κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3Β). JNK ενεργοποίησης φτάσει στο μέγιστο στις 4 ώρες μετά την αρχική θεραπεία και βαθμιαία μειώθηκε κατά τη διάρκεια της θεραπείας πολυτροπικότητα. Δεδομένα από ανοσοκηλίδα και απεικόνισης γέλης αναλύσεις δείχνουν ότι φωσφορυλίωση Bcl-xL φτάσει στην κορυφή περίπου 12 ώρες μετά την αγωγή υποδεικνύοντας ότι η ενεργοποίηση ΙΝΚ ήταν ένα πρώιμο συμβάν και θα μπορούσε να ρυθμίζει τη φωσφορυλίωση Bcl-XL. Σε CX 1-κύτταρα, το επίπεδο του c-FLIP

L μειώθηκε δραματικά σε 4 ώρες μετά τη θεραπευτική αγωγή με οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με υπερθερμία, ενώ στα κύτταρα HT116, έφθασε ελάχιστο 24 ώρες μετά την αγωγή.

CX -1 (Α) και τα κύτταρα HCT116 (Β) εκτέθηκαν σε hyperthermic (42 ° C) συνθήκες για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνη και επωάστηκαν στους 37 ° C παρουσία /απουσία Χάρτης και οξαλιπλατίνης για 3 h, 7 h, 11 h και 23 h. Μετά τη θεραπεία, η διάσπαση της κασπάσης 8/9/3 και PARP, φωσφο-ΙΝΚ /JNK, φωσφο-Bcl-xL /Bcl-xL και FLIP

L ανιχνεύθηκαν με ανοσοκηλίδωση. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ίση ποσότητα πρωτεϊνών.

Η

Η απαίτηση της ενεργοποίησης της JNK και φωσφορυλίωσης Bcl-XL στο πολυτροπικότητα θεραπεία απόπτωση

αναστολέα JNK SP6001125 μερικώς μειωμένη οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία-επαγόμενη διάσπαση PARP σε CX-1 κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι η οδός JNK ήταν κρίσιμη για πολυτροπικότητα θεραπεία προκαλούμενη απόπτωση (Σχήμα 4Α). Αισθητά, SP6001125 μειώνεται πολύ το επίπεδο της φωσφορυλίωσης Bcl-xL σε κύτταρα CX-1, η οποία παρέχει ισχυρές ενδείξεις ότι η πολυτροπικότητα θεραπεία επαγόμενης από Bcl-xL φωσφορυλίωση απαιτεί ενεργοποίηση JNK. Zhao et al. ανέφεραν ότι η ενεργοποίηση ΙΝΚ μεσολαβεί c-FLIP προς τα κάτω ρύθμιση [26]. Η δυνατότητα αυτή εξετάστηκε στην Εικόνα 4Α. Παρατηρήσαμε ότι δεν αποκατάσταση της γ-FLIPL σημειώθηκαν κατά τη διάρκεια της θεραπείας με SP6001125. Αυτή η παρατήρηση ήταν σύμφωνη με τις αναφορές άλλων ερευνητών [27,28].

(Α) Τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με JNK αναστολέα 25 μΜ SP6001125 ακολουθούμενη από οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PARP, αντι-φωσφο -Bcl-xL και αντι-ΒοΙ-χΕ αντίσωμα. (Β) επιμολύνσεις με πλασμίδιο ελέγχου (pcDNA), άγριου-τύπου Bcl-xL (Bcl-XL-WT), Ser62 /Ala φωσφο-ελαττωματικός Bcl-xL μετάλλαγμα (Bcl-XL-S62A), ή Ser62 /Asp φωσφο-μιμητικό Bcl-xL μετάλλαγμα (Bcl-xL-S62D) έλαβαν αγωγή με οξαλιπλατίνη /Χάρτης /υπερθερμία και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-ΡΑΚΡ ή αντι-Bcl-xL αντίσωμα. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει την ίση ποσότητα των πρωτεϊνών φορτώθηκαν σε κάθε λωρίδα.

Η

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της φωσφορυλίωσης Bcl-xL σε Ser62 για αντι-αποπτωτική δράση της, ιδρύσαμε CX-1 που προέρχεται από κύτταρο γραμμές που υπερεκφράζουν σταθερά άγριου τύπου Bcl-xL (Bcl-xL-WT), Ser62Ala φωσφο-ελαττωματικός Bcl-xL μετάλλαγμα (Bcl-xL-S62A), Ser62Asp φωσφο-μιμητικό Bcl-xL μετάλλαγμα (Bcl-xL-S62D), ή η αντίστοιχη άδειο φορέα (ροϋΝΑ). Όπως ήταν αναμενόμενο, η υπερέκφραση του Bcl-XL-WT εμπόδισε οξαλιπλατίνη Χάρτης υπερθερμία-επαγόμενη διάσπαση //PARP. Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του Bcl-XL-S62D ενισχυμένη διάσπαση PARP, ενώ εκείνη του Bcl-XL-S62A ανέστειλε διάσπαση PARP (Σχήμα 4Β). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι το επίπεδο των Bcl-xL και φωσφορυλίωση της σε S62 παίζουν σημαντικό ρόλο στην πολυτροπικότητα επαγόμενη απόπτωση.

μείωση της C-FLIP

επίπεδο L εξής υπερθερμία και οξαλιπλατίνη σε CX-1 κύτταρα

c-FLIP είναι το κύριο αναστολέας της εξωγενούς αποπτωτικό μονοπάτι μέσω της αναστολής της κασπάσης-8 ενεργοποίηση, και παρατηρήσαμε ότι το επίπεδο του c-FLIP

L μειώθηκε μετά υπερθερμία στους 42 ° C για 1 h σε κύτταρα CX-1 όπως δείχνεται στο Σχήμα 5Α. Ωστόσο, c-FLIP

L αποκαταστάθηκε στο κανονικό επίπεδο μετά από 3 ώρες επώασης στους 37 ° C, η οποία συνάδει με την προηγούμενη μας χαρτί [24]. Η οξαλιπλατίνη (10 μg /ml, 4Η) μόνο δεν μείωσε το επίπεδο του c-FLIP

L. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο του c-FLIP

L διατηρήθηκε σε μειωμένο επίπεδο, όταν συνδυάζεται με την υπερθερμία οξαλιπλατίνη.

(Α) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 37 ° C ή 42 ° C για 1 ώρα υπό την παρουσία /απουσία 10 μg /ml οξαλιπλατίνη και στη συνέχεια συλλέχθηκαν αμέσως ή 3 ώρες μετά από επώαση στους 37 ° C. c-FLIP

L εξετάστηκε με ανάλυση στυπώματος Western. (Β) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 37 ° C ή 42 ° C για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία 10 μg /ml οξαλιπλατίνη και στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C. Ποσοτικής αλυσιδωτής μεταγραφή-αντίδραση πολυμεράσης αντίστροφης (qRT-PCR) διεξήχθη για να μετρηθεί η σχετική επίπεδο mRNA γ-FLIP. Το ραβδόγραμμα αντιπροσωπεύει μέσες τιμές (+ SD) από πειράματα εις τριπλούν. (C) Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 37 ° C ή 42 ° C για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία 10 μg /ml οξαλιπλατίνη και στη συνέχεια επωάστηκαν για 3 h στους 37 ° C. σύνθεση πρωτεϊνών μετρήθηκε με [

35S] ενσωμάτωση μεθειονίνη. (D) Κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 30 μg /ml CHX, ή εκτίθεται σε υπερθερμία με την παρουσία ή απουσία CHX. Τα επίπεδα του c-FLIP

L και ακτίνης έλεγχος φόρτωσης μετρήθηκαν με ανάλυση αποτύπωσης Western. (Ε) Κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερθερμία για 30 ή 60 λεπτά παρουσία /απουσία MG132. Κυτταρόλυμα δείγματα ανοσοκαταβυθίζονται με αντίσωμα αντι-ουβικιτίνης και πρωτεΐνη G-Sepharose. Η ουβικουιτινωμένης FLIP ανιχνεύθηκε με στύπωμα Western με αντίσωμα αντι-FLIP. (F) Κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με 4 μg πλασμιδίου που περιέχει mock, K106R (106 κατάλοιπο λυσίνης αντικαταστάθηκε με αργινίνη), K195R, ή άγριου τύπου (WT) c-FLIP

L. Μετά από 48 ώρες επώαση, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπερθερμία στους 42 ° C για 1 ώρα. Το επίπεδο της γ-FLIP

L ανιχνεύθηκε με αντίσωμα αντι-FLIP. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (G) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με Flag-tagged c-FLIP

L WT ή K195R πλασμίδιο? 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε υπερθερμία στους 42 ° C για 1 ώρα. Τα επίπεδα του ουβικουιτινωμένης c-FLIP

L ανιχνεύθηκαν με ΙΡ με αντίσωμα αντι-Flag που ακολουθείται από κηλίδα Western χρησιμοποιώντας αντι-ubiquitin αντισωμάτων. Η παρουσία των διαμολυσμένων c-FLIP

L στα προϊόντα λύσης επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western. Η ακτίνη δείχθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. (H) Κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με c-FLIP

L WT, K106R, ή K195R πλασμίδιο? 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα θερμάνθηκαν στους 42 ° C για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης (100 ng /ml) και οξαλιπλατίνη (10 μg /ml) και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37

° C για 3 ώρες. Προϊόντα λύσης που περιέχει ίσες ποσότητες πρωτεΐνης ανοσοστυπώθηκαν με αντι-PARP και αντίσωμα αντι-FLIP. Η ακτίνη δείχθηκε ως εσωτερικό πρότυπο. (Ι) Τα κύτταρα διαμολύνθηκαν παροδικά με c-FLIP

L WT, K106R, ή K195R πλασμίδιο? 48 ώρες αργότερα, τα κύτταρα θερμάνθηκαν στους 42 ° C για 1 ώρα με την απουσία ή παρουσία Χάρτης (100 ng /ml) και οξαλιπλατίνη (10 μg /ml), και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες στους 37 ° C. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αναλύθηκε με δοκιμασία MTS. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από εις τριπλούν πειράματα. Ο αστερίσκος * αντιπροσωπεύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (Ρ & lt? 0,05).

Η

Ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική αναστολή της έκφρασης c-FLIP στο επίπεδο του mRNA ήταν εμφανής μετά υπερθερμία, οξαλιπλατίνη, ή ο συνδυασμού (Σχήμα 5Β). Παρατηρήσαμε στο Σχήμα 5C ότι το 25% της πρωτεϊνικής σύνθεσης αναστάλθηκε σε υπερθερμία, ενώ υπήρξε 46% αναστολή σύνθεσης πρωτεΐνης σε οξαλιπλατίνη σε συνδυασμό με υπερθερμία. Η Εικόνα 5D δείχνει ότι η μείωση του c-FLIP

επίπεδο L κατά 42 ° C για 1 ώρα θέρμανση μόνο ήταν περισσότερο από ότι με 30 μg του cyclohexmide η οποία αναστέλλει την πρωτεϊνική σύνθεση κατά 99% [28]. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της σύνθεσης πρωτεΐνης από μόνη της δεν αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την προς τα κάτω ρύθμιση του FLIP

L από υπερθερμία. Αξίζει να σημειωθεί ότι, C-FLIP

L ανακτήθηκε κατά τη διάρκεια 3 ώρες φυσιολογικής θερμοκρασίας κατάστασης, που δείχνει ότι το c-FLIP

L είχε ανασυντεθεί. Ωστόσο, η ανάκαμψη καθυστέρησε από τη θεραπεία με υπερθερμία και οξαλιπλατίνη, όπως πρωτεϊνική σύνθεση ήταν σημαντικά αναστέλλεται.

Σχήμα 5Ε δείχνει ότι η ουβικιτινίωση της ενδογενούς c-FLIP

L αυξήθηκε κατά θεραπείες υπερθερμία. Επιπλέον, αναστολέας πρωτεασώματος MG132 μπλοκάρει την υποβάθμιση του c-FLIP

L, επιβεβαιώνοντας την ύπαρξη του πρωτεασώματος με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης της πρωτεΐνης μετά την υπερθερμία.

Το λογισμικό online UbPred, το οποίο προβλέπει sites πρωτεΐνης ουβικιτινίωση, έδειξε ότι λυσίνη 106 και 195 είχαν τις υψηλότερες βαθμολογίες. Αντικαταστήσαμε 106 και 195 της λυσίνης με αργινίνη και δοκιμαστεί η σταθερότητα της πλήρους μήκους c-FLIP

L που φέρει την προκύπτουσα μετάλλαξη σημείου. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5F, στην ομάδα επιμόλυνση, c-FLIP

L K106R ήταν εύκολα υποβαθμισμένη, όταν υποβάλλεται σε υπερθερμία ενώ K195R ήταν ανθεκτική στην αποικοδόμηση από υπερθερμία. Το σχήμα 5G επιβεβαιώνει ότι το c-FLIP

L άγριου τύπου (WT) ήταν αποτελεσματικά ουβικουιτινωμένης αλλά όχι το μεταλλαγμένο K195R, το οποίο βρέθηκε σχεδόν χωρίς ουβικουϊτινίωση. Παρατηρήσαμε ότι το c-FLIP

L K195R κύτταρα που εκφράζουν ήταν το πιο ανθεκτικό στην πολυτροπικότητα θεραπεία που προκαλείται από αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο (Εικόνα 5Η και 5θ). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η παροδική υπερθερμία με τη μεσολάβηση της υποβάθμισης του c-FLIP

L εμπλέκονται ουμπικουιτίνωση του K195, και K195R μεταλλαγμένο ανατίθενται αντίσταση κατά της πολυτροπικότητας θεραπεία που προκαλείται από αποπτωτικό θάνατο.

Κατάργηση του συνεργιστική δράση με υπερέκφραση c-FLIP

L K195R και Bcl-xL-S62A σε CX-1 και τα κύτταρα HCT116

Τέλος, συγκρίναμε το αποτέλεσμα της θεραπείας πολυτροπικότητα σε CX-1 και τα κύτταρα HCT116 υπερεκφράζεται με c-FLIP

L WT, Bcl-xL-S62A, Bcl-xL-S62A + c-FLIP

L WT (Εικόνα 6Α και 6Β) και c-FLIP

L K195R, Bcl-xL-S62A, Bcl- xL-S62A + c-FLIP

L K195R (Σχήμα 6C και 6D). Παρατηρήσαμε ότι η γ-FLIP

L WT /K195R ή Bcl-XL-S62A μερικώς μπλοκάρει την επίδραση της θεραπείας πολυτροπικότητα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η πολυτροπικότητα θεραπεία απόπτωση ήταν σχεδόν πλήρως αποκλεισμένη από υπερέκφραση τόσο του c-FLIP

ελαφρών βαρών /K195R και Bcl-XL-S62A (Εικόνα 6Α και 6C), υποδεικνύοντας γ-FLIP

L και Bcl- xL ήταν ανεξάρτητοι παράγοντες που συμβάλλουν στη συνεργιστική δράση της θεραπείας πολυτροπικότητα. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας (Σχήμα 6Β και 6D). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι (α) μείωση των γ-FLIP

επίπεδο L και (β) Bcl-xL φωσφορυλίωση σε Ser62 είναι τόσο υπεύθυνη για τη συνεργιστική επαγωγή της απόπτωσης των κλινικά σχετική θεραπεία πολυτροπικότητα.

( Α) CX-1 κύτταρα σταθερώς υπερεκφράζεται με pcDNA, c-FLIP

L WT, Bcl-xL-S62A και c-FLIP

L WT + Bcl-xL-S62A, και τρεις σταθεροί κλώνοι συνενώθηκαν, και τα κύτταρα θερμάνθηκαν στους 42 ° C για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης (10 ng /ml) και οξαλιπλατίνη (10 μg /ml) και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37

° C για 3 ώρες. Η διάσπαση της PARP, και το επίπεδο των c-FLIP

L και Bcl-xL ανιχνεύθηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. βιωσιμότητας (Β) Cell αναλύθηκε με δοκιμασία MTS 24 ώρες μετά τη θεραπεία. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν SD από εις τριπλούν πειράματα. Asterisk ** αντιπροσωπεύει μια στατιστικά σημαντική διαφορά (P & lt? 0,01). (Γ) Κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν παροδικά με ίση ποσότητα του πλασμιδίου που περιέχει mock, c-FLIP

L K195R, Bcl-XL-S62A και c-FLIP

L K195R + Bcl-XL-S62A. Μετά από 48 ώρες επώαση, τα κύτταρα θερμάνθηκαν στους 42 ° C για 1 ώρα με την παρουσία /απουσία Χάρτης (10 ng /ml) και οξαλιπλατίνη (10 μg /ml) και στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37

° C για 3 ώρες.