έχουν

Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν αναγνωριστεί ως εμπλέκονται σημαντικά στον καρκίνο του προστάτη (PCA). Από υποδοχέα ανδρογόνων (AR) διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην καρκινογένεση του προστάτη και την εξέλιξη, είναι επιτακτική ανάγκη να αποσαφηνιστεί συστηματικά τη σχέση αιτιότητας μεταξύ AR και miRNAs, με έμφαση στους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων miRNAs μεσολαβούν AR σηματοδότησης. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μία σειρά από μικροσυστοιχίες χρονικής πορείας για την παρατήρηση των δυναμικών γονιδιώματος σε επίπεδο εκφράσεις των mRNA και miRNAs παράλληλα σε κύτταρα LNCaP καρκίνου του προστάτη ορμόνη ευαίσθητη διεγείρεται από ανδρογόνο. Ως εκ τούτου, εισαγάγαμε Σκορ Response για τον εντοπισμό miRNAs στόχο AR, καθώς και διαμόρφωση του Δείκτη για τον εντοπισμό των miRNAs mRNAs στόχο. Με βάση τις θεωρητικές αναγνώριση και την πειραματική επιβεβαίωση, νέους μηχανισμούς αντιμετώπισης της βιωσιμότητας των κυττάρων σε προστάτη είχαν κατέρρευσε για 3 miRNAs πρόσφατα αναγνωριστεί ως στόχοι AR. (1) miR-19a είναι άμεσα up-ρυθμίζεται από AR, και καταστέλλει SUZ12, RAB13, SC4MOL, PSAP και ABCA1, αντίστοιχα. (2) miR-27a είναι άμεσα up-ρυθμίζεται από AR, και καταστέλλει ABCA1 και PDS5B. (3) miR-133b είναι άμεσα up-ρυθμίζεται από AR, και καταστέλλει CDC2L5, PTPRK, RB1CC1, και CPNE3, αντίστοιχα. Επιπλέον, βρήκαμε miR-133b είναι απαραίτητο για την επιβίωση των κυττάρων του προστάτη. Η μελέτη μας παρέχει ορισμένες ενδείξεις σχετικά με miRNAs μεσολάβηση σηματοδότηση AR για τη βιωσιμότητα των κυττάρων επηρεάζοντας τις κρίσιμες οδούς, κυρίως με το σπάσιμο μέσω της επίδρασής περιορισμό της ανάπτυξης των ανδρογόνων για φυσιολογικό προστατικό ιστό

Παράθεση:. Μο W, Zhang J, Λι Χ, Meng D , Gao Υ, Yang S, et al. (2013) Ταυτοποίηση των Μυθιστόρημα AR-Στοχευμένες Τα microRNAs Μεσολαβητικές ανδρογόνων σηματοδότηση μέσω Κρίσιμη Pathways να ρυθμίζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων στον καρκίνο του προστάτη. PLoS ONE 8 (2): e56592. doi: 10.1371 /journal.pone.0056592

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 7 του Σεπτέμβρη 2012? Αποδεκτές: 11 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 22 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Μο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται εν μέρει από δύο επιχορηγήσεις 31071142 και 31171246 από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, καθώς και από τη Σαγκάη Βασικά Εργαστήριο Ευφυών Επεξεργασίας πληροφοριών της Κίνας (Αρ IIPL-2010-002). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι 20~24 nt ενδογενή RNAs πρωτεΐνη-nonencoding, και έχουν αναδειχθεί ως μια σημαντική κατηγορία των ρυθμιστικών μορίων που εμπλέκονται στην θηλαστικό εμβρυϊκή ανάπτυξη και παθογένεση [1]. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν επισημάνει ότι miRNAs παίξει ισχυρό ρόλο στον καρκίνο του προστάτη (PCA) την έναρξη, εξέλιξη και μετάσταση [1], [2], [3]. Του προστάτη εξαρτάται από ανδρογόνα για την ανάπτυξη και την ανάπτυξη, εν τω μεταξύ φυσιολογικού ιστού του ελέγχεται από ορισμένους μηχανισμούς περιορισμού της ανάπτυξης για την αποτροπή των ανδρογόνων που προκαλείται από υπερ-ανάπτυξη, είναι επιτακτική ανάγκη να αποκαλύψει πώς η υποδοχέα ανδρογόνων (AR) μεσολαβεί τις δράσεις αυτές και τα διαλείμματα μέσα από τον περιορισμό της ανάπτυξης για την καθοδήγηση του προστάτη καρκινογένεση. Έτσι, προσπάθησε να εντοπίσει συστηματικά miRNAs που γεφυρώνουν τα μονοπάτια από το AR διέγερση για την κυτταρική φαινοτυπική επίδραση στη ΣΕΣΣ.

Σήμερα, αρκετές αναφορές προσδιορίζονται miRNAs στην σηματοδότηση AR στον καρκίνο του προστάτη [4], [5], [ ,,,0],6], [7]. miR-21 ήταν άμεσα πάνω ρυθμισμένα με AR σε ανδρογόνα αποκριτικά κύτταρα του προστάτη [6], λόγω της σύνδεσης AR επί της οριοθετημένης υποκινητή. J. Ribas et al. διαπίστωσε περαιτέρω αναστολή της miR-21 μπορεί να μειώσει ανδρογόνων που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων PCa, και miR-21 ήταν επαρκής για εξαρτώμενων από ανδρογόνα όγκων να ξεπεράσουν ευνουχισμό επαγόμενη διακοπή αύξησης [6]. miR-125b ήταν άμεση διεγείρεται από AR, και προώθησε ανδρογόνων-ανεξάρτητη ανάπτυξη του προστάτη με την καταστολή της έκφρασης του Bak1 που ρυθμίζονται αποπτωτική σηματοδότηση σε προστάτη [7]. J. Ribas et al. [6] διεξάγεται ανάλυση μικροσυστοιχιών για έκφραση miRNA σε δύο εξαρτώμενη από ανδρογόνο κυτταρικές γραμμές προστάτη LNCaP και LAPC-4 για να βρείτε AR-ρυθμίζονται miRNAs στόχου. Ωστόσο, δεν μπορεί να διακρίνει σαφώς τις άμεσες και έμμεσες στόχους του AR αφού το προφίλ έκφρασης miRNA ελήφθη στις 72 ώρες μετά ανδρογόνων διέγερση. Πρόσφατα, Κ Takayama et al. έχουν εκτελέσει ένα γονιδίωμα-ευρεία προβολή των γονιδίων στόχων AR με την ενσωμάτωση της ανάλυσης κλουβί και τσιπ τσιπ για να εντοπιστούν οι περιοχές AR δεσμευτική (ARBSs) στο ανθρώπινο γονιδίωμα των κυττάρων LNCaP [4]. Καθόρισαν γονιδίωμα-ευρεία ARBSs στο 100 kb περιοχή των γονιδίων miRNA. Με βάση την δεσμευτική χρωμόσωμα, Κ Takayama et al. παρέχονται χρήσιμες πληροφορίες για την κατανόηση miRNA με τη μεσολάβηση του δικτύου σηματοδοσίας AR. Ωστόσο, σύμφωνα με τις ειδικές βιολογικές συνθήκες, δεν είναι όλοι οι στόχοι που προσδιορίζονται από την ανάλυση τσιπ τσιπ είναι οι πραγματικοί στόχοι της AR? μεταξύ όλων των AR-στοχευμένες miRNAs, τα κρίσιμα miRNAs που συμβάλλουν στην σηματοδότηση AR, δεν μπορεί να βρεθεί μόνο μέσα από την ανάλυση των χρωμοσωμάτων-δεσμευτική.

Από την άλλη πλευρά, για να μελετήσει πώς miRNA μεσολαβεί σηματοδότησης AR, είναι απαραίτητο να προσδιορίσει τα mRNA στόχο miRNA του. Σπόρος-ακολουθία με βάση τις προβλέψεις του στόχου miRNA, όπως TargetScanS, Miranda και miRDB βάσεις δεδομένων, παρέχουν την απαραίτητη πληροφοριακή ενδείξεις? εφαρμογή αυτών των βάσεων δεδομένων πρόβλεψης στο συγκεκριμένο πλαίσιο μπορεί να προσδιορίσει την πραγματική τους στόχους miRNA του. Στις περισσότερες περιπτώσεις, για τα ζώα, αν και miRNAs και mRNAs στόχος δεν είναι εντελώς βάσης-συμφωνημένα, miRNAs μπορεί να προκαλέσει ακόμα αποδόμηση του mRNA στόχο μέσω εξωνουκλεάσες ή Ρ-σώματος [8]. Δηλαδή, η μεταβολή της έκφρασης του mRNA στόχου μπορεί να αντανακλά κυρίως τον κανονισμό miRNA του. Ως εκ τούτου, είναι ιδανικό για να παρατηρήσουμε ταυτόχρονα εκφράσεις αμφοτέρων των miRNAs και mRNAs κατά τρόπο χρονοσειρών προκειμένου να εντοπισθούν αποτελεσματικά ρύθμιση miRNA για στόχο σε ένα πλαίσιο ιστού-ειδικό. Πρόσφατα, V. Jayaswal et al. [9] έδωσαν ένα δυναμικό δεδομένα ταυτόχρονα παρατηρώντας miRNA και εκφράσεις mRNA σε ένα μυελώματος κυτταρική γραμμή U266. Με βάση τα προσαρμοσμένα δεδομένα χρονική πορεία miRNA-mRNA, υπολόγισαν τις πιθανότητες στατιστική [9] για κάθε ζεύγος miRNA-mRNA που λαμβάνεται από την πρόβλεψη ακολουθία που βασίζονται. Επιπλέον, η αλλαγή της έκφρασης των miRNAs δεν μπορεί να παράγει αναγκαστικά μια στιγμιαία αλλαγή στην έκφραση του mRNA-στόχο [9], η επίδραση αυτή χρονική υστέρηση θα πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά τον καθορισμό κανονισμού miRNA. Σε V. Jayaswal et al. Μέθοδο [9], η σημασία των αποδόσεων στατιστική δεν εκτιμήθηκε από το ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη η οποία είναι το πρότυπο για την αξιολόγηση της σημασίας, και χρονική καθυστέρηση με διαφορετικά χρονικά διαστήματα για την εκπροσώπηση καθυστερημένη επίδραση miRNA είχαν ίσης μεταχείρισης που δεν συνάδει με την πραγματική κατάσταση. Ως εκ τούτου, ένα βελτιωμένο αλγόριθμο για τον ακριβή προσδιορισμό των στόχων των miRNAs σε ένα συγκεκριμένο πλαίσιο είναι ουσιαστικά απαίτησε.

Κατ ‘αρχήν, οι κρίσιμες miRNAs που παίζουν ισχυρό ρόλο στη διαμεσολάβηση μονοπάτια AR στην εξαρτώμενη από ανδρογόνο κύτταρα του προστάτη θα είναι σημαντικά up-ρυθμίζονται μετά ανδρογόνων διέγερση, και πιθανώς να κρατήσει τις υψηλές εκφράσεις για ένα σχετικά μεγάλο χρονικό διάστημα. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια μικροσυστοιχία χρονοσειράς να παρατηρήσουμε ταυτόχρονα γονιδιώματος σε επίπεδο miRNA και mRNA εκφράσεις υπό διυδροτεστοστερόνη (DHT, ένα τυπικό ανδρογόνων) διέγερση σε κύτταρα LNCaP οποίοι είναι ανδρογόνο-εξαρτώμενη. Προκειμένου να καθοριστεί ρόλους miRNAs »στη σηματοδότηση AR, εισαγάγαμε Σκορ Response για τον εντοπισμό miRNAs στόχο AR, καθώς και διαμόρφωση του Δείκτη για τον εντοπισμό των miRNAs mRNAs στόχο. Μετά βιολογικό πειραματική επιβεβαίωση, αρκετές ενδιαφέρουσες μηχανισμούς για διαμεσολαβητικό miRNAs »στη σηματοδότηση AR είναι πρόσφατα αποκαλύφθηκε, που συμβάλλουν σημαντικά στην επιβίωση του προστάτη κυττάρων και παθογένεση, και η μελέτη αποκάλυψε επίσης κάποια πιθανός μηχανισμός για το σπάσιμο μέσα από τον περιορισμό της ανάπτυξης των ανδρογόνων του.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και ανδρογόνων Θεραπεία

Το ανθρώπινο καρκίνου του προστάτη LNCaP κυτταρική σειρά ορμονο-ευαίσθητος ελήφθη από την ATCC και διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και πενικιλλίνη (100 μονάδες /ml) -streptomycin (100 g /ml) στους 37 ° C σε ένα υγροποιημένο 5% επωαστή κυττάρου CO2. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ερυθρό της φαινόλης -δωρεάν RPMI 1640 (GIBCO /BRL) συμπληρωμένο με 10% ξυλάνθρακα-δεξτράνης απογυμνωμένο FBS για 3 ημέρες πριν από τη θεραπεία ανδρογόνων, τότε επάχθηκαν με DHT σε συγκέντρωση 10 ηΜ. Το γονιδίωμα-ευρεία δυναμική απόκριση DHT αναλύθηκε σε δέκα χρονικά σημεία – 0 h, 20 λεπτά, 40 λεπτά, 1 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, 8 ώρες, 16 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες, όπου ‘0 h’ αντιπροσωπεύει την κατάσταση πριν από την δράση των ανδρογόνων. Σε αυτή τη μελέτη, τα 10 χρονικά σημεία αριθμούνται ως

k

= 0, 1, 2, … 9. Για κάθε χρονικό σημείο, το ολικό RNA εκχυλίστηκε και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy Mini (Qiagen, Inc., Valencia, CA).

Γονιδίωμα-ευρύ έκφραση Προφίλ από Illumina BeadArray

Σύνολο RNAs σε κάθε χρονικό σημείο υβριδοποιήθηκαν σε συστοιχίες Illumina Sentrix Ανθρωπίνων WG-6_V2 BeadChip έκφρασης (mRNA) και MicroRNAExpression Profiling πάνελ (για miRNA) ξεχωριστά. Τα δεδομένα των πρώτων μικροσυστοιχιών ανέβηκαν στην έκφραση του γονιδίου Omnibus δημόσιο αποθετήριο (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/?. Gene Expression Omnibus σειρά δεν GSE21245).

Δεδομένα προ-επεξεργασίας

κανονικοποιημένα δεδομένα μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας quantile μέθοδο, και η επεξεργασία τους unauthentic δεδομένων. Για ένα γονίδιο, «Ανίχνευση

P

αξία» αξιολογεί την αυθεντικότητα των δεδομένων που ανιχνεύθηκαν σήματος. Αν «Ανίχνευση

P

αξία» & lt? 0,01, το σήμα θεωρείται ως αυθεντικό? Αλλιώς είναι unauthentic. Προτείναμε ένα κριτήριο για την τροποποίηση του unauthentic δεδομένων. Σε κάθε μικροσυστοιχιών, η ελάχιστη τιμή της αυθεντικής σήματος έχει οριστεί ως κατώτατο όριο, και συμβολίζεται ως Min

au. Για ένα στοιχεία unauthentic σήμα,

μια

είναι η αρχική τιμή και η τροποποιημένη value = max {a, Min

au}. Γονίδια με περισσότερα από 5 unauthentic σήματα αποκλείστηκαν. Στη συνέχεια, το σύνολο των δεδομένων θεωρήθηκαν ως αξιόπιστες.

Αναγνώριση AR Υποψήφιος Δημοτικής Στόχοι

1) που αποκρίνονται στο ανδρογόνο γονίδια.

Για το γονίδιο

g

, αντιπροσωπεύει τον φορέα μεταγραφής του, όπου

N

είναι ο αριθμός των χρονικών σημείων εκτός του 0 h, και

N

= 9 σε αυτή τη μελέτη. (

k

= 0, 1, 2, …,

Ν

) δηλώνει την αξία μεταγραφή σε χρόνο

k

, και λειτουργεί ως έλεγχος για ερεθίσματα DHT. Για γονίδιο σε κάθε χρονικό σημείο, «Diffscore ‘αντιπροσωπεύει διαφορική σημασία έκφραση σε σύγκριση με 0 h. Θεωρούμε ως μειωτικά, και ως προς τα πάνω ρυθμισμένη, που αντιστοιχούν σε. υποδηλώνει discretized φορέα έκφρασης ενός mRNA, δηλαδή (

k

= 1, 2, …,

N

) = 1, -1 ή 0 λόγω προς τα πάνω ρύθμιση, ρύθμιση προς τα κάτω ή μη διαφοροποίηση στο χρόνο

k

? και δηλώνει discretized φορέα έκφρασης ενός miRNA του. Εάν ένα γονίδιο σημαντικά διαφορικά εκφράζεται σε ένα χρονικό σημείο σε σύγκριση με 0 h, ορίζεται ως «γονίδιο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο» σε αυτή τη μελέτη.

2) Ο χρόνος διάκρισης για την πρώϊμη και όψιμη αντίδραση.

για τον εντοπισμό συστηματικά AR άμεσα ρυθμίζονται στόχους, έχουμε αναπτύξει μια στρατηγική για την ανίχνευση «διευκρινιστή χρόνου» που διακρίνει κυρίως πρώιμων και ύστερων απάντηση στάδια. Σε κάθε χρονικό σημείο, ο αριθμός των διαφορικών εκφρασμένων γονιδίων (σε σύγκριση με 0 h) μετρήθηκε. Εφιστούμε την καμπύλη των διαφορικά εκφρασμένων αριθμό γονιδίων miRNA κατά μήκος του χρόνου. Καθώς ο αριθμός των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων σε όψιμο στάδιο είναι σίγουρα πολύ μεγαλύτερη από ότι σε ένα πρώιμο στάδιο λόγω του φαινομένου ενίσχυσης καταρράκτη [10], ορίζουμε το χρόνο διακρίσεως ως χρονικό σημείο όταν εμφανιστεί η δεύτερη ριπή του διαφορικού αριθμού γονιδίων, δηλαδή από, η διαφορική έκφραση είναι σε προχωρημένο στάδιο.

3) βαθμολογία απόκρισης για τη μέτρηση των ανδρογόνων-απάντηση γονιδίου.

είναι γενικά θεωρείται ότι ο άμεσος στόχος του AR θα πρέπει να έχουν μια πρώιμη έκφραση απόκριση σε ανδρογόνα θεραπεία? Επιπλέον, τα γονίδια με την έγκαιρη και διαρκείας ανδρογόνων-απόκρισης είναι πιθανό όχι μόνο να ρυθμίζονται απευθείας από τον AR, αλλά και να παίξουν ουσιαστικό ρόλο στη σηματοδότηση AR. Κατά συνέπεια, προκειμένου να προσδιοριστούν miRNAs που είναι και οι δύο πρώιμη και όψιμη αντίδραση, δηλαδή με έγκαιρη και διαρκείας ανδρογόνων-απόκρισης, προτείνουμε μια Σκορ στατιστική Ανταπόκριση (RS) για τη μέτρηση της απόκρισης έκφραση ενός γονιδίου σε ανδρογόνα ερεθίσματα: (1) όπου

Στην Εξ. (1), είναι η συνιστώσα του discretized φορέα έκφρασης του γονιδίου, είναι η πρώτη μη-μηδενική στοιχείο της διαδοχικής σετ?

I

(

x

=

y

) ισούται με 1 αν η κατάσταση είναι ικανοποιημένοι και 0, αλλιώς? Int (

x

) παίρνει το αναπόσπαστο τμήμα του

x

να είναι η αξία του. Ο πρώτος όρος στην εξίσωση. (1) είναι η αθροιστική επίδραση των ανδρογόνων-απόκρισης εντοπιστούν από τον συντελεστή βάρους

Ν

+ 1-

k

, δηλαδή η διαφορική έκφραση συνέβη σε προγενέστερο χρόνο έχει τη μεγαλύτερη συνεισφορά στο ρόλο . Ο δεύτερος όρος στην εξίσωση. (1) είναι η τιμωρία για συχνή μεταβολή του διαφορικού κατεύθυνση, δεδομένου ότι τα γονίδια με ταλαντευόμενη αλλαγή κατεύθυνσης είναι λιγότερο σημαντικό σε αγωγιμότητα σήματος. Αντικατοπτρίζεται, αυτό τιμωρείται βαρύτερα για την κατεύθυνση μεταβολή που συνέβη σε πρώιμο στάδιο, και να τιμωρηθούν ασήμαντο για ένα προχωρημένο στάδιο, από τις αρχές του αντίδραση είναι πιο σημαντικό για AR αρχική ρύθμιση. Με βάση τον ορισμό της RS, τα γονίδια με μεγαλύτερη RS τιμές είναι περισσότερο διατεθειμένοι να ρυθμιστούν άμεσα από AR, και είναι περισσότερο διατεθειμένοι να παίξουν ουσιαστικό ρόλο στην εκτέλεση κυτταρικές επιδράσεις AR του. Σε αυτή τη μελέτη, οι κορυφαίες 10% των γονιδίων κατατάσσονται σύμφωνα με την RS είναι θεωρητικά αναγνωριστεί ως υποψήφια AR πρωταρχικούς στόχους.

Προσδιορισμός των Στόχων Σημαντικά διαμορφώνεται από miRNA

1) Ή-στατιστική.

για να δείτε την παγκόσμια διαφοροποίηση miRNAs »στο mRNA, παρατηρούμε τα προφίλ έκφρασης πάνω πορεία του χρόνου, και να επικεντρωθεί σχετικά με το εάν υπάρχει αλλαγή στην έκφραση και όχι η κατεύθυνση της αλλαγής. Let.where

M

είναι ο συνολικός αριθμός των miRNAs, είναι ο αριθμός των ακολουθίας με βάση το προβλεπόμενο στόχους για miRNA

i

, και υποδηλώνουν την διαφοροποίηση της έκφρασης σε χρόνο

k

για miRNA

i

και mRNA

ι

αντίστοιχα. Το περίεργο λόγο (ή) =

διαφήμισή

/

bc

. Αν Ή & gt? 1, miRNAs θεωρούνται σε παγκόσμιο επίπεδο διαμορφώνοντας τις εκφράσεις της προβλεπόμενης mRNAs στόχο

2) βαθμολογία Διαμόρφωση για μια σειρά που βασίζεται ζευγάρι προβλέψει miRNA-mRNA

Για μια προβλεπόμενη miRNA.. ΓπΡΝΑ ζεύγος μέλη του οποίου είναι και οι δύο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο, είναι απαραίτητο να προσδιοριστεί αν το mRNA ρυθμίζεται σημαντικά από την miRNA στο συγκεκριμένο πλαίσιο. συντελεστής Pearson αντανακλώντας τη σύνδεση με συνεχή τρόπο χρησιμοποιείται συνήθως για τη μέτρηση της συσχέτισης της έκφρασης των miRNA και mRNA [11], ενώ θα πρέπει επίσης να εξεταστεί η διαφορική έκφραση του mRNA που αντικατοπτρίζουν διακριτά εφέ διαμόρφωσης miRNA του σε κάθε χρονικό σημείο. Επιπλέον, μια αλλαγή στην έκφραση των miRNAs δεν μπορεί να παράγει μια στιγμιαία αλλαγή έκφρασης mRNA στόχου, θα πρέπει να θεωρηθεί το αποτέλεσμα «χρονική υστέρηση». Ως εκ τούτου, προτείνουμε ένα στατιστικό στοιχείο – Διαμόρφωση Score (MS) – για τη μέτρηση της ρύθμισης miRNA σε ακολουθία με βάση το προβλεπόμενο mRNA στόχου. Για μια προβλεπόμενη ζευγάρι miRNA-mRNA, (2) όπου για

ι

= 1, 2, …,

Ν

, και για το

k

= 2, 3, … ,

Ν

.

Στην Εξ. (2),

r

είναι ο συντελεστής συσχέτισης Pearson υπολογίζεται από τα δεδομένα έκφρασης των miRNAs και mRNA, (

k

= 1, 2, 3, …,

Ν

) αντιπροσωπεύουν οι

N

χρονικά σημεία, και,,, …, σε αυτή τη μελέτη. Eq. (2) φαίνεται παρόμοια με

r

-σε-

z

μετασχηματισμό Fisher, η οποία διανέμεται κανονικά [12]? Πλην Εξ. (2) έχει προχωρήσει με συντελεστή βάρους

E

περιγράφει διακριτά αλληλογραφία διαφορική έκφραση των miRNAs και του mRNA του. μέτρα διαφορική αλληλογραφία έκφρασης χωρίς χρονική καθυστέρηση? ενώ συμπληρώνει τη διαμόρφωση με καθυστερημένη επίδραση οφείλεται σε διαφορετικές χρονικές υστερήσεις. Η σημασία της σκλήρυνσης κατά πλάκας αξιολογείται από την ονομαστική

σ

αξία και προσαρμόζονται

q

αξίας (συμπλήρωμα). Σε αυτή τη μελέτη,

q

= 0,2 ρυθμίζεται ως όριο για την αναγνώριση σημασία, δηλαδή εάν

q

& lt? 0,2, το mRNA προσδιορίζεται ως άμεσο στόχο σημαντικά διαμορφώνονται από το miRNA στη συγκεκριμένη πλαίσιο.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR για miRNA και mRNA

Η ποσοτικοποίηση των miRNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Αρδεννών-LoopTM miRNA qPCR (ριβο). Μικρές U6 πυρηνικό RNA ήταν ενδογενή έλεγχο. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του mRNA, cDNA συντέθηκε από ολικό RNA χρησιμοποιώντας κιτ αντιδραστηρίου PrimerScript ™ RT (Takara). Η RT-PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του κιτ SYBR ασφάλιστρα Ex Taq ™ (Takara) για 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystem). Οι εκκινητές που αναφέρεται στον πίνακα S5 του αρχείου S1. Όλες οι τιμές του δείγματος ήταν κανονικοποιημένες σε GAPDH. Το 2

– μέθοδος ΔΔCt χρησιμοποιήθηκε σαν σχετικό μέτρο ποσοτικοποίηση των διαφορικής έκφρασης

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

δοκιμασίες ChIP διεξήχθησαν όπως περιγράφεται στην αναφορά.. [13]. Εν συντομία, τα κύτταρα μετά επιθυμητή αγωγή σταθεροποιήθηκαν με 1% φορμαλδεΰδη σε 37 ° C για 7 λεπτά, στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε SDS ρυθμιστικό διάλυμα λύσης [50 mM Tris.Cl, ρΗ 8.1, 10 mM EDTA, 1% SDS] και κατεργασία με υπερήχους για να κουρέψει το χρωματίνης (200~500 bp). Για κάθε μάρκας, το διαλυτό κλάσμα από 2 × 10

6 κύτταρα συλλέχθηκε και επωάστηκε με αντίσωμα αντι-AR 4 ug κουνελιού (PG-21, Upstate) ή τον έλεγχο φυσιολογικό ορό κουνελιού (IgG) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα ανοσοσύμπλοκα συλλήφθηκαν με 20 μΙ πρωτεΐνης Α /Ο συν-αγαρόζης (Santa Cruz). Μετά από εκτεταμένη έκπλυση, τα δεσμευμένα θραύσματα ϋΝΑ εκλούεται και καθαρίζεται. Οι εκκινητές για qPCR ανάλυση των θραυσμάτων DNA που περιέχουν αυτές παρατίθενται στον Πίνακα S3 και S4 Πίνακας του αρχείου S1, ιδιαίτερα KLK3 (PSA) ενισχυτής λειτουργεί ως θετικός έλεγχος, ενώ XBP-1 προαγωγέα λειτουργεί ως αρνητικός έλεγχος. Κάθε δοκιμασία τσιπ βιολογικώς επαναλήφθηκε τρεις φορές.

miRNA Επιμόλυνση

Για την αποτελεσματική υπερέκφραση του miRNA, μιμούνται πρόδρομα μόρια miRNA και αρνητικού ελέγχου (Ambion) επιμολύνθηκαν σε κύτταρα LNCaP χρησιμοποιώντας διαμόλυνση Νέον ™ σύστημα (Invitrogen) σε συγκέντρωση 30 ηΜ. Για την επιμόλυνση υπό κατάσταση ασιτίας, τα κύτταρα LNCaP τέθηκαν σε ορμόνη-απογυμνωμένο μέσο για 3 ημέρες πριν από την επιμόλυνση.

κυτταρικού πολλαπλασιασμού /βιωσιμότητας Δοκιμασία

Για να ελέγξετε τη συμβολή miRNA για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη, κύτταρα LNCaP μετά από παροδική επιμόλυνση σπάρθηκαν σε πλάκα 24-φρεατίων σε συγκέντρωση 15,000 κυττάρων /φρεάτιο. Μετά από 1, 2, 3, 4 ημέρες από την επιμόλυνση, 80 υΙ ΜΤΤ (5 mg υλικού /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 3 h. Τα επεξεργασμένα κύτταρα προκάλεσε λύση με DMSO και η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε. Κάθε διαμόλυνση σε κάθε ημέρα επαναλήφθηκε 3 φορές.

Western Blotting

κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14] χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι AR (Millipore), PSAP (Santa Cruz) και ακτίνη ( Sigma). Για την εκχύλιση των πυρηνικών πρωτεϊνών, LNCaP κύτταρα προκάλεσε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα Α (10 mM HEPES ρΗ 7.9, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 0,1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Πυρήνες συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση και προκάλεσε λύση με ρυθμιστικό διάλυμα C (20 mM HEPES ρΗ 7,9, 400 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mMEGTA, 1 mM DTT, 0,5 mM PMSF). Πυρηνική λύμα συλλέχθηκε με φυγοκέντρηση και ποσοτικοποιούνται.

Λουσιφεράσης Δοκιμασία

Ένα πλασμίδιο ρεπόρτερ που περιέχει θέση δέσμευσης υποθετική miRNA στην 3′-UTR του mRNA στόχου κλωνοποιήθηκε από το pGL3-προαγωγό φορέα λουσιφεράσης. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν παρέχονται στον Πίνακα S6 του αρχείου S1. Το πλασμίδιο επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας DNA. Για τη δοκιμασία λουσιφεράσης, τα κύτταρα LNCaP (7.5 × 10

4 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 2 ημέρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια συμμορφομετατράπηκαν με miRNA, pGL3-προαγωγό φορέα λουσιφεράσης και το πλασμίδιο λουσιφεράσης ρΡΙ_-ΤΚ Renilla (Promega) με τη χρήση ακτίνων-tremeGENE Αντιδραστήριο siRNA Transfection (Roche). Η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε σε 48 ώρες μετά την επιμόλυνση με κιτ δοκιμασίας ανταποκριτή διπλής λουσιφεράσης (Promega).

Αποτελέσματα

Η στρατηγική για την κατασκευή του δικτύου σηματοδοσίας AR miRNA μεσολάβηση σε αυτή τη μελέτη απεικονίζεται στο Σχ . 1. Τα σταδιακή αποτελέσματα παρουσιάζονται ως ακολούθως.

Αυτό είναι το περίγραμμα της όλης διαδικασίας για την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών για την κατασκευή του δικτύου AR σε αυτή τη μελέτη. Τα λεπτομερή βήματα που περιγράφονται στις μεθοδολογία και το αποτέλεσμα τμήματα.

Η

Διαλογή ανδρογόνων-απόκρισης miRNAs

Για την αναγνώριση miRNAs AR-στόχο μια προσέγγιση κέρδος-of-λειτουργίας, πραγματοποιήσαμε χρόνου φυσικά μικροσυστοιχίας να παρατηρούν ταυτόχρονα miRNA και mRNA εκφράσεις στα κύτταρα LNCaP εξαρτώμενων από ανδρογόνα υπό DHT διέγερση σε έναν χρόνο σειρά 0 h, 20 λεπτά, 40 λεπτά, 1 ώρα, 2 ώρες, 4 ώρες, 8 ώρες, 16 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες, αντίστοιχα. Η «0 h» λειτουργεί ως μάρτυρας αντιπροσωπεύει την κυτταρική κατάσταση πριν DHT διέγερση. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μία ορμόνη-εξαντλημένο μέσο για 72 ώρες πριν από την DHT διέγερση. Μετά την προ-διαδικασία των αρχικών δεδομένων, υπήρχαν 16.172 mRNAs και 241 miRNAs παρέμεινε. Θα προβληθεί πρώτα αυτά τα δεδομένα για να βρουν το «γονίδιο που αποκρίνονται στο ανδρογόνο» ( «ARG»): αν ένα γονίδιο έχει σημαντική αλλαγή της έκφρασης σε ένα χρονικό σημείο σε σύγκριση με 0 h, έχει ονομαστεί «αποκρίνονται στο ανδρογόνο». Η διαφορική έκφραση σε σύγκριση με 0 h μετριέται με «DiffScore», η οποία αντιπροσωπεύει τη σημασία της διαφορικής έκφρασης. Κατά συνέπεια, 5.203 mRNAs και 137 miRNAs ήταν ανδρογόνων ανταποκρίνεται. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι, όντας αποκρίνονται στο ανδρογόνο δεν μέσα είναι άμεσα ρυθμίζονται από AR? Αντ ‘αυτού, ορισμένα γονίδια μπορούν να ρυθμίζονται από ορισμένους διαμεσολαβητές σε AR μονοπάτια. κύριος στόχος μας είναι να ξεχωρίσω τα miRNAs ρυθμίζονται απευθείας από τον AR, οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη διαμεσολάβηση δικτύου AR διαμορφώνοντας mRNAs στόχο.

Μεταξύ των 137 αποκρίνονται στο ανδρογόνο miRNAs, 22 miRNAs ήταν καλά τεκμηριωμένο σε προστάτη [11 ], [15], [16] [17]. Εκεί, miR-101, miR-145, miR-34a, miR-182, miR-375, miR-181, miR-92b και miR-125a είναι up-ρυθμίζεται από DHT διέγερση. Αυτά τα miRNAs αναφέρθηκαν ως άκρως υπερεκφράζεται σε PCa [11], [17], [18], [19]. miR-16, miR-126 *, miR-23b, miR-100, miR-222, miR-133a-1, miR-499 και miR-340 είναι ρυθμισμένα προς τα κάτω, οι οποίες είναι σύμφωνες με τις προηγούμενες εκθέσεις [11], [15], [16].

Τα ανδρογόνα ανταποκρίνεται mRNAs που βρέθηκαν στη μελέτη αυτή είναι σε μεγάλο βαθμό συνεπής με τις προηγούμενες εκθέσεις. Έχουμε ήδη συσταθεί μια καθορισμένη βάση δεδομένων ονομάζεται βάση δεδομένων ARGDB [20], η οποία επικεντρώνεται στην AR γονιδίων που ρυθμίζονται με την ενσωμάτωση λογοτεχνίες έως το έτος 2009. Για τους 5.203 που αποκρίνονται στο ανδρογόνο mRNAs που βρέθηκαν σε αυτή τη μελέτη, το 80% χτυπήσει τα ανδρογόνα-γονιδίων που αποκρίνονται στη βάση δεδομένων ARGDB . Η συμμόρφωση συνεπάγεται την ορθότητα των πειραματικών επιδόσεις μας για την παρατήρηση του γονιδιώματος δυναμικές εκφράσεις σε LNCaP κυττάρων κάτω από DHT διέγερση. Ενδιαφέρουσες, ορισμένα γονίδια που εμπλέκονται στην επεξεργασία των miRNAs ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω από τα ανδρογόνα (Σχήμα S1 στο S1 αρχείου). Για παράδειγμα,

Dicer

, μια πρωτεΐνη δέσμευσης RNA που επεξεργάζεται προ-miRNA σε ώριμο miRNA, ρυθμίζεται προς τα πάνω. Αυτό είναι σύμφωνο με την προηγουμένως αναφερθείσα ρύθμιση προς τα άνω σε PCa [21].

DGCR8

, ένας συνεργάτης της πυρηνικής RNase III Drosha, η οποία διασπά το στέλεχος-βρόχου pri-miRNA στην συνοδευτικά χωρίς προ-miRNA, διεγείρεται επίσης σημαντικά.

Αναγνώριση χρόνου Διευκρινιστά για πρώιμη – και αργά-απόκρισης

απόκριση γονιδιακής έκφρασης σε ανδρογόνων διέγερση μπορεί να συμβεί σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο μετά τη θεραπεία DHT? Έτσι, ανάλογα μόνο με ανδρογόνων ανταποκρίνεται δεν μπορεί να δώσει περισσότερο προβληματισμό σχετικά με τον προσδιορισμό των ανταποκρίνεται γονίδιο είναι κρίσιμη. Υποθέτουμε ότι τα γονίδια με σημαντική αλλαγή έκφρασης που συμβαίνει σε προγενέστερο στάδιο μπορεί να διαδραματίσει έναν πιο κεντρικό ρόλο στη διαμεσολάβηση σηματοδότηση AR, και μπορεί να έχουν περισσότερες πιθανότητες να είναι ο άμεσος στόχος της AR. Ως εκ τούτου, προκειμένου να εντοπίζονται τα κρίσιμα miRNAs που είναι πιθανόν AR στόχους, θα κατατάσσονται απάντηση miRNA σε πρώιμη και όψιμη φάσεις σε αυτή τη μελέτη με προσδιορισμό ενός χρόνου διάκρισης

τ

, η οποία σηματοδοτεί την έναρξη της καθυστερημένης ανταπόκρισης. Ο αριθμός των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs που καλύπτει την χρονική πορεία απεικονίστηκε γραφικά. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α,

τ

= 6, που αντιστοιχεί στο χρονικό σημείο 8 ωρών ταυτοποιείται, πράγμα που σημαίνει ότι για τις αποκρίσεις miRNAs «έκφραση ανδρογόνου, [20 λεπτά, 8 ώρες) είναι η πρώιμο στάδιο, ενώ το [8 ώρες, 48 h] είναι ο προχωρημένο στάδιο.

Εικόνα 2Α. προφίλ χρονική πορεία των διαφορικά εκφρασμένων αριθμό miRNA. Η διακεκομμένη γραμμή αναφέρεται σε χρόνο διάκρισης για τη διάκριση στις αρχές και τα στάδια αργά απάντηση. Σχήμα 2Β. προφίλ έκφρασης των πρώιμων και ύστερων απάντηση miRNAs »σε ερεθίσματα DHT. Η διαφορική έκφραση σε σχέση με 0 h αντιπροσωπεύεται από. χωρίζει απάντηση miRNA σε πρώιμο και όψιμο στάδια. Τα miRNAs συγκεντρωμένοι σε 4 ομάδες: πρώιμη ρυθμίζεται προς τα πάνω (1), αργά ρυθμίζεται προς τα πάνω (2), η πρώιμη μειωτικά (3) και αργά μειωτικά (4). Σχήμα 2C. διάγραμμα Venn για τη διανομή αριθμό των πρόωρων ανταποκρίνεται miRNAs και αργά ανταποκρίνεται miRNAs. Το κόκκινο μέρος δηλώνει τα ανδρογόνα-resonsive miRNAs με την απάντηση που συνέβη μόνο κατά το αρχικό στάδιο, το μπλε μέρος δηλώνει miRNAs με ανταπόκριση μόνο σε προχωρημένο στάδιο, και το μωβ μέρος δηλώνει miRNAs με την απάντηση τόσο στα πρώιμα και όψιμα στάδια. Σχήμα 2D. Προβλεπόμενη ΕΙΝΑΙ εμπλουτισμό σε πρώιμη και όψιμη ανταποκρίνεται γονίδια miRNA. AREs είναι στα ± 10 σειρές kb όμορη θέση 5′-έναρξη του προ-miRNAs.

Η

Για να αξιολογηθεί η αξιοπιστία του χρόνου διαχωριστή

τ

, ερευνήσαμε προφίλ έκφρασης διαφορική miRNAs » και αναλύονται είναι εμπλουτισμός διαφορά μεταξύ πρώιμης και όψιμης ανταποκρίνεται miRNAs. Το προφίλ της διαφορικής έκφρασης που αποκρίνονται στο ανδρογόνο miRNAs »παρατηρείται με τη χρήση ως μη συντηρητικές κριτήριο για να απεικονίσουν διαφορική έκφραση. Στο Σχ. 2Β, ο χρόνος διάκρισης «8 ώρες διακρίνει σαφώς έγκαιρης και μεταμεσονύκτιες στάδια αντίδρασης. Ως εκ τούτου, έχουμε συγκεντρωμένα miRNAs σε 4 ομάδες: πρώιμη up-ρύθμιση, αργά up-ρύθμιση, νωρίς κάτω-ρυθμίζονται και αργά προς τα κάτω-ρυθμιζόμενη (Σχήμα 2Β ως επίδειξη.). Μερικά ανδρογόνων ανταποκρίνεται miRNAs έχουν διαφορετικές εκφράσεις, τόσο στα πρώιμα και όψιμα στάδια, και άλλοι έχουν μόνο διαφορικό εκφράσεις είτε στο πρώιμο ή προχωρημένο στάδιο και μόνο. Σύκο. 2C έδειξε την κατανομή της πρώιμης απόκρισης 83 miRNAs (11 miRNAs σε κόκκινο μόνο να έχουν έγκαιρη αντίδραση), τα τέλη ανταποκρίνεται 126 miRNAs (54 miRNAs σε μπλε χρώμα μόνο έχουν τέλη απόκρισης), καθώς και 72 miRNAs είναι η τομή (σε μωβ). Το ποσοστό αυτό είναι με τη μορφή διαγράμματος Venn [22]. Στη συνέχεια αναλύονται είναι εμπλουτισμοί των πρώιμων και ύστερων ανταποκρίνεται miRNAs. Είναι φυσικό να αναμένεται ότι τα γονίδια ρυθμίζονται απευθείας από τον AR (π.χ. τα πρώτα αποκρίνονται γονίδια) θα έχουν υψηλότερες ΕΙΝΑΙ εμπλουτισμού. Οι ανάντη 10 kb και οι μεταγενέστεροι 10 kb του site 5′-έναρξη του προ-miRNA εξετάστηκαν για να αναζητήσετε τοποθεσίες AR-δεσμευτικές (ARBSs). βάση δεδομένων Genomatix [23] χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει AREs, συμπεριλαμβανομένων των υποθετικών και επικυρωμένες υποδοχέα ανδρογόνων (AR) και γλυκοκορτικοειδών υποδοχέα (GR) ανταποκρινόμενα στοιχεία, όπως φαίνεται στον Πίνακα S1 του S1 αρχείου. Υποθετικές είναι αριθμοί αποκρίνονται στο ανδρογόνο miRNAs απεικονίζονται στο Σχ. 2D. Είναι προφανές ότι εμπλουτισμοί για πρόωρη ανταποκρίνεται miRNAs είναι πολύ μεγαλύτερα από τα τέλη που ανταποκρίνονται αυτά (

σ

& lt? 0,01, Συμπλ.1), που τεκμηριώνουν την ορθολογικότητα του χρόνου διαχωριστή

τ

.

Αναγνώριση υποψήφιες miRNAs ότι το Ar Κυρίως στόχος

Για την αναγνώριση miRNAs που πιθανώς άμεσα ρυθμίζονται από AR, καθώς παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη διαμεσολάβηση δικτύου AR, προτείναμε και υπολογίζεται μια νέα στατιστική , Response Αποτέλεσμα (RS) για κάθε αποκρίνονται στο ανδρογόνο miRNA. Το Σχήμα 3Α δείχνει την κατανομή RS αποκρίνονται στο ανδρογόνο miRNAs. miRNAs με RS τιμές στο top 10% είναι θεωρητικά αναγνωρίζονται ως AR πρωταρχικούς στόχους. Το όριο RS για miRNA είναι 22, ως εκ τούτου, 15 miRNAs (8 καταστέλλεται και 7 που προκαλείται) έχουν θεωρητικά αναγνωριστεί ως υποψήφια.

Σχήμα 3Α. RS διανομή αποκρίνονται στο ανδρογόνο miRNAs. αριθμούς miRNA σύμφωνα με τις διαφορετικές RS τιμές που παρουσιάζονται είναι η διακεκομμένη γραμμή δηλώνει το όριο για τον προσδιορισμό των υποψήφιων AR miRNAs πρωταρχικός στόχος. Σχήμα 3Β. RT-PCR ανάλυση για τις προσδιοριζόμενες AR miRNAs υποψήφιος στόχος. Φορές μεταβολής DHT επεξεργασμένου LNCaP κύτταρα επί δειγμάτων ελέγχου παρουσιάστηκε με εκτίμηση σημασία (σε αυτή τη μελέτη, *: ρ & lt? 0,05? **: Ρ & lt? 0,01? ***: Ρ & lt? 0.001). Fold αλλαγή σε δείγματα ελέγχου κρίθηκε ως 1 για όλες τις αναλύσεις RT-PCR σε αυτή τη μελέτη. Αυτό το σχήμα είναι η RT-PCR ανάλυση των miRNAs στα 40 λεπτά της DHT διέγερσης. Σχήμα 3C. Σχηματικό διάγραμμα του miR-133b, miR-19a, και miR-27a είναι θέση στις περιοχές 5 ‘και 3’. Τα οριζόντια βέλη δείχνουν η προσέγγιση είναι τοποθεσίες. Σχήμα 3D. ChIP δοκιμασία του AR-δεσμευτικές για υποψήφιων στόχων της miR133b, miR19a, miR27a. «IgG» χρησιμεύει ως αρνητικός μάρτυρας για την δοκιμασία chip.

Η

Για να επιλέξετε miRNAs με νέα βιολογική σημασία για την επόμενη βαθιά εξελίξει έρευνα, χρησιμοποιήσαμε GenMAPP να αναλύσουμε τις επηρεάζονται μονοπάτια για κάθε υποψήφιο, ανάλογα με ο εμπλουτισμός οδός για τις προβλεπόμενες mRNAs στόχος που ήταν επίσης αποκρίνονται στο ανδρογόνο. Σε αυτή τη μελέτη, προέβλεψε στόχοι miRNAs »δόθηκαν από τη βάση δεδομένων miRDB [24], του οποίου η πρόβλεψη στόχων των miRNAs γονιδίωμα-ευρεία διεξήχθη με ένα νέο εργαλείο βιοπληροφορικής, MirTarget2 [25]. MirTarget2 αλγόριθμο που βασίζεται σε μηχανές διανυσμάτων υποστήριξης (SVMs) και σύνολα δεδομένων εκπαίδευσης μικροσυστοιχιών, έδειξε μεγαλύτερη εκλεκτικότητα στον εντοπισμό μειωτικά γονίδια σε σύγκριση με άλλους αλγορίθμους. Κατά την εκτέλεση GenMAPP, μονοπάτια με z≥1.96 θεωρήθηκαν ως σημαντικές. Μεταξύ των εντοπίστηκαν υποψήφιος AR miRNAs πρωταρχικός στόχος, miR-19a, miR-27a και miR-133b, βρέθηκαν με σημαντική εμπλουτισμοί μονοπάτι σε κρίσιμες κυτταρικές διεργασίες (Πίνακας S2 σε S1 αρχείου). Αυτά τα 3 miRNAs υπέστη σημαντική αυξητική ρύθμιση σε όλη την πορεία του χρόνου σύμφωνα με τα στοιχεία των μικροσυστοιχιών, και εμείς επικυρωμένων στοιχείων έκφρασης τους με την ανάλυση RT-PCR. Εμείς επιλέξαμε το δείγμα μικροσυστοιχιών σε 40 λεπτά για ανάλυση miRNA RT-PCR, δεδομένου ότι οι 3 miRNAs έδειξαν αλλαγή έκφρασης συντομότερο 40 λεπτά στο πείραμα μικροσυστοιχιών. Το αποτέλεσμα RT-PCR ήταν σύμφωνη με τα δεδομένα των μικροσυστοιχιών (Σχ. 3Β). Στη συνέχεια, μελετήσαμε τους μηχανισμούς του miR-19a, miR-27a και miR-133b στη μεσολάβηση σηματοδότηση AR σε PCA καρκινογένεση.

Επαλήθευση AR για δέσμευση σε miR-19a, miR-27a και miR-133b

χρωματίνης ανοσοκαθίζηση (μάρκας) δοκιμασίες διεξήχθη για να εξακριβώσει AR-σύνδεση προς τις προβλεπόμενες AREs των επιλεγμένων 3 miRNAs. Χρησιμοποιήσαμε τη βάση δεδομένων Genomatix [23] για την ανίχνευση AREs στα ανάντη και κατάντη 15 kb του site 5′-έναρξης προ-miRNA του. AREs με «πυρήνα Ομοιότητα = 1» επιλέχθηκαν για την επικύρωση δοκιμασία μάρκα, που αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο αγώνα μεταξύ της αλληλουχίας του DNA στόχου και συντηρημένες βάσεις της. AREs ανιχνεύονται στα ανάντη και κατάντη περιοχές του miR-19a, miR-27a και miR-133b, αντίστοιχα, που απεικονίζεται στο Σχ. 3C. Με βάση τα αποτελέσματα της ανάλυσης ChIP, βρήκαμε ότι η μεταχείριση των 10 ηΜ DHT σε κύτταρα LNCaP για 4 ώρες, οδήγησε σε σημαντική AR-σύνδεση προς το χρωματίνη των προβλεπόμενων AREs σε miR-19a, miR-27a και miR-133b, σε σύγκριση με οι έλεγχοι (Σχ. 3D). Η ανάλυση qPCR του KLK3 προαγωγό (χρησιμεύει ως θετικός έλεγχος για AR-σύνδεση), και XBP-1 προαγωγό (χρησιμεύει ως αρνητικός έλεγχος για AR-δεσμευτικές) δείχθηκαν στο Σχήμα S2 σε S1 αρχείου. Σύκο. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.