Αφηρημένο

Αν και c-Abl έχει όλο αναδειχθεί ως βασικός παράγοντας στην αντιμετώπιση βλαβών του DNA, το ρόλο της σε αυτό το πλαίσιο δεν είναι καθόλου σαφές. Μελετήσαμε την επίδραση της αναστολής της δραστηριότητας της κινάσης c-Abl με imatinib με φάρμακα χημειοθεραπείας και βρήκε μια εντυπωσιακή διαφορά στην επιβίωση των κυττάρων μετά συνδυάστηκαν μιτοξαντρόνη (ΜΧ) και θεραπεία imatinib σε σύγκριση με ένα πίνακα άλλων φαρμάκων χημειοθεραπείας. Η συνδυαστική θεραπεία που προκαλείται απόπτωση σε κύτταρα HeLa και άλλων καρκινικών κυτταρικών σειρών, αλλά όχι σε πρωτογενείς ινοβλάστες. Η διαφορά στην MX και δοξορουβικίνη σχετιζόταν με σημαντική αύξηση της βλάβης του DNA. Μεταγραφικά ενεργή ρ53 συσσωρεύεται σε κύτταρα στα οποία ανθρωπίνων θηλωμάτων Ε6 υποβαθμίζει κανονικά ρ53. Η θεραπεία συνδυασμού οδήγησε σε ενεργοποίηση της κασπάσης και απόπτωση, αλλά αυτό το αποτέλεσμα δεν εξαρτάται ούτε ρ53 ή δραστηριότητα ρ73. Παρά την αυξημένη δραστηριότητα p53, τα κύτταρα συνελήφθη στην G2 φάση έγινε ελαττωματικό σε αυτό το σημείο ελέγχου, επιτρέποντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Το αποτέλεσμα μετά τη θεραπεία MX εξαρτάται εν μέρει από το c-Abl: σύντομης παρεμβολής RNA νοκ ντάουν της c-Abl που παρέχονται κύτταρα HeLa λιγότερο ευαίσθητα σε MX. Η επίδραση του imatinib μειώθηκε κατά c-Abl siRNA υποδηλώνοντας ένα ρόλο για καταλυτικά ανενεργό c-Abl στον καταρράκτη θάνατο. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι MX έχει ένα μοναδικό κυτταροτοξική δράση, όταν η δραστικότητα της κινάσης του c-Abl αναστέλλεται. Τα αποτελέσματα της θεραπείας σε αυξημένες βλάβες στο DNA και c-Abl-εξαρτώμενη απόπτωση, που μπορεί να προσφέρει νέες δυνατότητες για την ενίσχυση της χημειοθεραπείας του καρκίνου

Παράθεση:. Alpay K, Farshchian Μ, Tuomela J, Sandholm J, K Aittokallio, Siljamäki Ε, et al. (2014) Αναστολή της c-Abl κινάσης Δραστηριότητα Αποδίδει Cancer Cells ιδιαίτερα ευαίσθητα στις μιτοξαντρόνη. PLoS ONE 9 (8): e105526. doi: 10.1371 /journal.pone.0105526

Συντάκτης: Stephan Neil Witt, Louisiana State University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Δεκεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 24 Ιούλη του 2014? Δημοσιεύθηκε: 22 Αυγούστου 2014

Copyright: © 2014 Alpay et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε οικονομικά από επιχορηγήσεις από φινλανδικό Ιατρικό Σύλλογο, Ίδρυμα Turku University και Αντικαρκινική Εταιρεία της Νοτιο-Δυτικής Φινλανδίας, η Ακαδημία της Φινλανδίας (έργα 137687 και 268360), το Ίδρυμα Καρκίνου φινλανδική έρευνα, Sigrid Ίδρυμα Juselius, Πανεπιστήμιο Turku Νοσοκομείο EVO επιχορήγησης (project 13336). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η χημειοθεραπεία σε θεραπεία όγκου λειτουργεί κυρίως μέσω προκαλώντας βλάβη στο DNA που προκαλεί ένα σύνθετο δίκτυο κυτταρικών αποκρίσεων οδηγώντας τελικά σε θάνατο των καρκινικών κυττάρων. Στον πυρήνα της απόκρισης είναι οδοί που αναγνωρίζουν τη ζημιά, την ανάσχεση του κυτταρικού κύκλου, και να θεσπίσει τον καταρράκτη θάνατο. Στη θεραπεία του καρκίνου, η ακτινοθεραπεία και η χημειοθεραπεία περισσότεροι πράκτορες λειτουργούν με άμεση βλάβη του DNA ή παρεμβαίνοντας με την αντιγραφή του DNA. Η απόκριση βλάβη του DNA των κακοήθων και φυσιολογικών κυττάρων καθορίζει την αποτελεσματικότητα και τις παρενέργειες της θεραπείας. Η τύχη του κυττάρου έγκειται στις πολύπλοκες οδούς επιδιόρθωσης του DNA που προκαλείται από πολυάριθμους τύπους βλάβης του DNA που μπορεί να συμβεί μετά γονοτοξικές θεραπεία [1]. Η επιτυχής επισκευή είναι κρίσιμη για τον φυσιολογικό ιστό για να ξεπεραστούν οι παρενέργειες της θεραπείας, αλλά στον όγκο μπορεί να οδηγήσει σε αντίσταση θεραπεία. Τα καρκινικά κύτταρα συνήθως έχουν συσσωρεύσει μεταλλάξεις σε γονίδια που εμπλέκονται στην επιδιόρθωση του DNA, προσφέροντας μια ποικιλία θεραπευτικών ευκαιριών για τους παράγοντες που διαμορφώνουν τα υπόλοιπα λειτουργικά μονοπάτια επιδιόρθωσης. Μετά DNA επιβλαβή θεραπεία, κατεστραμμένα βάσεις, αναντιστοιχίες, ή ενώσεις προσθήκης DNA συνήθως ανεκτή μέχρι ένα ορισμένο ποσοτικό όριο, αλλά μπορεί να οδηγήσει σε μεταλλάξεις αν παραμέληση της αποκατάστασης [2].

c-Abl αναστολή έχει προταθεί πρόσφατα να οδηγήσουν σε μία αλλοιωμένη απόκριση βλάβη του DNA [3]. c-Abl είναι μια κινάση τυροσίνης μη-υποδοχέα που παίζει έναν ρόλο στην διαφοροποίηση, προσκόλληση, την κυτταρική διαίρεση, ο θάνατος, και αποκρίσεις στρες και συνδέεται με διάφορες πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε οδούς απόπτωσης [4]. Οι αλλαγές σε c-Abl πρωτεΐνη διαμόρφωση ποικίλλουν, και κατά συνέπεια, οι εταίροι δέσμευσης διαφέρουν [4] – [6]. Αρκετές πρωτεΐνες όπως ΑΤΜ, DNA-PK, BRCA1, καθώς και των παραγόντων μεταγραφής p73 και RFX1 αλληλεπιδρούν με c-Abl [5]. Πιο συγκεκριμένα, c-Abl έχει αναφερθεί να αλληλεπιδρά με την ομόλογη πρωτεΐνη ανασυνδυασμού επισκευής Rad51, ανυψώσει [7] έκφραση του στο επίπεδο του γονιδίου, και να ενεργοποιήσετε με φωσφορυλίωση. Ενεργή c-Abl μπορεί να ανασταλεί από το μικρό μόριο imatinib ναρκωτικών (Gleevec? STI-571), το οποίο αναπτύχθηκε κατά της παρεκκλίνουσας πρωτεΐνης σύντηξης BCR /Abl βρεθεί σε χρόνια μυελοειδή λευχαιμία (CML) [8]. Σε κύτταρα CML, το πρώτο εξώνιο του c-Abl αντικαθίσταται από την αλληλουχία του γονιδίου BCR, με αποτέλεσμα συστατικώς δραστικό έκφραση c-Abl. Αυτή η παρεκκλίνουσα δραστικότητα κινάσης οδηγεί σε ενισχυμένη πολλαπλασιασμός, η οποία μπορεί να ανασταλεί με imatinib. Το imatinib είναι ένας ανταγωνιστικός της ΑΤΡ αναστολέας σταθεροποιητικό ανενεργό διαμόρφωση c-Abl [8]. Η δραστικότητα της κινάσης του c-Abl είναι αυξημένη μετά από βλάβη του DNA και στη συνέχεια αυξάνει τη δραστικότητα της ΑΤΜ και Atr [9]. Η θεραπεία με imatinib μειώνει το επίπεδο αυξημένων RAD51 εμπλέκονται σε διπλό σκέλος διάλειμμα (ΟΕΔ) Επισκευή και ευαισθητοποιεί διάφορους τύπους κυττάρων στη χημειοθεραπεία [10] – [13]. Άμεση αλληλεπίδραση έχει επίσης καταδειχθεί μεταξύ c-Abl και της ΟΝΑ-ΡΚ, η οποία ρυθμίζει μη ομόλογες τέλος ενώνει [14].

Η ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας είναι μια διαδικασία πολλών σταδίων που περιλαμβάνει αυχενικό μετασχηματισμό του βλεννογόνου κύτταρο με ογκογόνο των ανθρωπίνων θηλωμάτων πρωτεΐνες (HPV) Ε6 και Ε7. Ε7 αδρανοποιεί το ρυθμιστή pRb κυτταρικού κύκλου, αναστέλλοντας τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, ενώ Ε6 αδρανοποιεί το p53 πρωτεΐνη καταστολέας των όγκων, το βασικό ρυθμιστή της απόπτωσης και γενοτοξική αντίδραση στο στρες [15]. Επειδή τραχήλου καρκινικά κύτταρα φέρουν σχεδόν πάντα άγριου τύπου ρ53, το οποίο αποικοδομείται από HPV υψηλού κινδύνου, p53 ήταν παλαιότερα θεωρηθεί ως εντελώς μη-λειτουργική σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Ωστόσο, η εργασία των πολλών ομάδων κατέστησε πρόσφατα σαφές ότι η ρ53 απενεργοποίηση μπορεί να επανέλθει σε HPV Ε6-κυττάρων που φέρουν και ότι το καθεστώς ρ53 σε καρκίνο του τραχήλου κύτταρα δεν είναι ίση με εκείνη των καρκινικών κυττάρων με ένα μεταλλαγμένο γονίδιο p53 [16]. Έχουμε ήδη παρατηρήσει ότι chemoradiation επανενεργοποιεί p53 στον καρκίνο του τραχήλου κύτταρα και προάγει τον κυτταρικό θάνατο συνεργικά. Ωστόσο, όταν αναλυθεί λεπτομερώς, η πρωτεΐνη ρ53 μπορεί είτε να ενισχύσουν ή να αναστείλουν την κυτταροτοξικότητα του φαρμάκου χημειοθεραπείας [17], [18]. Mouse εμβρυϊκούς ινοβλάστες null για c-Abl είναι ελαττωματικά σε φωσφορυλίωση ρ53 και ανθεκτικά σε θάνατο μετά από γονιδιοτοξική βλάβη. Αναστολή της c-Abl με imatinib μειώνει ρ53 φωσφορυλίωση υδροξυουρία επαγόμενη [9]. Υποθέσαμε ότι η δραστική ρ53 μπορεί να ενισχύσει την επιδιόρθωση του DNA και έτσι ήθελαν να μελετηθεί η επίδραση επί του κυτταρικού θανάτου της διαφοροποίησης επισκευής. c-Abl είναι γενικά πιστεύεται να αναμεταδίδει προ-αποπτωτικών σηματοδότηση από ΑΤΜ και Atr να ρ53 και ρ73, μεταξύ των άλλων στόχων [3]. Μελετήσαμε εδώ το αποτέλεσμα της αναστολής c-Abl στη δραστηριότητα p53 σε HPV-θετικά κύτταρα και πώς σχετίζεται με τις βλάβες και θάνατο απαντήσεις.

Μια ολοκληρωμένη ομάδα φαρμάκων που εκπροσωπούν αλκυλιωτικούς παράγοντες, φάρμακα λευκόχρυσου, και τοποϊσομεράσης Ι και αναστολείς II μελετήθηκε μαζί με imatinib σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα που φέρουν τον ιό HPV και σε HPV-αρνητικές κυτταρικές γραμμές. Αναφέρουμε εδώ ότι η αναστολή c-Abl με imatinib σε συνδυασμό με ΜΧ αποτελέσματα γενοτοξική θεραπεία σε διαταραχές της επιδιόρθωσης του DNA, κατάργηση του σημείου ελέγχου G2 φάση, και μαζική απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Το ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές SiHa (HPV 16+), CaSki (HPV16 +), και HeLa (HPV 18+), των καρκινικών κυττάρων του μαστού γραμμή MCF7, και του αιδοίου Α431 καρκινικής κυτταρικής σειράς ελήφθησαν από η American Type Collection Culture (Manassas, VA, USA). Οι πρωτογενείς ανθρώπινοι ινοβλάστες έχουν περιγραφεί πριν από [19]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν ως μονοστιβάδες σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, 2 mM L-γλουταμίνη, μη απαραίτητα αμινοξέα (EuroClone, Wetherby, UK), και 50 μg /ml γενταμυκίνη (Calbiochem, San Diego, CA, USA ). Η HeLa p53 κυτταρική σειρά αναφοράς, που φέρει το p53 πλασμίδιο ανταποκριτή ptkGC3p53-Ιυο, έχει περιγραφεί προηγουμένως [18]. Παρά την παρουσία του HPV Ε6, ακόμη και οι HPV-θετικές κυτταρικές γραμμές δείχνουν κάποια δραστικότητα της ρ53 μετά γενοτοξικό στρες, αλλά η δραστηριότητα μπορεί να αποικοδομούνται από κυρίαρχο-αρνητικό ρ53 (DDp53) ή έκτοπη Ε6 οδηγείται από ένα ισχυρό προαγωγό. Το SiHa DDp53, SiHa CMV, HeLa DDp53, HeLa CMV (κενό φορέα), και SiHa Ε6 κυτταρικές σειρές έχουν επίσης περιγραφεί προηγουμένως [18].

Το κυρίαρχο-αρνητικό ρ53 κυτταρική γραμμή που εκφράζει HeLa (HeLa DD ) προήλθε από επιμόλυνση της μητρικής κυτταρικής σειράς με ένα πλασμίδιο που εκφράζει ένα περικομμένο ρ53 ποντικού που περιέχει υπολείμματα αμινοξέων 1-14 και 302 έως 390 υπό τον έλεγχο του υποκινητή CMV. Σταθερά επιμολυσμένα επελέγησαν με 0,8 mg /ml G418.

Σε βραχυχρόνιες δοκιμασίες κυτταρικής βιωσιμότητας, 1-2 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο (ανάλογα με την κυτταρική γραμμή) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων , και το μέσο αντικαταστάθηκε με φάρμακα αραιώνονται με μέσο. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με WST-1 παράγοντα (Roche, Mannheim, Germany) ή παράγοντα ΜΤΤ (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, ΜΟ, USA), και η απορρόφηση μετρήθηκε στα 450 nm (Multiskan microreader πλάκα? Labsystems, Φινλανδία) ή στα 570 nm αναγνώστη πολλαπλών δίσκων (Tecan?. Tecan, Ελβετία), αντίστοιχα

Για κλωνογονική δοκιμασίες ανάπτυξης, SiHa και HeLa κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων 48 ώρες πριν από τη θεραπεία. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε θεραπεία για 6 ώρες και στη συνέχεια σε επεξεργασία με θρυψίνη και εναιωρούνται σε φρέσκο ​​μέσο και εμβολιάστηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων με 3 μΜ imatinib. κύτταρα SiHa επωάστηκαν για 14 ημέρες και τα κύτταρα HeLa για 7 ημέρες. Μετά την επώαση, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 1:01 ακετόνη-μεθανόλη και χρωματίστηκαν με Giemsa (Merck, Σταθμός Whitehouse, NJ, USA). Στη συνέχεια, κλώνοι είτε μετρήθηκαν με το χέρι ή να αναλυθούν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Caspase 3/7 δραστηριότητα των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση καθορίστηκε χρησιμοποιώντας το Αρο-ΟΝΕ Caspase-3/7 δοκιμασία ομοιογενές κασπάσης (Promega).

Αντιδραστήρια, τα ναρκωτικά, και τα αντισώματα

Η χημειοθεραπεία ενώσεις μιτοξαντρόνη (MX) (Wyeth-Lederle, Φινλανδία), δοξορουβικίνη (DXR) (Nycomed, Roskilde, Δανία), κυκλοφωσφαμίδη (Orion Pharma, Espoo, Φινλανδία), η τοποτεκάνη (GlaxoSmithKline, Uxbridge, Middlesex, Ηνωμένο Βασίλειο), ετοποσίδη (Pfizer), σισπλατίνη (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA), docetaxel (Aventis), και καρβοπλατίνη (Bristol-Myers Squibb, Princeton, NJ, USA) φυλάχθηκαν και παρασκευάζονται όπως περιγράφεται [17]. Το imatinib ήταν ένα δώρο από τη Novartis Pharmaceuticals (Βασιλεία, Ελβετία). Το διάλυμα αποθέματος του imatinib στα 200 mM παρασκευάστηκε με διάλυση της ένωσης εντός DMSO. Η c-kit και PDGF-α και β αποκλεισμού του υποδοχέα AG1296 αγοράστηκε από την Calbiochem (αρ. Κατ. 658551). PDGF-ΒΒ αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την κηλίδωση Western: ποντικού μονοκλωνικό DO-1 για ρ53 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-GADD45α (.. Cell Signaling, Cat Νο 3518), πολυκλωνικά κουνελιού αντι-φωσφο -PDGF υποδοχέα β (Cell Signaling, cat ηο 3161..), ποντικού μονοκλωνικό αντι-RAD51 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA?. cat Νο 35-6500), μονοκλωνικό ποντικού αντι-κυκλίνης Β1 (BD Biosciences, cat. αρ. 554178) και μονοκλωνικά αντι-p73 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Το RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ RNeasy (Qiagen, Hilden, Germany).

σύντομης παρεμβολής RNA και επιμολύνσεις

Η c-Abl σύντομης παρεμβολής RNAs (siRNAs) ελήφθησαν από την Invitrogen (Stealth, Carlsbad, CA, USA?…. cat Νο 1299003), και μη-στόχευση siRNA (Qiagen, cat Νο 1027281) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η επιμόλυνση των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με 75 ηΜ τριών μεμονωμένων siRNAs που στοχεύουν c-Abl και ελέγχουν siRNA χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο siLentFect Λιπιδίων (Bio-Rad).

p53 ρεπόρτερ δοκιμασία

Σταθερό ptkGC3p53luc-BSD οι κυτταρικές σειρές SiHa, CaSki και HeLa, καθώς και η σύνθεση του p53 πλασμίδιο ανταποκριτή ptkGC3p53-Ιυο έχουν περιγραφεί προγενέστερα [17]. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων (10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Αφού αφέθηκε για προσκόλληση των κυττάρων για 24 ώρες, οι θεραπείες ξεκίνησαν για τις υποδεικνυόμενες διάρκειες. Τα ζωντανά κύτταρα σε κάθε φρεάτιο προσδιορίζεται χρωματομετρικά με τη δοκιμασία WST-1. Στη συνέχεια, τα κύτταρα ξεπλύθηκαν με PBS και επικαλύφθηκαν με 100 μΙ ενός μίγματος που περιέχει 50% PBS και 50% Bright-Glo αντιδραστήριο δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA). Η δραστικότητα της λουσιφεράσης ποσοτικοποιήθηκε με τη βοήθεια ενός μετρητή φωταύγειας σύλληψης υβριδίου (Digene, Gaithersburg, MD, USA). Λουσιφεράσης αναγνώσεις χωρίστηκαν από WST-1 τιμή για να ληφθεί κανονικοποιημένη δραστηριότητα ανταποκριτή.

κηλίδωση Western

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας 200 μΐ προτύπου 1 × ρυθμιστικού δείγματος SDS. Τα προκύπτοντα εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων έβρασαν και ακολούθως διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες Immobilon-P φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πρώτα αντισώματα και δευτερογενή ανίχνευση έγινε με ραφανιδική αντι-ποντικού υπεροξειδάσης (HRP) (GE Healthcare, NJ, USA), HRP αντι-κουνελιού (ϋΑΚΟ, Glostrup, Δανία), και ECL (GE Healthcare , NJ, USA). Βήτα-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Οι ταινίες κηλιδώσεως Western ψηφιοποιήθηκαν με μια ChemiDoc πλατφόρμα ανάλυση γέλης MP (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). και αναλύονται με τα Φίτζι (ImageJ) ver 1.47q (Wayne Rasband, ΝΙΗ, USA) χρησιμοποιώντας την επιλογή Τζελ.

Η κυτταρομετρία ροής

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου έγινε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση μαζί με κυμαινόμενο μη βιώσιμα κύτταρα. Τα κύτταρα πλύθηκαν μία φορά με PBS και εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού νατρίου (40 mM κιτρικό νάτριο, 0,3% Χ-100, 0,05 mg ιωδιούχου Triton /ml προπίδιο, PBS) 20 λεπτά πριν από την ανάλυση. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας FACSCalibur (Becton Dickinson, CA, USA) και λογισμικό CellQuest Pro (Becton Dickinson). αναλύσεις του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης πραγματοποιήθηκαν με ModFit LT (Verity Software House, Inc., Topsham, ME, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) και ρέει λογισμικού ver. 2.5 (κ Perttu Terho, Turku Κέντρο Βιοτεχνολογίας, Φινλανδία, www.flowingsoftware.com), αντίστοιχα. Για να αναλυθεί περαιτέρω η επαγωγή απόπτωσης μετά την επεξεργασία imatinib κύτταρα HeLa και MX + αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υποδεικνύεται φάρμακα για 24 και 48 ώρες. Μέσο και τα κύτταρα συλλέχθηκαν και τα δείγματα βάφτηκαν με κιτ Annexin-V-FITC (ab14085? Abcam, Cambridge, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα δεδομένα αποκτήθηκαν με ένα κυτταρόμετρο ροής FACSCalibur, και αναλύονται με Ρέει λογισμικού.

Real-time ποσοτική PCR αντίστροφης μεταγραφής

Η μέθοδος RT-PCR έχει περιγραφεί πριν [18]. Οι εκκινητές HPV 18 Ε6, προς τα εμπρός, 5′-TGGCGCGCTTTGAGGA-3 ‘, και αντίστροφη, 5′-TGTTCAGTTCCGTGCACAGATC-3′? και EF1α, προς τα εμπρός, 5’-CTGAACCATCCAGGCCAAAT-3 ‘, και να αντιστραφεί, 5′-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3’. Τα ποσά των HPV 18 Ε6 μεταγραφές ομαλοποιήθηκαν ενάντια στις αναγνώσεις για EF1α.

δοκιμασία Comet

βλάβες στο DNA μελετήθηκε με ένα απλό κιτ ηλεκτροφόρησης κυττάρων γέλης (Trivigen, Gaithersburg, MD, USA). Η δοκιμασία διεξήχθη σε αλκαλικές συνθήκες για την ανίχνευση τόσο μονής και διπλής έλικος βλάβη του DNA. Η ηλεκτροφόρηση γέλης μονοκύτταροι του DNA έγινε όπως περιγράφεται από τον κατασκευαστή. Εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus ΒΧ60 φθορισμού μικροσκόπιο (Zeiss AXIOVERT 200 Μ) σε × 20 μεγέθυνση.

Time-lapse μικροσκοπία

Εικόνες συνελήφθησαν σε ένα διάστημα ωρών για 72 ώρες με IncuCyte ZOOM κινητική σύστημα απεικόνισης (Έσσεν Bioscience, Michigan, USA). επιλέχθηκαν αντιπροσωπευτικά φρεάτια και ταινίες κατασκευάστηκαν με ImageJ ver 1.47d (Wayne Rasband, ΝΙΗ, USA). Bar αντιπροσωπεύει 200 ​​μm.

Στατιστικά

Για να αξιολογηθούν οι διαφορές μεταξύ των ομάδων, χρησιμοποιήσαμε t-τεστ του Student. Μία τιμή ρ κάτω από 0.05 θεωρήθηκε για να δείξει στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

Αναστολή της c-Abl με imatinib ενισχύει την κυτταροτοξική δράση του μιτοξαντρόνης σε καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε πρωτογενείς ινοβλάστες

Η ισχύς της ιματινίμπης στην ενίσχυση της κυτταροτοξικότητας σε διαλογή σε ένα μεγάλο πάνελ των φαρμάκων χημειοθεραπείας. Στις δοκιμασίες βραχυπρόθεσμες κυτταροτοξικότητα, imatinib από μόνη της δεν ήταν κυτταροτοξική σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές γραμμές στα 3 μΜ έως 10 μΜ. Όταν HeLa, CaSki και SiHa κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον αναστολείς τοποϊσομεράσης Ι (τοποτεκάνη και ετοποσίδη), νουκλεοσιδικά ανάλογα (γεμσιταβίνη, φθορουρακίλη, και κυταραβίνη), αλκυλιωτικούς παράγοντες (κυκλοφωσφαμίδη και δακαρβαζίνη), ή σισπλατίνη, imatinib δεν ενίσχυσε την κυτταροτοξικότητα (δεδομένα δεν φαίνεται). Ούτε επηρεάζει ανθρακυκλίνη (doxorubicin, DXR) αντιμετωπίζονται κύτταρα (Εικόνα 1Α). Η επίδραση της καρβοπλατίνης ενισχύθηκε δύο φορές με την προσθήκη imatinib για 48 ώρες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε αντίθεση με όλες τις άλλες φάρμακα χημειοθεραπείας που δοκιμάστηκαν, imatinib παρουσίασαν δραματική επίδραση μαζί με μιτοξαντρόνη (ΜΧ), ένας αναστολέας τοποϊσομεράσης II (Σχήμα 1Α). Η επίδραση του imatinib ήταν ίση μεταξύ 3 μΜ και 10 μΜ υποδεικνύοντας ότι η δραστικότητα κινάσης μπλοκάρεται στις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, ακόμη και σε 3 μΜ.

κύτταρα (Α) Ανθρώπινη καρκίνου του τραχήλου (HeLa) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MX ( 0,6 μΜ), DXR (0,8 μΜ), imatinib (10 μΜ) ή συνδυασμούς τους. δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας WST εκτελέστηκε σε 12 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες. Τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με τον αριθμό των κυττάρων εντός μέσου φρεάτια μόνο περιέχουν. *** P & lt? 0.001 ανεξάρτητα δείγματα T-test. (Β) Τόσο η Α-431 κυτταρική σειρά καρκινώματος του αιδοίου το οποίο έχει μια παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο γονίδιο ρ53 και MCF-7 κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού η οποία έχει ένα άγριου τύπου ρ53 γονίδιο δείχνουν μια ενισχυμένη επίδραση όταν MX και imatinib συνδυάζονται. Το imatinib δεν αυξάνει την κυτταροτοξικότητα της MX στην πρωτοβάθμια ινοβλάστες. Οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν στις 48 ώρες χρησιμοποιώντας κυτταρική ανάλυση βιωσιμότητας WST. ** P & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001 ανεξάρτητα δείγματα T-test. (Γ) κλωνογονική δοκιμασία. Imatinib ενισχύει MX κυτταροτοξικότητα τόσο στο κυτταρική σειρά HeLa CMV με άγριου τύπου ρ53 και άδειο φορέα και κυτταρική σειρά HeLa DDp53 μεταφέρουν ένα κυρίαρχο αρνητικό ρ53. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάθε φάρμακο για 12 ώρες. Στη συνέχεια, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο χωρίς φάρμακα. Η συγκέντρωση του imatinib ήταν 3 μΜ ενώ MX χρησιμοποιήθηκε σε διαφορετικές συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 1 ηΜ έως 40 ηΜ. Οι κλώνοι μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. Πείραμα έγινε εις τριπλούν, μέση ± SD. *** P & lt?. 0.001

Η

Το ενισχυμένο φαινόμενο παρατηρήθηκε επίσης σε CaSki και SiHa κύτταρα, αν και σε μικρότερο βαθμό (Σχήμα S1). Οι κυτταρικές γραμμές που θέλαμε πρωτίστως να δοκιμή προήλθαν από καρκίνο του τραχήλου της μήτρας HPV-θετικές. Ωστόσο, το αποτέλεσμα δεν φαίνεται να έχουν περιοριστεί σε αυτά τα κύτταρα. Τα φάρμακα δοκιμάστηκαν με δύο καρκινικές κυτταρικές σειρές διαφορετικής προέλευσης: Το καρκίνωμα του αιδοίου Α431 κυτταρική γραμμή έχει μια παρερμηνεύσιμη μετάλλαξη στο γονίδιο ρ53, και η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF7 έχει ένα άγριου-τύπου ρ53. Η επιβίωση ήταν εντυπωσιακά παρόμοια με τις κυτταρικές σειρές HPV-θετικών (Σχήμα 1Β). Αντίθετα, πρωτογενείς μη-μετασχηματισμένες ινοβλάστες δεν ήταν πιο ευαίσθητα όταν imatinib προστέθηκε στη θεραπεία ΜΧ (Σχήμα 1Β). Αυτό το αποτέλεσμα δείχνει ότι το παρατηρούμενο αποτέλεσμα δεν περιορίζεται σε HPV-θετικά καρκινικά κύτταρα αλλά μπορεί να συμβεί ευρύτερα ανεξάρτητα από την κατάσταση της ρ53. Ωστόσο, τα μη μετασχηματισμένα κύτταρα μπορεί να δεικνύουν αντίσταση σε αυτή τη θεραπεία.

Η ενισχυμένη επίδραση του imatinib παρατηρήθηκε επίσης στη μητρική και διαφορετικά τροποποιημένα κύτταρα HeLa και SiHa με τρόπο ανεξάρτητο από είτε ρ53 είτε Ε6 (Εικόνα S2). MX περαιτέρω μελετήθηκε σε κλωνογονική δοκιμασίες ανάπτυξης για την παρακολούθηση της ικανότητας μακροχρόνια ανάκτηση των κυττάρων. MX συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 1 ηΜ μαζί με 3 μΜ imatinib ανέστειλαν κλωνική ανάπτυξη κυττάρων HeLa εντελώς, και οι δύο κύτταρα που φέρουν τον φορέα ρ53-ηυΙΙ και κενή (Σχήμα 1 C). Σε κυτταρικές σειρές SiHa, 3 μΜ imatinib μόνη της δεν επηρέασε κλωνική ανάπτυξη. Η ευαισθησία των κυττάρων CaSki για προσθήκη imatinib ήταν μεταξύ εκείνη των κυττάρων SiHa και HeLa (Εικόνα S3).

μιτοξαντρόνη επάγει κασπάσης 3/7, η οποία ενισχύεται από το κλείδωμα c-Abl με imatinib

Η θεραπεία με MX αυξάνει την απελευθέρωση της κασπάσης 3 και 7 από τα μιτοχόνδρια ενδεικτική της απόπτωσης. Imatinib από μόνη της δεν είναι σε θέση να τροποποιήσει αυτά τα επίπεδα (Σχήμα 2). Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0,6 μΜ MX και 0,8 μΜ DXR αύξησε τη δραστικότητα της κασπάσης 2,5 φορές, ενώ η θεραπεία MX + συνδυασμό με imatinib αύξησε τη δραστηριότητα 4 φορές. Το imatinib δεν αύξησε τη δραστικότητα που επάγεται από DXR μόνον.

Κύτταρα

HeLa υποβλήθηκαν σε θεραπεία με φάρμακα ενδείκνυται για 48 ώρες. Στη συνέχεια, φρέσκο ​​μέσο αντικαταστάθηκε και κασπάσης 3/7 δραστικότητα μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία ELISA. Πείραμα έγινε εις τριπλούν, μέση ± SD. *** Ρ & lt? 0.001 T-test

Η

Η αναστολή της δραστικότητας της κινάσης c-Abl αυξάνει βλάβη του DNA σε ΜΧ-επεξεργασμένα κύτταρα

Η προσθήκη imatinib να MX αυξημένη κομήτη ουράς σε κύτταρα HeLa. λαμβάνοντας υπόψη ότι η imatinib από μόνη της δεν είχε καμία επίδραση (Σχήμα 3Α). Το imatinib δεν προκάλεσε ουράς στο DXR-επεξεργασμένα κύτταρα. Η ποσότητα της πρωτεΐνης GADD45α αυξήθηκε ελαφρά ακόμη και στα προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου με MX + imatinib (5 φορές, Σχήμα 3Β). Αυτή η αύξηση φαίνεται να ρυθμίζεται στο μεταγραφικό επίπεδο, διότι έχουμε επίσης παρατηρήσει μια αξιοσημείωτη αύξηση στα επίπεδα μεταγραφής GADD45α μετά τη θεραπεία συνδυασμού σε αναλύσεις RNA μικροσυστοιχιών (μη δημοσιευμένα δεδομένα). Όπως και η συσσώρευση της πρωτεΐνης p53 στο κελί του στρες, αυξάνει την μεταγραφή GADD45α κάτω από την πίεση, μεταξύ άλλων με βλάβες στο DNA. Τόσο DXR και ΜΧ αυξημένα επίπεδα RAD51 (10 φορές), και imatinib προεπεξεργασίας ανέστειλαν την αύξηση εξίσου (20%), αλλά ενίσχυσε την συσσώρευση της ρ53 όταν προστεθεί σε MX (13 φορές, Εικόνα 4).

(Α) βλάβη του DNA στα κύτταρα HeLa μελετήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Comet μετά τη θεραπεία με MX (0,6 μΜ), DXR (0,8 μΜ) και imatinib (5 μΜ), ή συνδυασμούς τους. Cometting (ουράς) υποδηλώνει βλάβη του DNA. (Β) Το imatinib συνδυάζεται με MX αυξάνει το επίπεδο της GADD45α. Western blot των επιπέδων της πρωτεΐνης GADD45α από λύματα ολόκληρων κυττάρων. κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MX (0,6 μΜ), DXR (0,8 μΜ), imatinib (5 μΜ), ή συνδυασμούς τους για 30 ώρες.

Η

Western blot της ρ53 και RAD 51 σε κύτταρα HeLa. Imatinib συνδυασμό με MX αυξάνει τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ53 σε κύτταρα HeLa. επίπεδο RAD51 ήταν ελαφρώς μειωμένη σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με imatinib και MX. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MX (0,6 μΜ), DXR (0,8 μΜ), imatinib (5 μΜ) ή συνδυασμοί τους για 30 ώρες.

Η

ενεργοποιήσεως ρ53 μιτοξαντρόνη επαγόμενη ενισχύεται από την αναστολή της c-Abl κινάση δραστηριότητα

τα φάρμακα χημειοθεραπείας που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη επάγουν διάφορες μορφές βλάβης του DNA, τα οποία ρ53 στα κύτταρα στόχους αισθήσεις. ρ53 ενεργοποιείται σε κύτταρα του τραχήλου, παρά την δραστηριότητα αποικοδόμησης του Ε6 [16], [19]. Μετρήσαμε δραστικότητα ανταποκριτή ρ53 σε κυτταρικές σειρές HeLa, CaSki, SiHa και με DXR, MX, και σισπλατίνη. Όταν συγκρίθηκαν τα φάρμακα, σισπλατίνη που προκαλείται από το ρεπόρτερ περισσότερο από MX σε κύτταρα HeLa και CaSki αλλά παρομοίως σε κύτταρα SiHa, και 0.6 μΜ MX μόνη της δεν ενεργοποιούν το ρεπόρτερ καθόλου σε κύτταρα HeLa στις 48 ώρες. DXR επάγεται ο ανταποκριτής περισσότερο από σισπλατίνη και MX σε όλες τις κυτταρικές σειρές (Πίνακας 1). Το imatinib μόνο του δεν μετέβαλε σημαντικά τη δραστικότητα σε οποιαδήποτε από τις κυτταρικές σειρές. Προσθέτοντας imatinib σε σισπλατίνη μείωσε ελαφρώς τη δραστηριότητα, αλλά δεν υπήρξε καμία επίδραση για DXR. Σε αντίθεση, η προσθήκη imatinib έως 0,6 μΜ MX αύξησε την δραστικότητα σε όλες τις κυτταρικές σειρές, κατά 50% σε κύτταρα SiHa, αλλά τέσσερις φορές σε κύτταρα HeLa και οκτώ φορές σε κύτταρα CaSki. Ο περιορισμός αυτής της προσέγγισης είναι ότι η άμεση σύγκριση μεταξύ των κυτταρικών σειρών δεν μπορεί να γίνει λόγω των διαφορετικών ποσοτήτων ενσωματωμένο πλασμίδιο ανταποκριτή. Σύμφωνα με τις δοκιμασίες ρεπόρτερ, επίπεδο πρωτεΐνης ρ53 αυξήθηκε σημαντικά σε αναλύσεις Western blot (Σχήμα 4). Είδαμε καμία μείωση στο επίπεδο p53 μόνο με imatinib, τα αποτελέσματα τα οποία ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα ανάλυσης δημοσιογράφος.

Η

p73 είναι μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών p53 και αλληλεπιδρά με c-Abl άμεσα και μπορεί επίσης να επάγει απόπτωση. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης p73 δεν άλλαξε μετά τις θεραπείες (Σχήμα S4).

Το imatinib δεν μεταβάλλει τα επίπεδα HPV Ε6

Τα περισσότερα από τα φάρμακα χημειοθεραπείας μειώσει το ποσό του Ε6 mRNA [17]. Θέλαμε να γνωρίζουμε εάν το imatinib προκαλεί μείωση στην έκφραση Ε6 στα κύτταρα HeLa είτε μόνη της είτε σε συνδυασμό με ΜΧ. Βρήκαμε ότι 1 μΜ MX μειώνει τα επίπεδα Ε6 mRNA σε κύτταρα HeLa κατά 50% περίπου και ότι 5 μΜ imatinib μόνη δεν μειώνει το επίπεδο του Ε6 mRNA στα κύτταρα αυτά. Ένας συνδυασμός 5 μΜ imatinib και 1 μΜ MX δεν μείωσε το επίπεδο του Ε6 mRNA σε κύτταρα HeLa περισσότερο από 1 μΜ MX μόνο. ​​

Imatinib καταργεί διακοπή φάσης S που προκαλείται από MX και αυξάνει την απόπτωση

σε κύτταρα HeLa που έλαβαν μόνο imatinib, στις 24 ώρες, κατανομή του κυτταρικού κύκλου ήταν η ίδια όπως σε κύτταρα με μέσο μόνο, αλλά υπήρχαν ελαφρώς περισσότερα κύτταρα σε φάση S μετά από 48 ώρες (Σχήμα 5Α). Στις 24 ώρες και ειδικότερα 48 ώρες, DXR συσσωρευμένη των κυττάρων σε φάση G2. Προσθέτοντας επαγόμενη imatinib σύλληψης φάσης S στην ανάλυση λογισμικού? Ωστόσο, στις 48 ώρες με DXR + imatinib, φάνηκε να είναι ένας μικρός πληθυσμός G2 που το λογισμικό ανάλυσης απέτυχε να ανιχνεύσει εκεί. MX-επεξεργασμένα κύτταρα προχώρησαν σε 24 ώρες σε S και G2, αλλά η εκτεταμένη επώαση μετά από 48 ώρες έδειξε μία σαφή σύλληψη G2. Προσθέτοντας imatinib σε MX έδειξαν σε 24 ώρες πληθυσμού προχωρά στην G1, υποδεικνύοντας κατάργηση της σύλληψης. Στις 48 ώρες, δεν υπήρχαν κύτταρα πέρα ​​φάσης S, αλλά ακόμα και μια σαφής πληθυσμός G1. Το εύρημα αυτό υποδηλώνει ότι τα κύτταρα είχαν πρόωρα εισέλθει απευθείας από τη φάση S για τη μίτωση και ότι το imatinib οδήγησε αυτό το αποτέλεσμα. Εναλλακτικά, MX + imatinib μπορεί να προκαλέσει μια καθυστέρηση από G1 /S για να G2. Ωστόσο, πολλές ανεπιτυχείς μιτώσεις εντοπίστηκαν στο βίντεο time-lapse του MX + imatinib που έλαβαν κύτταρα προκρίνοντας την ερμηνεία ότι η σύλληψη του κυτταρικού κύκλου καταργήθηκε (Βίντεο S1). Προσδιορίσαμε επίσης τα επίπεδα Β1 κυκλίνης, ένα καλά αναγνώρισε μιτωτική δείκτη, στις κυτταρικών πληθυσμών που πήραν φάρμακο για τη συλλογή περαιτέρω αποδείξεις για την αντίληψη ότι οι συν-κατεργασμένα κύτταρα MX + imatinib είναι ικανά διαδικασίας σε κυτταρικό κύκλο και εισέρχονται Μ-φάση. Βρήκαμε ότι η επεξεργασία των κυττάρων HeLa με DXR, DXR + imatinib, και MX + imatinib οδηγεί σε συσσώρευση της κυκλίνης Β1. Το επίπεδο της πρωτεΐνης των κυττάρων που έλαβαν imatinib ήταν κάτω από το επίπεδο ανίχνευσης ομοίως με τα μη επεξεργασμένα στοιχεία ελέγχου που εμφανίζουν έκφραση βασικό επίπεδο κυκλίνης Β1 (Σχήμα S5).

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με MX (0,6 μΜ), DXR (0.8 μΜ), imatinib (5 μΜ) ή συνδυασμοί τους για 24 και 48 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο για την ποσοτικοποίηση περιεχόμενο DNA με τη χρήση κυτταρομετρίας ροής. Ιστογράμματα δείχνουν κατανομές κυτταρικού κύκλου. (Β) Annexin-V (Χ-άξονας) έναντι PI (Υ-άξονας) χρώση κυττάρων HeLa σε επεξεργασία με υποδεικνύεται φάρμακα για 48 ώρες. Ποσοστά δείχνουν την πρώιμη (κάτω δεξιά τεταρτημόριο) και αργά (άνω δεξιά τεταρτημόριο) αποπτωτικό κλάσμα. MX και imatinib δείχνουν μια σαφή συνεργιστική επίδραση στην επαγωγή της απόπτωσης. Τα φάσματα εκπομπής ΡΙ και DXR συμπίπτουν στο κανάλι FL2, καθιστώντας αδύνατο να διακρίνει την πρώιμη αποπτωτική πληθυσμού από τα τέλη του αποπτωτικών πληθυσμού DXR-επεξεργασμένα κύτταρα. Ωστόσο, όταν τα δεξιά τεταρτημόρια προστέθηκαν μαζί, δεν υπήρχε καμία διαφορά μεταξύ DXR και DXR + πληθυσμούς imatinib.

Η

Το imatinib αύξησε τα γεγονότα G1 υπο το MX-επεξεργασμένα κύτταρα HeLa, εν μέρει ενδεικτική της απόπτωσης. Ο πληθυσμός sub G1 ήταν η μεγαλύτερη (38,6%) στην ομάδα MX + imatinib στις 48 ώρες. Imatinib αύξησε επίσης DXR επαγόμενη sub G1, αλλά σε μικρότερο βαθμό (17,8%) στις 48 ώρες (Πίνακας S1). Για να αναλυθεί περαιτέρω η πιθανή απόπτωση που χρωματίστηκαν τα κύτταρα με αννεξίνη V, η οποία είναι ένας δείκτης της πρώιμης απόπτωσης. Βρήκαμε ότι imatinib αυξάνει σημαντικά το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων σε MX-επεξεργασμένα κύτταρα, αλλά απέτυχε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε αύξηση όταν imatinib προστέθηκε σε DXR (Σχήμα 5Β) κυτταρομετρία ροής αποτελέσματα είναι σύμφωνα με το πείραμα κασπάσης που υποστηρίζουν την ιδέα ότι imatinib με MX είναι πιο ισχυρός επαγωγέας κυτταρικού θανάτου από ό, τι με DXR. Imatinib έχει προηγουμένως αναφερθεί ότι προκαλεί G1 σύλληψη σε καρκίνο κεφαλής και τραχήλου κυτταρικές σειρές [21], ενώ MX και DXR αιτία G2 σύλληψης [22]. Είδαμε καμία σύλληψη G1 μόνο με imatinib.

Ελάττωση της c-Abl με siRNA παρεμποδίζει την κυτταροτοξικότητα του MX + imatinib

Το imatinib και MX έδειξε αθροιστική δράση στη μείωση του αριθμού ελέγχου siRNA HeLa κύτταρα. Όταν c-Abl χτυπήθηκε κάτω με siRNA, βρήκαμε ότι ο πολλαπλασιασμός των μη επεξεργασμένων κυττάρων μειώθηκε κατά 30-50% σε επαναλαμβανόμενη πειράματα (Σχήμα 6, βίντεο S2). Τόσο οι καμπύλες ανάπτυξης και των δεδομένων μικροσκοπίας time-lapse δείχνουν μια μικρή αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων c-Abl siRNA HeLa. Ωστόσο, ούτε έλεγχος siRNA ούτε c-Abl siRNA μόνος επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Αυτό το αποτέλεσμα υποδηλώνει ότι το c-Abl απαιτείται για την κανονική πολλαπλασιασμό αυτών των κυττάρων. Στόχευση του c-Abl σε κύτταρα HeLa με siRNA παρέχονται οι κύτταρα λιγότερο ευαίσθητα σε MX. CaSki κύτταρα ήταν επίσης λιγότερο ευαίσθητα σε MX όταν c-Abl ήταν μειωτικά με siRNA, αλλά δεν παρατηρήθηκε αναστολή του πολλαπλασιασμού. Αυτά τα κύτταρα ήταν πιο δύσκολο για την επιμόλυνση με siRNA και μόνο το 40% αποτελεσματικότητα επιτεύχθηκε. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγήσει γιατί ο πολλαπλασιασμός δεν ανεστάλη σε αυτά τα κύτταρα. Επιπλέον, η συνδυαστική επίδραση του imatinib μειώθηκε σημαντικά, εμπλέκοντας c-Abl ως κεντρικό στόχο του imatinib σε αυτό το αποτέλεσμα. Το τελευταίο εύρημα είναι επίσης σύμφωνη με πειράματα με άλλους στόχους του imatinib, PDGF και c-Kit. AG1296 είναι γνωστό ότι αναστέλλει ισχυρώς σηματοδότηση της ανθρώπινης α- PDGF και β-υποδοχέων, καθώς και της σχετικής υποδοχέα c-Kit παράγοντα βλαστικών κυττάρων, σε συγκέντρωση 1 μΜ και 5 μΜ συγκεντρώσεις, αντίστοιχα. AG1296 δεν θα μπορούσε να μιμούνται τη δράση της imatinib με MX (Σχήμα 7Α). Επιπλέον MX δεν έχει καμία επίδραση επί της φωσφορυλίωσης του PDGF υποδοχέα (Σχήμα 7Β). Επιπλέον, το πείραμα siRNA υπονοείται ότι η κινάση-δραστικό c-Abl είναι υπεύθυνη για την επιβίωση των κυττάρων μετά από βλάβη MX. Της σημασίας, αυτό το πείραμα σημεία σε διαφορετικούς ρόλους για κινάση-ενεργό και κινάση-ανενεργό c-Abl. Κινάση ανενεργού c-Abl φαίνεται ότι απαιτείται για απόπτωση με MX, αλλά κινάση-δραστικό c-Abl είναι βασικός παράγοντας για την επισκευή βλάβης του DNA μετά MX σε κύτταρα HeLa.

(Α) HeLa και CaSki κύτταρα επιμολυσμένα με μη στόχευση ή c-Abl siRNA (75 ηΜ). Η ανάλυση στυπώματος Western διεξήχθη για να εξεταστεί η επίδραση των siRNA. Επίπεδο c-Abl ποσοτικοποιήθηκε και διορθώθηκε για το επίπεδο β-ακτίνης. Οι τιμές αναλογίες με τα επίπεδα ελέγχου siRNA για κάθε κυτταρική γραμμή. (Β) κύτταρα HeLa, και (Γ) CaSki κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή c-Abl siRNA. Αφού τα κύτταρα treansfection υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με MX (0,6 μΜ), imatinib (5 μΜ) και ο συνδυασμός τους για 48 ώρες. Σχετική ποσό των επιζώντων κυττάρων προσδιορίστηκε με WST-1 προσδιορισμό. Τα αποτελέσματα είναι από δύο ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05, ** p & lt? 0,01, *** p & lt? 0.001. NS, δεν είναι σημαντική.

Η

(Α) κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με MX και AG1296 ή συνδυασμούς τους για 48 ώρες και μετρήθηκαν με WST-1 προσδιορισμό. Wang et al. Chen et al.