Αφηρημένο

Οι βιοδείκτες και νέων θεραπευτικών στόχων χρειάζονται επειγόντως σε καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC). Ο υποδοχέας της κινάσης της τυροσίνης ψευδο 7 (PTK7) εμπλέκεται σε επίπεδη κυτταρική πολικότητα και είναι απορρυθμισμένη σε διάφορες κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένου CRC. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για την έκφραση της πρωτεΐνης της στην ανθρώπινη CRC, ή για μια πιθανή συσχέτιση της έκφρασης της με κλινικά σημεία. Χρησιμοποιώντας ένα κλινικά σχολιασμένη μικροσυστοιχιών ιστών (TMA) που παράγεται από από 192 συνεχόμενες CRC ασθενείς που έλαβαν θεραπεία με αρχική χειρουργική επέμβαση, εξετάσαμε την έκφραση PTK7 με ανοσοϊστοχημεία σε καρκινικό ιστό και συμφωνημένα κανονική βλεννογόνων, και συσχετίστηκε η έκφραση της με κλινικο-παθολογικά χαρακτηριστικά και την έκβαση των ασθενών. εξάντληση PTK7 από ειδικές shRNA σε HCT116 και κυτταρικές σειρές HCT15 CRC βρέθηκε να επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, αντίσταση στα φάρμακα και τη μετανάστευση των κυττάρων. Η ανάπτυξη του όγκου και τη μεταστατική φαινότυπο ερευνήθηκαν

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο ξενομοσχεύματος ποντικού κυττάρων CRC με διαμορφωμένη έκφραση των επιπέδων PTK7. PTK7 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε CRC ιστό συγκριτικά με συμφωνημένα υγιείς βλεννογόνους, και σημαντική υπερέκφραση βρέθηκε στο 34% των ασθενών. PTK7 υπερέκφραση σχετίζεται σημαντικά με μειωμένη μετάσταση επιβίωση χωρίς μη μεταστατικό ασθενείς. Σε HCT116 και HCT15 κύτταρα, shRNA PTK7 μειωθεί η μετανάστευση, αλλά δεν επηρέασε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την αντίσταση στα φάρμακα. Σε ένα ξενομόσχευμα ποντικού HCT15 κυττάρων, ρύθμιση προς τα κάτω του PTK7 οδήγησε σε μειωμένη ανάπτυξη του όγκου, ενώ η υπερέκφραση του στην PTK7-αρνητικά καρκινικά κύτταρα οδήγησε σε αυξημένη μεταστατική γεγονότα. έκφραση PTK7 αντιπροσωπεύει έτσι μια πιθανή προγνωστική βιοδεικτών και ένα νέο θεραπευτικό στόχο στην CRC

Παράθεση:. Lhoumeau Α-Γ, Martinez S, Boher J-M, Monges G, Castellano R, Goubard A, et al. (2015) Η υπερέκφραση του Promigratory και Prometastatic PTK7 υποδοχέας σχετίζεται με κακή έκβαση στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (5): e0123768. doi: 10.1371 /journal.pone.0123768

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, Queen Mary Hospital, ΧΟΝΓΚ ΚΟΝΓΚ

Ελήφθη: 2 Οκτ, 2014? Αποδεκτές: 21 Φλεβάρη, 2015? Δημοσιεύθηκε: 11 Μαΐου 2015

Copyright: © 2015 Lhoumeau et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και της υποστήριξη αρχείων Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από το La Ligue Nationale Contre le Καρκίνο (Label Λιγκ JPB) https://www.ligue-cancer.net/, Fondation pour la Recherche Médicale (ACL) https://www.frm.org/, Περιφέρεια PACA (SM) https://www.regionpaca.fr/, SIRIC (INCA-DGOS-Inserm 6038) https://www.oncopaca.org /FR /. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με 447 000 περιπτώσεις και 215 000 θανάτους ετησίως στην Ευρώπη, καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) παραμένει ένα σημαντικό ζήτημα δημόσιας υγείας [1,2]. Ένταξη της 5-FU, και οξαλιπλατίνη επικουρική χημειοθεραπεία βασιζόμενη σε χειρουργική εκτομή στον κόμβο θετική ασθενείς βελτίωσε την επιβίωση [3,4], αλλά ένας σημαντικός αριθμός αυτών των ασθενών παραμένει τελικά υποτροπιάζουν και πεθαίνουν από μεταστατική νόσο. Στο ίδιο χρονικό διάστημα, οι ασθενείς αρνητικούς λεμφαδένες είναι συνήθως δεν αντιμετωπίζονται με ανοσοενισχυτικό συστημική θεραπεία, ενώ ορισμένα από αυτά θα μπορούσαν να ωφεληθούν από αυτή τη στρατηγική [5]. Έτσι, ο προσδιορισμός των έγκυρη και ισχυρή βιοδείκτες που μπορεί να διακρίνει μια ομάδα ασθενών που παρουσιάζουν σημαντικό κίνδυνο υποτροπής είναι επειγόντως αναγκαία. Επιπλέον, ακόμα κι αν μερικοί μοριακή στοχευμένη θεραπευτική έχουν συμβάλει στην αύξηση της επιβίωσης στο μεταστατικό CRC [6-9], κανένας από αυτούς δεν είχε αποδειχθεί ότι βελτιώνει την επιβίωση στην επικουρική θεραπεία [10,11]. Ως εκ τούτου, εξακολουθεί να είναι ανυπόμονα αναγκαία για τον προσδιορισμό μοριακών παραγόντων που παίζουν σημαντικό ρόλο στη βιολογία του καρκίνου του παχέος εντέρου και μπορούν να χρησιμεύσουν ως στόχοι για νέες βιολογικές θεραπείες.

Ο υποδοχέας της κυτταρικής επιφάνειας PTK7, επίσης γνωστή ως καρκίνωμα κόλου κινάση-4 (CCK-4), είναι μια εξελικτική διατηρημένη μέλος της υπεροικογένειας κινάσης τυροσίνης υποδοχέα, η οποία εντοπίστηκε για πρώτη φορά στην ανθρώπινη φυσιολογικά μελανοκύτταρα [12] και σε καρκίνωμα ανθρώπινου κόλον [13]. Αποτελείται από επτά εξωκυτταρικά πεδία ανοσοσφαιρίνης, μια διαμεμβρανική περιοχή και μια ενδοκυτταρική περιοχή κινάσης τυροσίνης, έχει ένα ελαττωματικό δραστικότητα κινάσης και δεν είναι γνωστό συνδετήρα. Αν και ακριβής βιολογικός ρόλος του είναι ασαφής, πρόσφατα στοιχεία που συνδέονται PTK7 στην πολικότητα επίπεδη κύτταρο (PCP) μονοπατιού [14]. Ενώ η apico-βασική πολικότητα οργανώνει προσκόλληση των επιθηλιακών κυττάρων κατά μήκος ενός άξονα xy, PCP ελέγχει τη θέση των κυττάρων εντός του επιπέδου ενός επιθηλιακού δομή, εξασφαλίζοντας ότι προσανατολίζονται προς την ίδια κατεύθυνση, και ως εκ τούτου παίζει ένα σημαντικό ρόλο σε διάφορες αναπτυξιακές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών κυττάρων και τη διαφοροποίηση κινήσεις [15]. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η απορρύθμιση της PCP μπορεί να προκαλέσει διάφορες παθολογικές διαταραχές, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Γνωστές ρυθμιστές της PCP περιλαμβάνουν συνδετήρες Wnt και Frizzled (Fz) υποδοχείς, οι οποίοι ενεργοποιούν την Dishevelled προσαρμογέα στην πλασματική μεμβράνη, και κινεί τη λεγόμενη μονοπάτι Wnt, είτε σε κανονική (β-κατενίνης εξαρτώμενη) ή μη κανονικά του (β-κατενίνης-ανεξάρτητο) οργάνωση [16]. PTK7 προτάθηκε για τη ρύθμιση PCP από την μετάλλαξη του σε Xenopus ή στο ποντίκι οδήγησε σε προφανή αναπτυξιακές διαταραχές PCP που σχετίζονται, συμπεριλαμβανομένων των βλαβών του νευρικού σωλήνα κλείσιμο [17,18]. Επιπλέον, PTK7 δείχθηκε να αλληλεπιδρά άμεσα με Dishevelled, που οδηγεί σε πρόσληψη του στην μεμβράνη και την επακόλουθη φωσφορυλίωση /ενεργοποίηση από Fz7 [19]. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι PTK7 μπορεί επίσης να ενεργοποιήσει την κανονική οδό Wnt σε έναν τομέα με τρόπο που εξαρτάται κινάση [18,20].

Πρόσφατα, PTK7 βρέθηκε να υπερεκφράζεται σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων των επιθηλιακών όγκων, όπως ως γαστρικό, μαστού, του οισοφάγου, της χοληφόρου πόρου και καρκίνων του πνεύμονα [21-26], αλλά επίσης σε σάρκωμα [27] και σε αιματολογικές κακοήθειες, συμπεριλαμβανομένης της οξείας και χρόνιας μυελογενούς λευχαιμίας [28-30]. Παραδόξως, ενώ PTK7 περιγράφηκε για πρώτη φορά σε καρκίνο του παχέος εντέρου ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές [13], δεν υπάρχουν στοιχεία επί του παρόντος όσον αφορά την έκφραση της πρωτεΐνης του σε ιστούς CRC από κλινικώς σχολιασμένη ασθενείς. Έτσι, έχουμε αξιολογήσει την έκφραση της πρωτεΐνης σε ένα PTK7 TMA αποτελείται από CRC πρωτογενών ιστών και υγιών βλεννογόνων, και αξιολογήθηκαν πιθανές συσχετίσεις της έκφρασης του με συμβατικές κλινικές και παθολογικές παράμετροι, όπως επίσης και με την έκβαση του ασθενούς. έκφραση PTK7 Έτσι φαίνεται να σχετίζεται με μεταστατικό αποτέλεσμα και μειωμένη επιβίωση σε μη μεταστατικό ασθενείς CRC. Στη συνέχεια διερευνήθηκε η επίδραση της ρύθμισης της έκφρασης του σε προκλινικά μοντέλα και διαπίστωσε ότι PTK7 προκαλεί μια φιλο-μεταναστευτικών και pro-μεταστατικό φαινότυπο, σύμφωνα με τα κλινικά δεδομένα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από το Institut Paoli-Calmettes (IPC) Institutional Review Board (IRB, Comité d’Προσανατολισμός stratégique, COS). Η IRB δεν θεωρούν ως υποχρεωτική τη συναίνεση κατόπιν ενημέρωσης από τους ασθενείς, αλλά τα δεδομένα αναλύθηκαν μετά από όλα η ενημέρωση του ασθενούς έχουν πλήρως ανώνυμα. Για την έρευνα των ζώων, όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε συμφωνία με τις γαλλικές οδηγίες για το χειρισμό των ζώων και εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Μασσαλίας (C2EA-14). Τα ζώα στεγάζονται σε ειδικές συνθήκες χωρίς παθογόνα, σε ατομικά αεριζόμενα κλουβιά (Tecniplast, Γαλλία, Sealsafe Plus Mouse-Mouse IVC Πράσινη Γραμμή) με 4-5 συντρόφους.

Όλα τα ποντίκια είχαν ελεύθερη πρόσβαση σε αυτόκαυστο και φιλτράρεται νερό και ακτινοβολημένα τρόφιμα σε ένα κύκλο φωτός /σκότους 10-14 ωρών φωτός, με θερμοκρασία περιβάλλοντος 21 ± 2 ° C και η υγρασία σε 55 ± 15%. Όλα τα κλουβιά που περιέχονται ροκανίδια, κλινοσκεπάσματα και ένα ξύλο λεύκας μαλλί φωλιά (Anibed, Γαλλία) για εμπλουτισμό του περιβάλλοντος.

Κατά τη διάρκεια της μετεγχειρητικής περιόδου, ο πόνος ανακουφίστηκε από υποδόρια χορήγηση μελοξικάμης (Metacam ενέσιμα, Boehringer Ingelheim, 1 mg /kg μία φορά την ημέρα για 3 ημέρες) και Baytril (Bayer) με συμπλήρωμα νερού επιπροσθέτως χορηγήθηκε σε ποντικούς για 7 ημέρες πριν ξενομοσχεύματος για την πρόληψη της μόλυνσης κατά την διάρκεια 3 εβδομάδων μετά την επέμβαση.

ανώδυνη θανάτωση των ποντικών πραγματοποιήθηκε με τη χρήση εισπνεόμενη αναισθησία διοξειδίου του άνθρακα, σύμφωνα με την Επιτροπή Δεοντολογίας των πειραμάτων σε ζώα της Μασσαλίας (C2EA-14)

ασθενείς και ιστοί

Αρχειακές ιστούς από 192 διαδοχικούς ασθενείς με στάδια Ι έως IV ορθοκολικό καρκίνωμα (CRC ) που έλαβαν θεραπεία σε ίδρυμα μας (Institut Paoli-Calmettes, Μασσαλία, Γαλλία) με την αρχική χειρουργική εκτομή συλλέχθηκαν μεταξύ 1990 και 1998. στάσης που χρησιμοποιούνται στη μεικτή επιτροπή Αμερικής σχετικά με τα κριτήρια του καρκίνου [31]. Όλα τα δείγματα φορμόλη σταθερής και ενσωματωμένα σε παραφίνη, και αξιολογούνται στο τμήμα Βιοπαθολογίας. Οι ασθενείς έλαβαν επικουρική 5FU χημειοθεραπεία με βάση σε περίπτωση συμμετοχής λεμφαδένων ή μεταστατική νόσο, σύμφωνα με το πρότυπο συστάσεις. Μετά την ολοκλήρωση της θεραπείας, την επιτήρηση διεξήχθη σε διαστήματα 3 μηνών για τα πρώτα 2 χρόνια και σε διαστήματα 6 μηνών στη συνέχεια. Οι ασθενείς παρακολουθήθηκαν για μεταστατική υποτροπή από την κλινική εξέταση και εξετάσεις αίματος, ετήσια ακτινογραφία θώρακος και του ήπατος υπερηχογράφημα ή /και αξονική τομογραφία. Κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά καθώς και τα χαρακτηριστικά έκβαση εξήχθησαν από προοπτικά διατηρείται θεσμική βάση δεδομένων μας. Επιπλέον, για να διερευνήσει πιθανές διαφορές στην έκφραση μεταξύ PTK7 μεταστατικών και πρωτεύοντες ιστούς, 7 PTK7-θετικά ηπατικές μεταστάσεις και αντιστοιχισμένο πρωτογενούς CRC επιλέχθηκαν για συγκριτική ανοσοϊστοχημεία.

μικροσυστοιχίες Tissue κατασκευή

TMA παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32,33]. Για κάθε δείγμα, επιλέχθηκαν 3 αντιπροσωπευτικές περιοχές από ένα αιματοξυλίνη-ηωσίνη-βάφονται τμήμα ενός μπλοκ δότη. Πυρήνα κύλινδροι με διάμετρο 0,6 mm κτυπήθηκαν και να θέσει σε 3 ξεχωριστές ομάδες του αποδέκτη παραφίνης χρησιμοποιώντας μια ειδική συσκευή διευθετήσεως (Beecher Instruments, Silver Spring, MD, USA). Το μπλοκ δέκτης περιείχε ζεύγη όγκου και φυσιολογικού βλεννογόνου, καθώς και τον έλεγχο της κανονικής και καλοήθεις ιστούς (έντερο, αδενώματα) και τα σφαιρίδια κυτταρικής γραμμής. Πέντε μm τομές του προκύπτοντος μπλοκ ΤΜΑ χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση IHC μετά τη μεταφορά πάνω σε γυάλινες πλάκες. Δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (CaCo2, ΗΤ29) και μία γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή (HGT1) χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Ανοσοϊστοχημεία ανάλυση

Για PTK7 χρώση IgG αίγας, αντι-ανθρώπου /ποντικού /PTK7 αρουραίο /CCK-4 πολυκλωνικό αντίσωμα καθαρισμένο με συγγένεια ελήφθη από R &? D Systems (Minneapolis, ΜΝ, USA). Deparaffinisation πραγματοποιήθηκε σε histolemon (Carlo Erba Reagenti, Rodano, Ιταλία) και τα τμήματα επαναενυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Για την ενίσχυση του αντιγόνου, οι τομές επωάστηκαν πρώτα σε διάλυμα ανάκτησης στόχο (Dako, Glostrup, Δανία). Χρώση αντιδράσεις διεξήχθησαν σε θερμοκρασία δωματίου με ένα αυτόματο χρώσης (Dako Autostainer) και διεξήχθησαν ως εξής: μετά από πλύσεις σε κατάλληλο ρυθμιστικό φωσφορικών, που ακολουθείται από σβέση της ενδογενούς ενεργότητας υπεροξειδάσης με 3% Η2Ο2, πλακίδια πρώτα αποκλείστηκαν με ορό (Dako) κατά τη διάρκεια 30 λεπτά και κατόπιν επωάστηκαν με το αντίσωμα που περιγράφηκε παραπάνω PTK7 για 1 h (αραίωση 1/200). Μετά πλύσεις, τα πλακίδια επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο αντίσωμα εναντίον κατσίκας ανοσοσφαιρίνη (αραίωση 1/200? Dako) για 25 λεπτά και στη συνέχεια με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με υπεροξειδάση (Dako REALkit). Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο. Αιματοξυλίνη χρησιμοποιήθηκε για αντιχρωματισμός, και καλυπτρίδες στερεώθηκαν χρησιμοποιώντας διάλυμα Curemount (Instrumedics, Hackensack, USA). Εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτός από δύο παθολόγους (GM, FP). Οι ακόλουθες παράμετροι εξετάσθηκαν: ένταση χρώσης (0: απούσα, 1: χαμηλή, 2: μεσαία, 3: υψηλή)., Το ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων, και τα χαρακτηριστικά χρώσης (πυρήνας, μεμβράνη ή κυτταροπλασματική χρώση)

Για χρώση Κί67, IgG ποντικού, αντι-Ανθρώπινη Κί67 Clone ΜΙΒ-1 από Dako χρησιμοποιήθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [34].

κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Οι κυτταρικές σειρές CRC, HCT116 και HCT15 , δόθηκαν από την ATCC. HCT116 και HCT15 κύτταρα διατηρήθηκαν σε Μέσο Eagle Τροποποιημένο μέσο συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη.

Καλλιέργεια κυττάρων L, παραγωγή Wnt5a /Wnt3A, και B16F10 in vivo δοκιμασίες μετάσταση

Δείτε S1 Υλικά και Μέθοδοι.

Σχεδιασμός των ειδικών shRNA και την παραγωγή ιικών σωματιδίων

shRNA αλληλουχίες ειδικές για PTK7 κατασκευάσματα σχεδιάστηκαν όπως περιγράφεται στο S1 Υλικά και Μέθοδοι. Αυτά τα ολιγονουκλεοτίδια αγοράστηκαν από την Invitrogen, Γαλλία και κλωνοποιήθηκε μέσα σε φορέα pLKO.1-GFP χρησιμοποιώντας AgeI και EcoRI θέση περιορισμού. Μια σκαρφάλωμα μη στόχευση shRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος

Τα ιικά σωματίδια που περιέχουν shRNA παρήχθησαν με παροδική επιμόλυνση των κυττάρων ΗΕΚ 293Τ με φορείς σύστημα συσκευασίας (PSPAX:. Πλασμίδιο 12260 και VSVG: Το πλασμίδιο 12259, Addgene, Cambridge, USA ) και pLKO.1-Τα siRNAs-GFP. Viral υπερκείμενα συλλέχθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση, διηθήθηκε και χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει HCT 116 και HCT15 κύτταρα σε παρουσία 4 μg /ml πολυβρενίου. αποδοτικότητα μόλυνση ελέγχθηκε με έκφραση GFP σε μολυσμένα κύτταρα. Τα κύτταρα ταξινομήθηκαν με κυτομετρία ροής χρησιμοποιώντας έκφραση GFP (BD Aria2, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) και την αποτελεσματικότητα shRNA ελέγχθηκε με Western Blot και ανάλυση qRT-PCR.

εκχύλιση πρωτεϊνών και ανοσοκηλίδωση

τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (50mM Hepes, 150mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 10% γλυκερόλη, 1% Triton Χ-100, 25 mM NaF, 10 μΜ ΖηΟΙ2) συμπληρωμένο με 0,5mm φαινυλμεθυλσουλφονύλιο fuoride (PMSF), 1 mM ορθοβαναδικό, 1 mM β-γλυκεροφωσφορικό και ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma-Aldrich, USA). Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στα 13.000 rpm για 10 λεπτά στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια απορρίφθηκαν και συγκέντρωση πρωτεΐνης ρυθμίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία Bradford (BioRad). Οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης, μπλοκάρει 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου σε αλατόνερο ρυθμισμένο με Tris /5% άπαχο ξηρό γάλα /0,1% Tween20, και στυπώθηκαν επί μία νύκτα με πρωτεύοντα αντισώματα σε διάλυμα αποκλεισμού (μονοκλωνικό αρουραίου αντι-PTK7 παράγεται στο εργαστήριο? ποντικού μονοκλωνικό αντίσωμα αTubulin, Sigma-Aldrich, USA). Μετά από εκτενή πλυσίματα σε TBS /0,1% Tween20, φίλτρα επωάστηκαν 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) με ένα συζευγμένο με HRP δευτερογενές αντίσωμα προτού αποκαλυφθεί με ένα ενισχυμένο υπόστρωμα χημειοφωταύγειας (West Pico, Thermo Scientific, USA). Απόκτηση διεξήχθη με έναν εικονολήπτη G-BOX (Ozyme, Γαλλία).

Η ποσοτική ανάλυση RT-PCR

Το συνολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy μίνι κιτ (Qyagen, Κάτω Χώρες). Τα σφαιρίδια RNA ξηραίνονται στον αέρα και διαλύθηκε σε υπέρ-καθαρό νερό. cDNA δημιουργήθηκε με υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Bio-systems, USA) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. SYBR προμίγμα παρασκευάστηκε με εκκινητές 10 ρΜ και 1 μλ εκμαγείο cDNA. qRT-PCR σε 96 φρεατίων πλάκες οπτικός πραγματοποιήθηκε με τη χρήση των ανωτέρω αντιδραστηρίων, και τα προϊόντα αναλύθηκαν σε έναν ΑΒΙ Prism 7500 (Applied Bio-systems, USA). Το επίπεδο έκφρασης του PTK7 ομαλοποιήθηκε με GAPDH και παριστάνεται ως σχετική έκφραση. Ανιχνευτές είχαν ως εξής: PTK7 FWD 5′-CAGTTCCTGAGG ATTTCCAAGAG -3 και rev 5′-TGCATAGGGCCA ΚΔ TC-3 ‘? GAPDH FWD 5’-ATGGGGAAGGTGAAGGT-3 ‘και 5′-rev AAGCTTCCCGTTCTCAG-3’

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με CellTiter 96 δοκιμασία (Promega, USA). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια πυκνότητα 5000 κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν σε DMEM που περιείχε 10% FCS για τον υποδεικνυόμενο χρόνο. Στη συνέχεια, οι πλάκες επωάστηκαν με CellTiter 96 στους 37 ° C για 2 ώρες. Η απορρόφηση στα 490nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας 96 φρεατίων.

δοκιμασίες αντοχής Drug

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 000 κύτταρα σε πλάκες 96-φρεατίων και επωάστηκαν σε DMEM που περιείχε 10% FCS για το 24h. Στη συνέχεια, προστέθηκαν φάρμακα (ιρινοτεκάνη, 5-φθοριοουρακίλη και σισπλατίνη) και τα κύτταρα επωάστηκαν περαιτέρω για 72 ώρες CellTiter 96 στη συνέχεια προστέθηκε και οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 2 ώρες. Η απορρόφηση στα 490nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλάκας 96 φρεατίων.

Η μετανάστευση των κυττάρων δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πυκνότητα 5 000 κύτταρα σε πλάκες 6 φρεατίων προηγουμένως επικαλυμμένα με κολλαγόνο Ι και ήταν επωάστηκαν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής όλη τη νύκτα και διεγείρονται με ϋΜΕΜ 10% FCS ή DMEM χωρίς FCS ως έλεγχος. μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με παρακολούθηση κυττάρων χρησιμοποιώντας βίντεο-μικροσκοπία και λογισμικό Metamorph (Molecular Device) για 8 ώρες.

μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού

NOD /SCID (μη παχύσαρκοι διαβητικοί /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια) /γο null ποντίκια (NSG) ελήφθησαν από Charles River Laboratory (Γαλλία). HCT15 κύτταρα που εκφράζουν shCTRL ή shPTK7 μολύνθηκαν με φακοϊό φορέα που εκφράζει LUC2 και 2.10

6 κύτταρα υποδόρια ένεση σε 9 εβδομάδων ποντίκια NSG (βάρος: 25g). LUC2 επίπεδο έκφρασης ελέγχεται πριν από την ένεση. την ανάπτυξη των όγκων ακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια των 8 εβδομάδων και υπολογίζεται με τον τύπο V = 0.52x (LXW

2). Την ημέρα 50, εκτομή του όγκου διεξήχθη και το βάρος όγκου μετρήθηκε. Στη συνέχεια, η ανάπτυξη της μετάστασης ακολουθήθηκε από ανάλυση βιοφωταύγεια χρησιμοποιώντας Photon imageur (Biospace Lab, Παρίσι, Γαλλία). Μετά την εμφάνιση του μεταστατικού σημάτων ή την ολοκλήρωση της ανάλυσης (ημέρα 130), τα ποντίκια αυτοψία και η φωταύγεια όργανο εκτελέστηκε. ανάλυση εικόνας πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του λογισμικού όραμα Μ3 (Biospace εργαστήριο). Όλα τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε συμφωνία με τις γαλλικές οδηγίες για το χειρισμό των ζώων.

Η στατιστική ανάλυση

Η σύγκριση των κατηγορικών μεταβλητών κατανομή πραγματοποιήθηκε με χ2 ή την ακριβή δοκιμασία του Fisher. Για τις συνεχείς μεταβλητές, χρησιμοποιήθηκαν t-test του Student και μη παραμετρική Mann-Whitney U. Συνέχεια υπολογίστηκε από τη διάγνωση μέχρι την ημερομηνία της τελευταίας είδηση ​​για τους ασθενείς στη ζωή. Μετάσταση επιβίωση χωρίς (MFS) μετρήθηκε από τη διάγνωση μέχρι την πρώτη μεταστατικό γεγονός ή θάνατο. Για τους ασθενείς χωρίς μεταστατική υποτροπή ή θάνατο κατά τη στιγμή της τελευταίας παρακολούθησης, λογοκρισία πραγματοποιήθηκε κατά την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης. Η συνολική επιβίωση (OS) μετρήθηκε από τη διάγνωση μέχρι το θάνατο ή την ημερομηνία της τελευταίας παρακολούθησης. Επιβιώσεις εκτιμήθηκαν με τη μέθοδο Kaplan-Meier και συγκρίθηκαν μεταξύ των ομάδων με τη δοκιμασία log-rank. Για την πολυπαραγοντική ανάλυση, χρησιμοποιήθηκε ένα μοντέλο Cox αναλογικών κινδύνων. Τα στοιχεία που παρέχονται σύμφωνα με τις συστάσεις αναφοράς για το δείκτη όγκου προγνωστικές μελέτες (παρατήρηση) [35]. Για να συγκρίνουμε τις καμπύλες ανάπτυξης όγκου σε προκλινικές πειράματα, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ. Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν είτε με την έκδοση του λογισμικού R 2.15 ή λογισμικό Prism (λογισμικό Graphpad, San Diego, CA, USA)

Αποτελέσματα

πρωτεΐνη PTK7 σημαντικά up-ρυθμίζονται CRC

για να κατανοήσουμε καλύτερα τον ρόλο του PTK7 σε ορθοκολικό ογκογένεση, εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης του με ανοσοϊστοχημεία σε TMA περιέχουν ιστούς όγκου από 192 πρωτογενείς CRCs (τα κλινικά χαρακτηριστικά των οποίων παρουσιάζονται στον S1 πίνακα) και συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου. PTK7 ανοσοχρώση θα μπορούσε να αξιολογηθεί σε 138 CRC (72%) και 142 φυσιολογικούς ιστούς (74%), αντίστοιχα. Διαπιστώσαμε έκφραση PTK7 σε πρωτογενείς όγκους του 78 ασθενείς (56%), με ένταση 2 ή 3 σε 48 ασθενείς (35%) και ένα ουσιαστικά κυτταροπλασματική υποκυτταρική τοποθεσία (Σχήμα 1Α και 1Β). Συγκριτικά, μόνο 32 ασθενείς (22%) είχαν ανιχνεύσιμο ανοσοχρώση σε συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο, με ένταση 2 ή 3 σε 20 ασθενείς (14%) (ρ = 1.91.10

-8, chi-2 δοκιμή? Εικ 1Α και 1Β). Επιπλέον, όταν εκφράστηκε PTK7, το μέσο ποσοστό αριθμός των θετικών κυττάρων ήταν 31% (95% CI: 25-37%) στον ιστό του όγκου έναντι 2% (95% CI:. 1.2 έως 3.8%? P = 5.74 10

-14, Mann-Whitney U Test) σε συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου (Σχ 1C και 1D). Χρησιμοποιώντας μια cut-off τουλάχιστον το 10% των θετικών κυττάρων με ένταση 2 ή περισσότερες (οι οποίες θα χρησιμοποιηθούν στη συνέχεια ως ορισμός του PTK7 υπερέκφρασης), 47 ασθενείς είχαν ανιχνεύσιμη υπερέκφραση PTK7 στον ιστό του όγκου (34%), αλλά μόνο 3 φυσιολογικού βλεννογόνου (2%) (Σχήμα 1 D). Έτσι, PTK7 υπερεκφράστηκε σε σημαντικό αριθμό πρωτογενών CRC, αλλά όχι ή μόλις σε φυσιολογικό ιστό

Α- PTK7 έκφραση με ανοσοϊστοχημεία (IHC) σε ΤΜΑ περιέχουν πρωτογενή ιστούς CRC:. Χρώση των πυρήνων των όγκων που δείχνουν υψηλή ( άνω πάνελ) και καθόλου /χαμηλή (κάτω πίνακας) έκφραση σε αντιπροσωπευτικά καρκινικούς ιστούς (μεγέθυνση χ 400). Β- ένταση της χρώσης PTK7 με IHC στην πρωτοβάθμια CRC και συμφωνημένα φυσιολογικό βλεννογόνο: χρώση ταξινομήθηκε ως 0, 1+, 2+ και 3+, όπως περιγράφεται στο κεφάλαιο Υλικά και μέθοδο. Αναλογίες συγκρίθηκαν με δοκιμή Chi-2. C-Mean ποσοστό των κυττάρων με χρώση PTK7 στην πρωτοβάθμια CRC και συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου. D- πυρήνες Όγκων του πρωτογενούς CRC δείχνει PTK7 υπερέκφραση (όπως ορίζεται με χρώση 10% των κυττάρων ή περισσότερο, με ένταση από 2 ή περισσότερα) και συμφωνημένα φυσιολογικού βλεννογόνου (μεγέθυνση χ 400). Τα ποσοστά συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας Mann-Whitney U test. *** = Ρ & lt? 0.001. E- ανάλυση Kaplan-Meier της μετάστασης-free (δεξιά) και συνολικά (αριστερά) επιβιώσεις της μη μεταστατικό CRC ασθενείς σύμφωνα με PTK7 υπερέκφραση σε TMA. Επιβιώσεις συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank.

Η

PTK7 υπερέκφραση συνδέεται με κακή επιβίωση σε μη μεταστατικό CRC

Ερευνήσαμε αν PTK7 υπερέκφραση συσχετίστηκε με βασικά κλινικά και παθολογικά χαρακτηριστικά. Όπως φαίνεται στο S2 Πίνακα, καμία σημαντική συσχέτιση μεταξύ PTK7 υπερέκφραση και παραμέτρους όπως η ηλικία, το φύλο, το κόλον ή τοποθεσία του ορθού, το στάδιο του όγκου, λέμφο επέκταση κόμβος, μεταστατικό στάδιο, λεμφο-αγγειακή εισβολή (LVI), βαθμού διαφοροποίησης και κολλοειδούς βλεννώδεις συστατικό. Αξίζει να σημειωθεί ότι υπήρξε μια μη σημαντική τάση προς μια χαμηλότερη έκφραση σε όγκους με αστάθεια μικροδορυφόρου-υψηλής φαινότυπο. Στη συνέχεια επικεντρώθηκε στην Ι-ΙΙΙ, ασθενείς M0 CRC στάδιο και αξιολόγησε τον αντίκτυπο της PTK7 υπερέκφραση στην επιβίωση. Με μονοπαραγοντική ανάλυση, μαζί με εμπλοκή λεμφαδένων και κολλοειδούς βλεννώδης συστατικό, PTK7 υπερέκφραση σχετίστηκε με σημαντικά μειωμένη MFS (Πίνακας 1). Το 5-ετή MFS ήταν 75,7% (95% CI: 65 – 88,1%) σε PTK7-αρνητικούς όγκους έναντι 54% (95% CI: 38,8 – 75%) σε PTK7-θετικούς όγκους (HR = 2,1 [1 – 4,1] ? p = 0,034, δοκιμασία log-rank? Σχήμα 1Ε). Με την πολυπαραγοντική ανάλυση, μόνο κολλοειδούς βλεννογόνους συστατικό διατηρείται ανεξάρτητη προγνωστική αξία για την MFS, αλλά PTK7 προσέγγισε στατιστική σημαντικότητα (Πίνακας 1). Παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν σε σχέση με τη συνολική επιβίωση (Σχήμα 1 Ε? Πίνακας 1). Έτσι, PTK7 υπερέκφραση σε μη μεταστατικό CRC συνδέθηκε με δυσμενή έκβαση. Για να διερευνήσουν πιθανές διαφορές μεταξύ των πρωτογενών και μεταστατικών όγκων, εξετάσαμε και άλλα πρωτογενή ιστών από μια μικρή ομάδα των 7 PTK7 θετικών ηπατικές μεταστάσεις. Σε όλα τα δείγματα, η έκφραση PTK7 ήταν παρόμοια και στις δύο ιστούς (S1 Σχήμα)

Η

PTK7 μειορρύθμιση δεν επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και της ανθεκτικότητας στα φάρμακα, αλλά μειώνει την κυτταρική μετανάστευση των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών CRC

Για να διερευνηθεί η βιολογική βάση της αυξημένης επιθετικότητας σε PTK7 υπερεκφράζουν CRC, έχουμε δημιουργήσει ένα knockdown μοντέλο PTK7 σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC HCT15 και HCT116, τα οποία εκφράζουν ένα μεγάλο ποσό της ενδογενούς PTK7 (Σχήμα 2Α). Τα κύτταρα μολύνθηκαν με ιούς lenti εκφράζουν ένα μη-στόχευσης ελέγχου shRNA (shCTRL) ή δύο διαφορετικά shRNA στόχευσης PTK7 (shPTK7-1 και shPTK7-2) και την αποτελεσματικότητα των PTK7 knockdown επαληθεύτηκε σε mRNA και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (Σχήμα 2Α και 2Β).

επίπεδο έκφρασης PTK7 σε shCTRL- ή shPTK7 (1 και 2) μολυνθέντα HCT15 και HCT116 κυτταρικές σειρές ελέγχθηκε με κηλίδα western (Α) και ανάλυση Q-PCR (Β). Η βιωσιμότητα των κυττάρων ποσοστώθηκε με προσδιορισμό κυττάρων τίτλου για 3 ημέρες (C-D). Κυτταρική βιωσιμότητα του shCTRL- και shPTK7 (1 και 2) μολυνθεί από HCT15 κύτταρα αξιολογήθηκε με προσδιορισμό κυττάρων τίτλου, 72 ώρες μετά adjunction σισπλατίνης, ιρινοτεκάνη, και 5-φθοριοουρακίλη (Ε).

Η

τότε αναλύθηκε η επίδραση του PTK7 επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης χρησιμοποιώντας μια κυτταρική ανάλυση τίτλου. Σε αυτή τη δοκιμασία πολλαπλασιασμού, τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του PTK7 σε HCT15 και κυτταρικές σειρές HCT116 δεν είχε επίδραση στην πολλαπλασιαστική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 2C και 2D). Επειδή PTK7 εμπλέκεται σε WNT μονοπάτια, ελέγξαμε κατά πόσο πιθανές επιπτώσεις της στον πολλαπλασιασμό θα μπορούσε να εξαρτάται από την διέγερση Wnt συνδέτη [14,18]. Έτσι, ο πολλαπλασιασμός εξετάστηκε περαιτέρω με την παρουσία ρυθμισμένων μέσων από κύτταρα L που εκφράζουν Wnt3A και Wnt5a, τα οποία είναι γνωστά ενεργοποιητές κανονικών και μη κανονικών μονοπατιών, αντίστοιχα. Ωστόσο, ακόμη και κάτω από Wnt διέγερση, δεν ανιχνεύουν οποιαδήποτε επίδραση της έκφρασης PTK7 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων CRC (S2 σχήμα).

Έχουμε διαπιστώσει προηγουμένως ότι η έκφραση PTK7 ενισχύει την αντίσταση του φαρμάκου στην οξεία μυελοειδή κύτταρα λευχαιμίας [28]. Ως εκ τούτου, για να εξετάσει τις επιπτώσεις της στην αντίσταση στο φάρμακο σε κυτταρικές γραμμές CRC, αξιολογήσαμε βιωσιμότητα κυττάρου των κυττάρων που εκφράζουν HCT15 ή όχι PTK7 μετά τη θεραπεία με διαφορετικές δόσεις σισπλατίνης, ιρινοτεκάνη και 5-FU. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Ε, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης PTK7 δεν παρέχει κανένα συμπληρωματικό ευαισθησία HCT15 σε κυτταροτοξικά. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με HCT116 (S3 Εικ).

επόμενο διερευνηθεί ο ρόλος των PTK7 στη μετανάστευση των κυττάρων. HCT15 κύτταρα στερήθηκαν για 24 ώρες, στη συνέχεια διεγέρθηκαν με FCS και μετανάστευση των κυττάρων ακολουθήθηκε από παρακολούθηση ζωντανών κυττάρων. Όταν FCS προστέθηκε ως παράγοντας διέγερσης, η μετανάστευση των κυττάρων HCT15 shCTRL αυξήθηκε κατά 2,5 φορές. Ωστόσο, σε PTK7-νοκ ντάουν κύτταρα HCT15, FCS-επαγόμενη μετανάστευση καταργήθηκε. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν για τα κύτταρα HCT116 (Σχήμα 3Α και 3Β). Έτσι, η έκφραση PTK7 δεν επηρεάζει ούτε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ή ανθεκτικότητα στα φάρμακα, αλλά παρέχει προμεταναστευτικές ικανότητες για ανθρώπινες κυτταρικές σειρές CRC.

shCTRL- και shPTK7 (1 και 2) μολυσμένους HCT15 κύτταρα στερήθηκαν τη διάρκεια της νύχτας και επωάστηκαν με ή χωρίς FCS. μετανάστευση των κυττάρων μετρήθηκε με την παρακολούθηση των κυττάρων χρησιμοποιώντας μικροσκοπία βίντεο και το λογισμικό Metamorph. Απόσταση μετανάστευσης υπολογίστηκε για κάθε κατάσταση και μέσα συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας Mann-Whitney U Test (Α). Εκπρόσωπος μαθήματα μεταναστευτική παρουσιάστηκαν στο (Β).

Η

PTK7 αρνητική ρύθμιση μειώνει την ανάπτυξη του όγκου και την ανάπτυξη μετάσταση σε μοντέλα ποντικών ξενομοσχεύματος

Για να εξετάσει την ογκογόνο δράση του PTK7

in vivo

, μπορούμε υποδορίως μεταμοσχευθεί bioluminescent HCT15 κύτταρα (shCTRL ή shPTK7) σε NSG ποντίκια και παρακολουθείται τόσο την ανάπτυξη του όγκου και την μεταστατική διάδοση. Όπως φαίνεται στο Σχ 4Α και 4Β, η αποτελεσματικότητα της PTK7 knockdown ελέγχθηκε σε όγκους τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Σε PTK7 κύτταρα knockdown HCT15, ο όγκος του όγκου μειώθηκε σχεδόν κατά 50% (σχήμα 4Γ? Ρ = 0, 0125, αμφίδρομη ΑΝΟνΑ) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Ομοίως, η μάζα του όγκου μειώθηκε κατά 2,6 φορές σε όγκους knockdown PTK7 (Εικ 4D? Ρ = 0, 0025, Mann-Whitney U test). Έτσι, PTK7 παίζει pro-ογκογόνο ρόλο

in vivo

. Για να αξιολογηθεί κατά πόσον αυτή η φιλο-ογκογόνο επίδραση οφείλεται στην διαφορά στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εξετάσαμε την κατάσταση Ki67 σε ξενομοσχεύματα όγκου, με και χωρίς PTK7 νοκ ντάουν. Όπως φαίνεται στο Σχ S4, δεν παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά μεταξύ HCT15 shCTRL και HCT15 shPTK7 ξενομοσχευμάτων σε όρους χρώσης Κί67.

Η έκφραση της PTK7 ελέγχθηκε μετά την εκτομή του όγκου με Q-PCR (Α) και ανάλυση κηλίδος western ( ΣΙ). Η ανάπτυξη του υποδόριου ξενομοσχεύματος του shCTRL- και shPTK7-μολυσμένα κύτταρα HCT15 εξετάστηκαν (C- D). Εικόνες από έναν εκπρόσωπο HCT15 shCTRL ένεση του ποντικιού και τα όργανά τους παρουσιάστηκαν στο αριστερό πάνελ. Ο αριθμός των μεταστάσεων-free ή θετικούς ποντικούς σε κάθε κατάσταση αξιολογήθηκε και παρουσιάζεται στο δεξιό πλαίσιο. Αναλογίες συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fischer (Ε).

Η

Όσον αφορά την κλινική σημασία των PTK7 υπερέκφραση σε MFS και φιλο-μεταναστευτική επίδραση του

in vitro

, εξετάσαμε αν PTK7 θα μπορούσε να ενισχύσει τη μετάσταση σε ξενομοσχεύτηκε μοντέλο ποντίκια. Μετά την εκτομή των όγκων HCT15 που προέρχονται, μεταστατικό ανάπτυξη παρακολουθήθηκε

in vivo

χρησιμοποιώντας έναν ανταποκριτή λουσιφεράσης. Υπήρξε μια μη σημαντική τάση για λιγότερα μεταστατικό φαινόμενο σε ποντικούς που ενέθηκαν με PTK7-knockdown κυττάρων HCT15, σε σύγκριση με shCTRL-HCT15 εγχυθεί ποντίκια (2 μεταστατικών γεγονότων σε 15 ποντικούς έναντι 6 μεταστατικών γεγονότων σε 12 ποντίκια, αντίστοιχα? p = 0,0871, του Fischer exact test) (Σχήμα 4Ε).

για να διερευνήσει περαιτέρω μια πιθανή προ-μεταστατική επίδραση της PTK7, χτίσαμε ένα κυτταρικό μοντέλο της PTK7 υπερέκφραση σε PTK7 αρνητικά καρκινικά κύτταρα και εξέτασε τις επιπτώσεις της στην ανάπτυξη της μετάστασης

in vivo

. Στην απουσία οποιωνδήποτε διαθέσιμων PTK7 αρνητικά ανθρώπινα κύτταρα CRC, χρησιμοποιήσαμε μία κυτταρική γραμμή B16F10 μελανώματος, μια PTK7 αρνητικό κύτταρο με καλά τεκμηριωμένη ικανότητα να παράγουν τις πνευμονικές μεταστάσεις σε μοντέλα ξενομοσχεύματος [36], ως μοντέλο. Εμείς επιμολυσμένα Β16Ρ10 κυττάρων με την έκφραση PTK7 ή κενό φορέα, και ελέγξτε ότι PTK7 εκφράστηκε σταθερά στη μεμβράνη πλάσματος με ανάλυση FACS (S5A και S5B σχήμα). κύτταρα Β16Ρ10 συνέχεια εγχύθηκαν ενδοφλεβίως και την ανάπτυξη των πνευμόνων μετάσταση αναλύθηκε. Βρήκαμε ότι η υπερέκφραση της PTK7 ενίσχυσε σημαντικά την μεταστατική ανάπτυξη (p = 0.0024) (S5c και S5D σχήμα). Κοιτάζοντας το μέγεθος των μεταστάσεων, βρήκαμε ότι PTK7 υπερέκφραση οδήγησε σε αύξηση του αριθμού των μικρών και μεγάλων μεταστάσεων (p = 0,0019 και 0,0080, αντίστοιχα? S5E σχήμα). Ωστόσο, το ποσοστό των μικρών μεταστάσεων ήταν υψηλότερη σε κύτταρα που υπερεκφράζουν PTK7, υποδηλώνοντας μια κυρίαρχη επίδραση στην κυτταρική εισβολή και την προσκόλληση, αντί επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Έτσι, PTK7 υπερέκφραση ενισχύει το μεταστατικό φαινότυπο

in vivo

.

Συζήτηση

Ενώ η ανώμαλη έκφραση του mRNA της PTK7 αρχικά ανιχνεύθηκε σε CRC [13], ήταν διαθέσιμα για δεν υπάρχουν στοιχεία έκφραση της πρωτεΐνης του σε κλινικά δείγματα σχολιασμένη CRC. Χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, έχουμε επιβεβαιώσει πρωτεΐνη υπερέκφραση του σε ένα σχετικό κλάσμα των περιπτώσεων CRC (περίπου το ένα τρίτο των ασθενών) σε σύγκριση με υγιείς βλεννογόνους συμφωνημένα όπου δεν ήταν ή μόλις ανιχνεύσιμη. Σε αυτή τη σειρά, η έκφραση δεν βρέθηκε να σχετίζεται με τυχόν ειδικές κλινικές ή παθολογικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένης της ηλικίας, το μέγεθος του όγκου, τη συμμετοχή λεμφαδένων, στάδιο, LVI, κολλοειδές βλεννώδης συστατικό, και το βαθμό διαφοροποίησης. Ωστόσο, σε μη μεταστατικό CRC, PTK7 υπερέκφραση συσχετίστηκε με σημαντική μειωμένη MFS. Αυτή η επίδραση κακή πρόγνωση σε διάρκεια μεταστατικό δυναμικό βρέθηκε να προσεγγίσει στατιστική σημαντικότητα σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση, ενώ η συμμετοχή των λεμφαδένων δεν διατηρήθηκε. Αναφορικά με OS, παρόμοιες τάσεις παρατηρήθηκαν αλλά χωρίς να φτάσει στατιστική σημασία, πιθανότατα λόγω του περιορισμένου μεγέθους του δείγματος. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει σημαντική σχέση μεταξύ PTK7 υπερέκφραση και μεταστατικό στάδιο για τη διάγνωση βρέθηκε, αυξάνοντας την ενδιαφέρουσα υπόθεση ότι η έκφραση PTK7 μπορεί να χαθεί μία φορά είναι εγκατεστημένες μεταστάσεις.