Αφηρημένο

Ιστορικό

Το οστεοσάρκωμα είναι ο πιο κοινός πρωτοπαθούς όγκου των οστών. Οι στερεοί όγκοι είναι κατασκευασμένα από ετερογενείς κυτταρικούς πληθυσμούς, οι οποίες εμφανίζουν διαφορετικούς στόχους και τους ρόλους στην οικονομία του όγκου. Ένα μάλλον μικρό κελί υποσύνολο μπορεί να κρατήσει ή να αποκτήσει στέλεχος δυναμικά, κερδίζοντας την επιθετικότητα και την αύξηση του προσδόκιμου της υποτροπής. Το αντιγόνο CD133 είναι μία γλυκοπρωτεΐνη pentaspan μεμβράνη, η οποία έχει προταθεί ως ένας δείκτης του καρκίνου βλαστικών κυττάρων, δεδομένου ότι έχει καταδειχθεί προηγουμένως ότι είναι ικανή να ταυτοποιεί ένα καρκίνο έναρξη υποπληθυσμό στον εγκέφαλο, κόλον, μελάνωμα και άλλους στερεούς όγκους. Ως εκ τούτου, στόχος μας ήταν να παρατηρηθεί η πιθανή παρουσία των κυττάρων που εκφράζουν το αντιγόνο CD133 εντός συμπαγών όγκων κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος και, στη συνέχεια, να κατανοήσουν τα βιολογικά χαρακτηριστικά και τις επιδόσεις τους.

Μεθοδολογία και ΚΥΡΙΟΤΕΡΑ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιώντας SAOS2, MG63 και U2OS, τρεις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές σαρκώματος απομονωθεί από τους νέους Καυκάσιους, ήμασταν σε θέση να προσδιορίσει και να χαρακτηρίσει, μεταξύ των οποίων, CD133 + κυττάρων

δείχνει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, του κυτταρικού κύκλου ανίχνευσης σε μια φάση Μ G2 \\, θετικότητα για Ki-67, και την έκφραση των μεταφορέων ABCG2. Επιπλέον, στο FACS, ήμασταν σε θέση να τηρήσει την CD133

+ κλάσμα κυττάρων που δείχνει το προφίλ πλευρά του πληθυσμού και σχηματίζει σφαίρα-clusters σε μέσο ελεύθερο ορού με υψηλό κλωνογονικού απόδοσης.

Συμπεράσματα

στο σύνολό τους, τα ευρήματά μας οδηγήσει στη σκέψη ότι μπορούμε να υποθέσουμε ότι έχουμε εντοπίσει, για πρώτη φορά, CD133

+ κυττάρων μέσα οστεοσαρκώματος κυτταρικές σειρές, που δείχνει πολλά χαρακτηριστικά των καρκινικών βλαστοκυττάρων. Αυτό μπορεί να είναι μάλλον ενδιαφέρον με σκοπό το σχεδιασμό νέων θεραπειών κατά του καρκίνου των οστών

Παράθεση:. Tirino V, Desiderio V, d’Aquino R, De Francesco F, G Pirozzi, Galderisi U, et al. (2008) Ανίχνευση και χαρακτηρισμός του CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα στο ανθρώπινο Στερεά Όγκοι. PLoS ONE 3 (10): e3469. doi: 10.1371 /journal.pone.0003469

Επιμέλεια: Θωμάς Zwaka, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 12, 2008? Αποδεκτές: 29 Σεπτεμβρίου 2008? Δημοσιεύθηκε: 21η Οκτωβρίου 2008

Copyright: © 2008 Tirino et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. MURST ( Ιταλία), 2η Πανεπιστήμιο της Νάπολης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

το οστεοσάρκωμα είναι ο πιο κοινός πρωτοπαθούς όγκου των οστών. Εμφανίζεται στα οστά και επιπλέον οστική χώρους, και εμφανίζει μια δικόρυφη κατανομή ηλικίας, με μια πρώτη αιχμή κατά τη δεύτερη δεκαετία της ζωής, που σχετίζονται με την εφηβική έκρηξη ανάπτυξης (400 νέα παιδιατρική περιπτώσεις ετησίως στις Ηνωμένες Πολιτείες) και μια δεύτερη κορυφή σε ενήλικες μεγαλύτερης ηλικίας [1]. Η συχνότητα εμφάνισης είναι ελαφρώς υψηλότερο σε Αφρο-Αμερικανούς από ό, τι στους Καυκάσιους και ο θάνατος είναι συνήθως το αποτέλεσμα της προοδευτικής πνευμονικών μεταστάσεων με αναπνευστική ανεπάρκεια, λόγω της ευρείας νόσο [2]. Σάρκωμα γενετικές αλλοιώσεις περιλαμβάνουν τόσο oncosuppressor και ογκογονιδίου οδών, των οποίων τα προϊόντα ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης [3]. Στην πραγματικότητα, είναι καλά γνωστό ότι οι συμπαγείς όγκοι που κατοικείται από ετερογενείς κυτταρικούς πληθυσμούς που περιλαμβάνουν κύτταρα με στέλεχος-όπως ιδιότητες, όπως υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, γρήγορη επέκταση και μεταστατικής ανάπτυξης [4], [5].

Α όγκου μπορεί να προβλεφθεί ως σύνολο οργάνων, που σχηματίζονται από διάφορα κύτταρα που εμφανίζουν διακριτούς ρόλους στην οικονομία του όγκου. Είναι γνωστό ότι η λειτουργία των βλαστικών κυττάρων είναι η διατήρηση και ιστών επισκευής. Βλαστικά δυναμικό μπορεί επίσης να αποκτηθεί από καρκινικό κύτταρο και αυτό το γεγονός είναι πολύ σημαντικό για την εξέλιξη του όγκου.

Η τρέχουσα άποψη είναι ότι οι όγκοι μπορεί να προέρχεται από ένα μικρό αριθμό των κυττάρων που έχουν χαρακτηριστικά στέλεχος-όπως. Νέες θεραπείες που στοχεύουν αυτά τα κύτταρα, τα οποία είναι θεμελιώδης για την εξέλιξη του όγκου, θα μπορούσε να βελτιώσει σημαντικά την κλινική θεραπεία του καρκίνου. Ως εκ τούτου, είναι υψίστης σημασίας για την αναγνώριση, εντός των όγκων, υποπληθυσμών των κυττάρων που παρουσιάζουν σημαντικές διαφορές όσον αφορά τη διάδοσή τους, στέλεχος έκφρασης δείκτη και τη συμπεριφορά.

Το αντιγόνο CD133 είναι ένα pentaspan γλυκοπρωτεΐνη μεμβράνης, η οποία χαρακτηρίζεται από δύο ανεξάρτητες μελέτες [6], [7] και ταυτοποιήθηκε αρχικά σε νευροεπιθηλιακά βλαστοκύτταρα [8]. το ενδιαφέρον της ως δείκτης καρκινικά βλαστικά έχει αυξηθεί δραματικά από τότε φάνηκε ότι ήταν σε θέση να εντοπίσει έναν καρκίνο έναρξη υποπληθυσμό στον εγκέφαλο [9] και του παχέος εντέρου [10]. Επιπλέον, CD133

+ κύτταρα έχουν επίσης βρεθεί σε ηπατοκαρκινώματος [11] και το μελάνωμα [12], αλλά, μέχρι σήμερα, δεν έχει ακόμη τεθεί σε οστεοσαρκώματα, στην οποία η παρουσία του υποτίθεται βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν σχηματίζουν σφαίρες έχει αναφερθεί [13 ].

ως εκ τούτου, έχουμε ως στόχο να χρησιμοποιεί το CD133 ως δείκτης για να ανιχνευθεί η πιθανή παρουσία του καρκίνου βλαστικών κυττάρων εντός SAOS2, MG63 και U2OS ανθρώπινες κυτταρικές σειρές σαρκώματος απομονωθεί από οστεοσάρκωμα των νεαρών Καυκάσιους. Αυτές οι κυτταρικές σειρές έχουν χρησιμοποιηθεί προηγουμένως ως μοντέλα του οστεοσαρκώματος [14], [15] και οστεοβλάστη κύτταρα που μοιάζουν [16], [17]. Σε αυτή τη μελέτη, προκειμένου να προσδιοριστούν τα συγκεκριμένα CD133

+ καρκινικά βλαστικά κύτταρα, ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ των χαρακτηριστικών του στελέχους και της κινητικής της έκφρασης δείκτη CD133.

Τα αποτελέσματά μας, πρώτα απ ‘όλα να αποδείξει, για την πρώτη φορά, ότι το αντιγόνο CD133 δεν παρατηρείται σε κύτταρα σε διαφορετικές οστεοσαρκώματος σταθεροποιημένες κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, έχουμε δείξει ότι αυτά τα κύτταρα εμφανίζουν υψηλό ποσοστό πολλαπλασιασμού και ότι είναι ικανά να σχηματίζουν σφαίρες συμπλέγματος. Επιπλέον, έχουμε βρει ότι αυτά τα κύτταρα είναι άκρως κλωνογόνων και ογκογόνο. Στο σύνολό τους, τα δεδομένα μας οδηγήσει στη σκέψη ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), τα οποία είναι τα καρκινικά κύτταρα έναρξη, μπορεί να βρεθεί στο οστεοσάρκωμα και αυτό μπορεί να είναι ύψιστης σημασίας κατά το σχεδιασμό νέων αντικαρκινικών θεραπειών για τα οστά.

Αποτελέσματα

SAOS2, U2OS και MG-63 κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος δοκιμάστηκαν με σκοπό την ανίχνευση, στο εσωτερικό τους, η παρουσία ενός CD133

+ κυτταρικό πληθυσμό. CD133 είναι ένας δείκτης βλαστικών κυττάρων που περιγράφεται για πρώτη φορά στην νευρο-ενδοθηλιακά προγονικά, και πρόσφατα έχει υποτίθεται ότι είναι ένας επιλεκτικός δείκτης για τον καρκίνο βλαστικά κύτταρα (CSC) σε ορισμένους τύπους καρκίνου. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν σαφώς ότι σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές, δύο υποπληθυσμούς: α CD133

+ (που κυμαίνονται από 3% έως 5%) και μία CD133

-, μπορούν να ταυτοποιηθούν (Εικ. 1). Χρησιμοποιώντας το FACsorting, λάβαμε ένα CD133

+ εμπλουτίζεται πληθυσμού (98,8%) και CD133

– κυτταρικού πληθυσμού. Η έκφραση του αντιγόνου CD133 αναλύθηκε με χρήση δύο διαφορετικών αντισωμάτων. Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι τα αρνητικά κύτταρα CD133 δεν εκφράζουν το αντιγόνο στην επιφάνεια του κυττάρου και ότι τα θετικά κύτταρα CD133 εκφράστηκαν στο ίδιο ποσοστό επίπεδο και με τα δύο αντισώματα.

Ένα CD133

+ πληθυσμό κυττάρου μπορεί να ανιχνευθεί σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές.

η

Εκτός αυτού, οι τρεις κυτταρικές σειρές ήταν αρνητικά για το αντιγόνο CD34, αλλά αποδεικνύεται ίση ισχυρή θετικότητα για CD29, CD44 και CD90, τα μεσεγχυματικά βλαστικά και τα καρκινικά κύτταρα δείκτες. Τόσο τα κλάσματα του CD133

+ και CD133

– κύτταρα ήταν θετικά για αντιγόνα CD29, CD44 και CD90 σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές (Εικ. 2)

Και οι τρεις κυτταρικές γραμμές είναι αρνητικές για το CD34. αντιγόνο αλλά απόδειξη ίση ισχυρή θετικότητα για CD29, CD44 και CD90

Η

Οι δύο κυτταρικών πληθυσμών (CD133

+ και CD133

-). Στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να εκτελέσει την ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, την ανάπτυξη ανάλυση, δοκιμασία σχηματισμού συμπλέγματος σφαίρα, δοκιμασία μαλακού άγαρ και ανίχνευση πλευρά του πληθυσμού.

κυτταρικού κύκλου, δοκιμασίες πολλαπλασιασμού και αναλύει την ανάπτυξη

ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) δοκιμασία έδειξε μια αξιοσημείωτη διαφορά στον κυτταρικό κύκλο του CD133 ταξινομημένα κύτταρα. CD133

+ κυττάρων ήταν ως επί το πλείστον στη φάση G2 \\ Μ, ενώ CD133

– κύτταρα ήταν κυρίως στην G0 \\ G1 (Εικόνα 3Α.), Υποδεικνύοντας ότι ο CD133

+ υποπληθυσμός είναι το ενεργό κλάσμα πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων. Επιπλέον, όλα τα CD133

+ κύτταρα κατέληξε να είναι Ki-67

+ (Σχήμα 3Β.), Ενώ η πλειοψηφία των CD133

– κύτταρα ήταν αρνητικά για αυτό το δείκτη. Ki-67 είναι μία πρωτεΐνη που εκφράζεται μόνο σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, έτσι τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν ότι η CD133

κλάσμα + είναι η πηγή που δημιουργήθηκε πρόσφατα κυττάρων.

(Α) Σχήμα του κυτταρικού κύκλου αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν στα SAOS2, κυτταρικές σειρές MG63 και U2OS. Μια CD133

+ κυτταρικός πληθυσμός είναι κυρίως παρατηρείται στη φάση G2 \\ Μ, ενώ CD133

– κύτταρα ήταν κυρίως στην G0 \\ G1? (Β) Σχήμα δείχνει Ki-67 δραστικότητα. CD133

+ κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα να Ki-67

+, ενώ CD133

– ήταν κυρίως αρνητικές για αυτό το δείκτη? (C) Σχήμα δείχνει τις καμπύλες ανάπτυξης του CD133

+ κυττάρων σε σχέση με CD133

– κυττάρων σε κυτταρικές σειρές U2OS SAOS2, MG63 και. CD133

+ κύτταρα έχουν ένα υψηλό δυναμικό πολλαπλασιασμού σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές.

Η

Επιπλέον, για να δείξει κατά πόσον CD133

+ κύτταρα ήταν ικανά να πολλαπλασιάζονται extensivelly σε σύγκριση με CD133

– κύτταρα, παρατηρήσαμε την ανάπτυξή τους. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι οι καλλιέργειες όγκου που προέρχεται από CD133

+ κύτταρα εμφανίζουν υψηλότερη πολλαπλασιαστικού δυναμικού σε σχέση με το CD133

– κύτταρα σε όλες τις τρεις κυτταρικές σειρές. Στην πραγματικότητα (Σχήμα 3C) CD133

+ κύτταρα παρουσίασαν μέσο χρόνο περίπου 40 ώρες, 33 ώρες και 38 ώρες σε κυτταρικές σειρές SAOS2, MG63 και U2OS διπλασιασμό αντίστοιχα, ενώ CD133

– κύτταρα έδειξαν μέσο χρόνο διπλασιασμού 48 ώρες, 44 ώρες και 42 ώρες σε SAOS2, MG63 και κυτταρικές γραμμές U2OS αντίστοιχα. Όταν τα κύτταρα ήταν προσκολλητικά, μετά τη διαλογή, το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν CD133 μειώθηκε σημαντικά (ρ & lt? 0.001) με τον χρόνο καλλιέργειας (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

Σχηματισμός Σφαίρα Cluster

Η ικανότητα να αναπτύσσονται. σε εναιώρημα σε μέσο ελεύθερο ορού, περιγράφονται για πρώτη φορά για την επιλογή νευρικών βλαστοκυττάρων μέσω νευροσφαιρών σχηματισμού, έχει σε μεγάλο βαθμό ερευνηθεί ως μέθοδος επιλογής των καρκινικών κυττάρων για την έναρξη. Γλοιοβλάστωμα, καρκίνος του παχέος εντέρου, και κύτταρα μελανώματος πάνω από όλα, επιλέγονται για την ικανότητά τους να σχηματίζουν σφαίρα συστάδες, βρέθηκαν να είναι εξαιρετικά ογκογόνα και είναι σε θέση να την αναπαράγουν και να ανασυστήσει την αρχική αρχιτεκτονική του όγκου όταν εγχέεται ανεκτική ξενιστές. Τα αποτελέσματά μας σε κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος έδειξαν ότι clusters σφαίρα ήταν σαφώς παρατηρούνται ήδη μετά από 24 ώρες στο CD133

+ πολιτισμούς, ενώ CD133

(Εικόνα 4Α, C, D.) – δεν σχηματίζουν σφαίρες (Σχήμα 4Β.). Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, σφαιρών που ελήφθη στο CD133

+ κύτταρα σπάρθηκαν σε τυποποιημένες πλάκες με 10% FBS. Κύτταρα μετανάστευσαν από τις σφαίρες μέσα σε λίγες ώρες και προσκολλάται στο κάτω μέρος των φιαλών, υποθέτοντας ένα πολυγωνικό σχήμα. Τα κύτταρα αυτά είχαν ως αποτέλεσμα να είναι μικρότερα σε μέγεθος, σε σύγκριση με το CD133

– κύτταρα. Μετά από μια εβδομάδα, θα πραγματοποιηθεί ένα πρόσθετο τεστ για το αντιγόνο CD133 για προσκολλημένα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, και πάλι ένα CD133

– πληθυσμού παρατηρήθηκε, παρέχοντας ενδείξεις ότι CD133

– κύτταρα, αυτή τη στιγμή, προέρχονται από CD133

+ κυττάρων. Στη συνέχεια, θα πραγματοποιηθεί μια νέα ταξινόμηση των κυττάρων αυτών και παρατήρησε ότι το CD133

κλάσμα + εξακολουθούσε να διατηρεί την ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες, ενώ το CD133

– δεν σχηματίζεται δεν

συστάδες (Α) Σφαίρα. από CD133

+ κυττάρων σε ημιστερεό μέσο μετά από 24 ώρες (αρχική μεγέθυνση × 100)? (Β) CD133

– κυττάρων σε ημιστερεά μέσο μετά από 7 ημέρες, δεν σχηματίζουν σφαίρες. (Αρχική μεγέθυνση × 100)? clusters (C) Σφαίρα σχηματίζεται από CD133

+ κυττάρων μετά από 48 ώρες (αρχική μεγέθυνση × 200)? (D) συστάδες Σφαίρα σχηματίζεται από CD133

+ κυττάρων μετά από μια νέα ταξινόμηση (αρχική μεγέθυνση × 400).

Η

Επίσης δοκιμάσαμε OCT3 /4 και CD133 εκφράσεις σε 6

ου κυττάρου πέρασμα και σε 4

ου και 6

ου πέρασμα, αντίστοιχα sarcospheres προέρχεται από CD133

+ κύτταρα μετά τη διαλογή. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι σφαίρες εμπλουτίστηκαν τόσο στην OCT3 /4 και CD133 με το χρόνο της καλλιέργειας (Εικ. 5).

Η μπλε γραμμή δείχνει έλεγχοι ισοτόπου, κόκκινες και πράσινες γραμμές δείχνουν την έκφραση του CD133 στο 4

ου και 6

ου πέρασμα των κυττάρων, αντίστοιχα. Στα ιστογράμματα, OCT3 4 έκφραση /αναλύεται σε 6

ου πέρασμα των κυττάρων? Η πράσινη γραμμή δείχνει έλεγχοι ισοτόπου. Sarcospheres τόσο στο CD133 και OCT3 /4 είναι έντονα θετικές.

Η

Δοκιμασία Αγάρ Soft

Soft δοκιμασίες άγαρ έγιναν με σκοπό να παρατηρήσουμε τις διαφορές στο κελί ογκογενετικότητας μέσω της ικανότητας του CD133

+ κύτταρα να σχηματίσουν αποικίες σε σχέση με CD133

– κύτταρα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, οι αποικίες που σχηματίζονται πιο αποτελεσματικά με CD133

+ κύτταρα, τα οποία οδήγησαν σε 5.5 ± 1.8 φορές μεγαλύτερο αριθμό αποικιών από αυτούς που ανιχνεύθηκαν σε CD133

– πληθυσμό (

ρ

& lt? 0.005) σε SAOS2? 7.7 ± 1.5 φορές μεγαλύτερο αριθμό αποικιών από εκείνες που παρατηρούνται σε CD133

– πληθυσμό (

ρ

& lt? 0.001) σε MG63, και 6.8 ± 1.7 φορές μεγαλύτερο αριθμό αποικιών από εκείνες που παρατηρήθηκαν σε CD133

– πληθυσμού U2OS (P & lt? 0.005)

η

Side του πληθυσμού και ABCG2

στο CD133

κλάσμα + ένα πολύ μικρό υποσύνολο (0,97%) εξέφρασε την χαρακτηριστική. προφίλ ενός πλευρικού πληθυσμού. Είναι γνωστό ότι ο φαινότυπος πλευρά πληθυσμός είναι το πιο σημαντικό χαρακτηριστικό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη δείξαμε για πρώτη φορά ότι σε κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος μπορεί να ανιχνευθεί μια πλευρά του πληθυσμού. Επιπλέον, βρήκαμε ότι και οι τρεις κυτταρικές γραμμές εξέφρασαν τον μεταφορέα ABCG2 (Εικ. 6), τα οποία συνήθως συνδέονται με φαινότυπο πλευρά του πληθυσμού και της αντίστασης στα φάρμακα.

(Α) με κυτταρομετρία αναλύσεις της πλευράς πληθυσμού. Το CD133

κλάσμα + περιλαμβάνει ένα μικρό υποσύνολο (0,97%), εκφράζοντας το χαρακτηριστικό προφίλ μιας πλευράς πληθυσμού σε FACS. (Β) έκφραση ABCG2 στην κυτταρική σειρά SAOS2, δείχνοντας προφανή θετικότητα? η γκρίζα γραμμή δείχνει τον έλεγχο ισοτόπου.

Η

ανοσοϊστοχημείας και ανοσοφθορισμού

Τόσο η ανοσοϊστοχημική και ανοσοφθορισμού αναλύσεις σε προσκολλημένα κύτταρα και τα πλωτά σφαίρες πραγματοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Τα αποτελέσματά μας, ανάλογα με αναλύσεις FACS, επιβεβαίωσε την παρουσία του αντιγόνου CD133 στην κυτταρική μεμβράνη του CD133

+ ταξινομημένα κύτταρα. Επιπλέον, κυμαινόμενο σφαίρες έδειξε μια ευρέως διάχυτη χρώση για CD133, επιβεβαιώνοντας το γεγονός ότι οι σφαίρες σχηματίζονται από CD133

+ κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι η CD133

– ταξινομημένο κλάσμα υπέστησαν βαφή για CD133, ότι ήταν εντοπισμένη εντός ενδο-κυτταροπλασματική κυστίδια, όπως φαίνεται στο confoal μικροσκοπία (Σχήμα 7Α, Β, C, D, E, F.). Για να κατανοήσουμε βαθιά αυτή την πτυχή, εκτελέσαμε, στο FACS, ένας ενδο-κυτταρική χρώση για CD133. Βρήκαμε ότι σε όλες τις τρεις κυτταρικές γραμμές ένα ενδοκυτταρικό θετικότητα παρατηρήθηκε (Εικ. 8Α), ενώ ισοτύπων ελέγχου ήταν αρνητικά.

αναλύσεις (Α) Ανοσοϊστοχημική επί προσκολλημένα κύτταρα και (Β) κυμαινόμενο σφαίρες που δείχνει την παρουσία αντιγόνου CD133 (βέλη). (Αρχική μεγέθυνση × 100.)? (C) Ανάλυση ανοσοφθορισμού για SAOS-2 για CD133 ΡΕ, κυτταροσκελετού βάφονται με phalloidin-FITC, πυρήνα με DAPI (αρχική μεγέθυνση × 400.)? (Δ) Immunoflurescence ανάλυση σχετικά με SAOS-2 σφαίρες για CD133 ΡΕ μετά από 24 ώρες σε πρόσφυση. (Αρχική μεγέθυνση × 200)? (Ε) Ομοεστιακή αναλύσεις σε προσκολλημένα κύτταρα και (F) κυμαινόμενο σφαίρες που επιβεβαιώνει την παρουσία του αντιγόνου CD133. (Αρχική μεγέθυνση. × 400).

Η

(Α) Σχήμα εκτελείται σε FACS που δείχνουν την ενδοκυτταρική έκφραση του αντιγόνου CD133 σε SAOS-2, MG-63 και U2OS. (Β) Εικόνα που δείχνει σε πραγματικό χρόνο PCR, η έκφραση μεταγραφή του mRNA στο CD133

+ και CD133

– κύτταρα. Τα επίπεδα είναι σχεδόν ταυτόσημες, όπως ανιχνεύεται από το τόσο θετικές όσο και αρνητικές CD133 κύτταρα.

Η

Real Time-PCR ανάλυση

Η έκφραση των επιπέδων CD133 mRNA σε CD133

+ και CD133

– προσκολλημένα κύτταρα ήταν σχεδόν πανομοιότυπες, όπως ανιχνεύεται από Real Time PCR (Σχήμα 8Β.). Αυτό επιβεβαιώνει και τις δύο FACS και τα αποτελέσματα ανοσοφθορισμού, όπως φαίνεται παραπάνω.

Συζήτηση

Το οστεοσάρκωμα είναι ένα ιδιαίτερα επιθετικό όγκο, που πλήττει κατά κύριο νέους. Μετά τις πρόσφατες μελέτες [10] – [13], [18] υποστηρίζοντας την παρουσία ενός άκρως ογκογονική κυτταρική υπο-ομάδα – κοινώς ονομάζεται καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) – εντός του χύδην όγκου, προσπαθήσαμε να απομονώσουν και να χαρακτηρίσουν αυτή την υποπληθυσμού σε κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος . Όγκου αλλοιώσεις περιλαμβάνουν ετερογενείς πληθυσμούς κυττάρων, μεταξύ των οποίων η παρουσία αντιγόνων βλαστικών μπορεί να αποδεικνύεται μέσω φαινοτυπική αναλύσεων. Η παρουσία ενός CD133

+ υποπληθυσμό εντός ανθρώπινων στερεών όγκων έχει τεκμηριωθεί από πολλές εκθέσεις [10] – [13], [18] – [21], και κύτταρα που εκφράζουν αυτόν τον δείκτη φαίνεται να είναι διαφορετική από τις άλλες καρκινικά κύτταρα . Ειδικότερα, CD133

+ κύτταρα διαθέτουν βλαστικά-όπως χαρακτηριστικά, όπως η δυνατότητα διαφοροποίησης, υψηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού, ο σχηματισμός συμπλέγματος σφαίρα και την ικανότητα να διαδώσει όγκου σε ανεκτική οικοδεσπότες. αποτυχίες της θεραπείας του καρκίνου μπορεί να οφείλεται σε ανεπαρκή αποτελέσματα της τρέχουσας θεραπείας μετά δυνητικά ηρεμίας ΚΕΠ, τα οποία παραμένουν ζωτικής σημασίας και να διατηρούν την ικανότητα να αναγεννούν τον όγκο [22], [23]. Ανάπτυξη νέων CSC-στοχευμένες στρατηγικές σήμερα παρεμποδίζεται από την έλλειψη αξιόπιστων δεικτών για τον εντοπισμό των ΚΕΠ και την κακή κατανόηση της συμπεριφοράς και της τύχης τους. Κυτταρικές σειρές, που προέρχονται από όγκους, διατηρούν ιεραρχική μοτίβα βλαστοκυττάρων, αποδεδειγμένη με διαφορετικές ικανότητες κλωνογονική, που σχετίζονται με την κυτταρική ιδιότητες, όπως το μέγεθος, συγκολλητικότητα, βαφή αποκλεισμού και τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης [24].

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε το αντιγόνο CD133 ως δείκτης βλαστικών κυττάρων του καρκίνου, προκειμένου να προσδιορίσει, στο πλαίσιο σταθεροποιηθεί κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος, κύτταρα που εμφανίζουν διαφορετικές ιδιότητες όσον αφορά το ποσοστό πολλαπλασιασμού, κλωνογονικού αποτελεσματικότητα, ο σχηματισμός σφαίρα-cluster και βαφή αποκλεισμού. Διαλογή τρεις κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος, CD133

+ υποσύνολα βρέθηκαν να είναι 3% έως 5% των συνολικών κυττάρων, σύμφωνα με την υπόθεση ότι τα ΚΕΠ θα πρέπει να είναι μόνο ένα πολύ μικρό υποσύνολο κυττάρων. Δεν υπάρχουν διαφορές στη CD29, CD44 και εκφράσεις CD90 τόσο στο CD133

+ και CD133

– κύτταρα. Στην πραγματικότητα, τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα θεωρούνται ηρεμίας

in vivo

και σπάνια διαιρούν ασύμμετρα, δίνοντας ζωή σε εξαιρετικά πολλαπλασιαστικά απογόνους [5]. Παρ ‘όλα αυτά, εάν μια ιεραρχία στέλεχος υπάρχει σε κυτταρικές σειρές, κύτταρα με χαρακτηριστικά στέλεχος μπορεί να μην είναι σε ηρεμία? Αλλιώς, θα πρέπει να χαθεί σε μερικά περάσματα. Σύμφωνα με αυτή τη μελέτη, διαπιστώσαμε ότι CD133

+ κυττάρων ήταν άκρως πολλαπλασιαστική, σε σύγκριση με το CD133

– κύτταρα, όπως επιβεβαιώνεται από την ανάλυση PI, Ki-67 επισήμανση και την ανάπτυξη αναλύει

CD133

+ κύτταρα έδειξαν πολλές διαφορές σε σχέση με την αρνητική τους ομολόγους τους, που έχουν την ικανότητα να αναπτύσσονται ως σφαίρες σε ένα ημιστερεό μέσο και να σχηματίσει αποτελεσματικά αποικίες σε μαλακό άγαρ. Αυτές οι δοκιμασίες κοινώς θεωρείται αντίστοιχα ως δείκτες της αυτο-ανανέωση, ογκογονικότητα και κλωνογονικότητας. Επιπλέον, sarcospheres, η οποία προέρχεται από CD133

+ κύτταρα, εξέφρασαν υψηλά επίπεδα OCT3 /4, που είναι παράγοντες μεταγραφής που εμπλέκονται κριτικά σε αυτο-ανανέωση και τη διατήρηση της πλειοδυναμίας αδιαφοροποίητων εμβρυϊκών βλαστικών κυττάρων [25]. Στα χέρια μας η CD133

+ κύτταρα έδειξαν όλοι αυτές τις ικανότητες και εξέφρασε ABCG2, η οποία είναι ένας μεταφορέας μεμβράνη, που συνήθως συνδέεται με φαινότυπο πληθυσμό πλευρά και η αντίσταση των ναρκωτικών [26]. Ως εκ τούτου, αυτό μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι ένα επιπλέον δείκτης για ΚΕΠ. Επιπλέον, σε αυτή τη μελέτη, αποτελεσματικά έδειξε, για πρώτη φορά, ότι ένας πληθυσμός πλευρά μπορεί να ανιχνευθεί επίσης σε κυτταρικές γραμμές οστεοσαρκώματος. Η πλευρά πληθυσμός ορίζεται από την Hoechst αποκλεισμού στην κυτταρομετρία ροής [27], [28]. Αντιπροσωπεύει μόνο ένα μικρό κλάσμα του συνόλου του πληθυσμού των κυττάρων και εκφράζει υψηλά επίπεδα διαφόρων μελών της οικογένειας μεταφορέα ABC, όπως ABCG2 και MDR1, τα οποία είναι υπεύθυνα για την αντοχή φαρμάκου [29], [30]. Όπως ήταν αναμενόμενο, βρήκαμε ότι η πλευρά πληθυσμός έγινε από ένα πολύ μικρό κλάσμα (0,97%) των συνολικών κυττάρων, και, κατά τρόπο ενδιαφέροντα, ήταν εντελώς περιλαμβάνονται εντός του CD133

+ υποσύνολο.

Τα δεδομένα μας , στο σύνολό τους, μπορεί να οδηγήσει στην δίδαξε ότι CD133

+ κύτταρα είναι καρκινικά βλαστικά κύτταρα. Στην πραγματικότητα, αν και αυτό θα πρέπει να υποστηρίζεται από ένα

in vivo

ξενομοσχεύματος όγκου, όπως φαίνεται στην άλλους συμπαγείς όγκους [10] – [13], [18] – [21], δυστυχώς, δεν ήμασταν σε θέση να εκτελέσει

in vivo πειράματα

επειδή οστεοσάρκωμα κυτταρικές σειρές δεν μοσχεύματος με οποιοδήποτε υποδοχής. Εμείς ουσιαστικά προσπάθησε να εκτελέσει

in vivo

μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων CD133 μας, αλλά χωρίς επιτυχία, όπως και όλους τους άλλους ερευνητές.

Επιπλέον, μπορούμε επίσης να υποθέσουμε ότι το CD133

+ υποσύνολο περιλαμβάνει ένα μικρότερο CD133

+ \\ ABCG2

+ \\ SP

+ πληθυσμού, η οποία θα μπορούσε να είναι ανθεκτικά στα φάρμακα, έχει προέλθει χαρακτηριστικά και μπορεί να οδηγεί αποτελεσματικά την εξέλιξη του καρκίνου.

είναι ενδιαφέρον και απροσδόκητα, στα χέρια μας, κάποια κύτταρα τα οποία δεν εκφράζουν τον δείκτη CD133 στην μεμβράνη είχε σαν αποτέλεσμα να παραχθεί μία ανιχνεύσιμη ποσότητα μεταγράφων CD133 mRNA, και εξέφρασε το αντιγόνο CD133 στην κυτταροπλασματική κυστίδια, όπως φαίνεται με συνεστιακή μικροσκόπηση. Παρ ‘όλα αυτά, CD133

+ και CD133

– ταξινομημένο πληθυσμοί εμφανίζουν σαφώς διαφορετικές συμπεριφορές. Αυτό μας οδηγεί να κάνουμε εικασίες για το λειτουργικό ρόλο της CD133 στην οργάνωση της μεμβράνης και κατά την επιλογή ΚΕΠ, ως εξής: i) είναι CD133 υψηλά εμπλέκονται στο σχηματισμό συμπλέγματος σφαίρα, είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη μη προσκολλημένα κυττάρων καθώς επίσης και για κυττάρου-προς των β-κυττάρων cross talk, το οποίο επιτρέπει στα κύτταρα να επικοινωνούν και να λαμβάνουν ερεθίσματα που συνήθως παρέχονται από μόρια προσκόλλησης? ii) CD133

+ και CD133

– πληθυσμοί βρίσκονται σε συνεχή και αμοιβαία ανταλλαγή και μόνο αληθινό ΚΕΠ εκφράζουν CD133 συνεχώς πάνω στη μεμβράνη

Εν κατακλείδι, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι CD133 δείκτης μπορεί να είναι χρήσιμη για να. υποδεικνύουν την διαφοροποιημένη /αδιαφοροποίητη κατάσταση των όγκων οστεοσαρκώματος και αυτό μπορεί να οδηγήσει σε νέες προσεγγίσεις, προκειμένου να σχεδιάσει μια πιο συγκεκριμένη θεραπεία και βελτίωση της πρόγνωσης.

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων

SAOS2, MG63 και U2OS αγοράστηκαν από την ATCC CELL ΤΡΑΠΕΖΑ? κύτταρα τοποθετήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας α-ΜΕΜ, συμπληρωμένο με 15% FCS, 100 μΜ 2P-ασκορβικό οξύ, 2 mM L-γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλλίνη, 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (όλα αγοράστηκαν από την Invitrogen, San Giuliano Milanese, Μιλάνο, Ιταλία) και τοποθετήθηκαν σε 75 ml φιάλες με φιλτραρισμένο βαλβίδες. Οι φιάλες επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 και το μέσο αλλάχθηκε δύο φορές την εβδομάδα. Μετά συρροή, τα κύτταρα υποδιαιρούνται σε νέες φιάλες μέχρι το τέλος του πειράματος.

Κυτταρομετρία Ροής και ταξινόμηση κυττάρων

Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας 0.02% ΕϋΤΑ σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS), μετρήθηκαν και πλύθηκαν σε 0.1% BSA σε PBS. Τουλάχιστον 500.000 κύτταρα (σε 100 μΙ PBS /0.5% BSA) επωάστηκαν με φθορίζοντα-επισημασμένα μονοκλωνικά αντισώματα ή αντίστοιχων ελέγχων ισοτύπου (1/10 αραιωμένο 4 ° C για 30 λεπτά στο σκοτάδι). Μετά τα βήματα έκπλυσης, τα επισημασμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας ένα διαλογέα κυττάρου FACS Vantage (Becton & amp? Dickinson, Mountain View, CA, USA). Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-ανθρώπινο CD133 /2 ΡΕ ποντικού συζευγμένο (Miltenyi Biotec Srl Calderara di Reno, Μπολόνια, Ιταλία), αντι-ανθρώπινο CD133 ΡΕ ποντικού συζευγμένο (eBioscience), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD29 CY συζευγμένο (BD Pharmingen, Buccinasco, Μιλάνο, Ιταλία), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD34 ΡΕ συζευγμένο (Miltenyi Biotec), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD44 FITC συζευγμένο (Miltenyi Biotec), ποντικού αντι-ανθρώπινο CD90 FITC συζευγμένο (BD Pharmingen), ποντικού αντι-ανθρώπου OCT3 /4 μη συζευγμένο (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, California, USA), ποντικού αντι-ανθρώπου Κί67 FITC συζευγμένο (Miltenyi Biotec) και αντι-ανθρώπινη ABCG2 μη ποντικού συζευγμένο (Santa Cruz). CD133

+ κύτταρα ταξινομήθηκαν για πειράματα. CD133

– τα κύτταρα συλλέχθηκαν ως έλεγχος. Η καθαρότητα των ταξινομημένων πληθυσμών ήταν συνήθως 90%. Ισότυποι χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι

Επτά ημέρες μετά τη διαλογή, CD133

-. Κύτταρα αποκολλήθηκαν και ελέγχθηκαν δύο φορές για έκφραση CD133. OCT3 4 έκφραση /αναλύθηκε σε 6

ου πέρασμα των κυττάρων (ένα «πέρασμα» δείχνει ότι τα κύτταρα αποσπώνται όταν σε συρροή), ενώ η έκφραση CD133 αναλύθηκε σε 4

ου και 6

ου πέρασμα των κυττάρων σε sarcopheres προέρχεται από CD133

+ κύτταρα στις τρεις κυτταρικές γραμμές

Για ενδοκυτταρική χρώση Κί67, CD133 και OCT3 /4, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τη χρήση του Fix Caltag & amp.? Perm Kit (Invitrogen, Μιλάνο, Ιταλία) ακολουθώντας τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα λογισμικό CellQuest.

Hoechst 33342 Αποκλεισμός Δοκιμασία

SAOS2, MG63 και U2OS κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 2,0 × 10

6 κύτταρα /ml σε προθερμασμένο α- ΜΕΜ μέσο καλλιέργειας και διαιρείται σε δύο μέρη. Ένα τμήμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μΜ βεραπαμίλη και η άλλη αφέθηκε χωρίς θεραπεία. Αμφότερα τα τμήματα επωάστηκαν σε μέσο καλλιέργειας α-ΜΕΜ με 5 μg /ml Hoechst 33342 (Sigma, Μιλάνο, Ιταλία) για 90 λεπτά στους 37 ° C. Μετά την επώαση τα κύτταρα πλύθηκαν σε PBS και διατηρήθηκαν σε πάγο για 5 λεπτά, και αναλύθηκαν για Hoechst 33342 εκροής με FACS Vantage (Becton Dickinson, Μιλάνο, Ιταλία) [31]. Το 33342 χρωστική Hoechst ήταν ενθουσιασμένος στα 350 nm υπεριώδους και η προκύπτουσα φθορισμός μετρήθηκε σε δύο μήκη κύματος, χρησιμοποιώντας ένα 424/44 ΒΡ και 675 φίλτρα LP για την ανίχνευση της Hoechst μπλε και κόκκινο, αντίστοιχα.

Κύκλου κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό Αναλύσεις

κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε PBS που περιείχε 2 mM EDTA, πλύθηκαν μία φορά με PBS, σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένο αιθανόλης 70 ° και επωάστηκαν με 50 μg /ml ΡΙ (Sigma) συν Rnasi 1 mg /ml για 60 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Βιτρώ πυρήνες αναλύθηκαν με ένα διαλογέα κυττάρου FACS Vantage (Becton & amp? Dickinson, Mountain View, CA, USA)., Και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Mod-Fit πρόγραμμα ανάλυσης του κύκλου 2.0 κυττάρων (Becton-Dickinson)

Growth ανάλυση

Μετά την διαλογή με CD133, SAOS2, MG-63 και τα κύτταρα U2OS απλώθηκαν σε πυκνότητα 8,0 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε τρυβλία 6 φρεατίων. Κάθε δώδεκα ώρες τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-εναιωρήθηκαν σε PBS. Ένα υποπολλαπλάσιο του κυτταρικού εναιωρήματος αραιώθηκε με 0.4% κυανούν τρυπανίου (Sigma-Aldrich), με πιπέτα σε ένα αιμοκυτταρόμετρο και μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο σε 200 × μεγέθυνση. Ζωντανά κύτταρα απέκλεισε την βαφή, ενώ τα νεκρά κύτταρα παραδέχθηκε τη χρωστική ουσία και, κατά συνέπεια, χρωματίζονται έντονα με trypan μπλε. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων για κάθε πειραματική συνθήκη μετρήθηκε και παριστάνεται σε ένα γραμμικό γράφημα. Ο χρόνος διπλασιασμού (DT) προσδιορίστηκε από τις καμπύλες ανάπτυξης ή με τη χρήση του τύπου: όπου τα t και t

0 ήταν οι χρόνοι στους οποίους μετρήθηκαν τα κύτταρα, και Ν και Ν

0 ήταν οι αριθμοί των κυττάρων σε χρόνους t και t

0, αντίστοιχα [32].

Soft Δοκιμασία Αγάρ

για να προσδιοριστεί η διαφορετική ογκογόνο δυναμικό σε δύο κλάσματα κυττάρων, CD133

+ και CD133

– κύτταρα απλώθηκαν σε μαλακό άγαρ σε πυκνότητα 100, 500 ή 1000 κύτταρα /φρεάτιο σε 24 φρεάτια πλακών εις τριπλούν. Colo κυτταρική γραμμή μελανώματος 38 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος.

Για το στρώμα βάσης, 2,4% διάλυμα στοκ άγαρ τήκεται σε ένα φούρνο μικροκυμάτων, ψύχεται στους 40 ° C σε ένα λουτρό νερού και στη συνέχεια αναμιγνύεται με μέσο καλλιέργειας για να ληφθεί ένα διάλυμα από 0,8% άγαρ σε α-ΜΕΜ. 0,5 ml /φρεάτιο του διαλύματος αυτού προστέθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων. Για το κορυφαίο στρώμα, το άγαρ απόθεμα διαλύματος αραιώθηκε με μέσο καλλιέργειας για να ληφθεί ένα διάλυμα 0,3% άγαρ σε α-ΜΕΜ. 0,5 ml /φρεάτιο του διαλύματος αναμίχθηκε ήπια και κατανέμονται σε 24-βοθρίων. CD133

+, CD133

– και Wilde τύπου SAOS-2, MG63 και U2OS κύτταρα διαδοχικά επιστρώθηκαν και επωάστηκαν για 21 ημέρες στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO2 σε αέρα και 50 μΐ α-ΜΕΜ . Στο τέλος της περιόδου επώασης, οι αποικίες βάφτηκαν με 150 μΙ /φρεάτιο NBT (nitrobluetetraziolium) σε συγκέντρωση 1 mg /2 ml σε PBS και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon TS 100, Nikon, Μιλάνο, Ιταλία) .

ανοσοφθορισμού χρώσης

CD133

+ και CD133

– κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα 4% παραφορμαλδεΰδης /0,2% Triton σε PBS για 30 min στους 4 ° C, πλύθηκαν σε PBS, υπέστη επεξεργασία με PBS /5% γάλα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια χρωματίζονται με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αντι-ανθρώπινο CD133 /2 ΡΕ ποντικού συζευγμένο (Miltenyi Biotec), ποντικού αντι-ανθρώπου συζευγμένη με FITC φαλλοϊντίνη (AlexaFluor-Invitrogen) επωάζονται για 60 λεπτά στους 4 ° C. Οι πυρήνες βάφτηκαν με DAPI. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές όπως περιγράφεται παραπάνω και παρατηρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon TE 2000-S, Μιλάνο, Ιταλία). Οι ισότυποι και μη ανιχνεύθηκαν κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες.

Σφαίρα Δοκιμασίες

Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 60.000 κύτταρα /φρεάτιο σε 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning Inc., Corning , ΝΥ, USA) σε μέσο F12 κυττάρων /DMEM, συμπληρωμένο με 1% μεθυλκυτταρίνη, προγεστερόνη (10 ηΜ), πουτρεσκίνη (50 μΜ), σεληνικό νάτριο (15 ηΜ), τρανσφερίνη (13 μg /ml), ινσουλίνη (10 μg /ml? Sigma) και ανθρώπινου EGF (10 ng /ml) και ανθρώπινης bFGF (10 ng /ml? Sigma) [13]. Φρέσκα δείγματα του EGF και bFGF προστέθηκαν κάθε δεύτερη μέρα. Μετά από καλλιέργεια για 48-72 ώρες, σφαίρες ήταν ορατές στο μικροσκόπιο ανεστραμμένης αντίθεσης φάσης (Nikon TS 100, Nikon).

Laser σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο

Τα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά στους 4 ° C, πλύθηκαν σε PBS, υπέστη επεξεργασία με PBS /5% γάλα για 60 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 4 ° C όλη τη νύχτα. Το πρωτεύον αντίσωμα ήταν ένα ποντικού αντι-ανθρώπινο CD133 /1 καθαρό (Miltenyi Biotec)? το δευτερεύον αντίσωμα (γίδινο αντι-ποντικού FITC ή ΡΕ συζευγμένα Abcam) επωάστηκε για 60 λεπτά στους 4 ° C, και ο DAPI, που χρησιμοποιείται για τη χρώση του πυρήνα, επωάστηκε για 7 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η ίδια διαδικασία έγινε σε sarcospheres. Όλα τα σημασμένα κύτταρα αποθηκεύτηκαν στους 4 ° C πριν εικόνες λήψης, χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Laser σάρωσης ομοεστιακό μικροσκόπιο LSM 510 Meta (Zeiss- Oberkocken-Γερμανία). Εικόνες συνελήφθησαν με ανάλυση 512 × 512 pixels. Η κατάλληλη φθορισμού λέιζερ αργού για οπτικοποίηση του CD133 χρησιμοποιήθηκε με ένα μήκος κύματος διέγερσης 488 nm και φίλτρο εκπομπής BP 505 – 530.

Η ανοσοϊστοχημεία

ανοσοϊστοχημεία για CD133 για SAOS2, MG63 και U2OS κύτταρα διεξήχθη. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πυκνότητα 50.000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων, μονιμοποιήθηκαν με 3,5% παραφορμαλδεΰδη επί 10 λεπτά στους 4 ° C, και πλύθηκαν σε PBS. Το πρώτο αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε ήταν αντι-ανθρώπινο CD133 /1 καθαρό (Miltenyi Biotec). Για δευτερογενές αντίσωμα και βαφή, το κιτ ϋΑΚΟ Cytomation En Vision + System-HRP (AEC) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη και τα κύτταρα παρατηρήθηκαν υπό ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός. Αυτή η διαδικασία επίσης εκτελείται σε sarcospheres.

RT-PCR σε πραγματικό χρόνο

Ακολουθίες για mRNAs από την τράπεζα δεδομένων νουκλεοτιδίων (National Center for Biotechnology Information, USA) χρησιμοποιήθηκαν για να σχεδιάσουν ζεύγη εκκινητών για RT -PCR αντιδράσεις (Primer Express, Applied Biosystems, CA, USA). Primer ακολουθίες είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Κατάλληλες περιοχές της HPRT (φωσφοριβοσυλοτρανσφεράσης υποξανθίνης-γουανίνης) cDNA χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι.