Αφηρημένο

Τα κύτταρα με σφαίρα ικανότητα σχηματισμού, σφαιροειδές κύτταρα, υπάρχουν στα κακοήθη ασκίτη των ασθενών με επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) και αντιπροσωπεύουν ένα σημαντικό εμπόδιο για την αποτελεσματική θεραπεία λόγω του υποτιθέμενου ρόλου τους στην εξέλιξη, μετάσταση και αντίσταση χημειοθεραπεία. Οι ακριβείς μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω από ΕΓΚ μετάσταση και η αντίσταση των ναρκωτικών δεν είναι σαφείς. Η κατανόηση της βιολογίας των κυττάρων που σχηματίζουν σφαίρα μπορεί να συνεισφέρει στην ταυτοποίηση νέων θεραπευτικών δυνατοτήτων για μεταστατικό EOC. Εδώ δημιουργούνται κύτταρα σφαιροειδές από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών και πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών. Xenoengraftment του τόσο λίγα όσο 2000 διίσταται σφαιροειδές κυττάρων σε ανοσο-ανεπαρκή ποντίκια επέτρεψε την πλήρη ανακεφαλαίωση του αρχικού όγκου, ενώ & gt? 10

5 κύτταρα όγκου γονέα παρέμειναν μη ογκογόνα. Τα σφαιροειδή κύτταρα βρέθηκαν να εμπλουτιστεί για τα κύτταρα με χαρακτηριστικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα παρόμοια όπως προς τα πάνω ρύθμιση των γονιδίων των βλαστικών κυττάρων, αυτο-ανανέωση, υψηλή πολλαπλασιαστική και δυναμικό διαφοροποίησης, και την υψηλή αφυδρογονάση αλδεΰδης (ALDH) δραστηριότητα. Επιπλέον, σφαιροειδές κύτταρα ήταν πιο επιθετική στην ανάπτυξη, τη μετανάστευση, την εισβολή, την ανάκτηση μηδέν, κλωνογονική επιβίωση, αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη, και πιο ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία

in vitro

.

13C-γλυκόζης μεταβολικές μελέτες αποκάλυψαν ότι η γλυκόζη σφαιροειδές κύτταρα διαδρομή κατά κύριο λόγο για την αναερόβια γλυκόλυση και πεντόζη κύκλο εις βάρος της γλυκόζης επαναδρομολόγηση για αναβολικά σκοπούς. Αυτές οι μεταβολικές ιδιότητες των κυττάρων που σχηματίζουν σφαίρα φαίνεται να προσδώσει αυξημένη αντίσταση στην απόπτωση και να συμβάλει στην ανάπτυξη πιο επιθετική όγκου. Συλλογικά, αποδείξαμε ότι σφαιροειδές κυττάρων με χαρακτηριστικά καρκίνο βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν συνέβαλαν στην παραγωγή του όγκου, της εξέλιξης και της αντίστασης σε χημειοθεραπεία. Αυτή η μελέτη παρέχει ενδείξεις για τη σχέση μεταξύ της διάδοσης του όγκου και μεταβολικές ιδιότητες των ανθρώπινων καρκινικών βλαστικών κυττάρων και έχει κλινική σημασία για τη θεραπεία του καρκίνου

Παράθεση:. Liao J, Qian F, Tchabo Ν, Mhawech-Fauceglia P, Beck A , Qian Ζ, et al. (2014) Καρκίνος των ωοθηκών σφαιροειδές Κύτταρα με Βλαστικών Κυττάρων-όπως ιδιότητες συμβάλλουν στην Tumor Γενιάς, Μετάσταση και χημειοθεραπεία Αντίσταση μέσα από υποξία-Resistant μεταβολισμού. PLoS ONE 9 (1): e84941. doi: 10.1371 /journal.pone.0084941

Επιμέλεια: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Σεπ, 2013? Αποδεκτές: 29, Νοεμβρίου 2013? Δημοσιεύθηκε: 7 Γενάρη του 2014

Copyright: © 2014 Liao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από Cancer Research Institute Καρκίνος των ωοθηκών Ομάδα εργασίας Grant, Καρκίνος Εμβόλιο Συνεργατική επιχορήγησης του Ινστιτούτου Έρευνας Καρκίνου και Ludwig Institute for Cancer Research, Άννα-Μαρία Kellen κλινικός ερευνητής Βραβείο του Ινστιτούτου Έρευνας για τον Καρκίνο (να KO), Roswell Park Cancer Ίδρυμα Συμμαχία Ινστιτούτο, ΝΙΗ P30 CA016056? ΝΙΗ R01CA158318-01A1 και RPCI-UPCI καρκίνου των ωοθηκών SPORE P50CA159981-01A1. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή καρκίνο των ωοθηκών

τα επιθηλιακά (ΕΓΚ) είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες. Υπάρχουν περισσότερες από 23.000 περιπτώσεις ετησίως στις Ηνωμένες Πολιτείες, και 14.000 γυναίκες αναμένεται να πεθάνουν από την ασθένεια [1]. Παρά τις μέτριες βελτιώσεις στα ποσοστά ανταπόκρισης, χωρίς εξέλιξη και η διάμεση επιβίωση χρησιμοποιώντας ανοσοενισχυτικό πλατίνας και ταξάνιο χημειοθεραπεία μετά από κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση, τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης των ασθενών με προχωρημένο EOC και των ωοθηκών, όπως κακοήθειες (πρωτοβάθμια περιτοναϊκή) παραμένουν απογοητευτικές [2]. Αυτό έχει αποδοθεί σε διάφορους λόγους. Πρώτον, σε αντίθεση με τις περισσότερες άλλες συμπαγείς όγκους, περισσότερο από το 75% των ασθενών ΕΓΚ παρούσης με προχωρημένη νόσο σταδίου (FIGO III ή IV). Δεύτερον, αν και οι περισσότεροι ασθενείς ανταποκρίνονται αρχικά σε πλατίνα και χημειοθεραπεία με πακλιταξέλη, συμπεριλαμβανομένης της πλήρους απαντήσεις, το ποσοστό υποτροπής είναι περίπου 85%. Εντός 2 ετών από κυτταρομειωτική χειρουργική επέμβαση και συστηματική χημειοθεραπεία, όγκοι συνήθως υποτροπιάζει και μια φορά υπάρχει υποτροπή, η θεραπευτική αγωγή είναι δύσκολη. Ως εκ τούτου, είναι επιτακτική ανάγκη να κατανοήσουμε τον μηχανισμό (ες) του ΕΓΚ μετάστασης και της αντίστασης σε χημειοθεραπεία προκειμένου να βελτιωθεί η κλινική έκβαση σε αυτή τη νόσο.

Ο κύριος τρόπος μακρινή μετάσταση σε EOC περιλαμβάνει την απόπτωση των κυττάρων από τον πρωτεύοντα όγκου, μέσα στην κοιλιακή κοιλότητα, που ακολουθείται από εμφύτευση στο μεσοθηλιακών επένδυση του περιτοναίου [3], [4]. Επί του παρόντος, υπάρχουν δεδομένα που να καταδεικνύουν ότι «κύτταρα που σχηματίζουν σφαίρα» ή «σφαιροειδή» βρίσκονται συνήθως σε ασκίτη και είναι ικανά να ογκογένεσης

in vivo

, έχουν μειωμένη απόκριση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα

in vitro,

και μπορεί να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην μεταστατική νόσο [5] – [9]. Επειδή μεταβολικές αλλαγές μπορεί να παρέχει πλεονέκτημα στην ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να επιβιώσουν, πολλαπλασιάζονται και να εισβάλουν [10] – [12], υποθέσαμε ότι τα κύτταρα που σχηματίζουν σφαίρα είναι πιθανό να εμφανίζουν μεταβολικές ιδιότητες που προωθούν την ικανότητά τους να επιβιώσουν και να κάνουν μετάσταση. Στην παρούσα μελέτη, δημιουργούνται κύτταρα σφαιροειδές από κυτταρικές σειρές EOC και από ασθενείς με πρωτοπαθή καρκίνο των ωοθηκών. Μας

in vivo

και

in vitro

βιολογικές μελέτες πρότειναν ότι αυτά τα κύτταρα που σχηματίζουν σφαίρα είναι εμπλουτισμένα σε καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με (CSCL) που συμβάλλουν κριτικά στην ογκογένεση του καρκίνου των ωοθηκών, μετάσταση και η αντίσταση χημειοθεραπεία. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ισότοπο που βασίζεται σε δυναμική μεταβολικό προφίλ [13], [14], για να αξιολογήσει ταυτόχρονα τη ροή του υποστρώματος εντός και μεταξύ των κύριων μεταβολικών οδών της σύνθεσης μακρομορίων και την παραγωγή ενέργειας υπό διάφορες φυσιολογικές συνθήκες. Βρήκαμε ότι σφαιροειδές κύτταρα αυξάνουν την αναερόβια γλυκόλυση και πεντόζη κύκλο και να μειώσει εκ νέου δρομολόγηση της γλυκόζης για αναβολικά σκοπούς. Αυτή η μελέτη παρέχει γνώσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ της διάδοσης του όγκου και μεταβολικές ιδιότητες των κυττάρων CSCL των ωοθηκών, και έχει κλινικές επιπτώσεις για τη θεραπεία του καρκίνου.

Υλικά και Μέθοδοι

Απομόνωση καρκινικά κύτταρα από τον καρκίνο των ωοθηκών Human

δειγμάτων όγκου και ασκιτικό υγρό ελήφθησαν από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση όγκου debulking για επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών (EOC) σε Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, ΝΥ. Όλα τα δείγματα συλλέχθηκαν στο πλαίσιο εγκεκριμένου πρωτοκόλλου CIC 02-15 από το Διοικητικό κριτική Θεσμικών σε RPCI, και ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή. Καρκινικά κύτταρα από ασκίτη λήφθηκαν από φυγοκεντρήθηκαν κύτταρο σφαιρίδια ασκιτικού υγρού. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν δύο φορές σε PBS, τοποθετήθηκαν σε βαθμίδες πυκνότητας Ficoll-Hypaque και φυγοκεντρείται πάλι στα κύτταρα του όγκου συγκομιδής. Για τη λήψη κυττάρων όγκου από στερεές καρκινικό ιστό, τα δείγματα όγκου λεπτοκομμένη σε μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και απλά εναιωρήματα κυττάρου πλύθηκαν δύο φορές σε PBS που ακολουθείται από καθαρισμό Ficoll-Hypaque.

Cell Culture

Πρωτογενής EOC κυτταρικές γραμμές καθιερώθηκαν από συμπαγή όγκο και ασκίτη με καλλιέργεια κυττάρων σε 13 διαφορετικές συνθήκες [15], [16] από 30 ασθενείς EOC σε περίοδο 2 ετών. Σφαιροειδή κύτταρα δημιουργήθηκαν από νέες EOC κυτταρικές σειρές και από μια καθιερωμένη καρκινική κυτταρική γραμμή ωοθηκών, OV2774, τα οποία ελήφθησαν από Sloan Kettering Institute, Νέα Υόρκη, ΝΥ (ευγενική προσφορά του Lloyd J. Old, Ludwig Institute for Cancer Research, ΝΥ), με η μέθοδος όπως περιγράφεται [17] με τροποποιήσεις με επαναιώρηση 8 × 10

4 κύτταρα με ελεύθερο ορού DMEM /F12 συμπληρωμένο με 10 ng /ml ανθρώπινου ανασυνδυασμένου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF? Invitrogen), 10 ng /ml βασικό ινοβλαστικό αυξητικό παράγοντα (bFGF? Invitrogen), και Ν2 συμπλήρωμα-Α (StemCell Technologies Inc) σε Ultra Low προσάρτημα 6-φρεατίων (Corning) και μετέπειτα οργάνωση σε σφαίρες

In vivo

ξενομοσχεύματος πειράματα.

Όλες οι μελέτες σε ζώα τηρούνται πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Επιτροπή Θεσμικών ζωικά Φροντίδα και Χρήση των RPCI. Διασπασμένα σφαιροειδή ή γονέα καρκινικά κύτταρα μετρήθηκαν, επαναιωρείται σε 50 μί 1:01 RPMI /Matrigel (BD Biosciences), και με ένεση υποδόρια (SC) στα δεξιά πόδια των 3 έως 4 εβδομάδων ηλικίας θηλυκών SCID ποντίκια (CB-igh -1blcrTac-Prkdcscid /Ros) που παρέχονται από διευκόλυνση RPCI ζώων (προέρχεται από την Taconic Farms, Hudson, Νέα Υόρκη). Τα μεταμοσχευμένα ποντίκια επιθεωρούνται δύο φορές την εβδομάδα για την εμφάνιση όγκου με οπτική παρατήρηση και ψηλάφηση, και προσδιορίστηκαν λανθάνουσες όγκου. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση σε διάμετρο όγκου 1 cm ή στους 6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Ξενομοσχεύματος όγκοι αποκόπηκαν, μονιμοποιήθηκαν σε 10% ουδέτερη, ρυθμισμένης φορμαλίνης, και ενσωματωμένα σε παραφίνη για τεμαχισμό (5 μm) σε έναν περιστροφικό μικροτόμο, ακολουθούμενη από slide στερέωσης, Η &? Χρώση Ε, και ιστολογική αξιολόγηση από έναν παθολόγο για τον τύπο του όγκου, βαθμός , και το στάδιο. Για τον προσδιορισμό ξενομόσχευμα ανακεφαλαίωση του γονικού φαινοτύπου του όγκου, η ίδια διαδικασία εκτελέστηκε σε ανθρώπινους όγκους. Για να αξιολογηθεί σχηματισμό όγκων των ωοθηκών στη μητρική τους περιβάλλον, SCID ποντικοί εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά (ίρ) με διάφορες ποσότητες σφαιροειδή προερχόμενα κύτταρα ή γονέας οι όγκοι τους, παρακολουθούνται δύο φορές την εβδομάδα για την αλλαγή του βάρους και το σχηματισμό ασκίτη, και υποβάλλονται σε ευθανασία μετά την υπερβολική κοιλιακή διάταση ή ψηλαφητό όγκο ανάπτυξης.

Stem δείκτης κυττάρων Gene Expression Profiling

δείκτης βλαστικών κυττάρων σειρά Ανθρωπίνων πλάκα cDNA Signosis χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει που σχετίζονται με τη γονιδιακή έκφραση των βλαστικών κυττάρων σε σφαιροειδές κύτταρα και μητρικά κύτταρα σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, το ολικό RNA απομονώθηκε από τα κύτταρα με το αντιδραστήριο Tri (Molecular Research Center, Inc.) μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA, το οποίο υβριδοποιήθηκε με γονίδιο-ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο προ-επικαλυμμένα με μεμονωμένα φρεάτια. Το επίπεδο έκφρασης των γονιδίων ανιχνεύθηκε με σήματα χημειοφωταύγειας με αναγνώστη πλάκας.

ποσοτική PCR

Ολικό RNA ζητουμένη από σφαιροειδές ή μη σφαιροειδές κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit Qiagen ανά διαδικασία και αντίστροφη κατασκευαστή μεταγράφονται σε cDNA με iScript cDNA Synthesis Kit από τη Bio-Rad. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Bio-Rad του iQ SYBR Green Supermix ανά πρωτόκολλα εταιρείας σε ένα σύστημα iQ iCycler επίσης από την Bio-Rad. Οι σε πραγματικό χρόνο αλληλουχίες εκκινητών PCR παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Η θερμική κυκλοποίηση πραγματοποιήθηκε με ένα αρχικό βήμα μετουσίωσης στους 95 ° C για 3 λεπτά που ακολουθείται από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 δευτερόλεπτα, στη συνέχεια 60 ° C για 1 λεπτό για ανόπτηση και τη συλλογή δεδομένων. ανάλυση Λιώστε-καμπύλη εκτελέστηκε αμέσως μετά το πρωτόκολλο ενίσχυσης υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 80 κύκλοι των 0.5 ° μοίρες C (10 sec το καθένα) που αρχίζει στις 57,5 ​​° C (βαθμίδα συλλογής δεδομένων). Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν, με κανονικοποίηση προς το L4 γονίδιο ριβοσωμικής πρωτεΐνης (RPL4) ως ένα επίπεδο εσωτερικού ελέγχου και η έκφραση του γονιδίου-στόχου ήταν υπολογίζονται ΔΔC

t μέθοδο χρησιμοποιώντας ποσοτική λογισμικό ανάλυσης iQ5 PCR Bio-Rad του.

ΑΙ_ϋΗ Δραστηριότητα Ανάλυση

Το κιτ ALDEFLUOR (StemCell Technologies, Vacouver, Καναδάς) χρησιμοποιεί ένα φθορίζον υπόστρωμα που συσσωρεύεται στο εσωτερικό των κυττάρων μετά οξειδώνεται από το ένζυμο ALDH. Κύτταρα σε μια συγκέντρωση 2 × 10

5 /ml βάφτηκαν με 5 μl αντιδραστηρίου ALDEFLUOR στους 37 ° C για 45 λεπτά. Σε κάθε πείραμα, ένα δείγμα κυττάρων χρωματίστηκε υπό ταυτόσημες συνθήκες με ειδικές diethylaminobenzaldehyde αναστολέα ΑΙ_ϋΗ (ϋΕΑΒ) ως αρνητικός έλεγχος για τη δημιουργία κυτταρομετρία ροής πύλη. Το κιτ δοκιμασίας Δραστηριότητα BioVision ΑΙ_ϋΗ (BioVision) ποσοτικοποιεί την ενζυματική δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ με απορρόφηση ανάγνωσης στα 450 nm. Η ακεταλδεΰδη οξειδώνεται από ΑΙ_ϋΗ δημιουργώντας NADH η οποία στη συνέχεια μειώνει ένα άχρωμο ανιχνευτή σε ένα έγχρωμο προϊόν. Σφαιροειδές κύτταρα ή γονικά κύτταρα (1 χ 10

6) λύθηκαν δια 200 μΙ ALDH Assay Buffer και 10 μΐ του λύματος κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμασία. OD450s μετρήθηκαν στα 10 λεπτά και 1 ώρα διαστήματα και δραστηριότητες ALDH υπολογίστηκαν σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Όλες οι δοκιμές έγιναν εις διπλούν.

Ο πολλαπλασιασμός Δοκιμασία

Γονική και σφαιροειδή κύτταρα ΕΓΚ καλλιεργήθηκαν σε πλήρες μέσο (CM, 10% FBS + RPMI) ή μη συμπληρωμένα RPMI για 24 ώρες. Στη συνέχεια, οι ίδιες ποσότητες κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα καλλιέργειας ιστού με CM, το ήμισυ του μέσου αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες και η ανάπτυξη των κυττάρων ανιχνεύθηκε με Βιωσιμότητα Δοκιμασία CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων όπως περιγράφεται [18] (Promega Corp). Οι προσδιορισμοί πολλαπλασιασμού έγιναν εις τριπλούν.

Μετανάστευση Δοκιμασία

Γονική και σφαιροειδείς κύτταρα ΕΓΚ υποβλήθηκαν σε αγωγή με μη συμπληρωμένα RPMI για 24 ώρες. Σε μια πλάκα Transwell, 2 × 10

5 /φρεάτιο κύτταρα τέθηκαν σε ένθετο με 0.2% BSA μέσο-RPMI, ο θάλαμος δεν έχει κύτταρα εκτός μέσου RPMI με 2,5% FBS. Μετά από καλλιέργεια για 1, 2, και 3 ημέρες, οι αριθμοί των κυττάρων που πέρασαν από μεμβράνη όπως επίσης και κύτταρα εμπίπτουν σε θάλαμο υπολογίστηκαν υπό μικροσκόπιο μετά από 10% φορμαλδεΰδη, για τον καθορισμό για 20 λεπτά που ακολουθείται από 0,1% μπλε χρώσης crystal για άλλα 20 λεπτά και τα δύο σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Όλες οι δοκιμές έγιναν εις διπλούν.

Επούλωση Πληγών (Ξυστό) Δοκιμασία

Γονική και σφαιροειδή κύτταρα ΕΓΚ καλλιεργήθηκαν σε CM για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων σε 80-90% συρροή και η κυτταρική μονοστοιβάδα αποξέσθηκε σε ευθεία γραμμή με ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl για τη δημιουργία ενός «μηδέν». Θραύσματα απομακρύνθηκαν με PBS και στη συνέχεια η καλλιέργεια επανατροφοδοτούνται με φρέσκο ​​μέσο. Εικόνες ελήφθησαν στις 0 και 24 ώρες μετά την αρχή για να υπολογίσει το ρυθμό μετανάστευσης των κυττάρων.

Εισβολή Δοκιμασία

Γονική και σφαιροειδείς κύτταρα ΕΓΚ υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με RPMI μόνο μέσο για 24 ώρες. Σε μια πλάκα Transwell, 40000 /φρεάτιο κύτταρα τέθηκαν σε ένθετο το οποίο είναι επικαλυμμένο με Matrigel σε 0.2% BSA-μέσον RPMI, ο θάλαμος δεν έχει κύτταρα εκτός μέσου RPMI με 5% FBS. Μετά από καλλιέργεια για 1, 2, και 3 ημέρες, ένθετα συλλέχθηκαν και η επιφάνεια των μεμβρανών καθαρίζονται, τα κύτταρα σε Matrigel σταθεροποιήθηκαν κατά 10% φορμαλδεΰδη για 20 λεπτά RT και τους αριθμούς των κυττάρων που εισβάλει στον matrigel προσδιορίστηκαν μετά από χρώση με 0,1 % καταγάλανα 20 λεπτά RT. Όλα τα πειράματα έγιναν εις διπλούν.

Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη Δοκιμασία

Πεντακόσια κύτταρα σπάρθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες 6 φρεατίων που περιέχει ένα ανώτερο στρώμα του 0,3% μαλακό άγαρ και άγαρ 0,5% βάσης σε DMEM, 10% FBS. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, ο μέσος αριθμός κυττάρων σπάρθηκε ανά πεδίο προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων σε 5 διαφορετικά πεδία κάτω από το μικροσκόπιο φωτός. Οι αποικίες που σχηματίζονται (& gt? 0,1 mm σε διάμετρο) μετά από 3 εβδομάδες ανάπτυξης σε μαλακό άγαρ μετρήθηκαν? 10 διαφορετικά πεδία προσδιορίστηκαν ποσοτικά ανά φρεάτιο και υπολογίστηκε ο μέσος αριθμός των αποικιών ανά πεδίο. Ο δείκτης (ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη) AIG εκφράστηκε σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων σπάρθηκε.

Chemotherapy Δοκιμασία αντίστασης

Spheres διαχωρίστηκαν με αγωγή με θρυψίνη και σιφωνισμού και τα κύτταρα σπάρθηκαν στα 5000 κύτταρα ανά φρεάτιο (96-φρεατίων? Corning) σε 200 μί μέσου CM. Όλα τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 24 ώρες με 0 έως 6 μg /mL Σισπλατίνη (BD Biosciences) ή 0 έως 18 μg /mL Paclitaxel (Sigma? Η = 5 ανά δόση φαρμάκου). Σχετική αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν με CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας Δοκιμασία [18]. Πειράματα δόσης-απόκρισης διεξήχθησαν εις διπλούν. Ποσοστό επιβίωσης των κυττάρων εκφράζεται σε σχέση με μη κατεργασμένο έλεγχο. Σφαιροειδές κυτταροτοξικότητες κύτταρο φάρμακο συγκρίθηκαν μετά από αγωγή 48 ωρών με σισπλατίνη (4 μg /mL). Μετά φαρμακευτικές αγωγές, τα κύτταρα επωάστηκαν για 8 ημέρες σε μέσο και κυτταρικές αποικίες CM χωρίς φάρμακο εξετάστηκαν κάτω από μικροσκοπία.

Δοκιμασία Επιβίωσης Κλωνογόνος

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες ποσότητες σισπλατίνης για 24 ώρες . Μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS, συλλέχθηκαν και 300 επιζώντα κύτταρα /φρεάτιο επανα-τροφοδοτήθηκαν με μέσο CM σε πλάκα 6 φρεατίων. 10-14 ημέρες αργότερα, οι αποικίες βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν.

Ανοσοϊστοχημεία

δειγμάτων όγκου μονιμοποιήθηκαν με ρυθμισμένη φορμαλίνη και εγκλείστηκαν σε παραφίνη. Τμήματα (5 μm) τοποθετήθηκαν σε γυάλινα slides, θερμαίνεται στους 60 ° C για 20 λεπτά, και στη συνέχεια αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο και αιθανόλη. Για ανάκτηση αντιγόνου, τα δείγματα όγκων τοποθετήθηκαν σε υάλινες αντικειμενοφόρες πλάκες βυθίστηκαν σε προθερμασμένο διάλυμα ανάκτησης αντιγόνου (διάλυμα υψηλού ρΗ ϋΑΚΟ? DAKO, Carpinteria, CA) για 20 λεπτά και αφέθηκε να κρυώσει για 20 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την αδρανοποίηση του ενδογενούς υπεροξειδάσης, καθαρίστηκε ειδικό CA125 μονοκλωνικό αντίσωμα (Ov 185:1, Novocastra) (1:200 αραίωση) και CK7 (Dako) (1:20 αραίωση ή 75 μg /ml) προστέθηκαν στη συνέχεια, και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Το πρωτογενές αντίσωμα ανιχνεύθηκε με ένα βιοτινυλιωμένο IgG αντι-ποντικού (ϋΑΚΟ). Τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδίνη προστέθηκε στη συνέχεια για την ανάπτυξη για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από αντικηλίδωση με διάλυμα αιματοξυλίνης.

Biochemical Αναλύσεις

Η χρήση του [U-

13C

6] ιχνηθέτη γλυκόζης σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας επιτρέπει την αξιολόγηση της μεταβολικής ροής μέσω των κύριων οδών διευκολύνοντας την παραγωγή ενέργειας και βιοσυνθετικής μεταβολισμό του κυττάρου. Κανονική κύτταρα των ωοθηκών (RPNLOv78) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Τ Πέγιοβιτς [19]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1:01 μίγμα από RPMI και DMEM (χωρίς γλυκόζη) + 10% FBS 10 μg /ml ινσουλίνη 10 ng /ml EGF + 0,1% Γενταμυκίνη + [U-

13C

6] γλυκόζη (180 mg /ml). Μητρική κύτταρα (RP-OV17534) καλλιεργήθηκαν σε RPMI + 10% FBS + [U-

13C

6] (χωρίς γλυκόζη) γλυκόζη (180 mg /ml). RP-OV17534 κύτταρα σφαιροειδές καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 (χωρίς γλυκόζη) + Ν2 Συμπλήρωμα-Α + EGF 10 ng /ml + bFGF 10 ng /ml + [U-

13C

6] γλυκόζη (180 mg /ml). Μετά από 24 ώρες από την επώαση, τα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν (1500 rpm για 5 λεπτά) και ελήφθησαν μέσο επώασης και σφαιρίδια κυττάρου. Οι συγκεντρώσεις γλυκόζης και μέσον επώασης γαλακτικό προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Γαλακτικού οξέος από το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας εκχυλίζεται με οξικό αιθυλεστέρα μετά την οξίνιση με HCl. Γαλακτικό μετετράπη προς προπυλαμίδιο-επταφθοροβουτυρικό μορφή της και η

m /z

330 και 331 (άνθρακες 2-3 γαλακτικού, χημικό ιονισμό) παρακολουθήθηκε για την ανίχνευση

m2

(

13C διπλά επισημασμένου γαλακτικό) και

m3

(triple-σημασμένο γαλακτικό) για την εκτίμηση της πεντόζης δραστηριότητας κύκλου έναντι αναερόβια γλυκόλυση [21]. Το γλουταμινικό διαχωρίστηκε από το μέσο χρησιμοποιώντας ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία [22]. Γλουταμινικό μετατράπηκε σε

ν

-trifluoroacetyl-

ν

-βουτυλο παράγωγο και οι συστάδες ιόντων

m /z

198 (άνθρακες 2-5 του γλουταμινικού, πρόσκρουσης ηλεκτρονίων ιονισμού του ) παρακολουθήθηκαν.

13CO

2 απελευθέρωσης μετρήθηκε με μια αναλογία μάζας φασματοσκόπιο Finnegan Delta-S ιόντων και χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η χρησιμοποίηση του άνθρακα της γλυκόζης μέσω της οξείδωσης από τις κυτταρικές σειρές [23]. Μάζα φασματικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν από τρεις ανεξάρτητους αυτόματη ενέσεις από το δειγματολήπτη και γίνονται δεκτές μόνο εφόσον η τυπική απόκλιση του δείγματος ήταν & lt?. 1% της κανονικοποιημένης έντασης κορυφής

Ανάλυση Δεδομένων και Στατιστικές Μέθοδοι

οι στατιστικές αναλύσεις έγιναν χρησιμοποιώντας την παραμετρική αταίριαστα, δίπλευρη ανεξάρτητο δείγμα

t

δοκιμή με διαστήματα εμπιστοσύνης 99%.

Αποτελέσματα

Δημιουργία σφαιροειδές κύτταρα από Πρωτοβάθμια καρκίνου των ωοθηκών δείγματα και ιδρύθηκε EOC τηλέφωνα γραμμές

σταθερές κυτταρικές σειρές καθιερώθηκαν με επιτυχία από 3 30 (10%) των πολιτισμών που ξεκίνησε από το δημοτικό ΕΓΚ δείγματα για μια περίοδο 2 ετών. RP-OV15526 προήλθε από συμπαγή όγκο, ενώ RP-OV17534 και RP-OV313777 προήλθαν από EOC ασκίτη. Αυτά τα κύτταρα έχουν καλλιεργηθεί

in vitro

για 465, 312, και 125 ημέρες, με 68, 65, και 17 περάσματα, αντίστοιχα. Όλες οι γραμμές ήταν από τα τέλη του σταδίου (IIIC ή IV) ασθενείς των ωοθηκών ορώδες αδενοκαρκίνωμα. Συρρέουσα μονοστιβάδα πρωτογενών ανθρώπινων κυττάρων EOC απεικονίζεται τυπικός επιθηλιακή μορφολογία λιθόστρωτα με 3-διαστάσεων αυξανόμενη προς τα πάνω στις περιοχές των κυττάρων-συμπυκνωμένη (Εικ. 1Α). Εξέταση των επιθηλιακών δεικτών CK-7 και ΟΑ-125 επιβεβαίωσε περαιτέρω την επιθηλιακή φύση αυτών των πρωτογενών κυτταρικών σειρών (Σχ. 1 C). Για να παράγουν κύτταρα σφαιροειδές, καρκίνο ωοθηκών OV2774 κυτταρική γραμμή ή πρωτογενών κυττάρων EOC ενζυματικώς διαχωρίστηκαν και εμβολιάστηκαν σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής καλλιέργειας προσκόλλησης σε μέσο ελεύθερο ορού με EGF, bFGF, και Ν2 συμπλήρωμα-A. Σε αυτή την κατάσταση ο πολιτισμός μερικά κύτταρα πέθαναν από την πείνα στον ορό, ενώ άλλοι αναγκάστηκαν σε αναστολή και σχηματίζονται συσσωματώματα. Τρεις εβδομάδες μετά την επίστρωση, κάποια συσσωματώματα συμπιέζονται σε σφαίρες οι οποίες δεν μπορούσαν να διαχωριστούν με χρήση πιπέτας. Μερικές από τις σφαίρες, επίσης, συγκεντρώνονται για να σχηματίσουν σφαίρα συμπλέγματα. Κυμαινόμενο σφαίρες και συστάδες διαχωρίστηκαν με πιπέτα, και απλώνονται εκ νέου δύο φορές την εβδομάδα, με τα προκύπτοντα κύτταρα παράγουν δευτερογενή τομέα, που εμφανίζεται ως ξεχωριστή πρωτότυπη σφαιροειδή (Εικ. 1Β, 1Ε), παρόμοιες με αυτές που βρέθηκαν σε ασκίτη των ασθενών [5], [6] . Χρησιμοποιώντας αυτή την προσέγγιση, πετύχαμε βιώσιμη σφαιροειδή από καθιερωμένη κυτταρική γραμμή OV2774 (Σχ. 1D και 1Ε) και πρωτογενή κύτταρα EOC RP-OV17534 (Σχ. 1Α και 1Β) υπό συνθήκες στέλεχος εκλεκτικές. Έχουμε καλλιεργήθηκαν το OV2774 και RP-OV17534 κύτταρα ως σφαιροειδή για 6 μήνες, αποδεικνύοντας την αυτο-ανανέωση ικανότητα των κυττάρων σφαιροειδούς.

(Α) Τρεις πρωτογενείς κυτταρικές σειρές που δημιουργούνται από ασθενείς EOC δείχνουν επιθηλιακά κύτταρα μορφολογία. (Β) Ένας από τους πρωταρχικούς κυτταρική γραμμή EOC παράγεται 3-D ανεξάρτητο, αυτο-ανανέωση των κυττάρων σφαιροειδές σύμφωνα με τα μέσα ενημέρωσης επιλογή βλαστικών κυττάρων. (C) Πρωτογενής κυτταρικές σειρές εκφράζουν τον προσωπικό καρκίνωμα των ωοθηκών CA-125 και επιθηλιακά δείκτη CK-7, όπως φαίνεται από την IHC για RP-OV17534. (D) ΕΓΚ κυτταρική σειρά OV2774 είναι σε θέση να παράγουν τα κύτταρα OV2774 σφαιροειδές (Ε). Όλα μονάδας κλίμακας μπαρ σε αυτό το σχήμα και παρακάτω στοιχεία είναι σε μm.

Η

σφαιροειδές κύτταρα Ογκογονικότητα και μετάσταση σε ανοσοποιητικού-ανεπαρκή ποντίκια

Στη συνέχεια, μελετήσαμε την ογκογονικότητα των κυττάρων σχηματισμού σφαίρας . Εξετάσαμε αν εκθετικά μικρότερους αριθμούς (σε σύγκριση με τη γονική καρκινικά κύτταρα) ήταν ικανά ογκογένεσης, όπως δείχνεται προηγουμένως για άλλα επιθηλιακά κύτταρα έναρξης του καρκίνου (CICs) [24] – [28]. Σφαιροειδές κύτταρα ή αντίστοιχο καρκινικά κύτταρα γονική χύμα ενέθηκαν υποδορίως στο δεξί πόδι του SCID ποντίκια. Με ενέσεις μόνο 2.000 κύτταρα ανά ποντικό, σφαιροειδή κύτταρα ήταν ογκογόνα σε 4 από τους 4 ποντικούς SCID για κύτταρα σφαιροειδή RP-OV17534 και 2 από 2 για κύτταρα σφαιροειδές OV2774, όπως αποδεικνύεται από ψηλαφητών όγκων στο σημείο της ένεσης (Σχήμα 2Α?. Πίνακας 2 ). Ο διάμεσος χρόνος καθυστέρησης του όγκου στην ομάδα αυτή ήταν 31 έως 90 ημέρες για την RP-OV17534 σφαιροειδές και 50 έως 57 για OV2774 σφαιροειδή, παρόμοια με ή μικρότερη από CICs άλλων κακοηθειών [24] – [27]. Αντίστοιχα, ενέσεις 5000 και 10000 σφαιροειδή κύτταρα RP-OV17534 ήταν επίσης ογκογόνα σε τρεις από τρεις ποντικούς με μικρότερη λανθάνουσες όγκου (Σχ 2Α?. Πίνακας 2). Χωρίς μη προσκολλημένα επιλογή σφαιροειδές, χύμα καρκινικά κύτταρα απέτυχαν να σχηματίσουν όγκους ακόμη και στα 40.000 κύτταρα για την RP-OV17534 εμφύτευση (Πίνακας 2). Όλες οι υποδόριες ξενομοσχεύματος όγκους που προέρχονται από σφαιροειδή κύτταρα κατηγοριοποιούνται ως ορώδες αδενοκαρκινώματα μέτρια /κακή διαφοροποίηση (βαθμός 2 /βαθμός 3), παρόμοια με τα γονικά πρωτογενή όγκων του ασθενούς (Η &? Ε βαμμένες τομές? Εικ. 2C). Δεν αρχιτεκτονικά /κυτταρολογική παρατηρήθηκαν διαφορές μεταξύ πρωτοβάθμιας και μοσχευμάτων όγκων.

(Α) Διαφορετικοί ποσό των σφαιροειδές κυττάρων υποδορίως ένεση σε ποντίκια SCID που σχηματίζεται όγκους. (Β) σφαιροειδές κύτταρα ε.π. ένεση σε ποντίκια SCID που σχηματίζεται αιματηρή ασκίτης και όγκων σε διάφορα όργανα όπως υποδεικνύεται από τα βέλη. (C) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε τμήματα χρώσης (άνω πάνελ) δείχνει RP-OV17534 πρωτογενούς όγκου, υποδόριο όγκο μοσχεύματος από σφαιροειδή, ενδοπεριτοναϊκή όγκος μοσχεύματος από σφαιροειδή, και το σειριακό ενδοπεριτοναϊκή όγκου του μοσχεύματος από SCID ασκίτες ποντικού. Η ιστολογική ανάλυση (κάτω πάνελ) δείχνει συχνές μετάσταση των καρκινικών κυττάρων σε διάφορα όργανα των δικαιούχων σφαιροειδές κυττάρων.

Η

Ένας σημαντικός περιορισμός των μελετών CICs είναι εμφύτευση σε μη φυσικούς μικροπεριβάλλοντα [29], [30]. Για να αποδείξουν ότι CICs ανακεφαλαίωση πιστά την καθιερωμένη εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών στη μητρική περιβάλλον του, τα πειράματα διεξήχθησαν με ενδο-περιτοναϊκή (ε.π.) ενέσεις. Η ε.π. ένεση μόνο 10.000 κύτταρα ανά ποντικό σφαιροειδή κύτταρα RP-OV17534 οδήγησε σε ανάπτυξη της αιματηρής ασκίτη σε 4 από τους 4 ποντικούς SCID (Σχήμα 2Β?. Πίνακας 2), με λανθάνουσες όγκου από 75 έως 84 ημέρες, παρόμοια με ή μικρότερη από CICs του άλλες κακοήθειες [17]. Αντίστοιχα, ε.π. ενέσεις 20.000 και 40.000 σφαιροειδή κύτταρα επίσης ογκογόνα σε τρεις από τρεις ποντικούς με μικρότερη λανθάνουσες όγκου (Πίνακας 2). Χωρίς τα μη προσκολλημένα επιλογή σφαιροειδές, χύμα καρκινικά κύτταρα απέτυχαν να σχηματίσουν αιματηρή ασκίτη και όγκους ακόμη και σε 80.000 κύτταρα ανά ένεση, ενώ το ένα του ενός και 3 από 3 ποντίκια ε.π. ένεση αντίστοιχα με 1.7 × 10

7 και 2 × 10

7 γονικών κυττάρων πρωτογενούς ΕΓΚ ήταν ογκογόνο, έστω και με εκτεταμένη λανθάνουσα κατάσταση (92-105 ημερών? Πίνακας 2). Ε.π. ένεση κυττάρων σχηματισμού σφαίρας είχε ως αποτέλεσμα την ανάπτυξη της αιματηρής ασκίτη και περιτοναϊκή μετάσταση στην επίπλουν, το ήπαρ, του παχέος εντέρου, του στομάχου και των νεφρών (σχ. 2Β), και ενδοπεριτοναϊκή ιστολογία όγκων που είναι παρόμοια με δύο υποδόριες ξενομοσχεύματος και πρωτογενείς όγκους ασθενών (Σχ. 2C ). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα για το RP-OV17534, παρατηρήσαμε επίσης υψηλότερη ογκογονικότητα των κυττάρων σφαιροειδούς OV2774 σχέση με το μητρικό τους κύτταρα, σε παρόμοιες ί.ρ. πειράματα σε ζώα μεταμόσχευση χρησιμοποιώντας προέρχεται OV2774 κύτταρα (Πίνακας 2).

Ένα άλλο βασικό κριτήριο για CICs είναι η ικανότητά τους να διαδίδονται σειριακά όγκων σε διαδοχικά μεταμοσχευμένα ζώα [31]. Για να εξετάσουμε αυτό το οριστικό βλαστική ικανότητα χαρακτηριστικό, σειριακό ενοφθαλμισμών του έγιναν ξενομοσχευμάτων. 2 × 10

4 του σφαιροειδούς κυττάρων ήταν ε.π. ένεση σε ποντίκια SCID και ασκίτης αναπτύχθηκαν όπως αναμένεται σε 3 από 3 ποντικούς σε περίπου 60 ημέρες. Μεταμόσχευση 8 × 10

4, 1 × 10

5, και 5 × 10

5, όπως ασκίτης κυττάρων σε SCID ποντίκια είχε σαν αποτέλεσμα ασκίτη και όγκους, με μια λανθάνουσα κατάσταση σημαντικά μικρότερη από εκείνη των γονικών κυττάρων όγκου ασθενή ( 66/63/49 ημερών αντίστοιχα για το πέρασμα 2 ξενομοσχεύματα έναντι καμίας ανάπτυξης του όγκου για μητρικής καρκινικά κύτταρα του 8 × 10

4 μεταμόσχευση σε 0 στα 3 ποντίκια SCID). Η παθολογία της επιπλοϊκά μάζας ήταν παρόμοια με εκείνη του s.c. όγκων (Σχ. 2C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας είναι πιο ογκογόνα από τα γονικά κύτταρα όγκου τους, που καταδεικνύουν ότι μια εξαιρετικά ογκογόνα υποπληθυσμό κυττάρων είναι παρόντα μέσα στα κύτταρα σχηματισμού σφαίρας, και μπορούν να διαμένουν εντός νεοπλάσματα ωοθηκών. Από RP-OV17534 κύτταρα σφαιροειδές και OV2774 κύτταρα σφαιροειδή αποδειχθεί παρόμοια χαρακτηριστικά, τα ακόλουθα αποτελέσματα παρουσιάζονται για RP-OV17534 προέρχονται κυττάρων με παρόμοιες παρατηρήσεις για τα κύτταρα OV2774.

ωοθηκών Tumor σχηματισμού σφαίρας κύτταρα εκφράζουν γονίδια Βλαστικών Κυττάρων

για να εξεταστεί η έκφραση του γονιδίου ειδικά για τα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα, ολικό RNA από κύτταρα σφαιροειδές και πατρικά κύτταρα αναλύθηκαν με ανθρώπινων βλαστικών κυττάρων δείκτης cDNA Plate Array. Μεταξύ 32 γονίδια που εξετάστηκαν, τα κύτταρα σφαιροειδές ρυθμίζεται προς τα πάνω Notch 1, Nanog, Cdcp1, CD34, και την έκφραση Myc (Σχ. 3Α). Κάθε ένα από αυτά τα γονίδια είναι απαραίτητη για αναπτυξιακές διαδικασίες (εμβρυογένεση, νευρογένεση, στέλεχος επέκταση των κυττάρων, και την αιμοποίηση [32] – [34]). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με ποσοτική πραγματικού χρόνου δεδομένα PCR. Τα επίπεδα έκφρασης του Notch 1, Nanog, Cdcp1, CD34, και Myc σε σφαιροειδή κύτταρα ήταν περίπου 10 έως 2000 φορές υψηλότερη από εκείνη των μη σφαιροειδές κύτταρα που εντοπίστηκε με πραγματικού χρόνου PCR (Σχ. 3Β, κόκκινη γραμμή). Όταν σφαιροειδές κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε CM χωρίς παράγοντες ανάπτυξης, μια διαφοροποίηση κατάσταση, επιπλέοντα κύτταρα προσκολλώνται και μεγάλωσε σε επιθηλιακά κύτταρα. Στη συνέχεια συγκρίναμε τα ίδια σύνολα του επιπέδου έκφρασης γονιδίου με PCR πραγματικού χρόνου σε σφαιροειδές κύτταρα, την καλλιέργεια είτε σε βλαστικά συνθήκες κυτταρικής-επιλεκτική ή διαφοροποίηση για 14 ημέρες. Η έκφραση του CD34 και Nanog ήταν περίπου 1 φορές από εκείνη των μη σφαιροειδές κύτταρα, Cdcp1 και Myc μειώθηκαν σε 9 και 500 φορές, αντίστοιχα. επίπεδο έκφρασης Notch 1 στο σφαιροειδές κύτταρα έμειναν σε 12 φορές αυτής του μη σφαιροειδή κύτταρα μετά από καλλιέργεια σε CM για 14 ημέρες (Σχ. 3Β, πράσινη γραμμή). Υποδοχέα του παράγοντα αρχέγονων κυττάρων CD117 (c-kit) έχει αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες για προγονικά κύτταρα του όγκου του καρκίνου των ωοθηκών [17], [35]. Επομένως, εξετάσαμε την έκφραση CD117 με FACS σε αυτά τα σφαιροειδή κύτταρα. Συνεπής με προηγούμενες εκθέσεις, ανιχνεύσαμε επίσης CD117 ρύθμιση προς τα πάνω στο σφαιροειδές κύτταρα σε σύγκριση με τα μητρικά κύτταρα. Δεδομένου ότι ένας μεγάλος αριθμός κυττάρων σφαιροειδούς θανατώνονται από φάρμακα χημειοθεραπείας διαφοροποιήθηκαν μη βλαστικά κύτταρα, ενώ βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν επιβίωσαν (βλέπε παρακάτω), βρήκαμε ότι η έκφραση CD117 αυξήθηκε περαιτέρω το σφαιροειδές κυττάρων μετά κατεργασία σισπλατίνη για 24 ώρες (Εικ. 3C) . Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι σφαιροειδές κύτταρα από τον καρκίνο των ωοθηκών υπερεκφράζουν βλαστικών γονιδίων κυττάρων κάτω από κύτταρο-επιλεκτικές συνθήκες στέλεχος και να χάσουν ή να μειώσει αυτές τις εκφράσεις γονιδίων υπό συνθήκες διαφοροποίησης.

(Α) Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα και σφαιροειδές πατρικά κύτταρα εξετάστηκαν για γονιδιακή έκφραση τους από ένα ανθρώπινα βλαστικά συστοιχία δεικτών κυττάρου cDNA και βλαστικών γονιδίων-κυττάρων έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε κύτταρα σφαιροειδή σε μη σφαιροειδές κύτταρα. (Β) Τα επίπεδα υπερέκφρασης του Notch 1, Nanog, Cdcp1, CD34, και Myc σε σφαιροειδή κύτταρα σε σύγκριση με μη σφαιροειδή κύτταρα επιβεβαιώθηκε με ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR. έκφραση αυτών των κυτταρικών γονιδίων βλαστικών «χάθηκαν ή προς τα κάτω ρυθμισμένα όταν τα κύτταρα σφαιροειδείς διαφοροποιήθηκαν με καλλιέργεια σε CM χωρίς αυξητικούς παράγοντες επί 14 ημέρες. Τα επίπεδα έκφρασης εκπροσωπήθηκαν ως φορές αλλαγές σε σύγκριση με αυτά των μη-σφαιροειδές κύτταρα. (C) FACS εξέταση της έκφρασης CD117 για σφαιροειδές κύτταρα και πατρικά κύτταρα που δείχνουν υψηλή έκφραση CD117 σε σφαιροειδές κύτταρα. Μερικά κύτταρα σφαιροειδή υπέστησαν επεξεργασία με σισπλατίνη για 24 ώρες πριν την χρώση επιφάνειας με CD117 Abs. Οι μπάρες σφάλματος: SD, Ν = 3. *: ρ. & lt? 0,05

Η

αυξημένη δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ σε σφαιροειδή κύτταρα

ΑΙ_ϋΗ διαδραματίζει ζωτικό ρόλο στην κυτταρική αποτοξίνωση. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η αυξημένη δραστηριότητα ALDH οδηγεί σε διάφορους τύπους κακοηθειών, χρησιμεύει ως ένας δείκτης του καρκίνου των βλαστικών κυττάρων και συσχετίζεται με κακή πρόγνωση [36] – [39]. δοκιμασία ALDEFLUOR μας έδειξαν περισσότερο ALDH

+ κύτταρα σε σφαιροειδές κυττάρων απουσία του αναστολέα ΑΙ_ϋΗ ϋΕΑΒ (Σχ. 4Α). Η αυξημένη λειτουργία ΑίϋΗ στο σφαιροειδές κύτταρα επιβεβαιώθηκε από μια χρωματομετρική δοκιμασία δραστηριότητας ΑΙ_ϋΗ, δείχνοντας σημαντική αυξημένη δραστηριότητα στο σφαιροειδές κύτταρα (Εικ. 4Β).

(Α) Το κιτ ALDEFLOUR ετικέτες με τον πληθυσμό με ενζυματική δραστηριότητα υψηλής ALDH στο σφαιροειδές κύτταρα. Ένα κλάσμα του κάθε δείγματος κυττάρων υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αναστολέα ALDH ϋΕΑΒ ως αρνητικός έλεγχος για τη ρύθμιση πύλη FACS. (Β) Η χρωματομετρική δοκιμασία BioVision ΑΙ_ϋΗ ανιχνεύθηκε αυξημένη δραστηριότητα ΑΙ_ϋΗ σε σφαιροειδές προϊόν λύσης κυττάρου. Οι μπάρες σφάλματος: SD, Ν = 2. *: ρ. & lt? 0,05

Η

σφαιροειδές κύτταρα έχουν Υψηλής πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση δυναμικό από τα γονικά κύτταρα τους

Η σχέση του σφαιροειδές σχηματισμό και την ανάπτυξη των κυττάρων δυναμικό εξετάστηκε σε μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων κινητικής. Σύκο.