Αφηρημένο

Η μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου αυξάνει τον κίνδυνο θνησιμότητας από καρκίνο του παχέος εντέρου. Δείξαμε πρόσφατα ότι η αμερικανική ginseng προλαμβάνει τον καρκίνο του παχέος εντέρου, και ένα εκχύλισμα εξανίου του American Ginseng (HAG) έχει ιδιαιτέρως ισχυρή αντι-φλεγμονώδη και αντι-καρκινικών ιδιότητες. Η κακή ρύθμιση της microRNA (MIR) έκφραση έχει παρατηρηθεί σε αρκετές καταστάσεις ασθένειας συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου. Χρησιμοποιώντας παγκόσμιο προφίλ έκφρασης miR, παρατηρήσαμε αυξημένη miR-29b σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου μετά από έκθεση σε ΣΟΕ. Από miR-29b παίζει ένα ρόλο στη ρύθμιση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων, υποθέσαμε ότι HAG επάγει έκφραση miR-29b να στοχεύσουν μεταλλοπρωτεϊνάσης-2 (ΜΜΡ-2) καταστέλλοντας έτσι τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την υπόθεση αυτή. Η μελέτη μας υποστηρίζει την αντίληψη ότι η στόχευση MMP-2 από miR-29b είναι ένας μηχανισμός με τον οποίο ΣΟΕ καταστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Poudyal D, Cui Χ, Le μμ, Hofseth AB, Windust Α , Nagarkatti M, et al. (2013) Ένας βασικός ρόλος των microRNA-29b για την καταστολή της μετανάστευσης κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου από την American Ginseng. PLoS ONE 8 (10): e75034. doi: 10.1371 /journal.pone.0075034

Επιμέλεια: Α Ρ Μ Ruhul Amin, Winship Cancer Institute του Πανεπιστημίου Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15, Απριλίου του 2013? Δεκτές: 7, Αυγούστου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 9, Οκτώβρη του 2013

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από το Κέντρο Έρευνας για CAM αυτοάνοσων και φλεγμονωδών ασθενειών, ΝΙΗ επιχορήγηση 1P01AT003961-01A1 (PN, LJH, ΜΝ) , και η COBRE χρηματοδοτείται Πανεπιστήμιο της Νότιας Καρολίνας Κέντρο για Colon Cancer Research, ΝΙΗ P20RR17698-01 επιχορήγησης (Franklin Berger, Διευθυντής). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται ο καρκίνος σε άνδρες και γυναίκες και η τρίτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο. Στις ΗΠΑ, η Αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου εκτιμάται ότι 141.210 νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου και 49.380 θανάτους το 2011. Μετάσταση οδηγεί σε 90% του καρκίνου που σχετίζονται με θνησιμότητα [1], [2]. Κατ ‘αρχήν, κατά τη διάρκεια της μετάστασης του CRC, κάποια καρκινικά κύτταρα από τον πρωτογενή μάζα όγκου εισβάλλουν περιβάλλοντα ιστό, intravasate μέσα στο αγγειακό σύστημα για να ταξιδέψουν μέσω του αίματος και των λεμφικών αγγείων, σύλληψη στο μακρινό τριχοειδών αγγείων, εξαγγειώνονται σε παρέγχυμα των μακρινών ιστού (κυρίως το ήπαρ και τους πνεύμονες), όπου αυτοί σπόρους νέων αποικιών για να σχηματίσουν τις μακροσκοπικές δευτερογενείς όγκους [3]. Αυτά τα μεταστατικά καρκινικά κύτταρα χάνουν την ικανότητά τους να συμμορφώνονται με τα γειτονικά κύτταρα του όγκου και την ανάπτυξη μεταναστευτικών και επεμβατική ιδιότητες για να διαδώσουν σε μακρινά μεταστατικό όργανα. Πράττοντας αυτό, τα μεταστατικά κύτταρα υφίστανται αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και τη λειτουργία, κερδίζοντας έτσι περισσότερο mesenchymal- όπως χαρακτηριστικά και αυτή η διαδικασία έχει ονομαστεί ως Επιθηλιακά να μεσεγχυματικά Μετάβασης (EMT), ένα κρίσιμο γεγονός στην κακοήθεια. Τα microRNAs (Mirs) είναι μικρά μη-κωδικοποίησης RNAs από περίπου 22 νουκλεοτίδια (nts) καιρό ότι μετα-μεταγραφικά ρυθμίζει την γονιδιακή έκφραση σε φυτά και ζώα. Στα ζώα, Mirs μεταγραφές στόχου μέσω ατελής ζευγαρώματος βάσης του 2-7 nts του 5′-άκρου του miR (τα λεγόμενα αλληλουχία «σπόρος») σε πολλαπλές τοποθεσίες σε 3′-αμετάφραστες περιοχές (UTRs) του mRNA στόχου, και αυτό ατελής miR-mRNA υβρίδια με κεντρικό εξογκώματα (nt 9-12) προσλαμβάνει miRNP (microRNA συγκρότημα ριβονουκλεοπρωτεΐνης) που επιτρέπουν την μεταγραφική αναστολή ή εξωνουκλεολυτικό mRNA αποσύνθεσης [κριτική στο [4]]. Πολλά γονίδια καθαριότητας έχουν εξελιχθεί με το μικρότερο μήκος της 3’-UTR για να αποφύγει τη ρύθμιση miR [5]. Περίπου το 50% των γονιδίων σημειώνονται ανθρώπινης miR βρίσκονται σε καρκίνο που σχετίζεται περιοχές γονιδιωματική ή εύθραυστο τις περιοχές που είναι επιρρεπείς σε ενίσχυση, διαγραφή και μετατόπιση σε ποικιλία όγκων περιλαμβανομένων όγκων του παχέος εντέρου [6]. Εξαιτίας αυτού μερικοί Mirs θα μπορούσε να δράσει είτε ως καταστολέα όγκων ή ογκογονίδια [7], [8], [9], [10], [11]. Έκφραση ανάλυσης των χαρακτηριστικών αποκάλυψε χαρακτηριστικό υπογραφές miR που μπορεί να προβλέψει τις κλινικές εκβάσεις της CRC [12], [13].

Ένα από τα κλασικά χαρακτηριστικά του καρκίνου είναι η δυνατότητα για τα κύτταρα του όγκου να εισβάλει και να μεταστάσεις [14] . Mirs είναι τόσο θετικές όσο και αρνητικές ρυθμιστές της μετάστασης του καρκίνου [15], [16], [17]. Ένας αρνητικός ρυθμιστής της μετάστασης του καρκίνου είναι miR-29b [Για παράδειγμα [18], [19], [20], [21], [22]]. miR-29b ανήκει στην οικογένεια miR-29. Η οικογένεια miR-29 αποτελείται από τρία παράλογα: miR-29a, -29b και -29c. miR-29a και miR-29b1 βρίσκονται στο χρωμόσωμα 7q32? miR-29b2 και miR-29c βρίσκονται στο χρωμόσωμα θέση 1q23 [23]. miR-29b1 και miR-29b2 ακολουθίες είναι πανομοιότυπες αλλά διακρίνονται Β1 και Β2 λόγω της διαφοράς σε τόπο. MMP-2, μια εξωκυττάρια μήτρα (ECM) ταπεινωτική ένζυμο που έχει σημαντική επίπτωση στην μετάσταση και την αγγειογένεση έχει αποδειχθεί ότι είναι ο άμεσος στόχος του miR-29b [20]

αμερικανικό ginseng (AG?.

Panax quinquefolius

) είναι υποχρεωτικά σκιά αιώνιο μητρική της Βόρειας Αμερικής. Από Βιοδοκιμασία καθοδηγείται κλασμάτωση AG, έχουμε δείξει πρόσφατα ότι ένας εξάνιο κλάσμα AG (HAG) είναι ένας ισχυρός αντι-οξειδωτικών και αντι-καρκινικό παράγοντα [24], [25]. Μέχρι σήμερα, μόνο περιορισμένες μελέτες αντικαρκινικές λιπόφιλων εκχυλισμάτων AG έχουν διεξαχθεί και αυτές οι μελέτες είναι ως επί το πλείστον επικεντρώθηκε στην αντι-πολλαπλασιαστική και κυτταροτοξικά αποτελέσματα [26], [27], [28], [29]. Για την περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού αντι-καρκίνου του ΣΟΕ (α λιπόφιλο εκχύλισμα), μελετήσαμε το ρόλο του miR στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

εξάνιο κλάσμα του AG

Το

P. quinquefolius

εκχύλισμα έχει περιγραφεί προηγουμένως λεπτομερώς από το εργαστήριο μας [30]. Επίσης, έχουμε περιγράψει πρόσφατα την παραγωγή του ΣΟΕ που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη [24].

Κυτταροκαλλιεργειών

HCT 116 άγριου τύπου (WT), LOVO και DLD-1 του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA). HCT 116 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy (ATCC, Manassas, VA)? κύτταρα LOVO ήταν καλλιέργεια σε μέσο F-12K (ATCC, Manassas, VA)? και DLD-1 κύτταρα ήταν καλλιέργεια σε RPMI-1640. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% Νεογέννητα Εμβρυϊκό Ορό (NBCS? GIBCO /Life Technologies, Grand Island, ΝΥ), 2 mM γλουταμίνη (Biofluids, Rockville, MD), πενικιλίνη (10 U /ml, Biofluids) και στρεπτομυκίνη (10 μg /ml, Biofluids).

Παγκόσμια mir Έκφραση

HCT 116 WT κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

6 κύτταρα /πλάκα σε πλάκες 6 και σε τέσσερα αντίγραφα. Μετά από καλλιέργεια για 24 ώρες, 260 μg /mL HAG προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 0, 12, και 24 ώρες χωριστά σε σωληνάρια ελεύθερη ΕΡ ΚΝάσης. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Ambion, Austin, ΤΧ). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε από την Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng RNA από HCT 116 WT κύτταρα χρησιμοποιήθηκε για την nCounter miRNA έκφραση Δοκιμασία v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA) που περιέχει 800 miRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η έκφραση του miR-29b

Τα κύτταρα σπάρθηκαν, εκτίθενται σε όχημα (μέσων) ή 260 μg /ml ΣΟΕ, και η συγκομιδή στις 24 ώρες. Για την ανίχνευση miR-29b, 10 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan miR Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Biosystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και miR εκκινητές ειδικούς για HSA-miR-29b για την ανίχνευση και η μικρή πρωτεΐνη RNU6B πυρηνικό (U6) για ομαλοποίηση (Applied Biosystems). μέτρηση qPCR of-29b miR και U6 έκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan miR δοκιμασίες (Applied Biosystems) με το 7300 σύστημα προσδιορισμού PCR (Applied Bioystems). Η μέθοδος συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (Ct) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σχετική αφθονία του miR-29b σε σχέση με την έκφραση U6 (πολλαπλές μεταβολές σε σχέση με το U6). Όλες οι πειραματικές θεραπείες διεξήχθησαν σε τρεις ξεχωριστές περιπτώσεις? κάθε φορά με τρεις επαναλήψεις.

siRNA και miR Μορφομετατροπή

Για ΜΜΡ-2 siRNA, 1.5 × 10

5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο σε 6 φρεατίων 1 ημέρα πριν την επιμόλυνση. Χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ siRNA Transfection (Plyplus, iLllkirch, Γαλλία), τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 5 ηΜ ΜΜΡ-2 Trilencer-27 ανθρώπινα siRNA (ΟηΟεηε, Rockville, MD). Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση κηλίδος western για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του γκρεμίζω (Σχήμα S3). Για αναστολέα MirVana-miR-29b και αναστολέα mirVana-αρνητικό μάρτυρα (Ambion, Austin, ΤΧ) επιμόλυνση, 1.5 × 10

5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο σε 6 φρεατίων 1 ημέρα πριν την επιμόλυνση. Χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ siRNA Transfection (Polyplus Οι επιμολύνσεις, Illkirch, France), τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 10 nmol /L του αναστολέα MirVana-miR-29b ή αναστολέα ελέγχου MirVana-Αρνητικό. Μετά από 48 ώρες επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωληνάρια ελεύθερη ΕΡ ΚΝάσης. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ Regent. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με Nanodrop 2000. 10 ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή με microRNA εκκινητές ειδικούς για HSA-miR-29b και της μικρής πρωτεΐνης RNU6B πυρηνικό (U6) για ομαλοποίηση. μέτρηση της έκφρασης qPCR miRNA-29b και U6 διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασίες με το σύστημα προσδιορισμού PCR 7300. Η σχετική μεταβολή φορές σε επίπεδο miR-29b χρησιμοποιήθηκε για να αντιπροσωπεύσει τη σχετική αφθονία των miRNA-29b σε σχέση με την έκφραση U6. Όπως ανά προμηθευτή του Αναστολέα mirVana-miR-29b (Ambion από Life Technologies, Austin, ΤΧ), η αποτελεσματικότητα με την οποία τα κύτταρα θηλαστικών διαμολυσμένα με αναστολέα mirVana-miR εξαρτάται από τον τύπο του κυττάρου και παράγοντα μορφομετατροπής που χρησιμοποιείται. Συνιστάται ότι το πείραμα βελτιστοποίησης (συγκεντρώσεις από 1 ηΜ έως 100 ηΜ αναστολέα miR) να διεξάγεται για να ληφθεί η μέγιστη δραστηριότητα με ελάχιστη κυτταροτοξικότητα. Η αποτελεσματικότητα διαμόλυνσης και η προέλευση των 3 κυτταρικών σειρών HCT116, LoVo και DLD-1 είναι διαφορετικές και από το πείραμα βελτιστοποίησης (τα δεδομένα δεν φαίνονται), mirVana miR-29b Αναστολέας έδειξε μέγιστη δραστικότητα στα 10 ηΜ μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση για κύτταρα HCT116 και 50 ηΜ για LoVo και τα κύτταρα DLD-1. Μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση με τον αναστολέα MirVana-miR-29b, προστέθηκε HAG (260 μg /mL) για 24 ώρες και τα κύτταρα συλλέχθηκαν για γονιδίου στόχου (ΜΜΡ-2) έκφρασης και για προσδιορισμό της μετανάστευσης. Όλα τα δείγματα πειραματικές ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα ίσο συγκέντρωση μίας αλληλουχίας αρνητικού ελέγχου αναστολέα μη-στόχευσης, για χρήση ως έλεγχοι για μη-αλληλουχίας-ειδική επίδραση σε πειράματα miR. Mock-επιμολυσμένα έλεγχοι δεν παράγει κανένα σημαντικό αποτέλεσμα σε οποιαδήποτε από τις παραμέτρους που αναλύθηκαν.

mRNA Ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA). Ενα μα του συνολικού RNA χρησίμευσε ως μήτρα για σύνθεση ενιαία κλώνου cDNA σε μία αντίδραση χρησιμοποιώντας ολίγο (dT) εναρκτήρες και ΑΜν αντίστροφη μεταγραφάση (Promega Corp, WI) υπό συνθήκες που υποδεικνύονται από τον κατασκευαστή. PCR των δειγμάτων cDNA διεξήχθη με δείγματα ενισχύθηκαν για 30 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 s, ανόπτηση στους 50 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s με τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά . Οι αλληλουχίες για Real Time PCR εναρκτήρες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: ΜΜΡ-1 Forward 5′-ΑΟΟ TCT CTG AGG GTC AAG CA-3 ‘? ΜΜΡ-1 Reverse 5’-CTG GTT GAA AAG CAT GAG CA-3 ‘? ΜΜΡ-2 Forward 5’-ACA TCA AGG GCA TTC AGG AG-3 ‘? MMP-2 αντίστροφη 5’-GCC TCG ΤΑΤ ACC GCA TCA ΑΤ-3 ‘? ΜΜΡ-7 Forward 5’-GAG TGC CAG ATG TTG CAG ΑΑ-3 ‘? MMP-7 αντίστροφη 5’-ΑΑΑ TGC ΑΓΓ GGG ATC TCT ΤΤ-3 ‘? MMP-9 Forward 5’-TTG ACA GCG ACA AGA AGT GG-3 ‘? MMP-9 αντίστροφη 5’-GCC ΑΤΤ CAC GTC GTC CTT ΑΤ-3 ‘και GAPDH Forward 5′-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′, GAPDH αντίστροφη 5’-TTG ΑΤΤ TTG GAG GGA TCT CG-3 ‘( ολοκληρωμένη DNA Technologies, Inc). Real-time PCR (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το σύστημα πραγματικού χρόνου PCR 7300 Δοκιμασία (Applied Biosystems, CA) με το Power SYBR πράσινο κύριου μείγματος PCR (Applied Biosystems, CA) και εκκινητές για ΜΜΡ-1, -2, -7, -9 και GAPDH σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή. Η έκφραση του γονιδίου ΜΜΡ ομαλοποιήθηκε με έκφραση του γονιδίου GAPDH. Το φορές αλλαγή στην έκφραση γονιδίου είναι σε σχέση με το διάνυσμα αγωγή [1χ Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS)] κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες.

Ανάλυση Western Blot και Αντισώματα

κηλίδες Western διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλαμβάνουν: ΜΜΡ-2 (Rabbit πολυκλωνικά, αραιωμένο 1 σε 500, cat # 4022s? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ), και GAPDH (Rabbit πολυκλωνικά, αραιωμένο 1 σε 1000, cat # 5174? Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ). Για όλες τις κηλίδες, μια τυπική πρωτεΐνη (BenchMark Προχρωματισμένοι Πρωτεΐνη σκάλα? Invitrogen, Carlsbad CA) τρέχει να εξασφαλίσει το σωστό μοριακό βάρος κάθε μπάντες που παρατηρήθηκαν. Χρένα δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού συζευγμένο με υπεροξειδάση αγοράστηκαν από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Δευτερογενή αντισώματα αραιώνονται σε 1:2000. Όλα τα αντισώματα αραιώθηκαν σε 5% γάλα /PBST (0,1% Tween 20 σε 1 × PBS). σήμα κηλίδας Western ανιχνεύθηκε από Pierce ECL Western Blotting Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL) και αναπτύχθηκε σε Hyperfilm.

In Vitro

Δοκιμασία Μετανάστευσης

Το 24 καλά Costar Transwell διαπερατό υποστήριγμα με ένα 8-μm μέγεθος πόρων πολυανθρακικό μεμβράνη (Corning Incorporated, ΝΥ), και με ένα ένθετο 6,5 mm χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων. Για αυτή τη δοκιμασία της μετανάστευσης, η μεμβράνη εμποτίστηκε transwell με 15 μg /ml κολλαγόνου τύπου Ι (BD Biosciences) για 30 λεπτά στους 37 ° C σε άνευ ορού μέσο. Το κολλαγόνο απομακρύνθηκε με σιφώνιο και επικαλυμμένων με κολλαγόνο μεμβράνη τοποθετήθηκε σε ένα δίσκο των 24 φρεατίων. Τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 12 ώρες και 50.000 κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 200 μΙ ορού Ελεύθερη Medium (SFM) και μεταφέρθηκε στην κορυφή θάλαμο του transwell. Το κάτω μέρος του θαλάμου γέμισε με 750 μΐ SFM ή Complete μέσο ανάπτυξης (10% NCS συμπληρώνονται, ως χημειοπροσελκυστικό για τα κύτταρα) ή HAG (260 μg /ml σε πλήρες θρεπτικό μέσο). Η πλάκα transwell επωάστηκε στους 37 ° C για 12 ώρες. Μετά την επώαση, το μέσο απομακρύνθηκε από τον θάλαμο, η μεμβράνη transwell πλύθηκε σε 1Χ PBS και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με φορμαλδεΰδη (3.7% σε PBS) και διαπερατά κατά 100% μεθανόλη και χρωματίσθηκαν με 0,4% κρυσταλλικό ιώδες λεκέ. Η μεμβράνη πλύθηκε με 1Χ PBS και το μη-μεταναστεύσει στην κορυφή της μεμβράνης transwell αποξέονται με την αποστειρωμένη μπατονέτα. Η μεμβράνη φρεατίων αποκόπηκε από το θάλαμο φρεατίων και καθορίζεται με μικροσκοπική πλάκα με Permount και είδαν κάτω από το μικροσκόπιο (100Χ μεγέθυνση). 7 τυχαία τομές φωτογραφήθηκαν από κάθε πλακίδιο και τα κύτταρα τα οποία μετανάστευσαν στην κάτω της μεμβράνης transwell μετρήθηκαν αυτόματα χρησιμοποιώντας Image J λογισμικού (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Στατιστική Ανάλυση

για την παγκόσμια ανάλυση miR, όλα τα δεδομένα που εισήχθησαν v1.0 NSolver Λογισμικό ανάλυσης (Nanostring Technologies) και ομαλοποιήθηκε ως προς την γεωμετρική μέση τιμή των 100 Mirs με τις υψηλότερες τιμές έκφρασης. Κανονικοποιημένα δεδομένα που εισάγονται BRB-ArrayTools v4.1.0 για ανάλυση. Πριν από την ανάλυση, τα δεδομένα φιλτράρεται όπου οποιαδήποτε τιμή μικρότερη από 10 παραλείφθηκε και κάθε miR λείπει & gt? 50% των δειγμάτων είχαν εξαιρεθεί αφήνοντας 248 miR για ανάλυση. Τα κριτήρια φιλτραρίσματος ορίστηκε έτσι ώστε οποιαδήποτε ομαλοποιημένη σημείο δεδομένων & lt? 10 ή η log2 μετατραπεί τιμή δεδομένων & lt? 3,321928 κλήθηκαν λείπουν και αποκλείστηκαν επειδή αυτό είναι στο επίπεδο του υποβάθρου. ελήφθησαν 3.321928 υπόψη και πέρασε τα κριτήρια φιλτραρίσματος αφήνοντας 248 Mirs για ανάλυση? μόνο εκείνα τα σημεία δεδομένων & gt? 10 ή log2 μετατραπεί τιμή δεδομένων & gt. συγκριτική δοκιμή τάξη χρησιμοποιηθεί Τ-τεστ του Student για να συγκρίνετε miR της αγωγής έναντι μη επεξεργασμένων κυττάρων. δοκιμές τάσης χρησιμοποιείται γραμμική μοντελοποίηση παλινδρόμησης για διέταξε κατηγορικές μεταβλητές του 0 h, 12 h και 24 h. Η διαδικασία Benjamini-Hochberg χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό των ποσοστών εσφαλμένων ανακάλυψη. Όταν συγκρίθηκαν περισσότερες από δύο ομάδες, προσδιορίσαμε στατιστικές διαφορές χρησιμοποιώντας μια μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης, ακολουθούμενη από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης ενός του Scheffe. Αν συγκρίθηκαν δύο ομάδες, χρησιμοποιήσαμε Τ-test του Student. Η τιμή P επελέγη για σημασίας σε αυτή τη μελέτη ήταν 0.05.

Αποτελέσματα

ΣΟΕ Προκαλεί miR-29b Στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

American Ginseng και ΣΟΕ έχουν τόσο ασκείται προληπτική δράση για το χημικώς επαγόμενη μοντέλο καρκίνου του παχέος εντέρου [24], [32]. Για την έναρξη της μελέτης μας, δεδομένου ότι έχουν Mirs έχει αποδειχθεί ότι έχουν τόσο προ-καρκινικών και αντι-καρκινικών ιδιότητες, εξετάσαμε την επίδραση της ΣΟΕ για την παγκόσμια έκφραση του miR σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Υπήρξε μια σημαντική θετική συσχέτιση σε 2 Mirs, και σημαντική αρνητική συσχέτιση στα 6 Mirs μετά την έκθεση του HCT 116 κυττάρων σε HAG (260 μg /ml) για 0 ​​ώρες, 12 ώρες, και 24 ώρες (Πίνακας 1). Με βάση την κατανόηση ότι η οικογένεια miR-29 έχει κάτω ρυθμιστεί σε πολλές κακοήθειες [21], [23], [33], [34], ότι αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι μέχρι ρύθμιση του miR-29 να έχουν αποτελέσματα κατά του όγκου [22], [35], και ότι η αυξημένη έκφραση του miR-29b αποδείχθηκε με δύο διαφορετικές στατιστικές μεθόδους (πίνακες 1 και 2), εστιάσαμε σε αυτό το miR. Για να επιβεβαιώσετε miR-29b up-ρύθμιση από ΣΟΕ, επαναλάβαμε το πείραμα και εξετάζονται miR-29b ρύθμιση προς τα άνω από qRT-PCR. Συνεπής με τα συνολικά αποτελέσματα miRNA ανάλυση, το Σχήμα 1 δείχνει ότι υπήρχε αυξημένη έκφραση του miR-29b (7,3 φορές) με την έκθεση της HCT 116 κύτταρα να ΣΟΕ. Υπήρχε επίσης μια αύξηση στην έκφραση miR-29b με την έκθεση των δύο άλλων καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές (DLD-1, 3,1-φορές? και LOVO, 1,5 φορές). (Σχήμα 1)

HCT 116, DLD -1, και τα κύτταρα LOVO εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες (η = 3 ανά χρονικό σημείο). Σχετική ενδογενή επίπεδα έκφρασης miR-29b ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας Taqman εκκινητές και ανιχνευτές για την ανίχνευση ώριμη miR-29b και το μικρό RNU6B πυρηνικό RNA (U6), έναν εσωτερικό έλεγχο. Σχετικά επίπεδα έκφρασης miR-29b κανονικοποιήθηκαν στη μέση τιμή των μη επεξεργασμένων δειγμάτων (0 h). *, Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (pvalue & lt? 0.005). Από τον έλεγχο 0 h

Η

Η

ΣΟΕ Καταστέλλει MMP-2 σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα

Οι πιθανοί στόχοι γονίδια του miR-29b αρχικά προβλεφθεί χρησιμοποιώντας ηλεκτρονικές βάσεις δεδομένων, συμπεριλαμβανομένων miRTarBase, TargetScan, PicTar και Miranda. ΜΜΡ-2 υπολογίστηκε να είναι το δυναμικό στόχο του miR-29b από όλες αυτές τις βάσεις δεδομένων (Εικόνα 2Α). Επειδή η ΜΜΡ-2 υπερεκφράζεται σε ιστούς όγκων [36], [37], [38], και έχει άμεση επίπτωση στην μετάσταση και την αγγειογένεση των καρκινικών κυττάρων [39], [40], εξετάσαμε πρώτα τις επιδράσεις της HAG επί ΜΜΡ -2 έκφρασης. Θεραπεία της HCT-116 κυττάρων με HAG για 24 ώρες είχε ως αποτέλεσμα την μείωση της έκφρασης του γονιδίου ΜΜΡ-2 κατά περίπου το ήμισυ φορές [(1 ± 0,14 0,57 ± να 0.05), p-value = 0,078] (Σχήμα 2Β). θεραπεία HAG για 24 ώρες, μείωσε σημαντικά την έκφραση του γονιδίου ΜΜΡ-2 σε DLD-1 κύτταρα [(1 ± 0,03 0,03 ± να 0.01), p-value & lt? 0.005] (Σχήμα 2D). Παρομοίως επεξεργασία των κυττάρων με LOVO HAG για 24h ως αποτέλεσμα τη μείωση της ΜΜΡ-2 έκφραση [(1 ± 0,06 0,74 ± να 0,017), p-value & lt? 0.05] (Σχήμα 2F). Για να επαληθευθεί αν HAG μειώνει τη δραστικότητα ΜΜΡ-2, HCT-116 κύτταρα κατεργάστηκαν με HAG για 24 ώρες και πρωτεΐνη ΜΜΡ-2 αναλύθηκε. Εικόνα S4, ΣΟΕ μείωσε την προ- και με ενεργό έκφραση της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2? επιβεβαιώνοντας ότι HAG μειωμένη δραστικότητα ΜΜΡ-2 και την έκφραση του γονιδίου. Επιπλέον άλλα ECM εξευτελιστική MMPs, όπως ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-7 και γονιδιακή έκφραση ΜΜΡ-9 δεν ρυθμιζόταν από κατεργασία HAG (Πίνακας S2). Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα MMPs (ΜΜΡ-1, -7 και -9) δεν είναι ο άμεσος στόχος του miR-29b.

(Α) miR-29 οικογένεια (miR-29a /b /c) και υποθετικές της δεσμευτική αλληλουχία στην 3′-UTR του γονιδίου ΜΜΡ-2. Η ακολουθία σπόρος της οικογένειας miR-29 εμφανίζεται στο παράθυρο. (Β) κύτταρα WT HCT116 εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες. κύτταρα (C) HCT116 διαμολύνθηκαν με 10 ηΜ mirVANA miR-29b, 48 ώρες και εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες. (D) DLD-1 κύτταρα εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες. (Ε) DLD-1 κύτταρα επιμολυσμένα με 50 ηΜ mirVANA miR-29b, 48 ώρες και εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες. (F) Κύτταρα LOVO εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες. (G) κύτταρα LOVO επιμολυσμένα με 50 ηΜ mirVANA miR-29b, 48 ώρες και εκτέθηκαν σε 260 μg /mL HAG για 24 ώρες. Σχετική επίπεδο έκφρασης ΜΜΡ-2 ανιχνεύθηκε με qRT-PCR. mRNA ΜΜΡ-2 για κάθε δείγμα ομαλοποιήθηκε με έκφραση GAPDH. Διπλώστε αλλαγή στο επίπεδο mRNA ΜΜΡ-2 ήταν συγγενής των μη κατεργασμένων κυττάρων συλλέχθηκαν σε 0 h (n = 3 ανά χρονικό σημείο). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν το εξάνιο Κλάσματα AG καταστέλλει επίπεδο mRNA ΜΜΡ-2 σε σύγκριση με τα μη-κατεργασμένα κύτταρα. * Δηλώνει σημαντική διαφορά, Ρ αξία & lt?. 0,05 από 0 έλεγχο h

Η

Επιπλέον, για να εξακριβώσει αν η ΣΟΕ μεσολάβηση καταστολή του γονιδίου MMP-2 εξαρτάται από miR-29b, που φιμώνονται ΜΙΚ 29β (Σχήμα S1) με τη χρήση ενός αναστολέα miR-29b (βλέπε μεθόδους 4.2.5). ΣΟΕ δεν καταστέλλει την έκφραση του γονιδίου της ΜΜΡ-2, όταν miR-29b έχει σιγήσει (Σχήματα 2C, 2Ε και 2G). Στην πραγματικότητα, υπάρχει μία 2,4 φορές αύξηση στην έκφραση της ΜΜΡ-2 σε miR-29b σιγήσει κύτταρα HCT116 όταν εκτίθενται σε HAG, 24 h (Σχήμα 2C). Δεν υπήρξε καμία μείωση στην έκφραση του γονιδίου ΜΜΡ-2 σε miR-29b σιγήσει DLD-1 και LOVO κόλον καρκινικά κύτταρα όταν εκτίθενται σε HAG, 24 ώρες (Σχήματα 2Ε και 2G). Όλοι μαζί, αυτά τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την υπόθεση ότι η καταστολή της MMP-2 από ΣΟΕ εξαρτάται από miR-29b.

ΣΟΕ Καταστέλλει Μετανάστευσης του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα

στόχων MiR-29b κλειδί παίκτες να καταστείλει εισβολή και τη μετάσταση [19], [20], [21], [22]. ΜΜΡ-2 εμπλέκεται στην μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (Πίνακας S1? Εικόνα S2). Περίπου 3,5 φορές μείωση στον αριθμό των κυττάρων που μετανάστευσαν /μικροσκοπικού πεδίου στα κύτταρα HCT116 ΜΜΡ-2 knock /κάτω κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα HCT116 WT στην παρουσία 10% ορού ως χημειοελκτικό αναφερθεί (Πίνακας S1? Εικόνα S2). Αυτό αποτελεί σαφή ένδειξη ότι η ΜΜΡ-2 είναι ένας βασικός παράγοντας στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης, ωστόσο, δεν θα πρέπει να αποκλειστεί ότι άλλες εξευτελιστικές MMPs ECM, όπως ΜΜΡ-1, ΜΜΡ-7, MMP-9 και MMP-13 έχουν δειχθεί να σχετίζεται με την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [37], [41], [42], [43], [44]. Από HAG up-ρυθμίζει την έκφραση miR-29b και ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση ένζυμο αποικοδόμησης ΜΜΡ-2 γονίδιο ECM, ερευνήσαμε περαιτέρω τη λειτουργική επίδραση της HAG σχετικά με τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Σε κύτταρα HCT116, HAG κατέστειλε την μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων κατά σχεδόν 7 φορές (Σχήματα 3Α και 3C). Στην miR-29b σιγήσει HCT-116 κύτταρα, HAG δεν καταστέλλουν τη μετανάστευση. Συνεπής με ΜΜΡ-2 αποτελέσματα (Σχήμα 2C), με την απουσία της δραστηριότητας miR-29b, HAG αυξημένα τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν στο κατώτερο θάλαμο του Transwell μεμβράνης με σχεδόν 2,5 φορές σε σύγκριση με θετικό έλεγχο (Σχήματα 3Β και 3D). Ομοίως, HAG κατέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων DLD-1 μόνο παρουσία του miR-29b, όπου μείωσε τον αριθμό των κυττάρων που μεταναστεύουν κατά σχεδόν 5 φορές σε σύγκριση με τον θετικό έλεγχο (Σχήματα 4Α και 4C). ΣΟΕ δεν ασκούν αντι-μεταναστευτική δραστηριότητα όταν miR-29b σίγησε στα κύτταρα DLD-1 (Σχήματα 4Β και 4D). Συνολικά, τα αποτελέσματα εδώ δείχνουν miR-29b βρίσκεται στο σταυροδρόμι στην ικανότητα του ΣΟΕ να ασκήσει αντι-μεταναστευτικά δραστηριότητες.

Το κολλαγόνο τύπου Ι (15 μg /ml) με επικάλυψη θάλαμο transwell εφαρμόστηκαν με 5 × 10

4 HCT116 (Α /Β) για 12 ώρες. Το κάτω θάλαμος περιέχει SFM /ορός (10%) ή HAG (260 μg /mL εντός πλήρους μέσου). (Α) κύτταρα WT 5 × 10

4 HCT116 εφαρμόστηκαν στον άνω θάλαμο της μεμβράνης φρεατίων. (Β) 5 × 10

4 HCT116 (επιμολυσμένα με mirvana miR-29b, 10 nM, 48 ώρες) τα κύτταρα που εφαρμόζεται στον άνω θάλαμο του transwell μεμβράνη. Μετά από 12 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα μετανάστευσαν στο εσωτερικό (κάτω μεμβράνης) του Transwell μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (7 τυχαία μικροσκοπικά πεδία (100Χ) αξιολογήθηκαν για μέτρηση κυττάρων). (C) απεικονίζει την αντιπροσωπευτική εικόνα της μετανάστευσης των κυττάρων HCT116 WT από κάθε θεραπεία. (D) απεικονίζει την αντιπροσωπευτική εικόνα των HCT116 (επιμολυσμένα με mirvana miR-29b, 10 ηΜ, 48 ώρες) κυτταρική μετανάστευση από κάθε θεραπεία. Το φόντο της εικόνας δείχνει το πόρων 8 μm σε μεμβράνη φρεατίων. *, Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (pvalue & lt? 0.005) σε σύγκριση με την αειφόρο διαχείριση των δασών. #, Δείχνει σημαντική διαφορά (pvalue & lt? 0.005)., Σε σύγκριση με 10% ορό

Η

Το κολλαγόνο τύπου Ι (15 μg /ml) με επικάλυψη θάλαμο transwell εφαρμόστηκαν με 5 × 10

4 κύτταρα DLD-1 (Α /Β) για 12 ώρες. Το κάτω θάλαμος περιέχει SFM /ορός (10%) ή HAG (260 μg /mL εντός πλήρους μέσου). (Α) 5 × 10

4 κύτταρα DLD-1 WT εφαρμόστηκαν στον άνω θάλαμο της μεμβράνης φρεατίων. (Β) 5 × 10

4 DLD-1 (επιμολυσμένα με mirvana miR-29b, 10 ηΜ, 48 ώρες) τα κύτταρα που εφαρμόζεται στον ανώτερο θάλαμο του transwell μεμβράνη. Μετά από 12 ώρες επώασης στους 37 ° C, τα κύτταρα μετανάστευσαν στο εσωτερικό (κάτω μεμβράνης) του Transwell μεμβράνης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό ImageJ (7 τυχαία μικροσκοπικά πεδία (100Χ) αξιολογήθηκαν για μέτρηση κυττάρων). (C) απεικονίζει την αντιπροσωπευτική εικόνα της DLD-1 WT μετανάστευση των κυττάρων από κάθε θεραπεία. (D) Απεικονίζει την αντιπροσωπευτική εικόνα της DLD-1 (επιμολυσμένα με mirvana miR-29b, 10 nM, 48 ώρες) μετανάστευση των κυττάρων από κάθε θεραπεία. Το φόντο της εικόνας δείχνει το πόρων 8 μm σε μεμβράνη φρεατίων. *, Υποδηλώνει σημαντική διαφορά (pvalue & lt? 0.005) σε σύγκριση με SFM

Η

Συζήτηση

Εδώ έχουμε αποδείξει ότι ΣΟΕ καταστέλλει τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου.. Αυτή η αντι-μεταστατική ιδιότητα του ΣΟΕ διαμεσολαβείται από το up-ρύθμιση του microRNA-29b, που στοχεύει άμεσα και ρυθμίζει προς τα κάτω ένα βασικό μόριο που εμπλέκονται στην μετάσταση, MMP-2

Παγκόσμια miR ανάλυση του ΣΟΕ -. Αντιμετωπίζονται κύτταρα HCT116 είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του miR-29b που ταιριάζουν τόσο την τάση και πολλαπλή μεταβολή στατιστική ανάλυση (πίνακες 1 και 2). Υπήρχαν 8 miRNAs (HSA-miR-938, HSA-miR-203, HSA-miR-1975, HSA-miR-29b, HSA-miR-600, HSA-miR-1244, HSA-miR-548o και HSA-miR -590-5p) που ήταν στατιστικά (ρ & lt? 0.05) προς τα πάνω ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται. Ένα θετικό συντελεστή συσχέτισης ενδεικνυόμενη αυξημένα επίπεδα miR με αυξημένη έκθεση σε ΣΟΕ (0 h έως 12 h έως 24 h) με μόνο 2 Mirs (HSA-miR-29b και HSA-miR-590-5p) εμπίπτουν σε αυτή την κατηγορία. Από αυτά τα 2 Mirs, miR-29b έχει την υψηλότερη συσχέτιση αξία συντελεστή 0,621. Όπως επίσης, αφού miR-29b ήταν επίσης στατιστικά σημαντικά πάνω ρυθμισμένα με HAG στην ανάλυση πολλαπλή μεταβολή (Πίνακας 2), και ότι αυτή η miR έχει δειχθεί από άλλους για να παίξει ένα ογκοκατασταλτικό ρόλο [23], [33], [ ,,,0],45], [46], [47], εστιάσαμε στην miR-29b για τη συγκεκριμένη μελέτη. Ο ρόλος του miR-29b ως καταστολέας όγκου έχει καλά διαλευκανθεί σε διάφορες κακοήθειες που συμπεριλαμβάνουν, AML [23], [45], του πνεύμονα [33], CLL [46], [47] και χολαγγειοκαρκίνωμα [48]. Κάτω ρύθμιση της οικογένειας miR-29 έχει αναφερθεί σε αρκετές ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα [49], του προστάτη [50], διηθητικού καρκίνου του μαστού [51]. Πρόσφατα, Kuo et’al ανέφεραν ένα χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης του miR-29a /c σε καρκίνο του παχέος εντέρου ομάδα νωρίς επανάληψη σε σύγκριση με εκείνη ενός μη έγκαιρης ομάδα επανάληψης που δείχνει έκφραση χαμηλού επιπέδου miR-29a /c ως πιθανή βιοδείκτη για πρώιμη επανεμφάνιση του CRC [52]. Τα αποτελέσματά μας έχουν διευκρινιστεί καλύτερα τους πιθανούς μηχανισμούς αυτού του ευρήματος

Η οικογένεια miR-29 αποτελείται από τρία μέλη:. miR-29a, miR-29b, και miR-29c (miR29a /b /c) που εμφανίζουν υψηλή ομοιότητα αλληλουχίας και μοιράζονται μια κοινή αλληλουχία σπόρος για την αναγνώριση στόχου (Σχήμα 2Α). Άλλοι έχουν αναφέρει μια αντίστροφη σχέση όσον αφορά την έκφραση του miR-29b και ΜΜΡ-2 [20], [22], [53], [54]. Όπως επίσης, επειδή miR βάσεις δεδομένων (miRTarBase, TargetScan, PicTar, και η Μιράντα) υποδεικνύουν MMP-2 ως πιθανός στόχος του miR-29b, εξετάσαμε τη λειτουργική σημασία αυτού του γεγονότος. ΜΜΡ-2, επίσης γνωστή ως ζελατινάση Α ή IV κολλαγενάση τύπου, είναι ένα ένζυμο εξευτελιστική ECM, και εκφράζεται ευρέως στους περισσότερους ιστούς και τα κύτταρα [55]. Όπως επίσης, ΜΜΡ-2 υπερεκφράζεται σε ιστούς όγκων [36], [37], [38] και η ενεργοποίηση των ΜΜΡ-2 έχει ως αποτέλεσμα την υποβάθμιση της ECM, το οποίο διευκολύνει την εισβολή και τη μετάσταση των καρκινικών κυττάρων [56]. πραγματικού χρόνου δεδομένα μας RT-PCR έδειξε ότι HAG μειώνει την έκφραση ΜΜΡ-2 από 2-φορές σε κύτταρα HCT116 και σε περίπου 30-πλάσια μείωση σε κύτταρα DLD-1 (Σχήματα 2C και 2Ε). HAG μείωσε επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης ΜΜΡ-2 (Σχήμα S4). Όταν η δραστηριότητα miR-29b είναι σιγήσει διαμολύνοντας κύτταρα καρκίνου κόλου με έναν αναστολέα miRVana miR-29b (Σχήμα S1), HAG δεν έχει καμία επίδραση στη μείωση της ΜΜΡ-2 έκφραση (Σχήματα 2C, 2Ε και 2G) και σε κάποιο βαθμό επάγεται η MMP -2 έκφρασης. Ο λόγος θα μπορούσε να οφείλεται στην απουσία ενδογενούς miR-29b, HAG δεν ήταν σε θέση να ρυθμίσει miR-29b, που ενισχύεται περαιτέρω την έκκριση ΜΜΡ-2. Ορισμένα από τα συστατικά που υπάρχουν στο HAG, θα μπορούσε να έχει τη δυνατότητα να ενισχυθεί η έκφραση ΜΜΡ-2 άμεσα σε απουσία ενδογενούς miR-29b, όμως αυτό χρειάζεται περαιτέρω μελέτη για να επιβεβαιωθεί. Ως εκ τούτου, μια δυναμική διαδικασία απομόνωσης των δραστικών συστατικών του ΣΟΕ είναι σε εξέλιξη και μελλοντικές μελέτες σχετικά με αυτό είναι στη γραμμή. Όλοι μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το miR-29b είναι κρίσιμη για την ΣΟΕ για να καταστείλει την έκφραση της ΜΜΡ-2 σε καρκινικά κύτταρα.

μεταλλοπρωτεϊνάσες μήτρας έχουν θεωρηθεί ως βασικό βοηθητικά μόρια κυττάρων του όγκου κατά τη διάρκεια της μετάστασης [57], [58 ], [59], [60]. Οι MMPs αποτελούν μία οικογένεια ενδοπεπτιδασών που περιέχουν ψευδάργυρο πιό γνωστός για τους ρόλους τους σε φυσιολογικές και παθολογικές αναδιαμόρφωση της ECM κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης, επούλωσης τραύματος, της εμβρυογένεσης, μετάσταση όγκου, και διάφορες καρδιοαγγειακές και φλεγμονωδών νόσων [61], [62]. Έχει δειχθεί ότι miR-29b εμπλέκεται στην αρνητική ρύθμιση της μετάστασης σε πολλούς τύπους καρκίνου [18], [20], [63]. Συνδυάζοντας αυτά τα ευρήματα, όπου miR-29b είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της μετάστασης και στοχεύει παίκτης-κλειδί της μετάστασης ΜΜΡ-2, και HAG προκαλεί miR-29b και καταστέλλει MMP-2 έκφραση (Πίνακες 1 και 2? Σχήματα 1, 2 και S4), ζητήσαμε από το ερώτημα αν ΣΟΕ καταστέλλει λειτουργικά μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Έχουμε αποδείξει ότι HAG καταστέλλει λειτουργικά το

in vitro

μετάσταση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου εκτελώντας δοκιμασία μετανάστευσης του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων (Σχήματα 3Α, 3C, 4Α, και 4C). Σε περίπτωση απουσίας της δραστηριότητας miR-29b, HAG δεν ήταν αποτελεσματική στην καταστολή της μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου (Εικόνες 3Β, 3D, 4Β, και 4D). Παρά το γεγονός ότι, ακόμη να δείξει

in vivo

, όλοι μαζί, μας

in vitro

δεδομένα δείχνουν ότι ΣΟΕ εκτελεί αντι-μεταστατική δράση της με τη ρύθμιση miR-29b.

Major συστατικά που υπάρχουν στο εκχύλισμα εξανίου (λιπόφιλο εκχύλισμα) του AG είναι polyacetylenes (Panaxydiol, panaxydol και panaxynol), η οποία περιλαμβάνει περίπου το 50% του συνολικού εκχυλίσματος, όπως επίσης και τα λιπαρά οξέα, με σχεδόν καμία ginsenosides [24]. Δείξαμε πρόσφατα ότι HAG διαθέτει αντι-φλεγμονώδη και αντι-καρκινικών ιδιότητες [24]. Αρκετές άλλες μελέτες για αντι-φλεγμονώδη και αντι-καρκινικών ιδιότητες του American ginseng έχουν επικεντρωθεί στην ginsenoside ή τη σαπωνίνη περιεχόμενο του ginseng [64], [65], [66], [67], η οποία λαμβάνεται από ένα υδατικό εκχύλισμα αιθανόλης (πολικό διαλύτη) του ginseng.