Αφηρημένο

Οι αδενοϊοί (ΚΕΠ) με τη διαγραφή του

Ε1Β55Κ

προτίμηση αντιγράφονται σε καρκινικά κύτταρα και έχουν χρησιμοποιηθεί σε θεραπείες του καρκίνου. Έχουμε δείξει προηγουμένως ότι Ad Ε1Β55Κ πρωτεΐνη εμπλέκεται στην επαγωγή της κυκλίνης Ε για την αντιγραφή διαφημίσεων, αλλά αυτή η λειτουργία Ε1Β55Κ δεν απαιτείται σε καρκινικά κύτταρα στα οποία συχνά παρατηρείται απορρύθμιση της κυκλίνης Ε. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την αλληλεπίδραση της κυκλίνης Ε και CDK2 στο Ad-μολυσμένα κύτταρα. λοίμωξη ad αύξησε σημαντικά τη μεγάλη μορφή της κυκλίνης Ε (κυκλίνη EL), ο σχηματισμός συμπλόκου προωθείται κυκλίνης Ε /CDK2 και αυξημένη φωσφορυλίωση CDK2 στο χώρο T160. Ενεργοποιείται CDK2 προκάλεσε φωσφορυλίωση pRb στο χώρο S612. Καταστολή της δραστικότητας CDK2 με την ροσκοβιτίνη χημικό αναστολέα ή με ειδικές μικρά παρεμβαλλόμενα RNAs μειώθηκε σημαντικά φωσφορυλίωση pRb, με ταυτόχρονη καταστολή του ιικού αναδιπλασιασμού. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η αγγελία που προκαλείται από κυκλίνη E ενεργοποιεί CDK2 που στοχεύει το μεταγραφικό καταστολέα pRb να δημιουργήσει ένα κυτταρικό περιβάλλον για ιογενή παραγωγική αντιγραφή. Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει μια νέα μοριακή βάση για ογκολυτική αντιγραφή του

Ε1

-deleted διαφημίσεις και θα βοηθήσει στην ανάπτυξη νέων στρατηγικών για τη διαφήμισή ογκολυτικής virotherapies

Παράθεση:. Cheng PH, Rao XM, McMasters KM, Zhou HS (2013) Molecular Basis για Viral επιλεκτικού αναδιπλασιασμού σε καρκινικά κύτταρα: η ενεργοποίηση της CDK2 με αδενοϊό-Induced κυκλίνης Ε PLoS ONE 8 (2): e57340. doi: 10.1371 /journal.pone.0057340

Επιμέλεια: Yi Li, Wuhan Εμβιομηχανική Ινστιτούτο, η Κίνα

Ελήφθη: 3 Οκτ, 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 Φεβρουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Cheng et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ΝΙΗ Grant R01 CA129975 (με HSZ https://www.nih.gov/). PHC υποστηρίζεται μερικώς από την Υποτροφία K. C. Huang από το Πανεπιστήμιο του Louisville (https://louisville.edu/medschool/pharmacology). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ανθρώπινοι αδενοϊοί (Ads) είναι δίκλωνο γραμμικό DNA ιών που είναι σε θέση να μολύνουν και να αντιγράφονται σε μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών τύπων

in vitro

και

in vivo

, συμπεριλαμβανομένων των μετα-μιτωτικά κύτταρα. Μετά από λοίμωξη, ιογενής πρώιμες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με κυτταρικούς παράγοντες για τη δημιουργία ευνοϊκού περιβάλλοντος για την αντιγραφή του ιού [1]. Η διαφημίσεων

Ε1

περιοχή περιέχει δύο σύνολα των γονιδίων,

Ε1

και

Ε1

, που είναι αφιερωμένο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου, αποπτωτική αναστολή και ρύθμιση κυτταρικών και ιικών γονιδίων [ ,,,0],2]. Διαφημίσεις με

Ε1

τροποποιήσεις που αναπαράγουν κατά προτίμηση σε καρκινικά κύτταρα έχουν χρησιμοποιηθεί για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου.

Η ιογενής

Ε1

γονίδιο εκφράζεται αμέσως μετά τη μόλυνση. Ο πρωταρχικός ρόλος του

E1a

γονιδιακά προϊόντα είναι να ρυθμίζει την έκφραση των πολλαπλών κυτταρικών και ιικών γονιδίων [1]. Αντί να δεσμεύουν άμεσα σε συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA σε μεταγραφικά στοιχεία ρύθμισης, Ε1Α πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με αρκετές βασικές ρυθμιστές του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [3], [4]. Τα γνωστά κυτταρικά στοιχεία τα οποία δεσμεύουν Ε1Α πρωτεΐνες είναι τα προϊόντα της ρετινοβλάστωμα (

Rb

) γονίδιο και σχετίζεται δομικά γονίδια του,

ρ 107

και

ρ130

[5] , [6]. Με απομόνωσης της πρωτεΐνης ρετινοβλαστώματος (pRb), Ε1Α ενεργοποιεί μεταγραφικά πρωτεΐνες ρυθμιστής E2F. Μελέτες έχουν δείξει ότι το σύμπλοκο pRB /E2F καταστέλλει ενεργά μεταγραφής από γονίδια-στόχους και μεσολαβεί G

1 σύλληψη προκλήθηκε από ρ19 (ARF), p53, p16INK4a, TGF-β, ή την επαφή των κυττάρων [7] – [9]. Πρόσφατα Pelka

et al.

(2011) έδειξε ότι Ε1Α μπορεί να συνδέονται απευθείας προς E2F /DP σύμπλοκα αλληλεπιδρώντας με DP-1, με αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της E2F-αποκρίνεται γονιδιακή έκφραση ανεξάρτητα από σύνδεση με pRb [10] . Αρκετές ομάδες έχουν δείξει ότι η έκφραση του

E1a

γονίδιο προκαλεί την συσσώρευση της πρωτεΐνης ρ53 και ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση [11], [12], είτε με την ενεργοποίηση της μεταγραφής ρ53 ή την πρόληψη ρ53 από το να αποικοδομείται από το πρωτεάσωμα [11] – [14]

Ad Ε1Β55Κ έχει δειχθεί σε μερικές μελέτες για την εξουδετέρωση των Ε1Α επαγόμενη σταθεροποίηση της ρ53 [11], [15].. Ε1Β55Κ πρωτεΐνη μπορεί να αναστέλλουν τις λειτουργίες της ρ53 μέσω τουλάχιστον τρεις διακριτούς μηχανισμούς. Ε1Β55Κ φέρεται δεσμεύει το αμινοτελικό άκρο της ρ53 [16], και αυτή η σύνδεση μπορεί να καταστέλλουν την ενεργοποίηση της μεταγραφής ρ53, όπως προτείνεται σε προσδιορισμούς μεταγραφής [17] και παροδική διαμόλυνση μελέτες [18]. Ε1Β55Κ μπορεί επίσης να επηρεάσει τη λειτουργία της ρ53 συνεργαζόμενη με ιική πρωτεΐνη E4orf6 να προκαλέσει πρωτεολυτική αποικοδόμηση της πρωτεΐνης ρ53 [19] – [21]. Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι Ε1Β55Κ μόνη της λειτουργεί ως Ε3 SUMO1-p53 λιγάση που αλληλεπιδρά με την πυρηνική φορείς προμυελοκυτταρική λευχαιμία να αδρανοποιήσει p53 και να τονώσει την πυρηνική εξαγωγή του [22]. Με αυτόν τον τρόπο, Ε1Β55Κ μπλοκάρει την έκφραση των γονιδίων ρ53 ρυθμίζεται και, κατά συνέπεια, εξουδετερώνει την ρ53-εξαρτώμενη απόπτωση που επάγεται από Ε1Α, επιτρέπει την αποτελεσματική ιική αντιγραφή [16], [17].

διαφήμισης

dl

1520 (ONYX-015) περιέχει ένα 827-bp διαγραφή και σημειακή μετάλλαξη δημιουργεί ένα πρόωρο κωδικώνιο τερματισμού στην κωδικοποιητική αλληλουχία Ε1Β55Κ, εμποδίζοντας την έκφραση από το γονίδιο [23]. Αρχικά, προτείνεται το

Ε1Β55Κ

-deleted Ads μπορούσαν να αναπαράγουν μόνο σε καρκινικά κύτταρα p53-ανεπαρκή, καθώς η Ε1Β55Κ μεσολάβηση αποικοδόμησης της ρ53 πρωτεΐνης δεν απαιτήθηκε σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα [24], [25].

Ε1Β55Κ

-deleted ογκολυτικού διαφημίσεις έχουν δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους και να διατίθενται στο εμπόριο για τη θεραπεία του καρκίνου στην Κίνα μετά εγκριθεί από Κίνα κράτος Food and Drug Administration (SFDA) [26]. Ωστόσο, η αρχική υπόθεση αμφισβητήθηκε από πολλές μελέτες που δείχνουν ότι

Ε1Β55Κ

-deleted διαφημίσεις είναι σε θέση να αναπαραχθούν σε κύτταρα ανεξάρτητα από το καθεστώς p53 τους [27] – [30]. Περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι η συσσώρευση της πρωτεΐνης ρ53, μετά από μόλυνση με διαφημίσεις που φέρει μεταλλαγμένο

Ε1Β55Κ

γονίδια που είναι σε θέση να καταστείλει ρ53, δεν μπορεί ούτε αποτελεσματικά ούτε επάγει απόπτωση μεταγραφικά ενεργοποιούν την έκφραση του p53-γονιδίων που αποκρίνονται σε Ad-μολύνθηκαν κύτταρα [31], [32]. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η παρεμπόδιση της δραστηριότητας ρ53 με Ε1Β55Κ πρωτεΐνη είναι απίθανο να είναι η βασική προϋπόθεση για την αντιγραφή του ιού. Ο μηχανισμός (-οι)

Ε1Β55Κ

-deleted αντιγραφή του ιού στα καρκινικά κύτταρα δεν είναι ακόμη εγκατεστημένος, ακόμη και αν οι φορείς έχουν ήδη εφαρμοστεί στην κλινική για θεραπεία του καρκίνου του ανθρώπου [26].

Προηγουμένως, έχουμε δείξει ότι Ad Ε1Β55Κ εμπλέκεται στην επαγωγή των γονιδίων που σχετίζονται με τον κύκλο του κυττάρου, συμπεριλαμβανομένων κυκλίνη Ε και cdc25A [33]. Ad Ε1Β55Κ μεσολαβεί το μεγάλο μορφή της κυκλίνης Ε πρωτεΐνης (κυκλίνη EL) επαγωγή σε ad-μολυσμένα κύτταρα [34]. Η κυκλίνη Ε και η μεγάλη μορφή της κυκλίνης EL δημιουργούνται από το εναλλακτικό μάτισμα. Η μετάφραση της κυκλίνης EL ξεκινά στο ένα ATG κωδικόνιο που βρίσκεται στο εξόνιο 2 και κυκλίνη Ε είναι από το ΑΤΟ κωδικόνιο στο εξώνιο 3 [35]. Η λειτουργία Ε1Β55Κ απαιτείται για κυκλίνη επαγωγή EL στα φυσιολογικά κύτταρα, αλλά δεν απαιτείται σε καρκινικά κύτταρα με την απορυθμισμένη κυκλίνης Ε Η αποτυχία να επάγει αποτελεσματικά κυκλίνης έκφραση El στη φυσιολογικά κύτταρα, αντιγραφή του

Ε1Β55Κ

-deleted ογκολυτικού Διαφημίσεις είναι περιορισμένη. Ωστόσο,

Ε1Β55Κ

-deleted ογκολυτικού διαφημίσεις μπορούν αποτελεσματικά να προκαλέσει κυκλίνης EL σε καρκινικά κύτταρα και να πραγματοποιήσει επαρκή ογκολυτικού αντιγραφή. Προτείναμε ότι η κυκλίνη Ε απορρύθμιση στα καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι μια σημαντική μοριακή βάση για την επιλεκτική ογκολυτική αντιγραφή του

Ε1Β55Κ

-deleted Αγγελίες [34]

κυκλίνης Ε ρυθμίζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, την αντιγραφή του DNA. [36], [37], και κεντροσωμάτων επικάλυψη [38], [39]. Έκφραση της κυκλίνης Ε ελέγχεται αυστηρά σε φυσιολογικά κύτταρα. Το επίπεδο του κυκλίνη Ε αυξάνεται κατά αργά G

1 φάση, κορυφές στο G

1 /S φάση να προωθήσει την έναρξη της φάσης S, και στη συνέχεια μειώνεται [35], [40]. Απορρύθμιση της κυκλίνης Ε συχνά ανιχνεύεται σε πολλούς τύπους καρκίνων, όπως ενίσχυση κυκλίνη Ε γονίδιο [41], η υπερέκφραση της κυκλίνης Ε mRNA ή επίπεδα πρωτεΐνης [42], [43], μείωση του κύκλου εργασιών κυκλίνης Ε [44], και την παρουσία του πιο ενεργές μορφές της κυκλίνης Ε [45] – [47]. Συστατική υπερέκφραση της κυκλίνης Ε έχει δειχθεί ότι επάγει χρωμόσωμα αστάθεια και να βλάπτουν την κανονική εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [48], [49]. Η υπόθεση ότι ανώμαλη έκφραση κυκλίνης Ε μπορεί να προκαλέσει όγκους έχει επίσης υποστηρίζεται από μελέτες διαγονιδιακό ζώο [50] – [52].

Μία λειτουργία της κυκλίνης Ε είναι να δεσμεύσει και να ενεργοποιήσει κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση 2 (CDK2) [53]. Το σύμπλοκο κυκλίνης E /CDK2 τότε φωσφορυλιώνει υποστρώματα όπως pRb και οδηγεί σε μεταγραφική ενεργοποίηση του κατάντη γονιδίων. Μελέτες δείχνουν επίσης ότι η κυκλίνη Ε έχει CDK2-ανεξάρτητες λειτουργίες [54], [55].

In vivo

μελέτες σε ζώα δείχνουν διακύμανση μεταξύ των φαινοτύπων της κυκλίνης Ε null (κυκλίνη Ε1

– /- Ε2

– /-) ποντίκια και CDK2 null (CDK2

– /-) ποντίκια . Τα ποντίκια που στερούνται CDK2 είναι βιώσιμα, με φυσιολογική ανάπτυξη εκτός από την ανάπτυξη ελαττωματικό γεννητικών κυττάρων [56], [57]? ακόμη νοκ-άουτ της κυκλίνης Ε1 και Ε2 γονίδια στα ποντίκια προκαλεί εμβρυϊκή θνησιμότητα λόγω της ανεπάρκειας σε ενδοδιπλασιασμό του τροφοβλάστης γιγαντιαία κύτταρα και μεγακαρυοκύτταρα [58]. Ματσουμότο

et al.

(2004) προσδιόρισε έναν τομέα centrosomal σήμα εντοπισμού (CLS) στην κυκλίνης Ε [59]. Αυτή η CLS τομέα επιτρέπει κυκλίνης Ε να στοχεύσετε το κεντρόσωμα και να προωθήσουν την είσοδο S φάση σε ένα CDK2-ανεξάρτητο τρόπο. Επιπλέον, Geng

et al.

(2007) έδειξε ότι ένα κυκλίνη ανεπάρκεια κινάσης μεταλλάκτη (KD-Ε) το Ε είναι σε θέση να αποκαταστήσει μερικώς πρωτεΐνη συντήρηση μικροχρωμόσωμα (MCM) φόρτωση και S εισόδου φάση σε μηδενικά κύτταρα κυκλίνη Ε [54]. Έτσι, η κυκλίνη Ε έχει CDK2-εξαρτώμενη και ανεξάρτητες λειτουργίες στην καταχώρηση φάση S και την αντιγραφή του DNA. Ένα σημαντικό ερώτημα είναι αν Ad-που προκαλείται από την κυκλίνη Ε μπορεί να ενεργοποιήσει CDK2 και αν η αλληλεπίδραση κυκλίνη E-CDK2 μπορεί να διαδραματίσει καθοριστικό ρόλο στην αντιγραφή διαφημίσεων. Το ζήτημα αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την ανάπτυξη της ογκολυτικού στρατηγικές ιοθεραπείας.

Αναφέρουμε εδώ ότι Ad-επαγόμενη κυκλίνης Ε συνδέεται με και ενεργοποιεί CDK2 που στοχεύει καταστολέας της μεταγραφής pRb, η οποία με τη σειρά τους μπορούν να ρυθμίσουν την έκφραση των κυτταρικών και ιικών γονιδίων . Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ του Ad-που προκαλείται από την κυκλίνη Ε και CDK2 είναι να δημιουργήσει το κατάλληλο περιβάλλον για τη διαφήμισή παραγωγική αντιγραφή.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και συνθήκες καλλιέργειας

ΗΕΚ 293 (ΑΤΟΟ αρ. CRL-1573), ανθρώπινο πνεύμονα ινοβλαστών WI-38 (ATCC αρ. CCL-75), και ανθρώπινου πνεύμονα Α549 καρκίνου (ATCC αρ. CCL-185) κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Rockville, MD). WI-38 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) Άλφα GlutaMAX με 0,1 mM μη-απαραίτητα αμινοξέα και 1,0 mM πυροσταφυλικό νάτριο. ΗΕΚ 293 και Α549 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο άλφα. Όλα τα μέσα συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (100 U /ml). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ατμόσφαιρα 5%

2 επωαστήρα στους 37 ° C CO. Όλα τα αντιδραστήρια κυτταρικής καλλιέργειας ελήφθησαν από την Gibco BRL (Bethesda, MD).

αδενοϊικοί φορείς

Άγριου-τύπου αδενοϊού τύπου 5 (Adwt, ATCC αρ. VR-5) χρησιμοποιήθηκε ως αντιγραφής -competent ελέγχου. AdCMV /GFP, ένας φορέας διαφημίσεων με διαγραφή Ε1 μεταφέρουν μια πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), χρησιμοποιήθηκε ως ελαττωματικό αντιγραφής ελέγχου. Adhz63, ένας ογκολυτικής Ad φορέα με τη διαγραφή του

Ε1Β55Κ

περιοχή, κατασκευάστηκε από το εργαστήριο μας [60].

Η μόλυνση με ιούς και η τιτλοδότηση

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 6- φρεατίων σε πυκνότητα 2,5 χ 10

5 (κύτταρα /φρεάτιο) και καλλιεργήθηκαν κάτω από τις υποδεικνυόμενες συνθήκες. Ακολούθως, τα κύτταρα ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με AdGFP, Adwt, ή Adhz63 σε πολλαπλότητα μόλυνσης (ΜΟΙ) 5. κυτοπαθολογικό σύμπτωμα (CPE) παρατηρήθηκε σε χρονικά σημεία σχεδιάστηκε και φωτογραφήθηκαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Olympus CKX41). Σύνολο μολυσμένα κύτταρα και τα υπερκείμενα της καλλιέργειας συλλέχθηκαν σε 48 ώρες μετά τη μόλυνση (ρ.ί.) και λύθηκαν για να απελευθερώσει σωματίδια ιού με τρεις κύκλους κατάψυξης και απόψυξης. Οι ιικοί τίτλοι προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο μολυσματική μονάδα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [61], [62]. Εν συντομία, τα κύτταρα ΗΕΚ 293 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων σε μια πυκνότητα των 10

3 (κύτταρα /φρεάτιο) και στη συνέχεια μολύνθηκαν με 5-πλάσια σειριακά αραιωμένα ιούς. CPE καταγράφηκε και βαθμολογήθηκε μετά από επώαση για 7 ημέρες. Το ποσοστό μείωσης τίτλος του ιού υπολογίζεται από τον τύπο, τη μείωση% = [(τίτλος της ομάδας ελέγχου – τίτλος πειραματική ομάδα) /τίτλο της ομάδας ελέγχου]. Χ 100%

Viral ΟΝΑ

δοκιμασία σύνθεσης

Μετά την ιική μόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Η σύνθεση DNA του ιού προσδιορίστηκε με κηλίδα Southern? 1 μg του απομονωμένου γενωμικού DNA υποβλήθηκε σε πέψη με το ένζυμο περιορισμού

Pst

Ι και αναλύθηκε με γέλη αγαρόζης 1%, το οποίο στη συνέχεια απορροφήθηκε σε μία Ηγοοηά-Ν + μεμβράνη (YA3609? Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) . Ο ανιχνευτής παρασκευάστηκε με πέψη 0,5 μg pBHGE3 [63] με

Pst

Ι και επισημαίνονται ακολουθώντας το πρωτόκολλο του Amersham ΑΙκρήοδ άμεση σήμανση και τα συστήματα ανίχνευσης (RPN 3690? GE Healthcare, Piscataway, NJ). Το στύπωμα υβριδιοποιούνται επί 3 ώρες στους 63 ° C. Τα εκπλύματα υβριδοποίησης και αυστηρότητας διεξήχθησαν στους 55 ° C και ακολουθείται από την ανίχνευση χημειοφωταύγειας σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα μολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία και λύθηκαν με CDK2 ρυθμιστικού λύσης (20 mM Tris ρΗ 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 0,5% Nonidet Ρ-40, 0,1% Brij 35, 5 mM γλυκεροφωσφορικό νάτριο, 1 mM βαναδικό νάτριο, 1 mM διθειοθρεϊτόλη). Οι αναλύσεις στυπώματος Western διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [64]. Εν συντομία, 80 μα από κυτταρολύματα ηλεκτροφορήθηκαν μέσα από 12% πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μία Immobilon-P μεμβράνη (Millipore, Billerica, ΜΑ). Τα πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν κουνελιού αντι-κυκλίνης Ε (Μ-20), CDK4 (C-22), αντι-κυκλίνης D1 (DCS-6), PCNA (PC10), ρ21 ποντικού (F-5), pRb (IF8) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), αντι-CDK2, p27 (BD Biosciences, San Jose, CA), pCDK2 T160 (Cell σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ), αντι-φωσφορυλιωμένη pRb (φωσφο-pRb ) S612, και ακτίνης (Sigma, St. Louis, ΜΟ), αντι-φωσφο-pRb S795 (New England Biolabs, Beverly, ΜΑ), και αντι-φωσφο-pRb T821 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Οι μεμβράνες στη συνέχεια επωάστηκαν με ανοσοσφαιρίνη αντι-ποντικού G (IgG) ή IgG αντι-κουνελιού υπεροξειδάσης-συνδεδεμένο είδος-ειδικό ολικό αντίσωμα (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Χημειοφωταύγειας ανίχνευση εκτελέστηκε με αντιδραστήρια ECL σύμφωνα με τις συστάσεις του προμηθευτή (GE Healthcare). Η σαρωμένη ένταση ζώνη ποσοτικοποιήθηκε με Gel-pro Analyzer 4.0 λογισμικό (Media Cybernetics, Bethesda, MD) σύμφωνα με το σεμινάριο του κατασκευαστή. Η πυκνομετρική τιμή για κάθε ζώνη εκφράστηκε ως ολοκληρωμένη οπτική πυκνότητα (I.O.D.) και τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν με την ακτίνη. Οι τελικές τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο σχετικό ποσοστό αλλαγής, από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα, σε σύγκριση με την ομάδα ψευδο ± Τ.Α .. Στατιστική διαφορά εκτιμήθηκε με t-test του Student. Μια τιμή ρ & lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Ανοσοκαταβύθιση

κύτταρα Α549 σπάρθηκαν σε τρυβλία των 150 mm σε πυκνότητα κυττάρων 5 × 10

6 (κύτταρα /τρυβλίο) και στη συνέχεια ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με AdGFP, Adwt, ή Adhz63 σε ΜΟΙ 5. στις 48 ώρες ρί, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσεως CDK2 σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται σε προηγούμενες δημοσιεύσεις [34], [65]. Τα κυτταρολύματα (500 μα) ανοσοκαταβυθίστηκαν με κυκλίνη Ε (HE111), το μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (Santa Cruz), ή αντι-CDK2 αντισώματος (BD Transduction Laboratories) σε 4 ° C για 4 ώρες, ακολουθούμενο από την προσθήκη πρωτεΐνης Α Sepharose Cl- 4Β (82506? Sigma) και επώαση όλη τη νύκτα. Ανοσοσύμπλοκα αναλύθηκαν με κηλίδα Western με αντι-κυκλίνη Ε και CDK2 αντισώματα.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) διαμόλυνση

Τα ολιγονουκλεοτίδια siRNA συνετέθησαν με Eurogentec (Fremont, CA). Τρία διαφορετικά siRNA δίπολα σχεδιάστηκαν για να στοχεύσουν CDK2 επί νουκλεοτίδια 399 έως 419 (# 1), 619 έως 639 (# 2), και 691 να 711 (# 3) σύμφωνα με Genbank ένταξη NM001798.2 (National Center for Biotechnology Information GenBank) . Ένα αρνητικό duplex siRNA έλεγχο που περιέχει δύο σκέλη της 19ης συμπληρωματικές βάσεις του RNA με 3’dTdT προεξοχές λήφθηκε από Eurogentec (SR-CL000-005). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε πυκνότητα 10

5 (κύτταρα /φρεάτιο) και στη συνέχεια επιμολύνονται με 200 δίπολα ηΜ CDK2 siRNA ή ενός διπλού μη ειδικό siRNA ελέγχου με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες μετά την επιμόλυνση. Ογδόντα μα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με στύπωμα Western με CDK2, pCDK2 Τ160, pRb, φωσφορυλιωμένη pRb (ρ-pRb), κυκλίνη Ε, πρωτεΐνες καψιδίου, και αντισώματα ακτίνης.

Όλες οι παραπάνω πειράματα, εκτός υποδεικνύεται συγκεκριμένα, επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές.

Αποτελέσματα

κυκλίνης Ε /CDK2 συγκρότημα σχηματίστηκε σε κύτταρα μολυσμένα με αδενοϊούς

Έχουμε αναπτύξει στο παρελθόν τη σχέση μεταξύ της κυκλίνης Ε και αντιγραφή των αδενοϊούς [33], [34]. Τα δεδομένα που φαίνονται στο Σχήμα 1 ανακεφαλαίωση που Ad Ε1Β55Κ συμμετέχει στην επαγωγή της μεγάλης μορφής κυκλίνης Ε πρωτεΐνης (κυκλίνη EL), η οποία συμβάλλει στην αποτελεσματική αντιγραφή του ιού. Η κυκλίνη Ε και κυκλίνη EL δημιουργούνται από εναλλακτικό μάτισμα με διαφορετικά κωδικόνια έναρξης ΑΤΟ στα εξόνια 2 και 3 [35]. Το Ν τελικό άκρο της επαγόμενης από τον ιό κυκλίνη EL είναι 15 αμινοξέα μακρύτερη από εκείνη της κυκλίνης Ε πρωτεΐνης. Η κυκλίνη Ε πρωτεΐνη εκφράζεται ιδιοσυστατικά σε Α549 ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [34]. Άγριου-τύπου Ad5 (Adwt), με το ακέραιο

Ε1Β55Κ

περιοχή, προκάλεσε σημαντικές κυκλίνη ΕΛ έκφραση τόσο του WI-38 ανθρώπινα κύτταρα ινοβλαστών πνεύμονος και του καρκίνου του Α549 ανθρώπινα κύτταρα πνεύμονα (Εικ. 1Α, διαδρομές 2 και 5 ), και προκάλεσε αποτελεσματική κυτοπαθικό αποτέλεσμα (CPE) (Εικ. 1 β, πάνελ b και ε). Ad φορέα Adhz63 με

Ε1Β55Κ

-deletion [60] επίσης προκάλεσε σημαντικές κυκλίνης EL σε κύτταρα Α549 (Εικ. 1Α, λωρίδα 6) και προκάλεσε αποτελεσματική CPE των κυττάρων (Εικ. 1 Β, πίνακας C). Ωστόσο, ο φορέας απέτυχε να επάγει κυκλίνης EL υπερέκφραση σε κύτταρα WI-38 (Εικ. 1Α, λωρίδα 3) και CPE τους (Σχ. 1 Β, πίνακας F). Για τη σύγκριση της αντιγραφής του Adwt και Adhz63 σε Α549 και WI-38 κυττάρων, προσδιορίστηκαν οι τίτλοι αυτών των δύο ιών. Η αντιγραφή Adhz63 έντονα καταστέλλεται σε WI-38 κύτταρα, που δείχνει μόνο το 10% της σχετικής αντιγραφής σε σύγκριση με Adwt (Εικ. 1 C). Όταν συγκρίναμε την αντιγραφή Adhz63 με εκείνη των Adwt σε κύτταρα Α549, σύμφωνα με τα αποτελέσματα CPE, παρατηρήθηκε 80% σχετική αντιγραφής του Adhz63. Έτσι, η αναπαραγωγή Adhz63 είναι πιο καταπιεσμένη σε WI-38 κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα Α549. Το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με προηγούμενη παρατήρηση μας ότι η κυκλίνη επαγωγή EL σε καρκινικά κύτταρα συνδέεται με την επιλεκτική αντιγραφή του

Ε1Β55Κ

-deleted Διαφημίσεις σε καρκινικά κύτταρα [34].

WI-38 ή Α549 κύτταρα μολύνθηκαν με AdGFP, Adwt ή Adhz63 σε ΜΟΙ 5. (Α) τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 48 ώρες και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για κυκλίνη Ε και ακτίνης. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) CPE φωτογραφήθηκε στις 72 ώρες μετά τη μόλυνση (ρ.ί.). Ολη η μικροσκοπία ήταν αρχικά σε μεγέθυνση x100. (Γ) Viral τίτλοι προσδιορίσθηκαν σε 72 ώρες ρ.ί. με τη μέθοδο της μονάδας μόλυνση. Η τιμή δείχνει το μέσο όρο τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων, παρουσιάζονται ως η μέση ποσοστιαία μεταβολή σε σχέση με την ομάδα ελέγχου Adwt ± S.D. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα Adwt, Μαθητή

t-test

Η

κυκλίνης Ε μπορεί να προωθήσει την είσοδο S φάση και να συμμετέχουν στην αντιγραφή του DNA μέσω CDK2-εξαρτώμενη [53] και CDK2-ανεξάρτητες οδούς [59]. Για να μελετήσει κατά πόσον κυκλίνης Ε λειτουργία στην αντιγραφή διαφήμισης εξαρτάται CDK2 ή ανεξάρτητη, επιδιώξαμε πρώτα να διερευνηθεί η φυσική επαφή μεταξύ CDK2 και κυκλίνης ΕΛ στα κύτταρα που επηρεάζονται από τις διαφημίσεις. Πνεύμονα κύτταρα Α549 καρκίνου ήταν ψευδο-μολυσμένα ή μολυσμένα με AdGFP, Adwt, ή Adhz63. Για να καταλάβουμε πώς

Ε1

-deleted αγγελίες επιλεκτικά αναπαράγουν σε καρκινικά κύτταρα, εστιάσαμε στην Α549 κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα στην οποία τόσο Adwt και το

Ε1

-deleted Adhz63 μπορεί αποτελεσματικά να προκαλέσει κυκλίνης ΕΛ και να αναπαραχθούν. Στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση (ρ.ί.), τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Χρησιμοποιήσαμε το πρώτο αντι-κυκλίνης E αντίσωμα να ανοσοκαθιζάνει Ε πρωτεΐνη κυκλίνης και ανέλυσε τα ανοσοσύμπλοκα με κηλίδα Western. Τα δεδομένα δείχνουν ότι η κυκλίνη Ε πρωτεΐνη καταβυθίστηκε από κύτταρα ψευδο-κατεργασμένα ή κατεργασμένα με αντιγραφή-ελαττωματικό AdGFP (αρνητικοί έλεγχοι) δεν δεικνύουν σημαντική συσχέτιση με πρωτεΐνη CDK2 (Εικ. 2Α, λωρίδες 1 και 2). Ωστόσο, ανοσοσυμπλόκων από Adwt- και Adhz63-μολυσμένα κύτταρα Α549 που περιέχονται τόσο κυκλίνης Ε και κυκλίνης EL με αύξηση του CDK2 δέσμευσης (Σχ. 2Α, λωρίδες 3 και 4). Για να επαληθευθεί αυτή η σύνδεση κυκλίνης Ε /CDK2, χρησιμοποιήσαμε επίσης αντι-CDK2 αντισώματος για να γκρεμίσει το σύμπλοκο πρωτεΐνης και στη συνέχεια εξετάστηκε το επίπεδο των πρωτεϊνών κυκλίνης Ε στο σύμπλοκο κυκλίνης E-CDK2. Το ανοσοκαταβυθισμένο πρωτεΐνη CDK2 αυξήθηκε σε Adwt και Adhz63-μολυσμένα κύτταρα με ταυτόχρονη καταβύθιση της κυκλίνης ΕΛ (Σχ. 2Β, λωρίδες 3 και 4), ιδιαίτερα για Adwt-μολυσμένα κύτταρα (λωρίδα 3). Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι με ικανότητα αντιγραφής Adwt και Adhz63 επάγουν κυκλίνης έκφραση ΕΛ και να αυξήσει το σχηματισμό συμπλόκου κυκλίνης /CDK2 EL σε καρκινικά κύτταρα Α549, υποδεικνύοντας ότι η κυκλίνη EL επάγεται σε Ad-μολυσμένα κύτταρα συσχετίζει έντονα με CDK2.

(Α) κυτταρολύματα Α549 ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-κυκλίνη Ε αντίσωμα (1:50 αραίωση). Ανοσοσύμπλοκα αναλύθηκαν με κηλίδα Western με κυκλίνη Ε και αντισώματα CDK2. (Β) Τα κυτταρολύματα ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-CDΚ2 αντίσωμα και ανοσοστυπώθηκαν για CDK2, κυκλίνη Ε και κυκλίνη EL.

Η

αδενοϊό επαγόμενη κυκλίνης EL αυξάνει φωσφορυλίωση CDK2

ενεργοποιείται

CDK2 η φωσφορυλίωση στη θέση Τ160 και αυτή η φωσφορυλίωση αυξάνει την ηλεκτροφορητική κινητικότητα της, με αποτέλεσμα την ταχύτερη-μεταναστεύει ζώνες [66]. Ερευνήσαμε αν η κυκλίνη επαγωγή Ελλάδα και η αυξημένη αλληλεπίδραση μεταξύ κυκλίνης Ελλάδα και CDK2 στα κύτταρα Α549 μετά Adwt και Adhz63 λοίμωξη μπορεί να προωθήσει την φωσφορυλίωση CDK2 στο συγκεκριμένο χώρο T160. Ανάλυση των κυτταρικών λυμάτων με κηλίδα Western έδειξαν ότι η επαγωγή της κυκλίνης EL οδήγησε σε αύξηση της ταχύτερης-μεταναστεύει CDK2, συνεπής με φωσφορυλιωμένη-CDK2 πρωτεΐνη (pCDK2) Τ160 (η δραστική μορφή της CDK2), ιδιαίτερα στις 48 ώρες ρ.ί. (Εικ. 3Α, λωρίδες 7 και 8). Επαληθεύσαμε τη γρηγορότερη-μεταναστεύουν μορφή CDK2 με φωσφο-CDK2 αντισωμάτων (Τ160) (# 2561, κυτταρική σηματοδότηση). Η πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών αυτών έδειξαν ότι μόλυνση Adwt προκάλεσε 1,3 έως 2.7 φορές αύξηση (Ρ = 0.03) στο επίπεδο των pCDK2 Τ160 και λοίμωξη Adhz63 προκάλεσε 1,5 έως 1,9 φορές αύξηση (Ρ = 0,0026) σε σύγκριση με τον ψευδο-ελέγχου ομάδα στις 48 ώρες pi (Εικ. 3Β, λωρίδες 3 και 4). Το αποτέλεσμα εις το σχήμα 3Β είναι σύμφωνος με εκείνον στο σχήμα 3Α (λωρίδες 7 και 8).

Α549 κύτταρα ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με AdGFP, Adwt, ή Adhz63 σε ΜΟΙ 5. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 h ή 48 h pi και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδα Western. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για (Α) κυκλίνης Ε και CDK2? (Β) pCDK2 T160? και (Γ) κυκλίνης D, CDK4 και PCNA. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Η σαρωμένη ένταση ζώνη ποσοτικοποιήθηκε και οι τιμές αντιπροσωπεύουν τους μέσους όρους των αντίστοιχων ποσοστών αλλαγή σε σύγκριση με την ομάδα ψευδο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα εις τριπλούν. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ομάδα mock-ελέγχου, έλεγχος τ

Η

Εκτός από την κυκλίνη Ε, κυκλίνη D συμμετέχει επίσης στη μετάβαση της G

1-S φάση . Έτσι, εξετάσαμε επίσης το επίπεδο της κυκλίνης D. Είναι ενδιαφέρον ότι, το επίπεδο της κυκλίνης D μειώθηκε μετά ιογενή λοίμωξη. Η πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών κατέδειξε ότι η μόλυνση Adwt και Adhz63 στις 24 ώρες μειώθηκε πρωτεΐνη κυκλίνης D με τα επίπεδα του 11% (Ρ = 0.0000025) και 71% (Ρ = 0,001) του ψευδο μόλυνση, αντίστοιχα (Σχ. 3C, λωρίδες 3 και 4). Τα επίπεδα της κυκλίνης D σε κύτταρα μολυσμένα με Adwt ή Adhz63 ήταν περαιτέρω μειωμένη κατά 48 ώρες έως 3% (Ρ = 0.00000043) και 8% (Ρ = 0,00002), αντίστοιχα (Σχ. 3C, λωρίδες 7 και 8). Εν τω μεταξύ, το επίπεδο των CDK4 και το πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) δεν μεταβλήθηκε σημαντικά σε καμία από τις ομάδες. CDK4 ρυθμίζεται και ενεργοποιείται από την κυκλίνη D για την επεξεργασία της G

1-S μετάβαση [67], [68]? PCNA, γνωστό ότι ρυθμίζει την αντιγραφή του DNA και την επιδιόρθωση του DNA, συνδέεται με πολλαπλούς συμπλοκών κυκλίνης /CDK στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [69], [70]. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι αγγελίες μειωμένη παραγωγή της κυκλίνης D και δεν επηρεάζουν τα επίπεδα της CDK4. Έτσι, η μόλυνση του Ad συγκεκριμένα προκαλείται από κυκλίνη EL που ενεργοποιείται CDK2 μέσω φωσφορυλίωσης σε T160 site της, γεγονός που υποδηλώνει έναν κρίσιμο ρόλο της κυκλίνης Ελλάδα και CDK2 στην αντιγραφή διαφημίσεων.

αύξηση αδενοϊοί pRb φωσφορυλίωσης

κυκλίνης Ε- ενεργοποιημένο φωσφορυλιωμένη CDK2 (pCDK2) είναι γνωστό ότι ελέγχουν την G

1-S μετάβαση με φωσφορυλίωση των κατάντη υποστρωμάτων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι pRb είναι ένα από τα γνωστά στόχους για pCDK2, εξετάσαμε κατά πόσο η αύξηση των ενεργοποιημένων pCDK2 μεταβάλλει τη φωσφορυλίωση της pRb στο S612, το οποίο είναι ένα CDK2-προτιμώμενο υπόλειμμα φωσφορυλίωσης [71], [72]. Βρήκαμε ότι το επίπεδο φωσφο-pRb S612 αυξήθηκε σε 314% (Ρ = 0,016) και 240% (Ρ = 0,03) σε κύτταρα μολυσμένα με Adwt και Adhz63, αντίστοιχα, αν και το επίπεδο της πρωτεΐνης μη φωσφορυλιωμένου pRb μειώνεται ελαφρά ( Σχ. 4Α, λωρίδες 3 και 4). Δεν μπορέσαμε να εντοπίζονται τυχόν σημαντικές αλλαγές του ρ-pRb T821, ένα άλλο CDK2-προτιμώμενο υπόλειμμα φωσφορυλίωσης [71], [73], και η CDK4 προτιμώμενα ρ-pRb S795 [74] (Σχ. 4Α). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την επιλογή του τόπου S612 στην pRb από Ad-ενεργοποιημένα CDK2 για τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης.

Α549 κύτταρα ψευδο-μολύνθηκαν ή μολύνθηκαν με AdGFP, Adwt, ή Adhz63 και συλλέγονται σε 24 ώρες ή 48 ώρες pi , που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western. Κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για (Α) pRb, φωσφο-pRb (ρ-pRb) στο S612, S795 και T821 ή (Β) ρ21 και ρ27. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ομάδα mock-ελέγχου, έλεγχος τ

Η

Οι αδενοϊοί καταστείλει CDK αναστολείς

Παρατηρήσαμε επίσης ότι τα επίπεδα της πρωτεΐνης και των δύο ρ21 και ρ27 μειώθηκε. σε κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με Adwt και Adhz63, ειδικά για ρ21 (Εικόνα 4Β). ρ21 και ρ27 είναι τα γνωστά αναστολείς CDK, τα οποία ρυθμίζουν αρνητικά τη δραστηριότητα των συμπλοκών κυκλίνης E /CDK2 να αποτρέψει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [75]. Η πυκνομετρική ανάλυση των ζωνών αυτών έδειξαν ότι το επίπεδο της πρωτεΐνης ρ21 μειώθηκε στα επίπεδα του 8% (Ρ = 0.0000002) και 44% (Ρ = 0,00066) του mock ελέγχου σε κύτταρα Α549 μετά την μόλυνση με Adwt και Adhz63 στις 24 ώρες, αντίστοιχα (Εικ. 4Β, λωρίδες 3 και 4). Το επίπεδο ρ21 περαιτέρω καταστέλλεται σε κύτταρα Α549 στις 48 ώρες μετά τη μόλυνση με Adwt (2%, Ρ = 0.00000034) και Adhz63 (6%, Ρ = 0.0000007) (Εικ. 4Β, λωρίδες 7 και 8). λοίμωξη ad μειώθηκε επίσης τα επίπεδα της πρωτεΐνης p27 σε 36% (Adwt, P = 0,0015) και 49% (Adhz63, Ρ = 0,00043) σε 24 ώρες? 16% (Adwt, Ρ = 0.00012) και 37% (Adhz63, Ρ = 0,0092) σε 48 ώρες σε Α549 κύτταρα (Εικ. 4Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι διαφημίσεις ενεργοποιήσετε την CDK2 με την πρόκληση της κυκλίνης Ελλάδα και την καταστολή των p21 και p27.

Διακοπή της κυκλίνης Ελλάδα και CDK2 αλληλεπίδραση μειώνει αδενοϊική αντιγραφή

Για να διερευνήσουν περαιτέρω το ρόλο της CDK2 στην αντιγραφή του ιού , χρησιμοποιήσαμε την ροσκοβιτίνη CDK2 χημικό αναστολέα (Ros? CYC202) να διακόψει την κυκλίνη EL και την αλληλεπίδραση CDK2. Ros είναι ένα παράγωγο πουρίνης που αναστέλλει την δραστικότητα της CDK2 με σύνδεση προς δραστική θέση του [76]. Ros μειώνει την φωσφορυλίωση επί CDK2 [77] και αποκλείει την ανδροστενοδιόνη επαγόμενη αύξηση των ενεργών φωσφορυλιωμένου CDK2 [78]. Αν η ενεργοποίηση της CDK2 είναι απαραίτητη για την ιική αντιγραφή, αποκλεισμός της δραστικότητας CDK2 πρέπει να το μειώσει. Σχήμα 5Α, που αντιπροσωπεύουν ένα από τα τέσσερα επαναλαμβανόμενα πειράματα, δείχνει ότι με αυξημένη Ros, CPE που προκλήθηκε από Adwt και Adhz63 μόλυνση ήταν μερικώς αναστέλλεται. Το Σχήμα 5Β δείχνει ότι η αγωγή με 5 μΜ Ros οδήγησε σε μείωση κατά 50% σε Adwt τίτλο (Ρ = 0,0002) και μείωση 71% σε Adhz63 τίτλο (Ρ = 0,034), σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου οχήματος σε επεξεργασία με διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO , που ορίζεται ως το 0 μΜ Ros). Η θεραπεία με 10 μΜ Ros οδήγησε σε πιο μειώσεις του ιικούς τίτλους: μείωση 81% σε Adwt (Ρ = 0,00001), και μείωση 87% σε Adhz63 (Ρ = 0,012). Οι καταπιεσμένη ιικό αποδόσεις είναι συνεπής με το φαινόμενο CPE στο Σχήμα 5Α.

(Α) Τα κύτταρα επεξεργάστηκαν με 0 μΜ (ομάδα ελέγχου οχήματος σε επεξεργασία με DMSO), 5 μΜ, ή 10 μΜ ροσκοβιτίνη, και ψευδώς ή μολύνθηκαν με AdGFP, Adwt ή Adhz63 σε ΜΟΙ 5. Όλα μικροσκοπία είναι αρχικά σε μεγέθυνση Χ100 ελήφθησαν σε 48 ώρες ρί (Β) Viral τίτλοι προσδιορίσθηκαν σε 48 ώρες ρ.ί. με τη μέθοδο της μονάδας μόλυνση. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. ανεξάρτητων τετραπλούν. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με την ροσκοβιτίνη 0 μΜ, Μαθητή

t-test

Η

Στη συνέχεια εξετάζονται τα επίπεδα του ιικού DNA και πρωτεϊνών που παράγονται στα κύτταρα που επηρεάζονται από τη θεραπεία Ros.. Η σύνθεση του ιικού DNA προσδιορίστηκε με κηλίδα Southern επεσημάνθη με το γονιδίωμα Ad. Η γραμμική Adwt DNA είναι 36KB με το σύνολο των 28

Pst

θέσεις περιορισμού. Το μεγαλύτερο θραύσμα είναι 4333 bp και το μικρότερο κομμάτι είναι μόνο 12 bp. Τα μεγέθη των αντιπροσωπευτικών τεμάχια DNA επισημαίνονται στο σχήμα 6. Η σύνθεση ιικού DNA του Adwt και Adhz63 στις 24 ώρες ρ.ί. ήταν έντονα αναστέλλεται παρουσία 10 μΜ Ros (Σχ. 6Α, λωρίδες 6 και 12). Σταθερά, οι ιικές πρωτεΐνες καψιδίου ήταν σημαντικά αναστέλλεται παρουσία 10 μΜ Ros (Σχ. 6Β, λωρίδες 4 και 6). Η αναστολή της δραστηριότητας CDK2 με Ros μείωσε την φωσφορυλίωση της pRb στη θέση S612 σε AdGFP, Adwt και Adhz63 επεξεργασμένα κύτταρα (Σχ. 6C). Είναι ενδιαφέρον ότι, η θεραπεία Ros κατασταλεί σημαντικά την επαγωγή της κυκλίνης EL πρωτεΐνης που προκαλείται από Adwt και μόλυνση Adhz63 (Σχ. 6C, λωρίδες 4 και 6). Συνοψίζοντας, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η αναστολή της CDK2 με Ros καταστέλλεται φωσφορυλίωση pRb και ανέστειλε την αντιγραφή του ιού.

(Α) κύτταρα Α549 συλλέχθηκαν σε 0 ώρες και 24 ώρες μετά τη μόλυνση σύνθεσης ιικού DNA προσδιορίστηκε με στύπωμα Southern. Στις 24 ώρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και κυτταρολύματα ανοσοστυπώθηκαν για (Β) αδενοϊού τύπου 5 πρωτεΐνες καψιδίου, (Γ) κυκλίνη EL, ρ-pRb S612, και ακτίνη. Η ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. * Ρ & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την ροσκοβιτίνη επεξεργασμένο ομάδα 0 μΜ, έλεγχος τ

Η

siRNA αναστολή CDK2 καταστέλλει αδενοϊική αντιγραφή εμποδίζοντας φωσφορυλίωση pRb

Δεδομένου ότι ο χημικός αναστολέας Ros δύναται επίσης να επηρεάσουν και άλλα CDK και κινάσες [79], που εφαρμόζεται επίσης παρεμβολή RNA να φιμώσουν ειδικά την έκφραση CDK2.