Αφηρημένο

Ιστορικό

μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) χαρακτηρίζεται από ταχεία εξέλιξη και τα χαμηλά ποσοστά επιβίωσης. Ως εκ τούτου, τα νέα θεραπευτικά μέσα χρειάζονται επειγόντως για την ασθένεια αυτή. Η καψαϊκίνη, το δραστικό συστατικό του τσίλι πιπεριές, εμφανίζει αντι-πολλαπλασιαστική δράση σε προστάτη και του καρκίνου του επιδερμοειδούς

in vitro

. Ωστόσο, η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της καψαϊκίνης δεν έχει μελετηθεί σε ανθρώπινο SCLCs. Η παρούσα χειρόγραφο γεμίζει αυτό το κενό της γνώσης και διερευνά την αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της καψαϊκίνης σε SCLC

in vitro

και

in vivo

.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

δοκιμασίες BrdU και PCNA ELISAs έδειξε ότι η καψαϊκίνη εμφανίζει ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές SCLC. Επιπλέον, η καψαϊκίνη κατέστειλε ισχυρά την ανάπτυξη της Η69 ανθρώπινα SCLC όγκους

in vivo

όπως επιβεβαιώνεται από δοκιμασίες CAM και γυμνά μοντέλα ποντικών. Το δεύτερο μέρος της μελέτης μας προσπάθησε να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τους μοριακούς μηχανισμούς που διέπουν την αντι-πολλαπλασιαστική δράση της καψαϊκίνης. Βρήκαμε ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα της καψαϊκίνης συσχετίζεται με μία μείωση στην έκφραση της E2F-αποκρίνονται πολλαπλασιαστική γονίδια όπως κυκλίνη Ε, θυμιδυλική συνθάση, cdc25A και Cdc6, τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Ο παράγοντας μεταγραφής E2F4 μεσολαβεί την αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα της καψαϊκίνης. Κατάλυση επίπεδα E2F4 με μεθοδολογία siRNA κατέστειλε καψαϊκίνη που προκαλείται από G1 σύλληψη. δοκιμασίες ChIP έδειξαν ότι η καψαϊκίνη προκάλεσε την πρόσληψη E2F4 και ρ130 σε E2F-απόκρισης πολλαπλασιασμού υποστηρικτές, αναστέλλοντας έτσι τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι οι αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις της καψαϊκίνης θα μπορούσε να είναι χρήσιμη στη θεραπεία της ανθρώπινης SCLCs

Παράθεση:. Μπράουν KC, Witte TR, Hardman ΕΜΕΙΣ, Luo η, Chen YC, Carpenter AB, et al. (2010) Η καψαϊκίνη Εμφανίζει αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα εναντίον του Ανθρώπου μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα σε καλλιέργεια κυττάρων και Γυμνό Μοντέλα ποντίκια μέσω της E2F οδό. PLoS ONE 5 (4): e10243. doi: 10.1371 /journal.pone.0010243

Επιμέλεια: Dong-Yan Jin, Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 8 του Ιαν, 2010? Αποδεκτές: 24 Μαρ 2010? Δημοσιεύθηκε: 20 Απρ 2010

Copyright: © 2010 Brown et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από ένα Κέντρο Βιοχημικής Έρευνας αριστείας πιλοτική έρευνα επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (αριθμός επιχορήγηση 5P20RR020180)? η Φαρμακευτική Κατασκευαστές Ίδρυμα Ερευνών Σύλλογος Starter Grant? η υποτροφία Μάρσαλ Πανεπιστημίου ADVANCE? μια Grant-in-Aid επιδότηση προπτυχιακών έρευνα από την Εθνική Υπηρεσία Αεροναυτικής και Διαστήματος? και ένα Βραβείο Νέου Επιστήμονα Κλινική από το Attendant πτήσης Medical Research Institute (αριθμός επιχορήγηση 82.115). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) είναι μια επιθετική κακοήθεια που αντιπροσωπεύει το 13% όλων των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα, με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών μικρότερη του 5% [1], [2]. Οι στατιστικές αυτές υπογραμμίζουν την ανάγκη για νέες στρατηγικές θεραπείας για την ασθένεια αυτή. Πρόσφατες πρόοδοι στην κατανόηση του βασικού μοριακών γεγονότων που εμπλέκονται στην εξέλιξη SCLC έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση των πιθανών παραγόντων για θεραπευτικές παρεμβάσεις [2], [3], [4], [5]. Οι στρατηγικές αυτές περιλαμβάνουν παράγοντα ανάπτυξης /αναστολέων ειδικών για υποδοχέα, αναστολείς της πρωτεϊνικής κινάσης και θρεπτικούς παράγοντες. Ο προσδιορισμός των θρεπτικών παραγόντων που εμφανίζουν αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτική λεωφόρος στο ανθρώπινο SCLC.

Η καψαϊκίνη, το κύριο δραστικό συστατικό του πιπεριές τσίλι, χρησιμοποιείται τοπικώς για τη θεραπεία του πόνου και της φλεγμονής που σχετίζεται με μία ποικιλία ασθένειες [6], [7]. Μελέτες δείχνουν ότι χημειοπρόληψη καψαϊκίνη μπορεί να καταστείλει καρκινογένεση του δέρματος, του παχέος εντέρου, του πνεύμονα, της γλώσσας και του προστάτη [8], [9], [10], [11], [12]. Αν και αυτές οι μελέτες έχουν ασχοληθεί με το χημειοπροφυλακτική δυναμικό της καψαϊκίνης, μόνο λίγα έχουν αντιμετωπίσει τις δυνατότητές της ως αντικαρκινικού παράγοντα. Για παράδειγμα, η καψαϊκίνη έχει δειχθεί ότι διεγείρει απόπτωση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC), Τ-κυττάρου λευχαιμία, καρκίνωμα του οισοφάγου, astroglioma, του προστάτη, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του γαστρικού κυττάρων σε μοντέλα καλλιέργειας κυττάρων [13], [14], [15], [16], [17]. Επιπλέον, η χορήγηση της καψαϊκίνης έχει δειχθεί ότι καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του καρκίνου του προστάτη σε γυμνούς ποντικούς μοντέλα [10], [18].

Εκτός από την πρόκληση απόπτωσης, η καψαϊκίνη έχει βρεθεί ότι επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στον καρκίνο του ανθρώπου κύτταρα. Αρκετές συγκλίνουσες μελέτες έχουν δείξει ότι η καψαϊκίνη επαγόμενη G1 σύλληψη σε κύτταρα ανθρώπινου επιδερμοειδούς καρκινώματος CE 81T /VGH και τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη να συμβεί μέσω επαγωγής της ρ53 και της εξαρτώμενης από κυκλίνη κινάση (cdk) αναστολέα ρ21 [10], [17], [19 ], [20], [21]. Η θεραπεία της HL-60 ανθρώπινα λευχαιμικά κύτταρα με καψαϊκίνη που προκαλείται G1 σύλληψη μέσω αναστολής της δραστηριότητας cdk2. Η αντι-αγγειογενετική δραστικότητα της καψαϊκίνης αποδίδεται στην ικανότητά του να προκαλεί G1 διακοπή σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Καψαϊκίνη επαγόμενη G1 σύλληψη συσχετίζεται με την καταστολή της κυκλίνης επιπέδων D1, η αναστολή της δραστικότητας cdk4 και φωσφορυλίωσης Rb σε ενδοθηλιακά και κύτταρα καρκίνου του μαστού [21], [22]. Τα στοιχεία αυτά εγείρουν την πιθανότητα ότι η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της καψαϊκίνης διαμεσολαβείται από τα αποτελέσματά του στην E2F-Rb μονοπατιού.

Η οικογένεια E2F μεταγραφικών παραγόντων, που αποτελείται από οκτώ γονίδια μέλους (E2F1-E2F8), θεατρικά έργα ένα κεντρικό ρόλο στη ρύθμιση της προόδου του κυτταρικού κύκλου και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού [23], [24], [25], [26]. Αυτά E2Fs έχουν περαιτέρω υποδιαιρούνται σε δύο ομάδες με βάση την μεταγραφική ρυθμιστικών ιδιοτήτων τους σε υποκινητές γονιδίων. E2F1, E2F2 και E2F3 συχνά αναφέρονται ως E2Fs «ενεργοποιητής», επειδή μεταγραφικά ενεργοποιούν E2F στόχος πολλαπλασιαστική γονίδια όπως κυκλίνη Ε, cdc25A και Cdc6 [25], [27], [28], [29]. Αυτά τα γονίδια στόχου τότε επάγουν την είσοδο των κυττάρων σε S-φάση, προωθώντας έτσι την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η δεύτερη υποκατηγορία, E2F4 και E2F5, αναφέρονται ως τα E2Fs «καταστολέας» επειδή καταστέλλουν την μεταγραφή του E2F στόχευση πολλαπλασιαστικών γονίδια. E2F μέλη της οικογένειας E2F6, E2F7 και E2F8 είναι επίσης καταστολείς. E2F7 και E2F8 είναι τα πιο πρόσφατα εντοπίστηκαν τα μέλη αυτής της οικογένειας, και πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τη λειτουργία και τη ρύθμιση [25] τους. Παρά το γεγονός ότι όλοι οι μεταγραφικά ενεργή E2Fs δεσμεύονται στην ίδια θέση αναγνώρισης DNA σε υποκινητές στόχου, έχουν διαφορετικές λειτουργικούς ρόλους στο κύτταρο [26], [29].

Μελέτες των τελευταίων ετών έχουν δείξει ότι η δραστηριότητα της E2Fs ρυθμίζεται αυστηρά από την οικογένεια πρωτεϊνών τσέπη, δηλαδή Rb, ρ130 και ρ107. E2Fs 1-3 μπορεί να συνδέονται προς την Rb πρωτεΐνη, αλλά E2Fs 4 και 5 κατά προτίμηση συνδέονται προς ρ107 και ρ130 πρωτεΐνες [24], [25], [26], [29], [30]. Οι οικογένεια Rb πρωτεΐνες δεσμεύονται σε ένα ήμισυ εντός της περιοχής μεταγραφική ενεργοποίηση του E2Fs, αποτελεσματικά καταστολή δραστηριότητά τους. Έτσι, αδρανή κύτταρα περιέχουν υψηλά επίπεδα της E2F πρωτεΐνες που συνδέονται προς Rb, ρ130 και ρ107. Η έναρξη της μιτογόνα ερεθίσματα προκαλεί φωσφορυλίωση της Rb, ρ130 και ρ107 από κυκλίνη D και Ε και των συναφών κινασών τους. Η φωσφορυλίωση του Rb, ρ107 και ρ130 αποτελέσματα σε αδρανοποίηση και διαχωρισμό τους από E2F πρωτεΐνες [25]. Αυτά τα ελεύθερα E2Fs ακολούθως δεσμεύονται με στόχευση πολλαπλασιαστικών υποκινητές όπως κυκλίνη Ε, θυμιδυλική συνθάση (TS), cdc25A και Cdc6, οι οποίες ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης [31], [32]. Από αυτούς, E2F1-3 διεγείρει τη μεταγραφή των προαναφερθέντων γονιδίων, ενώ E2F4 και E2F5 καταστέλλουν μεταγραφή [25]. Η πλειοψηφία των ανθρώπινων SCLC έχουν έλλειψη της πρωτεΐνης Rb [3]. Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι οι άλλοι δύο τσέπη πρωτεΐνες, ρ107 και ρ130, διαδραματίζουν ζωτικό ρόλο στην E2F ρύθμιση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων στο ανθρώπινο SCLCs.

Η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της καψαϊκίνης δεν έχει μελετηθεί σε ανθρώπινο SCLCs . Η παρούσα χειρόγραφο γεμίζει αυτό το κενό της γνώσης και δείχνει για πρώτη φορά ότι η καψαϊκίνη μπορεί να αναστείλει ισχυρώς τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων SCLCs χρησιμοποιώντας καλλιέργεια πολλαπλές κυτταρικές και

in vivo

μοντέλα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η πλειοψηφία των ανθρώπινων SCLCs έχουν μεταλλάξεις σε Rb και ρ53, καθώς και απορρύθμισης στην οδό E2F-Rb [3], [4], [5]. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από τις μικροσυστοιχίες, δείγματα ιστών από ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα και ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα υποδεικνύουν ότι κυτταρικού κύκλου ρυθμιστικά μόρια, όπως E2F1-5, ρ130, Skp2, κυκλίνη D1 και ρ16, συμβάλλουν στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων του πνεύμονα [33] . Ως εκ τούτου, υποθέσαμε ότι η καψαϊκίνη εμφανίζει αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε ανθρώπινα SCLCs ρυθμίζοντας την δραστικότητα της E2F οικογένειας παραγόντων μεταγραφής.

Η παρούσα χειρόγραφο είναι μία αρχική μελέτη στοχεύει στη διερεύνηση της αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα της καψαϊκίνης σε ανθρώπινα SCLC και στα δύο μοντέλα κυτταρικής καλλιέργειας και των ζώων. Εδώ, αποδεικνύουμε για πρώτη φορά ότι η καψαϊκίνη εμφανίζει ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές SCLC

in vitro

. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η καψαϊκίνη καταστέλλει την ανάπτυξη των ανθρώπινων όγκων σε SCLC CAM και γυμνά μοντέλα ποντικών. Έχουμε επίσης διερευνηθεί η συμβολή της E2F οικογένειας παραγόντων μεταγραφής στις ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της καψαϊκίνης σε SCLC κύτταρα. Παρατηρήσαμε ότι η καψαϊκίνη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων SCLCs μέσω ενός συγκεκριμένου μέλους της E2F οικογένειας, δηλαδή E2F4. Κατάλυση επίπεδα E2F4 από δύο ανεξάρτητους siRNA βρέθηκε να αντιστραφεί η αντι-πολλαπλασιαστική δράση της καψαϊκίνης. Επιπλέον, η καψαϊκίνη επαγόμενη διακοπή αύξησης συνδέθηκε με μια μείωση στην έκφραση των γονιδίων στόχων E2F κυκλίνη Ε, TS, cdc25A και Cdc6. Τέλος, χρωματίνης IP (μάρκας) ανάλυση της ανθρώπινης SCLC κυττάρων έδειξαν ότι η θεραπεία της καψαϊκίνη μείωσε την πρόσληψη E2Fs ενεργοποιητή, δηλαδή E2F2 και E2F3, με πολλαπλασιαστικές υποστηρικτές, όπως η κυκλίνη Ε, TS, cdc25A και Cdc6. Από την άλλη πλευρά, η πρόσληψη καταστολέα E2F4 ενισχύθηκε από καψαϊκίνη θεραπεία. Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η καψαϊκίνη εμφανίζει ισχυρή αντι-πολλαπλασιαστική δραστικότητα σε ανθρώπινα κύτταρα με SCLC διαφορικά ρύθμιση της E2F οικογένειας παραγόντων μεταγραφής. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας εγείρουν την πιθανότητα ότι θρεπτικούς παράγοντες, όπως η καψαϊκίνη μπορεί να είναι χρήσιμοι για την θεραπεία της ανθρώπινης SCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Γυμνοί ποντικοί ελήφθησαν από Charles River Laboratories και εγκλιματίστηκαν για μία εβδομάδα. Αυτοί στεγάστηκαν σε αποστειρωμένα κλουβιά με

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό σε διέρχεται από φίλτρο HEPA ράφια και να παρακολουθούνται στενά από το προσωπικό της εγκατάστασης των ζώων. Όλες οι διαδικασίες που περιλαμβάνουν γυμνά ποντίκια διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας των ζώων και τη χρήση σε εγκαταστάσεις διαπιστευμένο από την Ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) Διεθνών και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Joan Γ Edwards της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Μάρσαλ (πρωτόκολλο # 371).

Cell Culture και διαμόλυνση

Τα ανθρώπινα SCLC κυτταρικές σειρές ΝΟΙ-Η69, NCI-H82 (στο εξής αναφέρεται ως Η69 και Η82, αντίστοιχα), DMS53 και DMS114 λήφθηκαν από την American Type Culture Collection, Rockville, MD. Αυτές οι κυτταρικές γραμμές επελέγησαν επειδή έχουν μελετηθεί εκτενώς, και φυσικά και μοριακά χαρακτηριστικά τους μοιάζουν πολύ με SCLC σε ασθενείς. Gazdar et al., (1985) αρχικά απομονώθηκε και χαρακτηρίστηκε τις κυτταρικές σειρές Η69 και Η82 [34], [35]. Βρήκαν ότι η μορφολογία και χαρακτηριστικά ανάπτυξης των κυττάρων Η69 και Η82 ήταν τυπικές των SCLC κυττάρων όγκου που βρίσκονται σε ασθενείς. Επιπλέον, η βιοχημικό προφίλ αυτών των κυττάρων (παρουσία της L-dopa αποκαρβοξυλάση, δείκτες νευροενδοκρινείς, βομβεσίνη-όπως ανοσοαντιδραστικότητα, νευρώνα-ειδική ενολάση και υψηλές συγκεντρώσεις στον εγκέφαλο ισοενζύμου της κινάσης της κρεατίνης) βρέθηκε να είναι ταυτόσημη με τον ανθρώπινο SCLC όγκους που παρατηρούνται σε ασθενείς . Ομοίως, DMS53 και DMS114 κύτταρα πρώτα απομονώθηκαν από ανθρώπινο SCLC βιοψίες και χαρακτηρίζεται από Pettengill et al., (1980). Βρήκαν ότι τόσο DMS53 και DMS114 διατήρησε τη φυσική, μορφολογικές και βιοχημικές προφίλ του ανθρώπινου SCLC όγκων παρατηρήθηκε στην κλινική [36].

Η69 και Η82 διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 2 mM γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη και 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). DMS53 ανθρώπινα SCLC κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 1 media Waymouth του MB752 /που περιέχει 2 mM γλουταμίνη, 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη, 50 μg /ml στρεπτομυκίνη και 10% FBS. Τα μέσα καλλιέργειας για τα ανθρώπινα κύτταρα SCLC DMS114 ήταν πανομοιότυπο με DMS53, εκτός του ότι το μέσο περιείχε επιπλέον 2% διττανθρακικό νάτριο.

Πρωτογενής φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα (ΝΗΒΕ) και επιθηλιακά κύτταρα των αεραγωγών μικρά (SAEC) ελήφθησαν από Lonza Technologies, Ελβετία. NHBEs διατηρήθηκαν σε μέσα που περιέχουν BEBM αυξητικούς παράγοντες. Ομοίως SAECs διατηρήθηκαν σε SABM μέσα συμπληρωμένα με αυξητικούς παράγοντες. Τόσο BEMB και SABM μέσα παρασκευάστηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλα τα πειράματα χρησιμοποιώντας NHBEs και SAECs διεξήχθησαν μεταξύ των διόδων 3-8 [31].

ΜΤΤ Δοκιμασία

προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται από HEO et al., (1990). Η69 και Η82 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 50.000 κύτταρα /φρεάτιο. DMS53 και DMS114 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 24 ώρες για να επιτραπεί πλήρης επανασυγκόλληση των κυττάρων. Ακολούθως, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μΜ καψαϊκίνης για 24 ώρες, 48 ώρες ή 72 ώρες. Μετά τα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, 50 μΙ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο, και οι δίσκοι επωάστηκαν για 4 ώρες στους 37 ° C [37]. Στη συνέχεια, το μέσο αναρροφήθηκε και 150 μΙ DMSO προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για την διαλυτοποίηση των κρυστάλλων φορμαζάνης. Η απορρόφηση των πλακών μετρήθηκε σε αναγνώστη ELISA (Benchmark, BioRad) σε μήκος κύματος 540 nm. Κάθε δείγμα έγινε εις τριπλούν, και ολόκληρο το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές.

BrdU και PCNA Δοκιμασίες Πολλαπλασιασμού

βρωμοδεοξυουριδίνη (BrdU) ένζυμο επισήμανσης συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) σετ ελήφθησαν από την Roche Biochemicals και χρησιμοποιήθηκαν για να εξετασθούν τα αποτελέσματα της καψαϊκίνης στον πολλαπλασιασμό των τεσσάρων ανθρώπινων κυτταρικών σειρών SCLC, Η69, Η82, DMS53 και DMS114. BrdU είναι ανάλογο θυμιδίνης νουκλεοτίδιο που ενσωματώνεται κατά την διάρκεια της φάσης S (αντί θυμιδίνης) μόνο στο DNA των πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων [31], [32], [38].

Η69 και Η82 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες των 96 φρεατίων σε πυκνότητα 50.000 κύτταρα /φρεάτιο. DMS53, DMS114, SAEC και ΝΗΒΕ κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο. DMS53 και DMS114 επωάστηκαν με μέσα άνευ ορρού για 36 ώρες για να απομακρυνθεί η επίδραση του ενδογενών παραγόντων ανάπτυξης. Μετά από 36 ώρες, τα κύτταρα αυτά στη συνέχεια επανα-διεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία ή απουσία υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της καψαϊκίνης για 18 ώρες, η οποία είναι ο χρόνος που απαιτείται για την είσοδο S-φάσης [31], [32], [38] . Η NHBEs και SAECs κατέστησαν εν ηρεμία σε βασικό μέσο που περιέχει το ¼ του ποσού (ν /ν) των αυξητικών παραγόντων επί 24 ώρες (CIT). Στη συνέχεια, τα κύτταρα διεγέρθηκαν με πλήρες μέσο που περιέχει την πλήρη όγκο των αυξητικών παραγόντων για 18 ώρες όπως περιγράφεται προηγουμένως. Ο ρυθμός ενσωμάτωσης BrdU μετρήθηκε με την τεχνική ELISA, και το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S ποσοτικοποιείται με χρωματομετρική αξιολόγηση (λ = 405 nm). Η απορρόφηση των κυττάρων σε επεξεργασία με 10% FBS ή πλήρη μέσα υποτέθηκε ότι είναι 100%, και η καψαϊκίνη επαγόμενη μειώσεις στην S-φάση υπολογίστηκαν ως ποσοστό των FBS ελέγχου επεξεργασμένα κύτταρα. Κάθε δείγμα εξετάστηκε εις τριπλούν, και η δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε επίσης με μέτρηση των επιπέδων του πυρηνικό αντιγόνο πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων (PCNA) χρησιμοποιώντας ένα κιτ ELISA PCNA από την Calbiochem. Η69, Η82, DMS53 και DMS114 απλώθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία κατά τον ίδιο τρόπο όπως η δοκιμασία που περιγράφεται παραπάνω BrdU. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε, και ρυθμιστικό διάλυμα επαναιώρηση (50 mM Tris, ρΗ 8, 5 mM EDTA, 0,2 mM PMSF, 1 μg /ml πεπστατίνη, 0,5 μg /ml λευπεπτίνη) προστέθηκε στα κύτταρα. Το επίπεδο του PCNA στα κύτταρα προσδιορίστηκε ποσοτικά με μέτρηση της απορρόφησης στα 405 nm, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα ελέγχθηκε εις διπλούν, και η δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές για κάθε κυτταρικό τύπο.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

κύτταρα Η69 SCLC χρησιμοποιήθηκαν για ανάλυση του κυτταρικού κύκλου, χρησιμοποιώντας μια τροποποίηση του ιωδιούχου προπιδίου τεχνική [15], [39]. Εν συντομία, 5 × 10

5 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ανά δείγμα. Κάθε δείγμα επωάστηκε με μέσα άνευ ορρού για 36 ώρες για να απομακρυνθεί η επίδραση του ενδογενών παραγόντων ανάπτυξης. Μετά από 36 ώρες, τα κύτταρα στη συνέχεια επανα-διεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία ή απουσία 50 μΜ καψαϊκίνης για 18 ώρες, η οποία είναι ο χρόνος που απαιτείται για την είσοδο S-φάσης [30]. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν δύο φορές σε ρυθμιστικό διάλυμα (1 mM EDTA εντός DPBS χωρίς ασβέστιο και μαγνήσιο, συμπληρωμένο με 1% εξαιρετικά χαμηλής IgG FBS, Invitrogen Corporation), όπως καθορίζονται στην παγωμένης αιθανόλης 70% και επανα-εναιωρήθηκαν σε διάλυμα χρώσης ιωδίου προπιδίου (50 μg /ml ιωδιούχου προπιδίου, 25 μg /ml RNase Α σε ρυθμιστικό διάλυμα /EDTA DPBS) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Τα δείγματα αναλύθηκαν με μια ροή BD FACS Aria II κυτταρόμετρο (BD Biosciences).

Τα προϊόντα λύσεως και κηλίδωση Western

Τα προϊόντα λύσης για κάθε κυτταρική σειρά έγιναν χρησιμοποιώντας την ΝΡ-40 με βάση το πρωτόκολλο λύσης [ ,,,0],31], [38], [40]. κύτταρα DMS114 αναπτύχθηκαν σε 100 πιάτα cm έως περίπου 70% συρροή. Τα κύτταρα κατέστησαν εν ηρεμία με επώαση σε μέσα άνευ ορού για 36 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα επαναδιεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία ή απουσία υποδεικνυόμενες δόσεις καψαϊκίνης για 18 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS. Τα κύτταρα στη συνέχεια λύθηκαν με Μ2 ρυθμιστικού λύσης (20 mM Tris, ρΗ 7,6, 0,5% ΝΡ-40, 250 mM NaCl, 3 mM EGTA, 3 mM EDTA, 4 μΜ DTT, 5 mM PMSF, 1 mM φθοριούχο νάτριο, 1 mM νάτριο ορθοβαναδικό, 25 μg /ml λευπεπτίνη, 5 μg /ml πεπστατίνη, 5 μg /ml απρωτινίνη, 25 μg ml αναστολέα /θρυψίνης-χυμοθρυψίνης). Εβδομήντα μικρολίτρα ρυθμιστικού λύσης προστέθηκαν για κάθε 20 μΙ συσκευασμένου όγκου κυττάρων. Το λύμα περιστράφηκε σε 4 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια στροβιλίστηκε στις 15,000 g για 15 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε για περαιτέρω ανάλυση. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης του προϊόντος λύσης μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο Bradford (Bio-Rad Labs). Εκατόν πενήντα υποπολλαπλάσιο μικρογραμμάριο της πρωτεΐνης διεξήχθη σε 10% γέλη SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης (BioRad Labs).

Η σχετική έκφραση των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών αναλύθηκε με κηλίδωση Western. E2F1 μονόκλωνα και πολύκλωνα αντισώματα E2F2-6 λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology. Τα μονοκλωνικά αντισώματα προς TS, cdc25A και Cdc6 ελήφθησαν επίσης από την Santa Cruz Biotechnology. Μονοκλωνικό αντίσωμα προς κυκλίνη Ε ελήφθη από την BD Biosciences. Το μονοκλωνικό αντίσωμα β-ακτίνης ελήφθη από την Sigma Chemical Company, USA. Πολυκλωνικά GAPDH αντίσωμα ελήφθη από Trevigen, Inc. Τα δευτερεύοντα αντισώματα ελήφθησαν από την Pierce Biotechnologies. Το σήμα που λαμβάνεται στα πειράματα κηλίδος Western ανιχνεύθηκε με την SuperSignal West Dura Extended Substrate Διάρκεια (Pierce Biotechnologies). Τα αποτελέσματα των δοκιμασιών κηλίδωση Western ποσοτικοποιήθηκαν με πυκνομετρική ανάλυση (BioRad Σύστημα Gel Documentation) χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης Ποσότητα 4.5.2.

εμβρύου κοτόπουλου χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) Δοκιμασία

Ειδικά παθογόνα ελεύθερο (SPF) γόνιμο αυγά κότας (Charles River Laboratories, North Franklin, CT) επωάστηκαν στους 37,5 ° C με 75% σχετική υγρασία, και συνεχώς περιστρέφεται αργά από ένα αυτόματο τορναδόρος αυγού (GQF Manufacturing Company, Savannah, GA). Την Ημέρα 9, αυγά ωοσκοπήθηκαν και τα παράθυρα ανοίγουν για το κέλυφος για να εκθέσει το CAM [41]. κύτταρα Η69 (3 χ 10

6) εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ψυχρού μέσου χωρίς ορό, αναμιγνύεται με 100 μΐ κρύου BD Matrigel Matrix (BD Biosciences, San Jose, CA) και 50 μΜ καψαϊκίνη. Αυτά τα κύτταρα εφαρμόζονται στο CAM κάθε εμβρύου κοτόπουλου. Αυγά επωάστηκαν στους 37 ° C για 4 ημέρες πριν από εμφυτεύματα όγκου αφαιρέθηκαν, φωτογραφήθηκαν και ζυγίστηκαν. Ένα σύνολο 12 αυγών προσδιορίστηκαν για κάθε ομάδα [41].

Αντικαρκινική Μελέτες σε γυμνούς ποντικούς

Οκτώ 4-εβδομάδων αρσενικούς γυμνούς ποντικούς λήφθηκαν από Charles River Laboratories και εγκλιματίστηκαν για ένα εβδομάδα. Αυτοί στεγάστηκαν σε αποστειρωμένα κλουβιά με

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό σε διέρχεται από φίλτρο HEPA ράφια και να παρακολουθούνται στενά από το προσωπικό της εγκατάστασης των ζώων. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με τις οδηγίες φροντίδας των ζώων και τη χρήση σε εγκαταστάσεις διαπιστευμένο από την Ένωση για την αξιολόγηση και διαπίστευση του Εργαστηρίου Φροντίδα Ζώων (AAALAC) Διεθνών και εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση (IACUC) του Joan C. Edwards της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Μάρσαλ (πρωτόκολλο # 371).

Η69 κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-αιωρούνται σε ένα διάλυμα 1:01 (ν /ν) του μέσου χωρίς ορό και μήτρα Matrigel (BD Biosciences). Δύο εκατομμύρια κύτταρα σε 100 μλ εγχύθηκαν υποδορίως μεταξύ των ωμοπλατών εκάστου ποντικού [42]. Αφού οι όγκοι έφθασαν 100 mm

3, οι ποντικοί μεταγωγής για τον έλεγχο ΑΙΝ-76Α δίαιτα βασισμένη περιέχει 10% αραβοσιτέλαιο μέχρι οι όγκοι έφθασαν 800 mm

3. Στη συνέχεια, οι ποντικοί διαιρέθηκαν σε δύο ομάδες. Η ομάδα θεραπείας (Ν = 4) αλλάχθηκε σε μία δίαιτα που περιέχει 50 mg καψαϊκίνη /kg τροφής (η οποία είναι περίπου 10 mg καψαϊκίνης /kg σωματικού βάρους του ποντικού ανά ημέρα). Η ομάδα ελέγχου (Ν = 4), συνεχίστηκε με τη δίαιτα ελέγχου. Οι ποντικοί ζυγίστηκαν μία φορά την εβδομάδα. κατανάλωση τροφής τους παρακολουθήθηκε με ζύγιση του έχουν απομείνει φαγητό μία φορά την εβδομάδα. Η χορήγηση της καψαϊκίνης προκάλεσε καμία δυσφορία ή απώλεια βάρους σε ποντίκια. Επιπλέον, η πρόσληψη τροφής ήταν παρόμοια μεταξύ ελέγχου και ποντίκια καψαϊκίνη αγωγή.

Η φαρμακευτική αγωγή συνεχίζεται έως ότου οι όγκοι της ομάδας ελέγχου έφθασαν 2000 mm

3. μήκη όγκου (Ι), τα πλάτη (W) και ύψος (h) μετρήθηκαν ημερησίως (για 6 ημέρες από μια εβδομάδα) για κάθε ποντικό. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν ως (L x Π x Υ) /2 [43], [44]. Μετά euthanizing τα ποντίκια, οι όγκοι αποκόπηκαν. Το ήμισυ του όγκου καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και χρησιμοποιούνται για να κάνουν τα προϊόντα λύσης. προϊόντα λύσης του όγκου παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Τ-Per ρυθμιστικού λύσης (Pierce Biotechnology), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή [38]. Το άλλο μισό του όγκου σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη και χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημεία.

Δοκιμασία Caspase Διάσπαση

δοκιμασία διάσπασης κασπάσης έγινε με προϊόντα λύσης του όγκου που παρασκευάζονται από ποντικούς ελέγχου και ποντικούς καψαϊκίνη επεξεργασμένα με τη χρήση της κασπάσης -3 διάσπαση σετ (Chemicon, Temecula). προϊόντα λύσης του όγκου παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας Τ-Per ρυθμιστικού λύσης όπως περιγράφεται παραπάνω. Ένα κλάσμα 60 μΐ λύματος χρησιμοποιήθηκε για κάθε αντίδραση. Επιπλέον, 60 μΙ της σισπλατίνης επεξεργασμένου Η69 λύμα (κατασκευασμένα από την αγωγή Η69 κυττάρων με 30 μΜ της σισπλατίνης για 72 ώρες) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος, σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα ελέγχθηκε εις διπλούν, και η δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές για κάθε κυτταρικό τύπο.

Ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το M.O.M. χρώση κιτ (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). ενσωματωμένες σε παραφίνη τομές Η69 ξενομοσχεύματος ιστού ποντικού (4 μm) αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και ακολούθως επανυδατωθεί σε αιθανόλη. Οι τομές υποβάλλονται σε κατεργασία ανάκτησης αντιγόνου χρησιμοποιώντας το κιτ Antigen retrival (BioGenex Inc.), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Οι τομές στη συνέχεια σε επεξεργασία με κατεργασία πρωτεϊνάση Κ (20 μg /ml) για 15 λεπτά και αποσβέστηκε ενδογενών υπεροξειδασών σε 0,3%

2O

διάλυμα Η2 σε μεθανόλη για 30 λεπτά. Τα τμήματα αποκλείστηκαν με χρήση του κιτ αποκλεισμού Αβιδίνης-Βιοτίνης (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Οι τομές επωάστηκαν με αντι-ΡΟΝΑ (BioGenex Inc.) μονοκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα (αραίωση 1:100) για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές πλύθηκαν σε PBS για να απομακρυνθεί η περίσσεια αντισώματος και που δημιουργήθηκε με την M.O.M. και υπεροξειδάσης DAB κιτ, που λαμβάνεται από την Vector Laboratories (Burlingame, CA). Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη, αφυδατωμένα, τοποθετημένα σε Permount Τοποθέτηση Medium (Fisher Biotech) και φωτογραφήθηκε κάτω από τον Όλυμπο BX41 φωτεινό πεδίο μικροσκοπίου. Αιματοξυλίνη και ηωσίνη (Η και Ε) εικόνες φωτογραφήθηκαν σε μεγέθυνση 40Χ. χρώση PCNA φωτογραφήθηκε σε 1000Χ χρήση του πετρελαίου. PCNA θετικών κυττάρων, τα οποία είναι τα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, ποσοτικοποιήθηκαν μετρώντας 5 πεδία 100 κυττάρων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το ποσοστό των PCNA θετικών κυττάρων.

siRNA Επιμόλυνση και Αναλύσεις

Χημικά συντίθεται, διπλής έλικας siRNA για E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5 και E2F6 αγοράστηκε από Σάντα Cruz Biotechnology. Τα πειράματα επιμόλυνσης εκτελέστηκαν σε Η69 και DMS114 κύτταρα [31], [45]. Ασύγχρονη κύτταρα συλλέχθηκαν και επανα-επιστρώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε περίπου 40% συρροή σε μέσο ανάπτυξης που περιέχει 10% FBS σε απουσία αντιβιοτικών. Η διαμόλυνση του προαναφερόμενου siRNA διεξήχθη με χρήση αντιδραστηρίου Oligofectamine (Invitrogen Corporation), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Δεκαοκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα καθίστανται εν ηρεμία για 36 ώρες με επώαση σε μέσα ελεύθερα ορού. Στη συνέχεια, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10% FBS με την παρουσία 50 μΜ καψαϊκίνης για 18 ώρες. Η καψαϊκίνη προστέθηκε 30 λεπτά πριν από την προσθήκη των μέσων που περιέχουν 10% FBS. Μετά από 18 ώρες, το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μετρήθηκε με το κιτ ELISA BrdU (Roche Laboratories). Ένα μη-αλληλουχία στόχευσης siRNA (Santa Cruz Biotechnology) χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για τα πειράματα διαμόλυνσης. Κάθε διαμόλυνση διεξήχθη εις διπλούν, και ολόκληρη η δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές.

Τα αποτελέσματα των πειραμάτων διαμόλυνσης E2F4 επαληθεύτηκαν χρησιμοποιώντας ένα δεύτερο σετ ανεξάρτητων siRNA που λαμβάνεται από Ambion Biotechnologies [31], [45]. Το πρωτόκολλο της επιμόλυνσης ήταν ίδια όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Ένα μη-στόχευσης ελέγχου siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας σε όλα τα πειράματα. Κάθε διαμόλυνση διεξήχθη εις διπλούν, και ολόκληρη η δοκιμασία επαναλήφθηκε δύο φορές.

Western blotting πειράματα διεξήχθησαν για να εκτιμηθεί η έκφραση των πρωτεϊνών μετά την επιμόλυνση siRNA [31], [45] και στις δύο Η69 και τα κύτταρα DMS114. Κάθε επιμόλυνση σε κύτταρα Η69 έγινε χρησιμοποιώντας 5 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε Τ-10 φιάλες (Midwest Scientific) σε RPMI που περιέχει 10% FBS χωρίς αντιβιοτικά. Στην περίπτωση των κυττάρων DMS114, η διαμόλυνση διεξήχθη σε πλάκες 6 φρεατίων, χρησιμοποιώντας 5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Σε αμφότερα τα κύτταρα Η69 και κύτταρα DMS114, κάθε διαμόλυνση έγινε εις διπλούν, και ολόκληρη η πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές. Η επιμόλυνση του υποδεικνύεται siRNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο Oligofectamine (Invitrogen Corporation), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ένα μη-στόχευσης ελέγχου siRNA χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά από 36 ώρες επιμόλυνσης, τα κυτταρολύματα έγιναν όπως περιγράφεται παραπάνω και η έκφραση της E2F οικογένειας πρωτεϊνών προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western ανάλυση.

Real-time PCR

Η69 κύτταρα υποβλήθηκαν σε ορό ασιτίας για 36 ώρες και στη συνέχεια διεγέρθηκαν με 10% FBS για 8 ώρες [46]. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy κιτ miniprep από QIAGEN. Ένα μικρογραμμάριο RNA ήταν κατεργασία ϋΝάσης χρησιμοποιώντας RQ1 DNase (Promega), που ακολουθείται από σύνθεση cDNA πρώτου κλώνου χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης cDNA iScript (Bio-Rad). Ένα κλάσμα (1/20) του τελικού όγκου της αντίδρασης cDNA χρησιμοποιήθηκε σε κάθε PCR [46]. Primer ακολουθίες [46], [47] είναι οι εξής:

κυκλίνης Ε (πρόσθιος εκκινητής): 5’TTCTTGAGCAACACCCTCTTCTGCAGCC3 ».

κυκλίνης Ε (αντίστροφου εκκινητή): 5’TCGCCATATACCGGTCAAAGAAATCTTGTGCC3″.

TS (πρόσθιος εκκινητής): 5’CTGCCAGCTGTACCAGAGAT3 «

TS (αντίστροφου εκκινητή):. 5’ATGTGCATCTCCCAAAGTGT3».

Cdc6 (πρόσθιος εκκινητής): 5’CCCCATGATTGTGTTGGTAT3 ».

Cdc6 (ανάστροφο εκκινητή): 5’TTCAACAGCTGTGGCTTACA3 «

18S (πρόσθιος εκκινητής):. 5’CTCAACACGGGAAACCTCAC3«

18S (αντίστροφου εκκινητή):. 5’AAATCGCTCCACCAACTAAGAA3 » .

σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα Bio-Rad iCycler.

χρωματίνης Ανοσοκαθίζηση (μάρκας) Δοκιμασία

Η69 ήταν ορό πεινασμένο για 36 ώρες από την επώαση αυτών σε ελεύθερο ορού RPMI-1640 [31], [32], [40], [48]. Στη συνέχεια, αυτά τα αδρανή κύτταρα Η69 επανα-διεγέρθηκαν με 10% FBS με την παρουσία ή απουσία 50 μΜ καψαϊκίνης για 8 ώρες. Είκοσι πέντε εκατομμύρια κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ανά αντίδραση IP. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1% φορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε διασταυρούμενη σύνδεση των πρωτεϊνών και του DNA. Η διασταυρούμενη σύνδεση διακόπηκε με την προσθήκη 0.125 Μ γλυκίνη. δευτερεύον αντίσωμα αντι-ποντικού κουνελιού χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για όλες τις αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση 5 μL του DNA από τις αντιδράσεις ανοσοκαθίζησης ή 1 μL του DNA από την αντίδραση εισαγωγής ως εκμαγείο. συνθήκες κύκλου PCR για την TS και Cdc6 ήταν ως εξής: 94 ° C για 2 λεπτά? τότε 35 κύκλοι των 94 ° C για 30 s, 56 ° C για 30 s και 65 ° C για 30 s? που ακολουθείται από 65 ° C για 2 λεπτά. συνθήκες κύκλου PCR για κυκλίνη Ε ήταν ως ακολούθως: 94 ° C για 2 λεπτά? τότε 35 κύκλοι των 94 ° C για 30 s, 66 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s? που ακολουθείται από 72 ° C για 2 λεπτά. Ο εκκινητής για κυκλίνη Ε περιλαμβάνονται δύο από τις τρεις θέσεις πρόσδεσης E2F στο προαγωγό όπως περιγράφεται στο Nevins et al., (1994). Αυτές οι θέσεις σύνδεσης περιλαμβάνουν το υψηλής συγγένειας E2F θέσεις επί της κυκλίνης Ε υποκινητή της ανθρώπινης [49] δεσμευτική. PCR για τον υποκινητή c-Fos (το οποίο δεν ρυθμίζεται από E2F) χρησιμοποιήθηκε ως ένας αρνητικός έλεγχος για όλα τα πειράματα. Οι αλληλουχίες των εκκινητών PCR που χρησιμοποιούνται στις PCRs είχαν ως εξής:

Κυκλίνη Ε (πρόσθιος εκκινητής): 5’CCCCGTCCCTGCGCCTCGCTG3 ».

Κυκλίνη Ε προαγωγό (αντίστροφος εκκινητής): 5’CGGCGGCGGCGACGGCAGTGG3 ‘ .

Cdc6 υποκινητή (πρόσθιος εκκινητής): 5’GGCCTCACAGCGACTCTAAGA3 ».

Cdc6 υποκινητή (αντίστροφου εκκινητή): 5’CTCGGACTCACCACAAGC3«

TS υποκινητή (πρόσθιος εκκινητής).: 5’TGGCGCACGCTCTCTAGAGC3 ».

TS υποκινητή (ανάστροφο εκκινητή): 5’GACGGAGGCAGGCCAAGTG3«

Η cdc25A, c-fos εκκινητών και οι συνθήκες PCR περιγράφονται στο [29]

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM και αντιπροσωπεύονται χρησιμοποιώντας Graph Pad Prism 5. διαφορές μεταξύ ελέγχου και επεξεργασμένα δείγματα αναλύθηκαν με ανάλυση διακύμανσης (ANOVA), ακολουθούμενη από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης του Dunnett ενός . Οι ρυθμοί ανάπτυξης όγκου σε αθυμικούς ποντικούς αναλύθηκαν με ANOVA ακολουθούμενο από το τεστ Neuman-Keuls. Στα πειράματα ανοσοϊστοχημείας, όλα τα θετικά πυρήνες PCNA μετρήθηκαν σε πέντε ανεξάρτητους τομείς από δύο ανεξάρτητους παρατηρητές σε μια τυχαιοποιημένη, διπλή τυφλή μόδας.